JPH06510911A - セリン及びセリン関連生成物の生合成に用いる物質並びに方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １２、前記細胞が、野生型５ｅｒＡについて欠失している請求の範囲第１１項に 記載の細胞。

１３、セリン又はセリン由来である所望の生成物の製造方法であって、請求の範 囲第１１項に記載の細胞を培養する工程と、前記所望の生成物を回収する工程と を含んでなる製造方法。

１４、前記生成物がセリンである請求の範囲第１３項に記載の方法。

１５、変化３“端を有するＰＧＤをコードする転写体を産生ずるように工学的処 理を施した細胞であって、前記転写体を野生型ＰＧＤと比較してセリンによる阻 害に対する感受性が減少したＰＧＤに翻訳することができる細胞。

明細書 セリン及びセリン関連生成物の生合成に用いる物質並びに方法１、発明の背景 本発明は、セリン及びセリン関連生成物、特にトリプトファンの生合成の一般的 分野並びに前記生合成に使用する方法及び物質に関する。

セリンは、コリン、グリシン、システィン及びトリプトファン等の経済的に重要 な化合物を含む多種多様な細胞代謝物の生合成の主要な中間体である。さらに、 セリンは、テトラヒドロフオレートから５．１０−メチレンテトラヒドロフオレ ートの製造を介して単一炭素供与体として作用し、ｃ１ユニットの細胞総必要量 の６０〜７５％を供与する。これらのＣＩユニットは、メチオニン、イノシンモ ノホスフェート、他のプリン及びある種のピリミジン類（例えば、チミジン及び ヒドロキシメチルンチジン）の合成を含む多種多様な生合成経路に使用される。

第１図に示すセリン生合成経路は、一般的に多種多様な組織及び微生物に有効で ある。この経路における最初の工程では、３−ホスフォ−Ｄ−グリセリン酸（Ｐ ＧＡ）を酵素３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）により３− ホスフォヒドロキシピルヒン酸（ＰＨＡ）に変換する。ＰＧＤをコードする遺伝 子のクローニングが行われ、ＰＧＤサブユニットのアミノ酸配列が波峰された（ トーベイ（Ｔｏｂｅｙ）及びグランド（Ｇｒａｎｔ）、ジエイ・パイオル・ケム （Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６１：１２１７９〜＋２１８３　（１９８０ ）参照）。

原核生物（特にバクテリア）及び酵母等の微生物であるがそれ以上高等な真核生 物ではない微生物では、野生型ＰＧＤの活性は、細胞セリンレベルにより阻害さ れる。この阻害は、運動論的に研究され、報告によれば、アロステリック的に進 行する（トーベイ（Ｔ。

ｂｅｙ）及びグランド（Ｇｒａｎｔ）、ジエイ・パイオル・ケム、２６１　：１ ２１７９〜１２１８３　（１９８６）；デュブロウ（Ｄｕｂｒｏｗ）及びピッツ ア（Ｐｉｚｅｒ）、ジエイ・パイオル・ケム、２５２：１５２７〜１５５１　（ １９７７）；マツキトリック（ＭｃＫｉｔｒｉｃｋ）及びピッツア、ジエイ・バ クチリオル（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　、１４１　：　２３５〜２４５　（ １９８０）参照）。

トサ（Ｔｏｓａ）及びピッツア、ジエイ・バクチリオル、１０６．９７２〜９８ ２　（１９７１）は、大腸菌株に対する通常有毒なセリン類似体であるＬ−セリ ンヒドロキサメートの影響を検討した。

前記類似体を含有する成長培地を選択したところ、セリン耐性変異体を生した。

ある種の変異体では、酵素の修飾によりＰＧＤ、セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ に無関係となることがわかった。−変異体の粗抽出物は、ＰＧＤ活性を示すが、 セリン感受性が減少した（ジエイ・バクチリオル、１０６：９７２〜９８２　（ １９７１）；図５；表６．及び第９７３頁左下欄、第９７７頁左下欄参照）。

Ｉｌ、発明の概要 本発明の一態様は、一般的に、野生型３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナー ゼ（ＰＧＤ）と比較してセリンによる阻害に対する感受性が減少したＰＧＤをコ ードするＤＮＡに関する。即ち、本発明のＤＮＡは、生合成に有用な少なくとも あるレベルの酵素活性を有し、（未修飾）野生型ＰＧＤよりも高いセリンレベル でその活性を保持するＰＧＤをコードしている。

好ましい実施態様では、野生型ＰＧＤは、微生物又は酵母ＰＧＤである。また、 上記工学的ＤＮＡは、野生型ＰＧＤのＣ−末端２５％、好ましくはＣ−末端アミ ノ酸５０個に変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を含んでなるＰＧＤをコードするこ とが好ましい。例えば、工学的ＤＮＡは、Ｃ−末端の一部又は全てが欠失してい るＰＧＤをコードしていてもよい。また、上記工学的ＤＮＡは、上記の欠失の他 に別個の変化として、Ｃ〜末端（ＶＡＬ３６３とＡＳＮ３６４との間か、ＡＬＡ ３９２とＧＬＮ３９４との間）に挿入を有するＰＧＤをコードすることが好まし い。

また、本発明は、ｉ）前記工学的ＤＮＡのアミノ酸配列を有するＰＧＤ　；　ｉ 　ｉ）前記工学的ＤＮＡと、宿主発現系において工学的ＤＮＡが発現するように 配置し指向させた調節ＤＮＡとを含んでなる発現ベクター：　ｉ　ｉ　ｉ）前記 発現ベクターを含んてなる細胞；及びｉｖ）前記細胞を培養することによりセリ ン又はセリン由来生成物を製造する方法に関する。上記ｉ　ｉ　ｉ）に関して、 細胞が野生型５ｅｒＡについて欠失していることが好ましい。

さらに別の態様によれば、変化した３゛端を有するＰＧＤをコードするｍＲＮＡ 転写体を産生ずるように工学的処理（例えば、組み換え遺伝子構築）を施した細 胞であって、前記転写体が前記細胞により翻訳されて野生型ＰＧＤと比較してセ リンによる阻害に対する感受性が減少したＰＧＤを生しる細胞が提供される。

本発明は、重要な生合成制御点を解除することにより、その制御点の下流て、特 にセリン及びトリプトファン等のセリン由来生成物を含む数多くの化合物の産生 を増強することができる。セリン由来の他の細胞代謝物（即ち、生合成において セリンが主要な中間体である）には、コリン、グリツツ、システィン並びにメチ オニン、イノノンモノホスフェート、プリン類及びある種のピリミジン類（例え ば、チミジン及びヒドロキシメチルントシン）等の０１−供与体依存化合物が含 まれる。

第１図は、グルコースから１−−セリンの生合成の工程を示す。

第２図は、トーベイ及びグランド（上記した）により報告された大腸菌３ｅｒＡ 遺伝子の配列と上記遺伝子から波峰されたアミノ酸配列である。

第３図は、Ｌ−セリン及びテトラヒドロフオレートからグリシン及びＮ”、Ｎ” −メチレンテトラヒドロフオレートへの生物変換を示す。

本発明の好ましい実施態様によれば、セリン及びセリン関連生成物（例えば、セ リンから生合成により誘導される上記生成物）の生合成が提供される。本発明に よるこれらの化合物の生合成における最初の工程では、下記で説明するセリン非 感受性ＰＧＤを提供する。

本発明者等は、ＰＧＤに特異的セリンフィードバック介在領域があり、その領域 は、有用なレベルのＰＧＤ活性を維持しなからセリン感受性を減少するように変 化することができることを見出した。

第２図は、以下の説明において参考に使用することができる一つの特定なＰＧＤ 遺伝子及びアミノ酸配列である。第２図の配列は、アミノ酸を４１０個（成熟タ ンパク質から開裂される最初のＭｅｔを含む）含んでいる。ＰＧＤ活性を破壊す ることなくセリン感受性を減少することができるＰＧＤの領域は、分子Ｃ−末端 ２５％内、最も好ましくは５０個のＣ−末端残基内にある。

本発明の範囲内であるＰＧＤ修飾としては、例えば、有用なＰＧＤ作用を保持し なからセリン感受性を減少するＣ−末端アミノ酸４２個の一部分若しくは全ての 欠失又はその領域内での挿入若しくは置換がある。例えば、Ｖａｌ　３６３とＡ ｓｎ　３６４との間にアミノ酸残基を挿入すると、ＰＧＤ活性を保持したままで 、野生型に対するＰＧＤのに、が増加する。

Ｃ−末端アミノ酸残基の一部分又は全てを欠失させることにより、Ｋ１をより大 きく増加させることができる。例えば、Ｃ−末端残基ＧＴＩＲＡＲＬＬＹを欠失 させＡＳＬ、Ｄで置換すると、有用なレベルのＰＧＤ活性を保持したままで、Ｋ １が数桁増加する。本発明の範囲である他の挿入は、Ａｌａ３９２とＧＩｎ３９ ４との間の挿入である。

他の有用な修飾には、上記した挿入及び修飾に加えてＣ−末端からの欠失が含ま れる。

上記したセリン非感受性ＰＧＤをコードしている遺伝子は、Ｃ−末端アミノ酸を コードしているコード領域の３゛端を変化させた後、ビヒクルで宿主株を形質転 換して変化したＰＧＤ酵素を発現することを含む遺伝子工学手法により構築でき る。

候補変性酵素を、以下で概略説明する方法により、セリン親和性（Ｋ１）とＰＧ Ｄ活性についてスクリーニングする。

２、遺伝子工学的構築物のスクリーニング上記した方法により作成した遺伝子構 築物をスクリーニングする際、以下のＰＧＤ活性のアッセイ及びセリン感受性の ア・ソセイを使用する。

本発明には重要ではないが、ＰＧＤ活性のアツセイは、一般的に、変性酵素のセ リン感受性の程度をめるのに必要である。当該技術分野で公知なように、酵素活 性は、総酵素分子数と各分子の触媒活性に関係がある。したがって、ＰＧＤフィ ートノ（・ツク変異体の触媒活性の比較において、相対触媒活性を比較する試料 についてのＰＧＤ分子の相対数を十分に制御する工程を設けなければならな０゜ これを行うには、多数の方法がある。しかしながら、トランケート５ｅｒＡ遺伝 子で形質転換した細胞における遺伝子発現のレベルを十分に確立することは困難 であるので（生存度の減少のため）、種々の構築物から産生されるＰＧＤ活性と 野生型とを比較する最も適当な方法は、標準調節要素を含有する変性５ｅｒＡ遺 伝子を単一コピーに染色体一体化した後、形質転換体を収穫し、野生型細胞力１ らのＰＧＤに対する相対触媒活性をめることである。

ＰＧＤ活性の測定に適当ないずれかの方法を用いることができる。

ＰＧＤ活性は、マツキトリッへジョン・シー及びルイス・アイピンツア（１９８ ０）ンエイ・バクチリオル、１４１．２３５〜２４５に記載の方法による正反応 か逆反応の検出により測定できる。

上記した酵素アッセイは、化学修飾したＣ−末端を有するものを含むいずれかの ＰＧＤ酵素についてのセリン感受性を測定するのに適当である。アッセイは、種 々のレベルのセリンの存在下で行う。

セリンの存在下での触媒活性をセリンの不存在下での触媒活性と比較し、Ｋ１を 算出する。

はとんどの場合、ＰＧＤ触媒活性を顕著に変化させることなくセリン感受性を減 少させることが好ましい。さらに他の実施態様では、フィードバック感受性と触 媒活性の両方を減少させることが望ましいことがある。表１　（以下に示す）に あげた３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼのＣ−末端アミノ酸配列を有 する構築物を使用することができる。

修飾３゛端を有する他の構築物も、本発明により試験構築物を調製し細胞を形質 転換し、ＰＧＤ活性のセリン阻害について試験することが容易であり、本発明の 範囲内である。

セリンによる阻害に対する感受性を欠いているＰＧＤタンパク質の発現を生しる いずれのベクターも、本発明に属する。しかしながら、一般的に、セリンのシン クの不存在下では、フィードバックフリーＰＧＤの高レベルの発現は、得られる 高細胞質レベルのセリン又はセリン由来代謝物が細胞に対して有害であるので、 避けなければならない。即ち、一般的には、通常の触媒活性及び天然遺伝子から のものと類似した発現レベルを有するフィードバック阻害ＰＧＤをコードしてい る構築物の場合、形質転換により、高レベルのＰＧＤが発現し、細胞生存性が減 少する傾向がある。産生ずる高レベルのセリンの毒性により、実際に、ＰＧＤ発 現の減少した変異体を選択することがある。したがって、多コピープラスミドを 用いた形質転換は、ある種の実施態様を用いた構築物の初期スクリーニングに有 用なことがあるが、単一コピーにおける５ｅｒＡ構築物をゲノムに染色体一体化 することが好ましい。さらに、以下で説明する染色体一体化により、フィードバ ック欠失ＰＧＤの活性測定が容易になる。したがって、強力な触媒活性が予測さ れるか望ましいほとんどの実施態様では、単一コピー染色体一体化に適当なベク ターを利用することが好ましい。数多くのこのようなベクターとそれらの使用方 法は、当該技術分野では公知である。例えば、ベックマンによる１９８７年９月 １日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ０７１０９１，８３７を参照できる。ここに開示され ている内容は引用することにより本明細書の内容となる。有用なベクターと構築 物は、所望の生成物を産生ずるのに適当な宿主において酵素の形質転換と発現が うまくできるものである。これらの目的を達成する手段は、当該技術分野で公知 であり、本発明の中心を成すものではない。変性ＰＧＤをコードしているＤＮＡ の他に、発現ベクターは、下記する種々の他の要素含んでいる。

第一に、ベクターに存在するコード配列は、プロモータ、リポソーム結合部位及 び終止配列を含むコード配列の適当なレベルの発現に必要な適当な調節要素が伴 っている。はとんどの場合、天然５ｅｒＡ調節配列が、分子の触媒活性部分の好 ましい源であるが、当該技術分野で公知であるか、将来発見されるであろう数多 くの他の調節配列を用いることができる。

第二に、選択マーカ及び／又はリポータ−遺伝子をコードする配列も、適当な調 節要素とともにベクターに存在する。このような選択マーカの発現は、形質転換 体を同定するのに有用である。適当な選択マーカ遺伝子には、アンピシリン、テ トラサイクリン及びクロラムフェニコールをコードするものが含まれる。

第三に、プラスミドベクターでの複製の起点のデザイラビリティは、主に染色体 又は染色体外に遺伝子を維持することのデザイラビリティに依存している。複製 の起点の欠如を利用して染色体への一体化を促進できる種々の方法は、当業者に は理解されるところである。例えば、ベックマン等による米国特許第４，７４３ ．５４６号を参照できる。ここに開示されている内容は引用することにより本明 細書の内容となる。

発現ベクターを構築したら、適当な宿主細胞を、セリン非感受性ＰＧＤタンパク 質をコードする転写ユニットを含んでいるベクターて形質転換てきる。はとんと の場合、内因性ＰＧＤタンパク質がセリンにより阻害されることが公知であり、 そして内因性５ｅｒＡ遺伝子が欠失され本発明の変性遺伝子により置換される細 胞を用いるのが有用である。このような細胞系は、セリン関連代謝物の過産生に 有用である。セリン感受性タンパク質を含有することが知られている細胞は、原 核生物及び酵母である。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例のみには限定さ れない。

コードする５ｅｒＡ遺伝子対立遺伝子の構築大腸菌に１２ｓｅｒＡ遺伝子を、ｐ ＴＲ２６４のＢｃ１１部位にクローニングした５ａｕ３Ａ部分消化物由来の６． ４ｋｂＤＮＡ断片で単離した（ベックマン等による１９８８年１２月１６日出願 のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０７／２８５，１２８及びロバーツ等、ジーン、上置：１２ ３　（１９８０）参照）。このプラスミドを、ｒｐＫ−Ｂ１３０２」と命名した 。５ｅｒＡ遺伝子を含んているｐＫＢ１３０２ＤＮＡの３ｋｂＳａ　ｌ　Ｉ〜５ ｐｈｌ断片を、ｐＵｃ１９にクローニングしてｐＫＢ　ｌ　３２１を生成した。

５ｅｒＡ遺伝子を含んでいる３ｋｂＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　ｌ−８ａ　ｌ　Ｉ断片を ｐＢＲ３２２にクローニングして、ｐＫＢｌ、３７０を生成した。

フィードバック耐性３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする５ ｅｒＡの対立遺伝子を、５ｅｒＡ遺伝子の３′領域における制限部位にＸｂａｌ リンカ−を挿入することにより生成した。ＨｉｎｃｌｌによるプラスミドりＫＢ 　１３２１の部分消化物により、位置１７９３に平滑末端が生成した。ここで、 リンカ−の挿入により、ｉ）トランケート３−ホスフォグリセレートデヒドロゲ ナーゼをコードするｐＫＢ１４５９　；　ｉ　ｉ）　トランケート３−ホスフォ グリセレートデヒドロゲナーゼをコードするｐＫＢ１５０７゜及び１ｉｉ）アミ ノ酸残基４個を挿入して有する３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコ ードするＩ）ＫＢ１５０８が生成した。

ｐＫＢ１３２１のＰｓｔｌ消化は、位置１８８Ｂで３°懸垂を生じる。ＤＮＡポ リメラーゼ■のクレノー断片の作用により平滑端を生成した。リンカ−を平滑端 断片に結さっし、誘導したプラスミドは、アミノ酸２個を挿入して有する３−ホ スフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードするｐＫＩ３１５０９と、トラン ケート３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードするｐＫＢ１５１０ であった。１）ＫＢ　ｌ　３７０のＫｐｎＩ消化物をＤＮＡポリメラーゼ■のク レノー断片を用いて平滑端とし、挿入リンカ−により、トランケート３−ホスフ ォグリセレートデヒドロゲナーゼ、ｐＫＢ１４５５及びｐＫＢ１５１２又はアミ ノ酸残基２個を挿入して有する３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、ｐ ＫＢ１５１１を生じた。それぞれｐＫＢ！５０８由来の０．８ｋｂＢａｍＨＩ− ＸｂａＩ断片又はｐＫＢ　１５０９由来の０．９ｋｂＢａｍＨＩ−Ｘｂａｌ断片 を、ｐＫＢ１５１］の５．８ｋｂＢａｍＨＩ−Ｘｂａｌ断片に挿入することによ り欠失プラスミドｐＫＢ　１５３０及びｐＫＢ１５３１を生成した。

以下の表２に、作成した種々の構築物をまとめて示す。

全ての構築物について、開始ベクター、使用した制限部位及び挿入リンカ−の配 列を示す。染色体一体化（下記する）後のこれらの構築物３種についての相対触 媒活性とともに、セリンについてのＫ。

値を表１に示す。Ｎ／Ａが呟構築物が染色体一体化しなかったことが明らかであ り、したがって、活性レベルの標準化を行わなかった。

３、化学修飾 野生型））　ＣＤのＣ−末端の欠失又は修飾は、例えば、カルボキシペプチダー ゼＹを含む種々のカルボキンペプチダーゼが、ラクトパーオキシダーゼ介在ヨウ 素化により酵素的又は化学的に達成できることは、当業者の理解するところであ る。

４、アンチセンスｍ　ＲＮ　Ａの使用 また、天然又は形質転換したＰＧＤをコードする配列の３゛　コード領域の部分 に相補的であるヌクレオチド配列を含む産生アンチセンスｍＲＮＡにより３゛端 でトランケートしたＰＧＤをコードする転写体の生成を介して、生体内における セリン感受性を減少させて第３図に示すように、セリンは、グリシンの製造にお ける中間体である。また、セリンは、メチオニン、プリン類（イノシンを含む） 及びある種のピリミジンの合成に必須である普遍形ｃ１供与体であるＮ’、Ｎ” −メチレンテトラヒドロフオレートの製造における中間体でもある。したがって 、ホスフォグリセレートがらセリンの通産生は、コリン、グリシン、システィン 、メチオニン、トリプトファン、及びイノンンモノホスフエートを含む全てのプ リン類用の産生糸を含む広範な細菌性産生糸において有用である。

以下具体的実施例により、本発明を説明する。

プラスミド由来５ｅｒＡ遺伝子に対して内部の配列を、カナマイシン耐性遺伝子 と置換した。次に、このプラスミドを、対立遺伝子交換により宿主株５ｅｒＡ遺 伝子を不活性化するのに使用した。

ＹＭＣ９（ＡＴＣＣ３３９２０）の５ｅｒＡ領域を、コネチヵット州ニューヘブ ンにあるカリ・ジェネティック・ストック・センター（Ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉ ｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）がら入手したＰＣｌ５２３　（ａｒｇ１６１． ａｒｇＦ５８．５ｅｒＡ２７、ｐｕｒＡ５４、ｔｈｒ−２５、ｔｏｎＡ４９、ｒ ｅｌＡｌ、５ｐｏＴＩ）の相補により、Ｓａｕ　３ＡＩで部分消化した染色体Ｄ ＮＡからクローニングした。５ｅｒＡ遺伝子を担持した３ｋｂ断片を、ｐＵＣ１ ９にサブクローニングして、ｐＫＢ１３２１と称するプラスミドを得た。このプ ラスミドがら、３ｋｂＳａｌＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片を、ｐＢＲ３２２に再クロ ーニングして、プラスミドｐＫＢ　ｌ　３７０を得た。５ｅｒＡ遺伝子の３′端 でのＫｐｎ　１部位を、リンカ−を用いてＢａｍＨＩに変換し、得られた５ｅｒ Ａに対して内部のＢａｍＨＩ断片を、Ｔｎ９０３カナマイシン耐性遺伝子を含ん でいるｐＵＣ−４−ＫＳＡＣ（ファーマシア製）由来のＢａｍＨＩ断片で置換し た。この新規なプラスミドは、ｐＫＢ１４２９と命名した。複製の起点をフラン キングしているＭｂｏｌ及びＴＴｈｌｌｌｌをＫｐｎ１部位に変換したｐＫＢ７ ｏ１　（ＡＴＣＣ３９７７２）と称するｐＢＲ３２２誘導体（ＵＳＳＮＯ６／７ ５７，０１９参照；ここに開示されている内容は引用することにより本明細書の 内容となる）を生成した。ｐＫＢ１４２９由来の５ｅｒＡ：：ＫａｎＲを含んて いる５ａｌｌ　〜ＥｃｏＲＩ断片をｐＫＢ７０１にクローニングして、ｐＫＢ　 １４３８を得た。ｐＫＢ１４３８をＫｐｎｌで消化して、ｏｒｉ領域を除去した 。５ｅｒＡ：　：ＫａｎＲの他にアンピシリン耐性コード領域を含んでいる大き な断片を環化し、ＹＭＣ９のＣａＣ１２形質転換に使用した。形質転換後に、宿 主７ＭＣ９細胞を、アンピシリンを用いた選択に附した。これらの条件下では、 アンピシリン耐性クローンは、環状ＤＮＡを相同組み換えを介して５ｅｒＡ遺伝 子フランキング領域に組み込むことにより生じる。アンピシリン選択を行わずに アンピシリン耐性分離株を成長させると、５ｅｒＡ遺伝子フランキング領域の反 復配列の相同組み換えにより、アンピシリン耐性遺伝子の損失が生じる。このよ うな株は、製造業者の指示に準じてＡｍｐＳｃｒｅｅｎ　（ＢＲＬ）を用いたβ −ラクタマーゼの産生の損失により同定した。セリンの存在下及び不存在下での 培地上の単一コロニーの重複ストリーキングにより、最小培地での成長にセリン を必要とするアンピシリン感受性であって、カナマイシンに対しても耐性がある クローンが明らかとなった。そのような分離株の一つを、ＫＢ８７５と命名した 。

５ｅｒＡ１４５５対立遺伝子を、実施例２で概略を述べた５ｅｒＡ・：ＫａｎＲ の導入に使用した方法と類似の方法により、染色体に導入した。簡単に述べると 、５ｅｒＡ１４５５対立遺伝子を担持している断片（Ｓａｌ　Ｉ＝Ｈｉｎｄｌ　 ＩＩ）を、ｐｋＢ７０１にクローニングした。プラスミド起点を、Ｋｐｎｌ消化 により除去した。

環状化ＤＮＡを用いて、アンピシリン耐性に形質転換して、命名株を得た。エン プスクリーン及びカナマイシン用レプリカ平板を用いた非選択成長後、ＫＢ９０ ４　（ｓｅｒＡ１４５５）を分離したところ、アンビンリン及びカナマイシンＫ Ｂ９０４に対して感受性があることが分かった。得られた５ｅｒＡ１５４４対立 遺伝子を、Ｐ１形質導入により産生株に転移させることができる。これについて は、ミラー（１９７２）、エクスベリメンツ・イン・モル・ジエネテイクス（Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリ ング・ハーバ−・プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１−（ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅ ｓｓ）、第２０１〜２０５頁を参照できる。

別の手法を利用して、５ｅｒＡ１５０８対立遺伝子を染色体に移動させた。ＫＢ ８７５株を、■２２０からのＰｉ形質導入によりｒｅｃＤとした（ｒｅｃＤ、ａ ｒｇＡ：ＴｎｌＯ、アムンゼン（Ａｍｕｎｄｓｅｎ）等、（１９８６）、ブロク ・アカド・サイ、米国、８２（５５５８〜５５６２）（ＤＳＭ６８２３）。エク ソヌクレアーゼＶの必須第三サブユニット用遺伝子を用いて、ＪＧＰ　１０１を 得た。プラスミドｐＫＢ１５０８を線状化し、シェベル（Ｓｈｅｖｅｌｌ）等、 （１９８８）ジェイ・バクチリオル１７０．３２９４〜３２９６により記載され ているのと実質的に同様の方法でセリンプロトトロフィに対してＪＧＰＩＯＩを 形質転換するのに使用して、ＪＧＰ１０３を得た。次に、５ｅｔＡ１５０８対立 遺伝子を、Ｐｌ形質導入により産生株に移動できる。これについては、ミラー等 、エクスペリメンツ・イン・モル・ジエネティクス、コールド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリ−１第２０１〜２０５頁（１９７２）を参照できる。

過産生代謝物の収穫 セリン関連代謝物の過生産のために、セリン感受性が減少したＰＧＤを産生ずる 細胞を調製し、適当な条件下で、はとんどの場合定常期まで醗酵槽中て成長させ た。次に、細胞を収穫し、溶菌し、標準的な生化学操作により所望の代謝物を調 製した。微生物の成長のための条件、原理及び参考文献並びに特定の代謝物の収 穫は、クルーガ−（Ｃｒｕｅｇｅｒ）及びクルーガー（１９８２）（バイオテク ノロジー　ア・テキストブック・オフ・インダストリアル・ミクロバイオロジー （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｔｅｘｔｂ。

ｏｋ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）並びにバーマ ン（Ｈｅ　ｒ　ｒｍａｎｎ）及びサマービレ（１９８３）（アミノ・アシッズ； バイオシンセシス・アンド・ジエネティック・レギュレーション（Ａｍｉｎｏ　 Ａｃ１ｄｓ二Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｇｕｌ ａｔｉｏｎ）に記載されている。これらに開示されている内容は引用することに より本明細書の内容となる。

第４図 ↓ ＦＩＱ、　２−１ Ｆｉｇ、　２−２ Ｆｉｇ、　２−３ ＦｉＱ、　２−　ｂ Ｆｉｇ、　２−５ 第３図 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８の規定による補正書）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．野生型３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）と比較してセ リンによる阻害に対する感受性が減少したＰＧＤをコードしてなる工学的ＤＮＡ 。 ２．野生型ＰＧＤが、微生物又は酵母ＰＧＤである請求の範囲第１項に記載の工 学的ＤＮＡ。 ３．前記ＤＮＡが、野生型ＰＧＤのＣ−末端２５％に変化を含んでなるＰＧＤを コードしている請求の範囲第１項に記載の工学的ＤＮＡ。 ４．前記ＤＮＡが、野生型ＰＧＤのＣ−末端アミノ酸５０個に変化を含んでなる ＰＧＤをコードしている請求の範囲第３項に記載の工学的ＤＮＡ。 ５．前記ＤＮＡが、野生型ＰＧＤのＣ−末端欠失を含んでなるＰＧＤをコードし ている請求の範囲第３項に記載の工学的ＤＮＡ。 ６．前記Ｃ−末端変性が、野生型ＰＧＤ配列への挿入を含んでなる請求の範囲第 ３項に記載の工学的ＤＮＡ。 ７．前記挿入が、野生型ＰＧＤのＶＡＬ３６３とＡＳＮ３６４との間か、ＡＬＡ ３９２とＧＬＮ３９４との間になされている請求の範囲第６項に記載の工学的Ｄ ＮＡ。 ８．下記のＤＮＡからなる群から選択される請求項１に記載の工学的ＤＮＡ： ｉ）ｓｅｒＡ１４５５ｖｉ）ｓｅｒＡ１５１０ｉｉ）ｓｅｒＡ１４５９ｖｉｉ） ｓｅｒＡ１５１１ｉｉｉ）ｓｅｒＡ１５０７ｖｉｉｉ）ｓｅｒＡ１５１２ｉｖ） ｓｅｒＡ１５０８ｉｘ）ｓｅｒＡ１５３０ｖ）ｓｅｒＡ１５０９ｘ）ｓｅｒＡ１ ５３１９．請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の工学的ＤＮＡによりコ ードされたアミノ酸配列を有する３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ。 １０．請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の工学的ＤＮＡと、宿主発現 系において前記工学的ＤＮＡを発現するように配置し指向した調節ＤＮＡとを含 んでなる発現ベクター。 １１．請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の工学的ＤＮＡと調節ＤＮＡ とを含んでなる細胞であって、前記調節ＤＮＡが前記細胞において前記工学的Ｄ ＮＡを発現するように配置し指向している細胞。 １２．前記細胞が、野生型ｓｅｒＡについて欠失している請求の範囲第１１項に 記載の細胞。 １３．セリン又はセリン由来である所望の生成物の製造方法であって、請求の範 囲第１１項に記載の細胞を培養する工程と、前記所望の生成物を回収する工程と を含んでなる製造方法。 １４．前記生成物がセリンである請求の範囲第１３項に記載の方法。 １５．変化３′端を有するＰＧＤをコードする転写体を産生するように工学的処 理を施した細胞であって、前記転写体を野生型ＰＧＤと比較してセリンによる阻 害に対する感受性が減少したＰＧＤに翻訳することができる細胞。