JPH06511150A - キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス - Google Patents

キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６１、（ｉ）部位特異的突然変異誘発により、４型デング熱ウイルスのゲノムに 突然変異を導入し、 （ｉｉ）前記突然変異を宿す感染性４型デング熱ウイルスを回収し、（ｉｉｉ　 ）回収したウィルスを評価する工程を含むことを特徴とする４型デング熱ウイル スの突然変異を作製する方法。
６２、前記回収されたウィルスは、弱毒化または無毒化の表現型について評価さ れることを特徴とする請求の範囲第６１項に記載の方法。
６３゜疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の無毒性４型デング熱ウイルス と、薬学的に許容可能な担体とを含む、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワ クチン。
６４、前記無毒性４型デング熱ウイルスは、ウィルスゲノムの戦略的領域に突然 変異を加工することにより得られることを特徴とする請求の範囲第６３項に記載 のワクチン。
６５　キメラフラビウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片。
６６　前記キメラＲＮＡは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、お よび３型デング熱ウイルスからなる群から選択されたウィルスの一部を含むこと を特徴とする請求の範囲第６５項に記載の断片。
６７、請求の範囲第６０項に記載の４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、フラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分て置換する工程を含 むことを特徴とするキメラデング熱ウィルスの構築方法。
６８　前記ワラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、 および３型デング熱ウイルスからなる群から選択されることを特徴とする請求の 範囲第６７項に記載の方法。
６９、前記４型デング熱ウイルスは少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴 とする請求の範囲第６７項に記載の方法。
７０、疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の感染性キメラウィルスと、薬 学的に許容可能な担体とを含む、デング熱ウィルスに対するヒト用ワクチン。
７１、前記キメラウィルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、 ３型デング熱ウイルス、および４型デング熱ウイルスからなる群から選択される ことを特徴とする請求の範囲第７０項に記載のワクチン。
７２、（ｉ）請求の範囲第６５項に記載のＤＮＡ断片と、（ｉｉ）ベクターと、 を含む、組換えＤＮＡ構築物。
７３、前記ベクターはプラスミドであることを特徴とする請求の範囲第７２項に 記載の組換えＤＮＡ構築物。
７４　前記ＤＮＡの発現を可能とするように、請求の範囲第７３項による組換え ＤＮＡ構築物で安定的に形質転換された宿主細胞。
７５、前記細胞は原核細胞であることを特徴とする請求の範囲第７４項に記載の 宿主細胞。
７６、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片において、非構造 タンパク質Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳＩのＣ末端における８個のアミノ 酸の１つ又はそれ以上をコード化する配列内に置換突然変異を含むことを特徴と する、ＤＮＡ断片。
７７．４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片において、Ｎ５Ｉ −ＮＳ２Ａの非構造タンパク質の開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グリ シンをコード化する部位に置換を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。
７日　４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片において、前記Ｄ ＮＡ断片は３′非コード領域に欠失を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。
７９、前記欠失の配列の長さはヌクレオチド３０〜２０２個であることを特徴と する請求の範囲第７８項に記載のＤＮＡ断片。
８０、（ｉ）請求の範囲第７６項、第７７項、第７８項、第７９項のいずれかに 記載のＤＮＡ断片と、 （ｉｉ）ベクターと、 を含む、組換えＤＮＡ構築物。
８１、請求の範囲第７６項、第７７項、第７８項、第７９項のいずれかに記載の ＤＮＡ断片の感染性ＲＮＡ転写物。
８２、前記ＤＮＡ断片の発現を可能とするように、請求の範囲第８０項によるＤ ＮＡ構築物で形質転換された宿主細胞。
８３、前記細胞は哺乳類または昆虫の細胞であることを特徴とする請求の範囲第 ８２項に記載の宿主細胞。
８４　前記細胞は哺乳類または昆虫の細胞であることを特徴とする請求の範囲第 ８３項に記載の宿主細胞。
８５　疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の、毒性が低下した突然変異４ 型デング熱ウイルスを含む、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチン。
８６、前記突然変異４型デング熱ウイルスは、ウィルスゲノムの３°非コード領 域内に欠失突然変異を加工することにより得られることを特徴とする請求の範囲 第８５項に記載のワクチン。
８７、前記突然変異４型デング熱ウイルスは、非構造タンパク質ＮＳ　１−ＮＳ 　２Ａの開裂部位のＮＳＩのＣ末端における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上 をコード化するウィルスＤＮＡ配列内に置換突然変異を加工することにより得ら れることを特徴とする請求の範囲第８５項に記載のワクチン。
８８、前記突然変異４型デング熱ウイルスは、Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａの非構造タンパ ク質の開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化するウィル スＤＮＡ部位に置換を加工することにより得られることを特徴とする請求の範囲 第８５項に記載のワクチン。
８９　請求の範囲第５６項に記載の４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、ワラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分て置換する工程を含 むことを特徴とするキメラデング熱ウィルスの構築方法。
９０　前記フラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、 ３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウィルス、およびダニ媒介脳炎ウィルスからな る群から選択されることを特徴とする請求の範囲第８９項に記載の方法。
９１゜請求の範囲第５７項に記載の４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、ワラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその両分で置換する工程を含 むことを特徴とするキメラデング熱ウィルスの構築方法。
９２、前記フラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、 ３型デング熱ウイルス、および日本脳炎ウィルスからなる群から選択されること を特徴とする請求の範囲第９１項に記載の方法。
９３、請求の範囲第５８項に記載の４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、フラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその両分で置換する工程を含 むことを特徴とするキメラデング熱ウィルスの構築方法。
９４、前記ワラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウィルス、 ３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウィルス、およびダニ媒介脳炎ウィルスからな る群から選択されることを特徴とする請求の範囲第９３項に記載の方法。
９５、疾病に対する免疫を誘導するのに十分な量投与される、デング熱つィルス に対するワクチンにおいて、前記ワクチンは、毒性が低下したキメラウィルスか らなり、前記キメラウィルスは、３゛非コード領域に欠失を含む４型デング熱ウ イルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片を含むことを特徴とするワクチン。
９６、前記キメラウィルスは、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウィルス、 および４型デング熱ウイルスからなる群から選択されることを特徴とする請求の 範囲第９５項に記載のワクチン。
明細書 キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス挟術分野 本発明は、組換え活性キメラフラビウイルスに関し、さらに、デング熱ウィルス と、ダニ媒介脳炎ウィルス（Ｔ　Ｂ　Ｅ　Ｖ）を含むその他のワラビウイルスに 対するワクチンに関する。本発明は、さらに、組換え４型デング熱ウイルスの生 成を導くようにＲＮＡ転写物をコードするｃＤＮＡ配列と、組換え突然変異４型 デング熱ウイルスキメラデング熱ウイルスと、組換えＤＮＡ断片を作製して突然 変異を組み込んだキメラデング熱ウィルスと、それらを用いて形質転換した細胞 に関する。
茸景挟術 ワラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）には、約６０個の包被正鎖ＲＮ Ａウィルスが含まれ、その大半は昆虫により媒介される。この科に属する多数の ウィルスは、世界各地で重大な公衆衛生上の問題を起こしている（Ｔ、Ｐ、　Ｍ ｏｎ　ａ　ｔ　ｈ（１９８６）ｒトガウィルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）お よびフラビウイルス科ＪＳ。
Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ他編、３７５〜４４０頁、プレナム・プレス社、ニュー ヨーク）。これまでに配列決定されたすべてのフラビウイルスのゲノムは、同一 の遺伝子順序を有している。すなわち、５’　−Ｃ−ｐ　ｒ　ｅＭ−Ｅ−ＮＳ　 １−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５−３’であり、 最初の３つの遺伝子は、構造タンパク質であるカプシド（Ｃ）と、プレメンブレ ンタンパク質（ｐｒｅＭ）と、エンベロープタンパク質（Ｅ）をコードしている 。
デング熱は、蚊媒介ウィルス性疾病であり、世界各地の熱帯および亜熱帯地域で 発生する。デング熱ウィルス亜群［ｓｕｂｇｒｏｕｐ］は、ワラビウイルス科の 他のウィルスのどれよりもヒト疾病を起こす。デング熱は、発熱、発疹、激しい 頭痛、関節痛を特徴としている。その死亡率は低い。しかしながら、過去数十年 間にわたり、出血およびショックを特徴とする、より重症のデング熱（デング出 血熱／デング熱ショック症候群、ＤＨＦ／ＤＳＳ）が、子供および若者に増加し ている。ＤＨＦ／ＤＳＳは、ある血清型［５ｅｒｏｔｙｐｅ］のデング熱ウィル スにすでに感染した者が別のデング熱ウィルスに感染した際に、もっとも頻繁に 発生する。このことは、ウィルス複製の免疫強化が、より重症の疾病の病因にお いである役割を果たしていることを示唆している（Ｓ、Ｂ、Ｈａｌｓｔｅａｄ（ １９８８）サイエンス第２３９巻４７６〜４８１頁）。
デング熱伝染は、媒介となる蚊種が豊富な熱帯および亜熱帯の多（の地域におい て、大きな公衆衛生問題となっている。４０年間もの熱心な研究にもががゎらず 、デング熱ウィルス疾病のための安全で有効なワクチンはできていない。デング 熱ウィルスは、ＷＨＯにより、研究促進およびワクチン開発の高優先度目標とし て指定された。
デング熱ウィルスは、１９４４年における単離の後まもなく、マウスの脳におい て繰り返し継代培養［ｐａｓｓａｇｅ］され、その結果、マウス神経毒性［ｎｅ ｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｔ］突然変異体が選抜された（Ａ、Ｂ、Ｓａｂｉｎ（１９ ５２）Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、第１巻３０〜５ｏ頁）。
興味深いことに、被験希望者において実施された研究により、１型または２型デ ング熱ウイルスの３つの株のマウス脳適合神経毒性突然変異体は弱毒化されては いるが、なお、ヒトについて免疫原性をもっことが示された（Ａ、　Ｂ、５ａｂ ｉｎ　（１９５２）Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、第１巻３０〜５ ｏ頁、Ａ、　Ｂ、　Ｓａｂ　ｉｎ　（１９５５）　Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｔｒｏｐ 、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、第４巻１９８〜２０７頁、Ａ、Ｂ、５ａｂｉｎ　（１９ ５５）Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｔｒ。
ｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、第４巻１９８〜２０７頁、Ｒ，Ｗ、　Ｓｃｈ　ｌ　ｅ　ｓ 　ｉ　ｎｇｅｒ他（１９５６）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　第７７巻３５２〜３６４頁 、Ｃ，Ｌ、　Ｗｉｓｓｅｍａｎ他（１９６３）Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ 、第１２巻６２０〜６２３頁）。しかしながら、これらの突然変異体は、ワクチ ン株候補としてはそれ以上開発されなかった。これは、ワクチン製剤中のマウス 脳抗原に対する懸念の故である。このとき以来、（ｉ）小型プラーク（溶菌斑） 表現型を示した、および／または（ｉｉ）温度感受性であった、および／または （ｉｉｉ　）人工的な宿主から由来する細胞培養に適合した（すなわち宿主域突 然変異）ウィルス突然変異が、弱毒化生菌ウィルスワクチンに包含させるための 候補として選抜され評価されてきた（Ｖ、Ｒ，Ｈａ　ｒ　ｒ　ｉ　ｓｏｎ他（１ ９７７）Ｉｎｆｅｃ、Ｉｍｍｕｎ。
第１８巻１’５１〜１５６頁；Ｃ，Ｈ，Ｈｏｋｅ他（１９９０）Ａｍ、Ｊ、Ｔｒ 。
ｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ　第４３巻２１９〜２２６頁；Ｎ、Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖ ａｔｉ他（１９８７）Ｂｕ　Ｉ　１．ＷＨＯ第６５巻１８９〜１９５頁）。しか しながら、２５年間のこのような努力にもかかわらず、安全で効果的なデング熱 ワクチンは、一般用としてはまだ得られていない。不活化全デング熱ウィルスワ クチンは、免疫原性が不十分であることが証明されている。細胞培養において連 続継代培養により弱毒化された生菌ウィルスワクチンは、弱毒化による遺伝子的 不安定性や免疫原性の欠乏という難点がある。本発明は、キメラデング熱ウィル スおよびキメラフラビウイルスワクチンを提供することにより、技術的発展をも たらすものである。
４つの血清型のデング熱ウィルス（１型〜４型）は、血清型特異的モノクローナ ル抗体を用いたプラーク減縮中和法により、および、ポリクローナル血清を用い たやや特異性の低い試験により区別することができる（Ｗ、　Ｍ、　Ｂａｎｋｃ 　ｒｏｆｔ他（１９７９）Ｐａｎ　Ａｍ、Ｈｌｔｈ、Ｏｒｇ、Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ 、第３７５巻１７５〜１７８頁；Ｅ、Ａ、Ｈｅｎｃｈａｌ他（１９８２）Ａｍ、 Ｊ。
Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、第３１巻５４８〜５５５頁）。血清型の存在は、ヒ ト被験希望者における初期の研究において最初に発見され、１つの血清型のデン グ熱に感染すると耐久性のある同型免疫が誘導されるものの異型免疫は３〜５ケ 月しか持続しないことが証明された（Ａ、Ｂ、５ａｂｉｎ　（１９５２）Ａｍｅ ｒ。
Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、第１巻３０〜５０頁）。デング熱つィルス一般 に対して広範囲の免疫を誘導するために４つの血清型すべてを含む効果的なデン グ熱ワクチンがあれば、ＤＨＦ／ＤＳＳの発生を妨害することができるだろう。
３型および４型デング熱ウイルスおよびマウス神経毒性ニューギニアＣ型を含む ２型ウイルスの数株については、完全なヌクレオチド配列が決定されている。
しかしながら、１型ウイルスゲノムについては、５゛部分だけが配列決定されて いるにすぎない（Ｅ、　Ｍａ　ｃ　ｋ　ｏｗ他（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第 １５９巻２１７〜２２８頁：Ｂ、Ｚｈａｏ他（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１ ５５巻７７〜８８頁；に、ＯｓａｔｏｍｉおよびＨ，Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ　（１ ９９０）ｖｉｒｏＩｏｇｙ第１７６巻６４３〜６４７頁；Ａ、Ｉｒ１ｅ他（１９ ８９）Ｇｅｎｅ第７５巻１９７〜２１１頁；　Ｐ、　Ｗ、　Ｍａ　ｓ　ｏｎ他（ １９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇ）’第１６１巻２６２〜２６７頁；Ｙ、Ｓ、Ｈａｈｎ 他（１９８８）Ｖｉｒｏ１ｏｇＹ第１６２巻１６７〜１８０頁）。これらの研究 の成果は、デング熱ウィルスの４つの血清型が共通のゲノム構成をもつことを示 している。４型デング熱のカリブ株８１４６６９のゲノムは１０６４６個のヌク レオチドを含むことがわかっている（Ｅ、Ｍａｃｋｏｗ他（１９８７）Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁；Ｂ、Ｚｈａｏ他（１９８６）Ｖｉ　ｒｏ ｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁）。５°末端における最初の１０１個のヌクレ オチドおよび３゛末端における最後の３８４個はコードしていない。残りの配列 は、３３８６個のアミノ酸ポリタンパク質をコードしており、これには、３つの 構造タンパク質、すなわち、カプシド（Ｃ）、プレメンブレン（ｐｒｅ−Ｍ）、 エンベロープ（Ｅ）がそのＮ末端に含まれ、７個の非構造タンパク質が上述した 順序で続いている。
これは、これまでに識別されたすべてのフラビウイルスゲノムに共通している。
ポリタンパク質は、細胞信号ペプチダーゼにより、および、ウィルスプロテアー ゼにより、１１個以上のウィルスタンパク質を生じるようにプロセス（Ｌ。
Ｍａｒｋｏｆｆ　（１９８９）Ｊ、Ｖｉ　ｒｏｌ、第６３巻３３４５〜３３５２ 頁；ｆ３．Ｆａ１ｇｏｕｔ他（１９８９）Ｊ、Ｖｉ　ｒｏｌ、第６３巻１８５２ 〜１８６０頁；Ｂ、Ｆａ１ｇｏｕｔ他（１９９１）Ｊ、Ｖｉ　ｒｏｔ、第６５巻 ２４６７〜２４７６頁；比ＨｏｒｉおよびＣ０Ｊ、Ｌａｉ　（１９９０）Ｊ、Ｖ ｉｒｏｌ。
第６４巻４５７３〜４５７７頁）。
我々はすでに、感染性ＲＮＡの転写のための鋳型として用いることのできる完全 長デング熱ウィルスｃＤＮＡを構築した。我々は、安定的にクローンされた完全 長デング熱ウィルスｃＤＮＡを得、ＤＮＡ鋳型から派生した（インビトロ）試験 管内ＲＮＡ転写物が培養中の細胞に対して感染性をもつことがわかった。しかし ながら、この感染性構築物と、そこから生成された感染性ＲＮＡ転写物は病原性 である。さらに、これまでに生成された弱毒化デング熱ウィルスは遺伝学的に不 安定で、時間がたつと病原性形態に逆戻りする可能性を有している。それでも、 弱毒化ウィルスは望ましい。その理由は、弱毒化ウィルスにより長期間持続する 免疫が得られることが一般に知られているからである。したがって、この構築物 またはキメラ構築物を病原性の低いウィルスの産生を導くように改変すれば、弱 毒化フラビウイルスワクチン技術において相当の進歩となるだろう。したがって 、我々は、ここに開示するとおり、ｃＤＮＡの３′非コード領域において一連の 欠失を構築し、活性デング熱ウィルス突然変異体を回収して増殖特性を分析した 。
フラビウイルス科のその他のウィルスもやはり病原性である。その例としては、 ダニ媒介脳炎ウィルスおよび日本脳炎ウィルスがあげられる。弱毒化デング熱ウ ィルスワクチンのように、弱毒化ダニ媒介脳炎ウィルス（ＴＢＥＶ）ウィルスは 、遺伝学的に不安定で免疫性に乏しい傾向があった。したがって、他の弱毒化フ ラビウイルスワクチンも、技術におけるかなりの前進となるであろう。すなわち 、本発明は、さらに、他のフラビウイルスに対するワクチン製造のための遺伝子 操作およびキメラウ・イルス開発のフレームワークとして、デング熱ウィルスや 別のフラビウイルスの改変完全長組換えｃＤＮＡ構築物を採用する。
ダニ媒介脳炎ウィルス（Ｔ　Ｂ　Ｅ　Ｖ）は、ダニによってのみ媒介され、血清 学的に区別できる２つのサブタイプに分類される。ロシアのシベリア地方と極東 地方に優勢な東部サブタイプ（プロトタイプ株５ｏｆｊｉｎ）と、ヨーロッパ東 部および中央部に見られる西部サブタイプ（プロトタイプ株Ｎｅｕｄｏｒｆ　Ｉ ）である。ＴＢＥＶは、死亡率が１〜３０％の重い脳炎を引き起こす。ＴＢＥＶ の詳細についてはＣａ１ｉｓｈｅｒ他（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、第７０巻３７ 〜４３頁）を参照されたい。現在、ＴＲＥＶのホルマリン不活化により製造され た試験的ＴＢＥワクチンが入手できるが、このワクチンはい（つかの制約を有し ている。
たとえば、このワクチンの免疫原性は十分ではないため、防御免疫反応を生じさ せるためには繰返し接種が必要である。ワクチンに対する抗体反応があった場合 でも、このワクチンは、個体群の２０％において、ウィルスに対する防御反応を 提供することができない。したがって、より改良されたＴＢＥＶワクチンが必要 とされている。
あり男Ｑ＠要 一−ｇ様においＣ１率発明は、少なくとも２つのワラビウィルスから出来した核 酸を含む、組換えｉ）　Ｎ　Ａ構築物を提供ｔ　６　ｏごの構築物は、ダニ媒介 脳炎ウィルス、ｃｒｘ＊Ｅｖ＞からの２つ以−ｒの構造タンパク質を作動可能（ ｏｐｅｒａｊｉｌｙ）にコード化する核酸領域を含む。この領域は、ｉ”ＢＥＶ 以外のフラビウィルスからの構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域 （ご結合する。好ましくは、この構築物は、ダニ媒介脳炎つ・イルスからの２つ 以下の構造タンパク質を作動−１能にコード化する核酸領域に結合する、フラビ ウィルスカプシドタンパク質を作動可能にコード化する核酸領域を含む。カプシ ドタンパク質および非構造タンパク質を」−ド化する核酸領域は、好ましくは、 ４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウィルス由来のものである。好ましい形態 において、この構築物は、少なくとも２つのワラビウイルスに由来する核酸内に 、少なくとも１つの突然変異を含む。
この好ましい形態の一実施例において、突然変異は、ＮＳＩ　（１）タンパク質 グリコジル化を排除する。この形態の別の実施例において、突然変異は、成熟フ ラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害する。突然変異がウィルス増殖 速度に影響することが好ましい。さらに、本発明は、これらの組換えＤＮＡ構築 物に対応するＲＮＡ転写物を含む。
本発明の別の態様において、ワラビウイルス由来のゲノムを有するキメラウィル スが得られる。このギメラウーイルスは、ダニ媒介脳炎ウィルスからの２つ以下 の構造タンパク質をコード化する核酸領域と、別のワラビウィルスからの非構造 タンパク質をコード化する核酸領域とを含む。好ましくは、このウィルスは、他 のワラビウィルスからのカプシドタンパク質をコード化する核酸領域を含む。ダ ニ媒介脳炎ウィルスからの核酸は、プレメンブレンおよび／またはエンベロープ タンパク質など、多数のタンパク質のどれでもコード化することができる。別の ７ラビウイルスからの構造タンパク質をコード化する核酸は、好ましくは、４型 デング熱ウイルスなどのデング熱ウィルスである。一実施例において、本発明の 本態様のキメラウィルスは、核酸内に少なくとも１つの突然変異を含む。この突 然変異は、ＮＳＩ　（１）タンパク質グリコジル化を排除する突然変異や、成熟 フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害する突然変異など、多数の形 態のいずれをとってもよい。突然変異がウィルス増殖速度に影響することが好ま しい。
本発明の別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウィルスのプレメンブレンおよび工２ ／ベローブタンバク質をコード化する核酸領域と、別のワラビウィルスがらのカ プシドタンパク質をコード化する核酸領域と、同じワラビウィルスがらの非構造 タンパク質をコード化する核酸領域とを含むキメラウィルスが得られる。フラビ ウイルスは、たとえば、４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウィルスである。
本発明の本態様において、好ましい形態のキメラウィルスは、ダニ媒介脳炎ウィ ルスのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質をコード化する核酸領域内 に少なくとも１つの突然変異を含む。突然変異は、成熟フラビウイルスメンプレ ンタンパク質の産生を妨害するものを用いることができる。別の好ましい形態に おいて、キメラウィルスは、フラビウイルスからの核酸領域内に少なくとも１つ の突然変異を含む。この突然変異は、ＮＳＩ　（１）タンパク質グリコジル化を 排除するものを用いることができる。
さらに別の態様において、本発明によれば、を推動物において防御免疫反応を生 起することのできる、本発明のキメラウィルスからなるダニ媒介脳炎に対するヒ ト用ワクチンが得られる。すなわち、本発明は、さらに、フラビウイルスに対す るヒト用ワクチンを製造する方法を含む。この方法は、ワラビウイルスからのプ レメンブレンおよびエンベロープタンパク質と、デング熱ウィルスからのカプシ ドおよび非構造タンパク質とをコード化することのできるＤＮＡ構築物を作製し 、］−記ＤＮＡ構築物から感染性ＲＮＡ転写物を生成し、上記ＲＮＡ転写物を細 胞に導入し、上記細胞内でＲＮＡ転写物を発現させ、上記細胞からウィルスを収 穫し、上記ウィルスをを推動物において試験し、上記ウィルスをヒトに接種する ことを含む。
本発明の好ましい態様によれば、日本脳炎ウィルスのプレメンブレンおよびエン ベロープタンパク質をコード化する核酸領域と、別のワラビウイルスからのカプ シドタンパク質をコード化する核酸領域と、デング熱ウィルスなどの、同じフラ ビウイルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むキメラウィ ルスが得られる。
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡゲノムを有するキメラウィルスが得られる。
このゲノムは、４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質を作動可能（ｏｐｅｒ ａｔｉｖｅｌｙ）にコード化する核酸領域と、１型デング熱ウイルス、２型デン グ熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、［］本脳炎ウィルス、 ダニ媒介脳炎ウィルス、または別のワラビウイルスの構造タンパク質を作動可能 にコード化する核酸領域とを含む。本発明の一実施例において、キメラウィルス のゲノムは、４型デング熱ウイルス構造タンパク質を作動可能にコード化する核 酸を実質的にもっていない。このキメラ１フイルスの好ましい実施例は、ｐ２Ａ （ＤＩＷＰ）またはｐ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）ＲＮＡを含む。好ましくは、キメラ ウィルスは、１型デング熱ウーイルス、２型デング熱ウイルス、または３型デ゛ ／グ熱ウイルスの非構造タンパク質をコード化する。−とのできる核酸領域と、 Ｊ型デング熱ウィルス、２型デング熱つ、イルス、３型デング熱ウイルス、４型 デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、８本脳炎つ・イルス、ダニ媒介脳炎ウィル ス、または別のフラビウイルスの構造タンパク質をコード化することのできる核 酸領域とを含む。非構造タンパク質を作動【可能にコード化することのできる核 酸は、好ましくは、非構造タンパク質を作動可能にコード化することのできる核 酸の領域とは異なるウィルス由来のものである。
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡゲ２ツムを有するキメラウィルスが得られる 。
このゲノムは、黄熱病ウィルス、［］本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、 または別のワラビウイルスの非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領 域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、 ４型デング執ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィ ルス、または別のワラビウイルスの構造タンパク質を作動可能にコード化する核 酸領域とを含む。構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸の領域は、好ま しくは、非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸の領域とは異なるウィ ルス由来のものである。
本発明のさらに別の態様によれば、を推動物においてウィルスに対する防御免疫 反応を生起することのできるワクチンが得られる。このワクチンは、安全でかつ 免疫学的に有効な量の本発明のウィルスのいずれがと、薬学的および免疫学的に 受容可能な担体とを含んでいる。
本発明のさらに別の態様によれば、を推動物においてウィルスに対する防御免疫 反応を生起することのできる別のワクチンが得られる。本発明の本態様において 、このワクチンは、以下のウィルスの安全でかつ免疫学的に有効な量を含む。
ａ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコード化する核酸領域と、１型 デング熱ウイルスの構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むゲノムをも つキメラウィルス、ｂ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコード化す る核酸領域と、２型デング熱ウイルスの構造タンパク質をコード化する核酸領域 とを含むゲノムをもっキメラウィルス、ｃ）４型デング熱ウイルスの非構造タン パク質をコード化する核酸領域と、３型デング熱ウイルスの構造タンパク質をコ ード化する核酸領域とを含むゲノムをもっキメラウィルス、ｄ）弱毒化４型デン グ熱ウイルス。
本発明のさらなる態様によれば、４型デング熱ウイルスの非構造領域と、１型デ ング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウィル ス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、および別のフラビウィルスのう ちの１つからの構造領域とを含むＤＮＡセグメントが得られる。本発明の好まし い実施例において、ＤＮＡセグメントは、構造および非構造領域に作動可能に結 合するプロモーターを含む。別の好ましい実施例において、ＤＮＡセグメントは 、プロモーターとしてＳＦ３またはＴ７プロモーターを含む。さらに別の実施例 において、ＤＮＡセグメントはｐ２Ａ　（ＤＩＷＰ）またはｐ２Ａ　（Ｄ２ＮＧ Ｃ）である。
本発明の他のいくつかの態様によれば、他のキメラＤＮＡセグメントが得られる 。本発明のこれらの態様によるＤＮＡセグメントは、１型デング熱ウイルス、２ 型デング熱ウイルス、または３型デング熱ウイルスの非構造領域を含んでいる。
これらのＤＮＡセグメントは、さらに、以下のウィルスのうちの１つからの構造 領域を含んている。１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング 熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、ダニ 媒介脳炎ウィルス、ワラビウイルス。ただし、構造領域と非構造領域は同一ウイ ルス由来ではないことを条件とする。
本発明のさらなる態様によれば、ＤＮＡセグメントは、黄熱病ウィルス、日本脳 炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、および別のフラビウィルスのうちの１つか らの非構造領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、４型デング 熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、およ び別のワラビウィルスのうちの１つからの構造領域とを含み、構造領域は非構造 領域とは異なるウィルス由来である。
本発明の別の態様によれば、ワラビウィルスの非構造領域またはその一部、およ び別のフラビウィルスの構造領域またはその一部からなるＤＮＡセグメントが得 られる。
本発明のさらに別の態様によれば、を推動物においてウィルスに対する防御免疫 反応を生起することのできるワクチンが得られる。このワクチンは、安全かつ免 疫学的に有効な量のキメラウィルスを含む。このウィルスのゲノムは、ダニ媒介 脳炎ウィルスからの構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸と、デング熱 ウィルスからの非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸とを含む。
本発明のさらに別の態様によれば、別のキメラウィルスが得られる。この態様に おいて、キメラウィルスは、ダニ媒介脳炎ウィルス構造タンパク質および４型デ ング熱ウイルス非構造タンパク質とを作動可能にコード化するウィルスのゲノム をもつ。好ましい実施例において、ウィルスの構造タンパク質はダニ媒介脳炎ウ ィルス由来のものである。
本発明のさらに別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウィルス構造タンパク質および ４型デング熱ウイルス非構造タンパク質を作動可能にコード化するＤＮＡセグメ ントが得られる。
本発明のさらなる態様によれば、感染性４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化 する、分離されたＤＮＡ断片が得られる。本発明のさらに別の態様によれば、本 発明のＤＮＡ断片とベクターからなる組換えＤＮＡ構築物が得られる。好ましい 実施例において、ベクターはプラスミドである。本発明のさらなる態様によれば 、ＤＮＡ断片の発現を可能とするようにして本発明の組換えＤＮＡ構築物で安定 的に形質転換された宿主細胞が得られる。好ましい実施例において、宿主細胞は 原核細胞である。
本発明の別の態様によれば、４型デング熱ウイルスの突然変異を作製する方法が 得られる。この方法は、（１）部位特異的突然変異誘発により４型デング熱ウイ ルスのゲノムに突然変異を導入し、（ｉｉ）突然変異を有する感染性４型デング 熱ウイルスを回収し、（ｉｉｉ　）回収したウィルスを評価するステップを含む 。本方法の一実施例において、回収されたウィルスは、弱毒化または無毒性の表 現型について評価される。
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチ ンが得られる。このワクチンは、疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の無 毒性４型デング熱ウイルスと、薬学的に受容可能な担体とを含む。好ましい実施 例において、無毒性４型デング熱ウイルスは、ウィルスゲノム内の重要な領域に おいて突然変異を加工することにより得られる。
本発明のさらに別の態様によれば、キメラフラビウィルスＲＮＡをコード化する ＤＮＡ断片が得られる。キメラＲＮＡは、たとえば、１型デング熱ウイルス、２ 型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルスからなる群から選択されたウィルス を含んでいる。
本発明のさらに別の態様によれば、キメラデング熱ウィルスの構築のための方法 が得られる。この方法は、本発明の方法により得られた４型デング熱ウイルスＤ ＮＡのＤＮＡ断片を、フラビウイルスからの、対応する遺伝子全体またはその画 分［ｆ　ｒａｃｔ　ｉｏｎ］で置換することを含んでいる。好ましい実施例にお いて、ワラビウイルスは以下のウィルスの１つである。１型デング熱ウイルス、 ２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス。別の好ましい実施例において、 ４型デング熱ウイルスは少な（とも１つの突然変異を含む。
本発明は、デング熱ウィルスに対するヒト用ワクチンを提供する別の態様を含む 。本態様において、本発明は、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量の感染 性キメラウィルスと、薬学的に受容可能な担体とを含む。キメラウィルスは、た とえば、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス 、あるいは４型デング熱ウイルスである。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片と、ベクターからなる組 換えＤＮＡ構築物が得られる。１つの好ましい実施例において、ベクターはプラ スミドである。本発明のさらに別の態様によれば、ＤＮＡの発現を可能とするよ うにして、本発明の方法により得られた組換えＤＮＡ構築物で安定的に形質転換 された宿主細胞が得られる。好ましい実施例において、宿主細胞は原核細胞であ る。
本発明のさらに別の態様によれば、非構造タンパク質Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａの開裂部 位のＮＳＩのＣ末端における８個のアミノ酸のうちの１つ又はそれ以上をコード 化する配列内に置換突然変異を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化す るＤＮＡ断片が得られる。
本発明のさらなる態様によれば、非構造タンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａの開裂部位 のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部位に置換を含む、４ 型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片が得られる。
本発明のさらなる態様によれば、３゛側非コード領域内に欠失を含む、４型デン グ熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片が得られる。好ましい実施例にお いて、欠失は、ヌクレオチド３０〜２０２個分の長さをもつ。
本発明の別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片のいずれかとベクターとを含む 組換えＤＮＡ構築物が得られる。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤ ＮＡ断片の感染性ＲＮＡ転写物が得られる。本発明のさらなる態様によれば、Ｄ ＮＡ断片の発現を可能とするようにして、本発明のＤＮＡ構築物でトランスフェ クションされた宿主細胞が得られる。このような宿主細胞には哺乳類または昆虫 の細胞を用いることができる。
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチ ンが得られる。本発明の本態様において、このワクチンは、疾病に対して免疫を 誘発するのに十分な量の、毒性低減化突然変異４型デング熱ウイルスを含む。
好ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウイルスは、ウィルスゲノムに おける３゛側非コード領域内に欠失突然変異を加工することにより得られる。別 の好ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウイルスは、非構造タンパク 質Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳＩのＣ末端における８個のアミノ酸のうち の１つ又はそれ以上をコード化するウィルスＤＮＡ配列内に置換突然変異を加工 することにより得られる。さらに別の好ましい実施例において、突然変異４型デ ング熱ウイルスは、非構造タンパク質Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａの開裂部位のっぎの＋１ 位置の部位である、グリシンをコード化するウィルスＤＮＡ部位に置換を加工す ることにより得られる。
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、フラビウィルスからの対応する遺伝子全体またはその画分て置換することを含 む、キメラデング熱ウィルスの構築方法が得られる。好ましい実施例において、 ワラビウィルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング 熱ウイルス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルスの１つである。別の好ま しい実施例において、キメラデング熱ウィルスの構築方法は、本発明にょる４型 デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、フラビウィルスからの対応する遺伝子 全体またはその両分で置換することを含む。好ましくは、ワラビウィルスは、１ 型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、日本脳炎 ウィルスからなる群から選択される。さらに好ましくは、キメラデング熱ウィル スの構築方法は、本発明による４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、フ ラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分て置換することを含む。
好ましい方法において、フラビウィルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング 熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス からなる群から選択される。
本発明のさらに１つの態様によれば、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量 を投与される、デング熱ウィルスに対するワクチンが得られる。このワクチンは 、毒性が低減したキメラウィルスを含み、上記キメラウィルスは、３゛側非コー ド領域に欠失を含む４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片を含 む。好ましい実施例において、キメラウィルスは２型デング熱ウイルス、３型デ ング熱ウイルス、４型デング熱ウイルスからなる群から選択される。
本発明のさらなる態様は、以下の発明の詳細な説明を参照することにより、当業 者にとって明らかになるであろう。
区回Φ説叫 図１は、キメラデング熱ウィルスの作製に用いられる完全長デング熱ウィルスｃ ＤＮＡの構造を示す。
図２は、ＲＮＡ転写物を用いたトランスフェクション後の、ウィルス感染細胞の パーセンテージとウィルスの力価［ｔ　ｉｔ　ｅ　ｒｌを示す。
図３は、キメラデング熱ウィルスの血清型分析を示す。
図４は、親またはキメラのデング熱ウィルスにより生成された１型、２型、また は４型ウイルスタンパク質のポリアクリルアミドゲル分析を示す。
図５は、ＬＬＣＭＫｚ細胞上のウィルスプラークの形態観察を示す。
図６は、親２型ＮＧＣまたは４型デング熱ウイルスまたは２型／４型キメラウイ ルスのマウス神経毒性を示す。
図７は、感染性ＲＮＡの転写に用いられるクローン化された完全長デング熱ウィ ルスｃＤＮＡの末端配列を示す。
合計１０６４６個のヌクレオチドの長さをもつ完全長デング熱ウィルスｃＤＮＡ は、図示のように、ＳＰ６ボリメラーゼのためのプロモーター配列および唯一の Ａｓｐ７１８開裂部位に隣接してクローン化される。ここで、１０４４８および １０４４９の間の位置に付加Ｃ残基が、１０４７０および１０４７１の間に付加 Ｇ残基が存在する。これらはもとの４型デング熱つィルス配列にはなかったもの である。ＲＮＡ転写物の予測５゛末端および３′末端の近くの配列も示されてい る。転写開始のＧは、太字体で示される３゛デング配の前に配置されていた。
Ａｓｐ７１８開裂配列ＧＧＴＡＣＣは、太字体で示される３゛デング配の直後に 位置していた。
図８は、完全長デングｃＤＮＡクローンおよび制限エンドヌクレアーゼ消化パタ ーンを示す。
図には、５°端にＳＰ６プロモーター、３′端にＡｓｐ７１８開裂部位を含む完 全長デングｃＤＮＡクローンが示されている。ヌクレオチド５ｏ６９のＢＳｔＢ １開裂部位により、デングゲノムは５°および３゛断片に分離される。完全長ク ローンＩＡの断片を、対応する５゛−２，３−Ｂ１または３“　−Ｃ断片で置換 することにより、図示されている他の完全長の組合せが得られる。
図９は、Ｂｇ　ＩＩＩ、　Ｎｓ　ｉ　Ｉ、およびＡｓｐ７１８で消化された完全 長デングｃＤＮＡクローンの制限エンドヌクレアーゼパターンを示し、消化物は アガロースゲル上での分離により分析された。Ｍは、キロ塩基対の分子サイズマ ーカーとしてのλＨｉ　ｎ　ｄｌｌｌ　ＤＮＡ断片を示す。
図１０は、感染ＲＮＡから回収されたデング熱ウィルスが鋳型ＤＮＡのゲノム配 列を含むことの実例を示す。
子孫デング熱ウィルスは、クローン２ＡＤＮＡ　（野生型対照（コントロール） ）から、または、デング配列のヌクレオチド３４７３のＰｓｔＩ部位を含むクロ ーン２Ａ　（Ｐ）ＤＮＡから転写されたＲＮＡでトランスフェクションしたＬＬ Ｃ−ＭＫ２細胞から回収された。回収されたウィルスから抽出されたゲノムＲＮ Ａは、逆転写に用いられ、ｃＤＮＡ産物は、適当なプライマーを用いたＰＣＲに より１３４ａｂｐのＤＮＡ断片（ヌクレオチド３１９３〜４５３６）を製造する ための鋳型として用いられた。ＰＣＲ産物のＰｓｔＩ消化が図示されている。レ ーンＭは、サイズマーカーとしての１２３のＤＮＡラダーを示す。
図１１は、回収されたウィルスおよび親ウィルスに感染した細胞からのデング熱 つィルスタンパク質の比較を示す。
回収されたデング熱ウィルスまたは親好生型ウィルスに感染したＬＬＣ−ＭＫ　 ２細胞からの溶解物［ライゼート（ｌｙｓａｔｅｓ）　］を％％ｃ３．メチオニ ンで標識したものを用意し、デング高度免疫マウス腹水を用いた免疫沈降を行な った。沈殿物は、５ＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分 離された。図示のゲルレーンは、下記のものに感染した細胞からの溶解物を含ん でいる。（１）親デング熱ウィルス、（２）クローン２ＡＤＮＡから回収された デング熱ウィルス、（３）クローン２Ａ　（Ｐ）ＤＮＡから回収されたデング熱 ウィルス。レーン４はダミ　［ｍｏｃｋ］感染細胞溶解物からのものである。レ ーンＭは、左側に示したキロダルトンのタンパク質サイズマーカーを含む。Ｐｒ ｅＭ、Ｅ、ＮＳ。
ＮＳ３を含むデング熱つィルスタンパク質に対応する標識バンドが図示されてい る。その他の標識バンドの特定はしなかった。
図１２は、野生型４型デング熱ウイルスと、それに由来するアミノ酸置換突然変 異体Ｄ４　（ＤＮ２Ｂ　Ｅ）のプラーク形態観察を示す。
７６ｃｍ’ビンに入れた集密な（コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な）蚊 Ｃ６／３６細胞をデング熱ウィルスに感染させ、次に、アガロースのオーバーレ イを加えた。
感染の６日後、ニュートラルレッドを用いて細胞を染色した。翌日、プラークサ イズを測定した。１０個の別々のプラークから、野生型４型デング熱ウイルスお よび置換突然変異体の平均プラークサイズを算出した。図示の突然変異ウィルス は、４型デングボリペプチド配列の１１２６位置に、Ｇｌｙ（Ｇ）を置換したＧ Ｉｕ（Ｅ）を含んでいた。この位置は、Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａ開裂配列の＋１位置に 対応する。
図１３は、３゛非コ一ド配列中に欠失を含む４型デング熱ウイルス突然変異のゲ ノム構造と特性を示す。
図示の線形マツプは、４型デング熱ウイルスのヌクレオチド３８４個の３゛非コ 一ド配列を示す。この領域には、少なくとも３つの配列要素が示されている。
塗り潰した四角形で示したのは、ｎｔ２３４からｎｔ２１１、および、ｎｔ１４ ３からｎｔ１２０の保存配列２　（ＣＳ−２）である。白抜きの四角形で示した のは、ｎｔ１０５からｎｔ８２の保存配列１　（Ｃ３−１）であり、最後の８４ 個のヌクレオチド内にはステム・アンド・ループ構造がある。各々特定の位置に 長さ３０〜２０２個のヌクレオチドの欠失突然変異を含む、７個のｃＤＮＡクロ ーンが構築され、これから誘導されたＲＮＡ転写物を用いて、受容（ｐｅｒｍｉ ｓｓｉｖｅ）Ｌ　Ｌ　Ｃ−ＭＫｚ細胞のトランスフェクションを行なった。Ｃ３ −１配列を全く欠いた突然変異Ｄ４（Δ３’　、１７２〜８３）ｃＤＮＡは致死 突然変異のようである。
というのは、活性ウィルスが試行を繰返しても検出されなかったからである。活 性欠失突然変異体は、残り６個のＲＮＡ転写物から回収された。感染の６日後、 野生型ウィルスとこれから誘導された欠失突然変異体の増殖特性を、染色したＬ 　Ｌ　Ｃ−ＭＫｔ細胞単層上のプラーク検定により比較した。同一条件のもとで 、野生型ウィルスは約０．３ｃｍの大きさのプラークを示した。逆番号付与シス テム（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、４型デ ング熱ウイルスのヌクレオチド位置を割り当てた。１０６４６の最後のヌクレオ チドには、この番号付与システムを用いてｎｔｌが割り当てられた。
図１４は、野生型デング熱ウィルス、および、これから誘導された、３゛非コー ド領域に欠失を含む突然変異体のプラーク形態観察を示す。
プラーク検定は、蚊Ｃ６／３６細胞に対して実施された。７５ｃｍ’ビンに入れ たコンフルエントな蚊Ｃ６／３６細胞を、野生型４型デング熱ウイルスまたは活 性欠失突然変異体ウィルスに、適当な多重度で感染させた。実施例に述べるよう に、感染の６日後に、被感染細胞をニュートラルレッドで染色した。翌日、プラ ークサイズを測定した。各突然変異体について、１０個の別々のプラークの平均 プラークサイズを算出した。パネルＡは、非感染細胞単層（ダミーＬ４型デング 熱ウィルス欠失突然変異体（Δ３’、１７２〜１１３）、（Δ３’　、１７２〜 １４３）、親・野生型ウィルスを示す。
図１５は、野生型ウィルスと、欠失突然変異体（Δ３’　、２４３〜１８３）、 （Δ３°、３０３〜１８３）、（Δ３°、３８４〜１８３）を示す。逆番号付与 システムを用いて４型デング配列の欠失位置を割り当てた。
図１６は、Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ接合部の表を示す。
図１７は、キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４構築物における遺伝子間接合部を示す。
制限酵素で開裂したＴＢＥＶｃＤＮＡ断片を、下線を付した配列により示される 適当な部位において、ＤＥＮ４　ｃＤＮＡに挿入した。ＴＢＥＶのアミノ酸およ びコード化ヌクレオチド配列は太字で示されている。ヌクレオチド番号付与シス テムは、Ｐｌｅｔｎｅｖ他によりＶｉｒｏｌｏｇＶ第１７４巻２５０〜２６３頁 （１９９０）に開示されたものである。
図１８は、親ＤＥＮ４およびキメラＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウィルスにより 産生されたウィルスタンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の写真である。Ｖ ＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４またはＤＥＮ４ウィルスに感染したサル細胞、また は、非感染のサル細胞の溶解物を３５８メチオニンで標識し、ＴＢＥＶのＨＭＡ Ｆ　（１）、またはＤＥＮ４のＩ（ＭＡＦ　（２）　、またはＤＥＮ４ＯＮＳ３ 　（３）　、ＮＳ５　（４）、ｐ　ｒｅＭ　（５）　、Ｅ　（６）に特異的なウ サギ血清を用いた免疫沈殿を行ない、５ＤＳ−１２９６ポリアクリルアミドゲル 上で分析した。タンパク質マーカーの分子量はキロダルトンで示す。ＤＥＮ４タ ンパク質の位置は右端に沿って示されている。
図１９は、ＬＬＣ−ＭＫ２およびＣ６／３６細胞上のｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥ Ｎ４およびＤＥＮ４についての増殖曲線を示す。細胞は、細胞当り０．０１ｐｆ ｕのＭｏｌで、図示の時点（感染後日数）において細胞を収穫し、プラーク検定 によりウィルス力価を判定した。
図２０は、被感染組織培養細胞から分離したＲＮＡの試料をプロットしたニトロ セルロースフィルターの写真のコピーである。フィルターは、３２Ｐで標識した ｐＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ニックトランスレーションＤＮＡをプローブとし て検査された。
図２１は、感染後のさまざまな時点における、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４お よびＤＥＮ４に感染したＬＬＣ−ＭＥ４たはＣ６／３６細胞からの細胞溶解物タ ンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の写真である。
図２２は、マウスにおけるｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４の防御効力および神経 毒性を判定するための研究の結果を示す。
図２３は、神経毒性に対する突然変異の効果を評価するために、ＴＨＥ（ＭＥ） ／ＤＥＮ４構築物に組み込んだいくつかの突然変異例のリストである。
図２４は、図２３に示した突然変異を含む構築物から回収したＴＢＥ　（ＭＥ） ／ＤＥＮ４キメラを用いた神経毒性研究の結果をまとめたものである。
魚叫の詳槌ダ説叫 キメラフラビウイルスの生成 デング熱ウィルスは、はぼ１１キロベースの正鎖ＲＮＡゲノムを含み、このゲノ ムは、３つの構造タンパク質（カプシド（Ｃ）、プレメンブレン（ｐｒｅＭ）、 エンベロープ（Ｅ））を１つの読取りフレームでコードしており、７個の非構造 タンパク質（ＮＳＩ、Ｎ５２Ａ、Ｎ５２Ｂ、ＮＳ３、Ｎ５４Ａ、Ｎ５４Ｂ、Ｎ５ ５）がそれに続いている。
本発明は、１つの［型（ｔｙｐｅ）　Ｊのデング熱ウィルスまたはワラビウイル スからの非構造タンパク質と、異なる「型」のデング熱ウィルスまたは別のフラ ビウイルスからの構造タンパク質とを含むキメラデング熱ウィルスに関する。
一実施例において、本発明は、 １）１型、２型、３型、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィ ルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、またはワラビウイルスの非構造領域と、２）１型 デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング 熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、また はフラビウイルスから選択された構造領域とを含み、上記構造領域は上記非構造 領域とは異なる「型」のデング熱ウィルスまたはフラビウイルス由来のものであ ることを特徴とするキメラウィルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 １）４型デング熱ウイルス（ＤＥＮ４）の非構造領域と、２）１型デング熱ウイ ルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳 炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、およびフラビウイルスから選択された構造 領域とを含むキメラウィルスに関する。１つの好ましい実施例において、このウ ィルスは、４型デング熱ウイルス構造領域を実質的にもっていない。好ましい実 施例において、このウィルスはり２Ａ（ＤＩＷＰ）またはｐ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ ）ＲＮＡからなる。
さらなる実施例において、本発明は、 １）１型デング熱ウイルスの非構造領域と、２）２型デング熱ウイルス、３型デ ング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、 ダニ媒介脳炎ウィルス、およびフラビウイルスから選択された構造領域とを含む キメラウィルスに関する。
さらなる実施例において、本発明は、 １）２型デング熱ウイルスの非構造領域と、２）１型デング熱ウイルス、３型デ ング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、 ダニ媒介脳炎ウィルス、およびフラビウイルスから選択された構造領域とを含む キメラウィルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 １）３型デング熱ウイルスの非構造領域と、２）１型デング熱ウイルス、２型デ ング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、 ダニ媒介脳炎ウィルス、およびフラビウイルスから選択された構造領域とを含む キメラウィルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 １）黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、およびフラビ ウイルスから選択された非構造領域と、２）１型デング熱ウイルス、２型デング 熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、ダニ 媒介脳炎ウィルス、およびフラビウィルスから選択された構造領域とを含み、上 記構造領域は上記非構造領域とは異なるウィルス由来のものであることを特徴と する、キメラウィルスに関する。
さらなる実施例において、本発明は、上記キメラウィルスの少なくとも１つと、 薬学的ならびに免疫学的に受容可能な担体からなるワクチンに関する。
ワクチンに含まれるウィルスの量は、投与の経路に応じて選択される。皮下経路 が好ましいが、上述のワクチンは、陵内経路によっても投与できる。当業者であ れば、いかなる治療法についても、投与すべき量を容易に決定できることが理解 されよう。
さらに別の実施例において、本発明は、１）４型デング熱ウイルスの非構造領域 と、１型デング熱ウイルスの構造領域からなるキメラウィルスと、 ２）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、２型デング熱ウイルスの構造領域か らなるキメラウィルスと、 ３）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、３型デング熱ウイルスの構造領域か らなるキメラウィルスと、 ４）弱毒型４型デング熱ウイルスからなるワクチンに関する。
１つの好ましい実施例において、弱毒化ウィルスは、非構造タンパク質領域（た とえば、改変されたＮ５Ｉ−ＮＳ２開裂部位配列）内に、突然変異（点突然変異 、欠失、挿入、これらの組合せ）を含む。別の好ましい実施例において、弱毒化 ウィルスは、３゛非コード領域内に、突然変異（点突然変異、欠失、挿入、これ らの組合せ）を含む。さらに好ましい実施例において、弱毒化ウィルスは、５゛ 非コード領域に、突然変異（点突然変異、欠失、挿入、これらの組合せ）を含む 。別の好ましい実施例において、弱毒化ウィルスは、天然由来のものまたは研究 室で加工したものである。
別の実施例において、本発明は、上述のウィルスの少な（とも１つをコード化す るＤＮＡセグメントに関する。１つの好ましい実施例において、ＤＮＡセグメン トは、構造および非構造領域に作動可能に連結するプロモーター（好ましくは、 真核、原核、ウィルス性プロモーター、より好ましくはＳＦ３またはＴ７プロモ ーター）を含む。別の好ましい実施例において、ＤＮＡセグメントはｐ２Ａ（Ｄ ＩＷＰ）またはｐ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）を含む。
すなわち、当業者であれば、後述の実施例において提供される方法を用いて、フ ラビウイルス科の１つのウィルスの構造領域を、フラビウイルス科の別のウィル スからの非構造領域に組合せて得られる型間組換え体を含むキメラデング熱ウィ ルスワクチンを生成できることはいうまでもない。好ましい実施例において、４ 型デング熱ウイルス（ＤＥＮ４）の非構造タンパク質を１型デング熱ウイルスの 構造タンパク質に組み込んだキメラデング熱ウィルスが作製される。これらの方 法の詳細は、Ｂｒａｙ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、第８８巻 １０４２〜１０４６頁、１９９１年）を参照されたい。
後述の実施例１７は、実施例１に説明するキメラデング熱ウィルス製造のための 方法につづいて４型デング熱ウイルスの非構造領域をダニ媒介脳炎ウィルスの構 造領域に組み合わせたキメラウィルス（ＴＢＥＶ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４）の作 製を開示している。これらの方法により作製されたウィルスは培養中で複製され 、組織培養細胞または実験動物の感染に用いられた。
神経毒性に影響するデングゲノムにおける突然変異我々は、細胞培養における増 殖特性およびプラーク形態の変化を示す、３゛非コード領域における欠失を含む 一連の活性デング熱ウィルス突然変異体を加工した。同様に、我々は、ウィルス ポリタンパク質の非構造タンパク質領域の新規な開裂部位配列内にアミノ酸置換 を含む、別の一連の、増殖制限されたデング熱ウィルス突然変異体を加工した。
複製能力が低下したデング熱ウィルス突然変異体は、生菌ウィルスワクチンに用 いるだめの適格性を判定するために、実験動物における毒性の低下について評価 を受ける。
本発明において、３°非コード領域内に欠失を含む増殖制限された４型デング熱 ウイルス突然変異体の構築は、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡクローンを 用いて重要な領域内に欠失を加工することにより実行される。欠失突然変異は、 アミノ酸置換突然変異に比べて、表現型の逆転が少ないという利点をもっている 。
他の蚊媒介ワラビウイルスと同様に、４型デング熱ウイルスは、指定された保存 配列１　（ＣＳ−１）および保存配列２　（ＣＳ−２）の保存領域と、潜在的末 端ステム・アンド・ループ構造とを含む３゛非コ一ド配列を有している。ヌクレ オチド３〜２０２個の範囲の欠失は、４型デングｃＤＮＡのヌクレオチド３８４ 個の３′非コ一ド配列内のさまざまな位置に導入することができる。Ｃ３−１領 域のｃＤＮＡクローン欠損配列から作製され、しかしステム・アンド・ループ構 造をとどめているＲＮＡ転写物は、子孫ウィルスを生じることがなく、欠失が致 死的であることを示している。一方、たいていの他の３゛非コード領域欠失構築 物からは、感染性ウィルスを回収することができる。
これらの突然変異体および野生型ウィルスのプラーク検定は、蚊細胞（Ｃ６／３ ６）に対して実施することができる。分析の結果、はとんどの欠失突然変異体が 、欠失の位置と程度に応じて、１．０から０．３ｃｍにわたる、縮減サイズのプ ラークを形成することが示されている。プラーク形態のこのような変化は、これ らの欠失突然変異体が増殖制限表現型をあられすことを示すものである。３′非 コード領域内に欠失を含むデング熱ウィルス突然変異体のこのパネルは、実験動 物においてそれらの感染性および免疫原性について評価することができる。実験 霊長類に対して低下した毒性を示す突然変異体は、ワクチンウィルス候補として 選択され、ヒトにおける評価を受ける。
さらに、本発明は、３°非コード領域に欠失を含むＤＮＡ断片およびベクターを 含む組換えＤＮＡ構築物に関する。さらに、本発明は、ＤＮＡ構築物を用いてト ランスフェクションした宿主細胞に関する。さらに、本発明は、ウィルスゲノム の３′非コード領域に欠失突然変異を導入し、欠失突然変異を宿す感染ウィルス を回収する工程を含む、４型デング熱ウイルスの突然変異を生成する方法に関す る。
別の実施例において、本発明は、非構造タンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａの開裂部位 のＮＳＩのＣ末端における８個のアミノ酸のうちの１つ又はそれ以上をコード化 する配列内に置換を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断 片に関する。置換の概略は図１６に示されている。さらに、本発明は、非構造タ ンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａの開裂部位のっぎの＋１位置の部位である、グリシン をコード化する位置に置換を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化する ＤＮＡ断片に関する。本発明は、さらに、ここに述べたＤＮＡ断片の感染性ＲＮ Ａ転写物に関する。
非構造タンパク質内に突然変異を含む増殖制限された４型デング熱ウイルス突然 変異の構築は、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡクローンを用いてこのよう な戦略的突然変異を加工することにより実行できる。デング熱つィルス非構造タ ンパク質の機能的活性に影響する突然変異により、増殖制限を誘起することがで きる。たとえば、開裂配列またはウィルスプロテアーゼ部分を改変することによ り、ウィルスポリタンパク質の開裂を最適以下に抑え、ウィルス増殖を制限する 。
我々は、非効率的な開裂により増殖制限されるデング熱ウィルス突然変異を構築 するためのターゲットとして、ポリタンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂部位を選択 した。我々は、４型デング熱ウィルスＮ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂には、ＮＳＩのＣ末 端における８個のアミノ酸ドメインが必要であることを証明した。我々は、さら に、これらの位置の各々における置換および開裂部位のっぎの＋１位置のＧＩｙ の置換の効果を証明した。
このドメインにおけるアミノ酸置換の突然変異のパネルは、開裂に対する効果に ついて評価された（図１６参照）。開裂に対して広範囲の効果を生じた突然変異 を識別し、多数のこのような突然変異を選抜して、完全長４型デング熱ウイルス ｃＤＮＡクローンに組み込んだ。突然変異体ｃＤＮＡ由来のＲＮＡ転写物を用い て細胞のトランスフェクションを行ない、これにより、Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂領 域内に指定された突然変異をもつ活性デング熱ウィルス突然変異体が生成された 。これらの突然変異体は、まず、蚊Ｃ６／３６細胞でのプラーク検定により特徴 づけられた。突然変異体のいくつかは、サイズの縮小したプラークを生じ、これ らの突然変異体ウィルスが細胞培養において増殖制限を呈したことを示す。
さらに、本発明は、非構造タンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳＩのＣ 末端における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード化する配列内に置換突 然変異を含むＤＮＡ断片と、ベクターを含む組換えＤＮＡ構築物に関する。本発 明は、さらに、ＤＮＡ構築物でトランスフェクションした宿主細胞に関する。
さらに、本発明は、非構造タンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａの開裂部位のつぎの千１ 位置である、グリシンをコード化する位置に置換を含むＤＮＡ断片と、ベク別の 実施例において、本発明は、上述したように、毒性の低下した突然変異体４型デ ング熱ウイルスを、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量含んでなる４型デ ング熱ウイルスに対するヒト用ワクチンに関する。
本発明の突然変異体は、（１）ウィルス血症の期間として測定される毒性と、（ ２）ウィルス感染後の抗体反応の種類と規模により示される免疫原性について、 霊長類において評価される。サルにおいて毒性が低下しなお十分な免疫原性を維 持するデング熱ウィルス突然変異体は、ヒトに対する臨床試験において評価され る。
さらなる実施例において、本発明は、４型デング３゛非コード領域および／また は非構造タンパク質遺伝子内に、十分な弱毒化をもたらす突然変異を含む４型デ ング熱ウイルスを構築すること、ならびに、４型デング熱ウイルス突然変異体の 各々を用いて他のデング熱ウィルス血清型の抗原特異性をもつ型間キメラウィル スを構築しこれにより１型、２型、または３型デング熱ウイルスにより発生する 疾病の防御のために用いることのできる弱毒化ウィルスを創作することに関する 。さらに、キメラウィルスは、日本脳炎ウィルスおよびダニ媒介脳炎ウィルスな どのその他のワラビウイルスに対する抗原特異性をもつものとしても構築するこ とができる。
デング熱に対する免疫のための現在の戦略としては、４つのデング熱血清型すべ てを含むワクチン製剤の使用が好ましい。このことは、異なるデング熱血清型に 連続して感染することから生じる重いデンジ出血性ショック症候群の危険から、 風土病地域の人々を守ることになろう。現在、弱毒化デング熱ワクチン候補は、 人工的な宿主の細胞内の連続継代培養を含む標準的技術により作製されている。
これらの宿主域突然変異体を用いて達成された成功は、ごく限られたものに過ぎ ない。たとえば、２型デング熱ワクチンは満足できる程度に弱毒化されたけれど も、この方法により作製された３型デング熱ワクチンはヒト被験希望者にデング 熱を引き起こした。
本発明は、活性キメラデング熱ウィルスを構築する方法を提供する。本発明は、 さらに、４型ウイルス５゛および３゛非コ一ド配列と、その７個の非構造タンパ ク質のすべてをコードする配列とを含む、共通の４型デング熱ウイルス遺伝子的 背景を共有するキメラウィルスを用いて、４つのデング熱血清型すべてに対して 有効なワクチンを製造する方法を提供する。
この目的のため、我々は、３′非コード系に、あるいは、非構造タンパク質遺伝 子の１つに欠失を含む４型デング熱ウイルスを構築し、これらのデング熱ウィル ス突然変異体が複製能力の大幅な抑制を示すことを証明した。したがって、満足 できる程度の弱毒化をもたらす突然変異をこれらの共通領域内において加工する ことができ、その結果、４つのデング熱血清型特異性を別々に発現することにな る４個のクローン化された弱毒化デング熱ウィルスのひと組が得られる。これら のウィルスには、親４型ウィルス、ｌ型（構造タンパク質遺伝子領域）−４型キ メラ、同様な２型−４型キメラ、および同様な３型−４型キメラ、ならびに、日 本脳炎およびダニ媒介脳炎のキメラが含まれる。
不活化全デング熱ウィルスワクチンは、十分な免疫原性を欠くことが示されてい た。細胞培養における連続継代培養により弱毒化された生菌ウィルスワクチンは 、不十分な弱毒化、遺伝学的不安定性、過度の弱毒化などの欠点をもっていた。
２型デング熱ワクチンは、まだ、開発の初期段階にある。残りの３つの血清型の 生菌ワクチンは得られていない。本発明は、ウィルスゲノム内に指定された突然 変異をもつデンク熱ウィルスを構築する能力における技術的進歩を提供する。
キメラダニ媒介脳炎ウイルスワクチン カプシド、メンブレン、エンベロープの３つの構造タンパク質配列を、デング熱 つィルス非構造タンパク質をコード化する配列を含むデング熱ウィルス構築物に 組み込むことにより、ダニ媒介脳炎キメラウィルスが作製される。
デング熱／ダニ媒介脳炎ウィルス（ＴＢＥＶ）の組合せは、デング熱ウィルスと ＴＲＥＶウィルスタンパク質および核酸配列の協力を必要とするようである。
構築物のウィルスは、それぞれ対応する天然のウィルスのようには感染性ではな かった。ＤＥＮ４およびＴＢＥＶは、同じゲノム構成をもち、遺伝子発現の同じ 戦略を共有する。しかし、２つのウィルス間の配列を比較すると、配列相同性が 比較的低いことが示される（Ｐｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏｌｌ’第１７４巻 ２５０〜２６３頁（１９９０）をここに参考として取り入れる）。たとえば、２ つのウィルスの間のアミノ酸同一性は、カプシドタンパク質（Ｃ）については１ ５．４９６、メンブレンタンパク質（Ｍ）については１５．９％、エンベロープ グリコタンパク質（Ｅ）については３６．５％、非構造タンパク質（ＮＳＩ）に ついては３９．１％である。以下の実施例に、改良されたキメラＴＢＥＶワクチ ンを開示する。
我々は、すでに、感染性ＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型として用いること のできるクローン化された完全長デング熱ウィルスｃＤＮＡについて説明した。
これは、ｐＢＲ３２２ベクターを用いて大腸菌株内に安定な完全長デング熱ｃＤ ＮＡコピーをクローン化することにより達成された。デング熱ウィルスは、ｃＤ ＮＡのインビトロＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションした受容細胞から 回収された。デング熱ｃＤＮＡの感染性ＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクシ ョンした細胞により生成されたウィルスの特性は、ｃＤＮＡクローンが由来した もとのウィルスの特性と同一であった。
さらに、我々は、本発明において、１つの血清型のデング熱ウィルスの部構造タ ンパク質遺伝子と、別の血清型のデング熱ウィルスからの構造タンパク質遺伝子 とを含むゲノムを有するキメラデング熱ウィルスの作製を開示した。キメラデン グ熱ウィルスの１例として、１つのデング熱ウィルスからのカプシド、ｐｒｅＭ （メンブレン）、エンベロープ遺伝子配列を用いて、組換えｃＤＮＡ構築物にお ける４型デング熱ウイルスの対応する遺伝子を置換した。この構築物でトランス フェクションした細胞内で生成されたウィルスは、同型デング熱ウィルスに対す るワクチンの作製において有用である。上述したように、本出願は、さらに、デ ング熱ウィルスの非構造領域と別のフラビウィルスの構造領域に対応する遺伝子 配列を含むキメラウィルスの構築を開示している。特に、キメラダニ媒介脳炎ウ ィルスが開示されている。「キメラフラビウイルスの生成」と題した項において 概説した本発明の方法は、ＴＢＥＶからの３つの構造タンパク質を組み込んだ組 換えデング熱ウィルス構築物の製造を開示している。この構築物でトランスフェ クションした細胞から生成されるウィルスは、生菌ウィルスワクチンのためのウ ィルス候補である。
本出願に係る発明は、キメラフラビウイルス作製の技術に対する重要かつ予想外 の改良と、この新規なワクチン戦略の有用性についてのあらがえない証拠を提供 する。当業者であれば、１つのウィルスの構造タンパク質のすべてを第２のウィ ルスの非構造要素に組み込んだキメラフラビウイルス組合せが容易に回収可能で あり、培養細胞において効率的に複製することを期待できる。これは、関連性の 離れたフラビウイルス由来の構造タンパク質の機能的協力という要件の可能性が あるためである。しかしながら、予期せぬことに、本発明は、ＴＢＥＶゲノムか らの２つの構造タンパク質（すなわちＭおよびＥ）を、デング熱ウィルスからの 第３の構造タンパク質（すなわちＣ）と組み合わせたキメラＴＢＥＶウィルス（ ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４）を識別する。
キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４構築物の作製ＤＥＮ４とＴＲＥＶとの間のアミノ酸配 列相同性は低いため、ＴＢＥＶ配列を用いて対応するＤＥＮ４配列を置換するこ とにより、多様なＴＢＥＶおよびＤＥＮ４キメラｃＤＮＡ構築物が作られた。こ れらの構築物は、分子生物学分野において公知の技術を用いて作製された。ｃＤ ＮＡ構築物のインビトロ転写およびＲＮＡ産物の受容細胞内へのトランスフェク ションの後、さまざまな遺伝子組合せのいずれかにより活性キメラウィルスが産 生されるかどうかを決定するために、構築物を試験した。すでに、ＴＢＥＶ　（ Ｓｏ　ｆ　ｊ　ｉ　ｎ株）のサブゲノムｃＤＮＡ断片がクローンされ、公知の技 術を用いてヌクレオチド配列が決定された（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ、および、Ｐｌｅｔｎｅｖ他、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、第２００巻３１７ 〜３２１頁１９８６を参照）。これらのプラスミドは、全ＴＢＥＶゲノム配列を 一緒に含む重複遺伝子配列を提供する。
プラスミドｐＧＥＭ２−ＣＭＥまたはｐＧＥＭ２−ＥＮＳｌを鋳型として用い、 適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて（例１７参照）、ポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）により一連のＴＢＥＶ　ｃＤＮＡ断片を作製し、各断片は、制 限酵素開裂部位が脇にある１つ又はそれ以上の特異遺伝子を定めている。断片は 図１７に示されており、右端のヌクレオチド位置により示される断片の配列は、 ＰＩ　ｅ　ｔｎｅｖ他による刊行物（Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ第１７４巻２５０〜２６ ３頁、１９９０）において提供されている。図１７に、７個のこのようなＴＢＥ Ｖ　ｃＤＮＡ断片と、部位特異的突然変異誘発により完全長ＤＥＮ４　ｃＤＮＡ のＲＮＡ転写物内に同様に導入された適当な部位に連結するのに適した修飾末端 を示す。ＴＢＥＶ配列の、ヌクレオチド（ｎｔ）７６〜１９７７を含むプラスミ ドｐＧＥＭ２−ＣＭＥおよびヌクレオチド９６６〜３６７２を含むｐＧＥＭ２− ＥＮＳｌは、共有された制限酵素部位におけるＴＢＥＶ断片のライゲーション（ 連結）により、プラスミドｐ１０、ｐ４、ｐ１８、ｐ２、ｐＨから構築された（ 前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉ　ｒｏｌｏｇｙ、１９９０参照）。プラスミドＤ ＥＮ４ｐ５’　−２およびｐ５’−２（ΔＰｓｔｌ、Ｘｈｏｌ）（前出のＢｒａ ｙ他、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１９９１）、および誘導体ｐ５°−２（ΔＰｓｔ ＬＸｈｏ１、ΔＨｉｎｄＩＩＩ）が、対応するＤＥＮ４遺伝子のかわりに１つ又 はそれ以上のＴＢＥＶ遺伝子を置換するために用いられた。分子生物学の当業者 であれば、実施例１７に示したプライマー配列すなわち配列番号２１〜３１を用 いてキメラＴＢＥＶ構築物を生成することができる。キメラ構築物の接合部にお ける配列は、核酸配列決定により証明された。得られたキメラプラスミドのすべ ては、ＤＥＮ４の第１のヌクレオチドをあられすＡ残基が後に続く転写開始のＧ の上流に位置するＳＰ６プロモーターを含んでいた。プラスミドは、インビトロ 転写物の前に、ＤＥＮ４配列の３°末端の直後の唯一のＡｓｐ７１８開裂部位で 線状化された。この構築物は、Ｌａｉ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、第８８巻５１３９〜５１４３頁、１９９１）により開示された技術を用い て、インビトロ転写により転写された。図１７のキメラ構築物からの転写物は、 サルＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＲＮＡをトランスフェクションすることにより、感染 性について試験された。トランスフェクション処理には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ　ｉ ｎ”（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎ ｃ、、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）またはＤＯＴＡＰ　（Ｎ−［ １−（２゜３−ジオレオイロキシ）プロピル−Ｎ、　Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモ ニウム硫酸ジメチル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ慢ｅｉｍ、インディアナ 州インディアナポリス） のいずれかを用い、キメラＲＮＡ転写物を受容細胞に導入した。サルＬＬＣ−Ｍ Ｋｘ細胞の培養をこれらの処理に用いたが、ＴＲＥＶ複製のための受容細胞型の どれでもかわりに用いることができることは言うまでもない。トランスフェクシ ョンされた培養は、ＴＢＥＶ特異的ウサギ血清または高度免疫マウス腹水を用い た免疫蛍光検査により、時間に対するウィルスの存在について、評価された。
ｐＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４　（ＴＢＥＶ（７）プレメンブレンおよびエンベ ロープタンパク質からの配列をＤＥＮ４のカプシドタンパク質および非構造配列 に連結したものを含む）のＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションされた細 胞は、ＴＢＥＶ特異的ウサギ血清、ＴＢＥＶ特異的高度免疫マウス腹水（ＨＭＡ Ｆ）、およびＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦで、陽性に染まった。ＤＥＮ４のみに感染 した対照培養は、免疫蛍光標識されたＴＢＥＶ特異的血清に対しては、陰性であ った。
このことは、キメラｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４がＴＢＥＶおよびＤＥＮ４双 方の特異抗原を発現したことを示す。
キメラウィルスをトランスフェクションｖＴＢＥＶから分離し、ＴＨＥ　（ＣＭ Ｅ）／ＤＥＮ４　（ＴＢＥＶのカプシド、メンブレン、エンベロープ遺伝子と、 ＤＥＮ４の非構造配列とを含むゲノム構築物）と、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ ４と呼ぶ。実施例１７に開示したように、ＴＢＥ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４のＲＮ Ａによるトランスフェクションの１６日後、約１％の細胞が、ＴＢＥＶおよびＤ ＥＮ４特異抗原に対して陽性に染まった。陽性細胞の割合は時間とともに増加し 、トランスフエクション後２６日目に６　ｘ　ｌ　Ｏ’ｐ　ｆ　ｕ／ｍＬのピー ク力価を示し、８０％の細胞がトランスフェクションされた。一方、ＴＨＥ　（ ＭＥ）／ＤＥＮ４のＲＮＡを用いてトランスフェクションした細胞はより迅速に ウィルスを生成し１６日目に培養の１００％が感染した。トランスフェクション 細胞内に存在するＴＨＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウィルス（ｖＴＢＥ　（ＭＥ）（ ＤＥＮ４）で示す）の力価は、感染後２６日目に４　ｘ　１０’ｐ　ｆ　ｕ／ｍ Ｌであった。さらに、キメラ構築物に感染させた細胞から生成された子孫ウィル スの配列決定により、図１７に示すように、キメラピリオン（ウィルス粒子）か らのゲノム断片のＤＥＮ４およびＴＢＥＶ接合部が、キメラ構築物の接合部に符 合することが確認された。
ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ウィルスの性質 実施例１７において提供された方法を用いて、キメラウィルスの性質を調べた。
キメラＴ　Ｂ　Ｅ　Ｖ／Ｄ　Ｅ　Ｎ　４ウイルスを用いたすべての作業は、ＢＬ −３封じ込め設備において実施された。
キメラウィルスから製造されたタンパク質を、４型デング熱ウイルスから作製さ れたタンパク質と比較した。完全長ＤＥＮ４ｃＤＮＡクローンから回収した４型 デング熱ウイルスのタンパク質は、「キメラフラビウイルス」と題する項におい て同定され、図４に示され、Ｂｒａｙ他（前出のＰｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　（１９９１））に開示されている。デング熱つィルスタ ンパク質のタンパク質分離のパターンを、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）ＤＥＮ４感染細胞 から生成されたキメラウィルスタンパク質と比較した。この検定（図１８および 実施例１８参照）において、融合性Ｌ　Ｌ　Ｃ−ＭＫｚ細胞を、感染多重度（Ｍ ＯＩ　）０．０１で感染させた。前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９９１）により開示された技術を用いて、被感染培 養を８８３メチオニンとともにインキュベートした。以下のレーンを用いて感染 細胞溶解物の免疫沈降検査を実施した。１）ＴＢＥＶ特異的ＨＭＡＦ、２）ＤＥ Ｎ４特異的ＨＭＡＦ、３）ＤＥＮ４ＮＳ３に対して作製されたウサギ抗血清、４ ）ＤＥＮ４ＮＳ５に特異なウサギ抗血清、５）ＤＥＮ４のｐｒｅＭに特異なウサ ギ抗血清、６）ＤＥＮ４のＥタンパク質に特異なウサギ抗血清。免疫沈降物は、 Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ第２２７巻６８０〜６８５頁、１９７０）により 開示された技術を用い、図１８に示すように、変性条件のもとで、ポリアクリル アミドゲル電気泳動により分析された。キメラおよび親ＤＥＮ４ウィルスのいず れも、ＤＥＮ４　ＮＳ３およびＮＳ５として識別されたタンパク質バンドを生じ た（レーン３および４）。ＤＥＮ４のｐｒｅＭまたはＥタンパク質は、キメラウ ィルスに感染した細胞においては識別されなかったが、ＤＥＮ４感染細胞におい ては識別された（レーン５および６参照）　。ＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦは、ｖＴ ＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４感染細胞溶解物からのタンパク質バンドのみを沈降させ 、これはＤＥＮ４　ＮＳＬおよびＮＳ３非構造タンパク質と共に泳動した（レー ン２）。ＴＢＥＶのＨＭＡＦは、キメラｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４に感染し た細胞の溶解物からのＴＢＥＶのＥタンパク質（５５ｋＤａ）について正確なサ イズを有するタンパク質を免疫沈降した。キメラウィルス感染細胞タンパク質は 、ＤＥＮ４のＥよりも迅速に泳動した（レーン１および６）。以前の実験におい て、ＴＢＥＶのＨＭＡＦは、ＴＢＥＶ感染細胞からの天然ＴＢＥＶｐｒｅＭおよ びＣタンパク質を沈降しなかった。したがって、ＴＢＥＶのｐｒｅＭおよびＣタ ンパク質の同定は期待されなかった。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞においてｖＴＢＥ　（ ＣＭＥ）／ＤＥＮ４により生成されたタンパク質バンドのプロフィールは、ｖＴ ＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４により生成されたものと同一であった。このように、 キメラウィルスはＬＬＣＭＫ２細胞において期待されたタンパク質を生成した。
ＤＥＮ４により生じたウィルスプラークをキメラ構築物から生じたプラークと比 較することにより、ウィルスのプラーク形態観察を評価した。蚊Ｃ６／３６細胞 上で、ＤＥＮ４ウィルスプラークの平均サイズは１２．１ｍｍであった。一方、 ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４は平均６．５ｍｍのプラークを生じた。ｖＴＢＥ （ＭＥ）／ＤＥＮ４は、サルＬＬＣ−ＭＫ２細胞上にＤＥＮ４により生じるもの と比べて５倍大きいプラークを生じた。このことは、キメラウィルスが、ＬＬＣ −ＭＫ２細胞において、ＤＥＮ４よりも効果的に複製したことを示唆する。これ らの思わぬ結果は、被感染ＬＬＣＭＫ２細胞におけるｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥ Ｎ４の増殖速度およびウィルス収量の分析により確認された（図１９参照）。
キメラウィルスの力価は１０’ｐ　ｆｕ／ｍＬに達し、これは、同一条件下で親 ＤＥＮ４により達成されるものにくらべて、はぼ１０００倍高い。キメラｖＴＢ Ｅ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウィルスは、蚊Ｃ６／３６細胞上でゆっくりと増殖し、親 ＤＥＮ４により生成されるよりも１００倍低い力価に達した。キメラｖＴＢＥ　 （ＣＭＥ）／ＤＥＮ４のプラークサイズは、ＬＬＣＭＫｔ細胞上のＤＥＮ４のも のと比べて、検知できるほどには異なっていなかった。これらの研究において、 ウィルスは、Ｂａｎｃｒｏｆｔ他（Ｐａｎ　Ａｍ、Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎ、 Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ、第３７５巻１７５〜１７８頁、１９７９）に開示された技術 を用いたプラーク検定により、測定された。プラークサイズの相違は、ＴＢＥＶ のＣタンパク質とＤＥＮ４ウィルスＲＮＡとの非互換性を反映するものであり、 これは、ウィルスＲＮＡパッケージングおよびウィルス成熟の際のタンパク質の 効率的な相互作用を妨げる。また、プラークサイズの相違は、ＤＥＮ４の５′非 コード領域におけるＡＵＧコドンの上流の６個のヌクレオチドの置換の結果であ る可能性もある。この配列変更は、ウィルスタンパク質翻訳の効率に影響し得る 。
キメラ構築物からのウィルスＲＮＡ生成の分析（図２０）は、図２１のタンパク 質データとあわせて、被感染Ｃ６／３６細胞におけるｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥ Ｎ４の小型プラーク表現型と増殖速度低下の説明を与える。Ｌ　Ｌ　Ｃ−ＭＬま たはＣ６／３６細胞の培養（約１０’個の細胞）は、ウィルス吸着の後のさまざ まな時間に収集され、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液中に溶解 された。
Ｍａｎｉａｔｉｓ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、１９８２　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）により提供された技術を用いて、フェノー ル抽出により、全ＲＮＡが細胞溶解物と培地から分離された。ＲＮＡ試料をホル ムアルデヒド中で変性し、ニトロセルロースフィルター（ＢＡ８５，５ｃｈｌｅ 　ｉ　ｃｈｅ　ｒおよび５ｃｈｕｅ　Ｉ　Ｉ）に塗布した。フィルターは、ニッ クトランスレーションされた！２ｐ標識ｐＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４のＤＮＡ プローブを用いて、ハイブリダイズされた。ｐＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４から インビトロで作製されたＲＮＡ転写物を陽性対照（コントロール）として用いた 。
ＤＥＮ４に感染したＬ　Ｌ　Ｃ−ＭＥ２またはＣ６／３６細胞からのウィルスタ ンパク質は、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４に感染したＬＬＣＭＫｚまたはＣ６ ／３６細胞からのウィルスタンパク質と比較された。ＤＥＮ４に感染したＬＬＣ −ＭＥ２またはＣ６／３６細胞において、Ｅ、ＮＳＩ、ＮＳ３を含むＤＥＮ４ウ ィルスタンパク質は感染後４８時間で高レベルに蓄積した（図２１）。しかしな がら、ウィルスタンパク質合成の動態は、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４感染Ｌ ＬＣ−ＭＫ、とＣ６／３６細胞では異なっていた。ウィルスタンパク質は、ＬＬ ＣＭＫｔ細胞においては感染後８時間と早（検出された。一方、Ｃ６／３６細胞 においては感染後４８時間まではウィルスタンパク質は検出されなかった。Ｃ６ ／３６細胞への接種の後、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ピリオンの約７０％が 培地中に残っていた。一方、ＬＬＣＭＫ２細胞培養の培地においては接種された ウィルスの小さなフラクションのみが見られた。この発見は、キメラｖＴＢＥ　 （ＭＥ）／ＤＥＮ４のＬＬＣＭＫ２細胞への導入は、Ｃ６／３６細胞への導入よ りも、効率的であることを示唆している。そしてその結果としてあり得ることは 、このウィルスがＤＥＮ４ウィルスと比較してこれらの細胞においてよりゆっく りと、かつ、より低い力価に増殖するということである。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞へ の導入の後、キメラウィルスＲＮＡの複製は、ＤＥＮ４ウィルスＲＮＡのそれと くらべて迅速であった。一方、キメラウィルスのＲＮＡ合成は、被感染Ｃ６／３ ６細胞におけるＤＥＮ４のそれよりもゆっくりであった。このように、ｖ　Ｔ　 Ｂ　Ｅ　（ＭＥ）　／　Ｄ　ＥＮ４は、蚊細胞内への導入の効率が低く、これは 、ウィルスＲＮＡおよびタンパク質の生成低減に関連していた。これらの観察結 果は、ＴＢＥＶウィルスＲＮＡのＣ６／３６細胞内へのトランスフェクションの 効率が低いことと符合している（Ｍａｎｄｌ他、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、第６５巻、４ ０７０〜４０７７頁、１９９１年）。
当業者には、１つのウィルスからの核酸配列を別のウィルスの核酸配列に組合せ るために用いることのできるさまざまな方法があることが理解されよう。このよ うなライゲーション技法とクローニング戦略は公知である。したがって、他の技 術を用い得ること、および、これらの技術の採用はクレームされた発明から逸脱 しないことは言うまでもない。
キメラワクチンの効力と神経毒性の判定ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４は、さま ざまな投与経路を介して試験動物にウィルス試料を導入することにより、ワクチ ンとしての防御効力について評価された。
親デング熱ウィルスと比較したｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４の神経毒性は、マ ウスへの脳内接種（ＩＣ）により分析された。他の投与経路としては、皮肉（Ｉ Ｄ）または腹腔内（ＩＰ）注射が含まれる。１つの実験において、生後３日のＢ ＡＬＢ／ｃｖウス乳児に、ウィルス１０”ｐ　ｆ　ｕをＭＥＭｏ、０２ｍＬ１０ ．２５％ヒト血清アルブミンに加えた服用量を、ＩＣ注射した。別の組の実験に おいて、生後６週のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスにＩＣ，ＩＤ、ＩＰ接種を行なった。
２１日間にわたり、脳炎の症候や死亡について、マウスを観察した。生存した成 体マウスは感染後２０日後に採血し、ＴＢＥＶに対する抗体反応を評価した。ワ クチンの防御効力を判定するため、感染後２１日目間、ＢＬ−４封じ込め設備に おいて、生存したマウスに、１０”ＬＤｓｏ　ＴＢＥＶ　（Ｓｏ　ｆ　ｊ　ｉ　 ｎ株）をＩＰ投与した。
ｖＴＢＥ　（ＭＥ）ＤＥＮ４は、乳児または成体マウスの脳（ＩＣ）内に直接接 種した場合、親ＴＢＥＶの神経毒性を維持していた（図２２および実施例２１） 。
陽性対照として、ＴＢＥＶの典型的な株（Ｓｏｆｊｉｎ株）との比較を行なった 。
ＴＢＥＶは神経毒性が高く、０．１ｐｆｕで、ＩＣ接種した乳児マウスの５０％ に新生児脳炎を起こした。同様に、ＴＢＥＶは、ＩＰ接種した成体マウスに対し ても神経毒性が高かった。この場合には、ＩＤ５ｏは１４．２ｐｆｕであった。
一方、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）ＤＥＮ４は、ＩＤまたはＩＰのいずれかの周辺（末梢 ）経路により接種した場合には脳炎を起こさず（図２２参照）、これらが潜在的 に安全なワクチン接種経路であることが示された。
ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４の免疫原性は、生存したマウスの血清抗体を用い た３８３標識抗原を使用して、ウィルスに対する抗体の免疫沈降検査を行うこと により分析された。免疫沈殿物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し たところ、ＤＥＮ４　ＮＳＩ　（キメラウィルスによりコード化されるタンパク 質）に特異な抗体は容易に検出されること、しかし、ＴＢＥＶ　Ｅに対する抗体 は力価が低いか、検出不可能であることが明らかになった。マウスはＴＢＥＶに 対する天然の宿主ではないため、マウスの周辺接種では、低レベルのウィルス複 製しか行なわれないということが推定される。
ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４のＩＰまたはＩＤ接種を生き延びたマウスは、つ ぎに、致死量の投与に対する抵抗の徴候について研究された。ｖＴＢＥ（ＭＥ） ／ＤＥＮ４またはＤＥＮ４ウィルス接種の２１日後、神経毒性の高いＴＢＥＶの ５ｏｆｊｉｎ株１０”ＬＤ＝ｏを投与した。キメラｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ ４のＩＰまたはＩＤ接種で生き延びたマウスは、この投与に対して防御ができて いた。
一方、先にＤＥＮ４で免疫化されたマウスの３つのグループのすべては、１１日 〜２０日の間に死亡した（図２２参照）。これらの結果は、ワクチンとしてのこ のウィルスは、ＴＢＥＶ感染に対して防御的であり特異的であることを示した。
非免疫化対照マウスは、ＴＢＥＶ感染の後、１０日〜１６日の間に脳炎で死亡し た。ＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウィルスは、脳内接種の後、乳児および成体マ ウスの両方に、均等に脳炎を起こした。一方、ＤＥＮ４を接種したマウスでは、 デング熱ウィルス関連の疾病の発生頻度は低かった。このように、キメラウィル スは、ｐｒｅＭおよびＥ遺伝子が由来した、もとのＴＢＥＶのマウス神経毒性を 維持している。このことは、すべてでないとしても、ＴＢＥＶマウス神経毒性マ ツプの遺伝的決定基のほとんどが、これら２つの構造タンパク質遺伝子内にある ことを示している。しかしながら、親ＴＢＥＶとは異なり、ｖＴＢＥ　（ＭＥ） ＤＥＮ４は、成体マウスに周辺接種した場合には病原性ではなく、周辺接種によ り神経侵入性の損失が起きたことが示される。これらの発見は、ＴＢＥＶがＣＮ Ｓに侵入し脳炎を生じるためには、ｐｒｅＭおよびＥ遺伝子以外のＴＢＥＶゲノ ムの領域が必要であることを示唆するものである。ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ ４で周辺接種したマウスは、次回の致死量ＴＲＥＶの腹腔内投与に対して防御さ れた。
一方、ＤＥＮ４で同様に接種したマウスではそうではなかった。これらの発見は 、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）ＤＥＮ４のｐｒｅＭ（Ｍの前駆体）、Ｍｌおよび／または Ｅタンパク質が、マウスにおけるＴＢＥＶ脳炎に対する防御免疫の主要な抗原決 定基を含んでいることを示すものである。
キメラｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４の神経毒性の改変上記の「神経毒性に影響 するデングゲノムにおける突然変異」と題する項において説明したように、組換 えデング熱ウィルス構築物を、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲなどによる 突然変異誘発により改変し、神経毒性特性が低減したことによりワクチン接種に 適した改変ウィルスを生成する。ここに開示するように、同様な技術を用いて、 ｖＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ゲノムを改変して神経毒性を低減させることができ、これ により、ＴＢＥＶに対する弱毒化ウィルスワクチンの安全性が改善される。
ＴＢＥＶの防御抗原を維持し、かつ、ＴＢＥＶの周辺侵入性を欠く、活性ＴＢＥ Ｖ／ＤＥＮ４キメラを構築することができれば、この重要な病原体の免疫予防の ための新規な戦略、すなわち、弱毒化ＴＢＥＶワクチンの開発の基盤が得られる 。しかしながら、このゴールに到達するには、まず、キメラのさらなる改変を達 成しなければならない。すなわち、ウィルスの脳内への直接接種により測定され る、ＣＮＳに対する神経毒性の除去である。ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４キメラは、親Ｔ ＢＥＶの神経毒性を維持しているため、キメラゲノムのＤＥＮ４またはＴＢＥＶ 部分において戦略的突然変異を加工し、マウス神経毒性に対するそれらの効果を 評価することにより、この特性を無効にする必要があった。これらの突然変異体 は、ウィルスゲノム内の位置のいくつにでも導入される突然変異を潜在的に含ん でいる。初期の研究は、以下の突然変異をもつキメラウィルスを評価した。すな わち、（１）　５’非コード領域における欠失、（２）ｐｒｅＭ−Ｍ開裂部位ま たはｐｒｅＭあるいはＥあるいはＮＳＩタンパク質のグリコジル化部位を除去す る突然変異、（３）Ｅ遺伝子における点突然変異である。これまでに試験された 突然変異は図２３に含まれている。
ＴＨＥ　（ＭＥ）ＤＥＮ４構築物を系統的に改変し、神経毒性に対する遺伝子的 変更の効果について試験を行なうという研究の一部として、タンパク質配列に１ つ又はそれ以上の変化を含む、６個の異なる構築物を作製した。実施例２２参照 。
当業者であれば、本発明において提供される技術を用いて、ＴＢＥ　（ＭＥ）／ ＤＥＮ４構築物に対して任意の数の置換、挿入、欠失を作製し、神経毒性におけ る変化を試験することができる。同様に、当業者であれば、遺伝子組成における 好ましくは少なくとも１つの変更を有するキメラ構築物を、天然の配列を組合せ たキメラ構築物と比べて試験するために、図２３に示す突然変異をこれらのまた はその他の突然変異と組合せることが容易に行なえる。
突然変異体キメラウィルスの作製を導（突然変異構築物の能力を評価する研究に おいて、トランスフェクションされたＬＬＣＭＫｘ細胞から６個の突然変異体キ メラを回収し、プラーク形態観察における変化についてウィルスを分析した。
突然変異体ＴＨＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウィルスの子孫をＬＬＣ−ＭＫ！細胞内 の継代培養により増幅し、ＬＬＣＭＫ２細胞上または蚊Ｃ６／３６細胞上でのプ ラーク検定により分析した。キメラウィルスＴＢＥ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４は、 ＴＢＥＶの３つの構造タンパク質遺伝子すべてを含んでいたが、同様に分析され た。また、野生型ＤＥＮ４も、対照として用いられた。図２４に示すように、各 細胞株上のたいていの突然変異体のプラークサイズは、親ＴＨＥ　（ＭＥ）／Ｄ ＥＮ４のウィルスプラークに比して縮減しており、これらの突然変異体はウィル ス複製について制限されていることが示唆される。ＥまたはＮＳＩに欠陥グルコ シル化部位を含んでいた突然変異体は、試験された数組の突然変異体の中で最小 サイズのプラークを生じた。
突然変異体キメラ構築物は、マウスにおける神経毒性についてさらに試験された 。実施例２１に記載されるように、および、実施例２３に記載されるように、マ ウスにウィルスを接種した。脳炎の徴候および死亡について、被感染マウスを３ １日間観察した。”ＮＳＩ　（１）−Ｇｌｃ−および”ＰｒｅＭ／Ｍ−突然変異 を含む構築物のＬＤ”は、１００ｐｆｕより大きく、これらの突然変異体がマウ ス神経毒性において１００倍以上減少したことが示された。この発見は、ＮＳＩ 　（１）−Ｇ　Ｉ　ｃ−１Ｐ　ｒ　ｅ　Ｍ／Ｍ−１あるいは両方の突然変異を、 マウス神経毒性の弱毒化を提供するために用いることができることを示す。この 発見は、同様の突然変異を、日本脳炎ウィルスを含む他の脳炎フラビウイルスの 弱毒化を提供するためにも採用できることを示唆するものである。
さらに、ＬＤｓｏの値の増加により証明されるとおりマウスにおける神経毒性低 下を示すこれらのキメラ構築物は、つぎに、霊長類において試験されることはい うまでもない。実施例２４は、霊長類におけるワクチン効力に対する試験法を提 供する。霊長類研究における成功に続き、本発明のワクチンは、ヒトに対する臨 床試験において試験される。当業者であれば、霊長類での研究をヒトにおける研 究に適したものに改変することができる。
したがって、本出願の発明は、多数のワクチンを提供するとともに、デング熱ウ ィルスやその他のワラビウィルスの血清型に対する防御免疫反応を発生させるた めにキメラデング熱ウィルスワクチンを作製することを当業者に教示する。この ようなワクチン試料は、好ましくは、キメラウィルスの集団を含み、各ウィルス は少なくとも１つのデング熱ウィルスに対して構造タンパク質を発現する。ウィ ルス学および分子生物学の当業者であれば、ここに開示された技術を用いて、１ つのワラビウイルスの構造領域と第２のウィルスの非構造領域とを組合せたキメ ラウィルスを作製することができる。好ましくは、この第２のウィルスはデング 熱ウィルスである、さらに好ましくは、この第２のウィルスは４型デング熱ウイ ルスである。さらに、本発明は、部位特異的突然変異誘発などを用いてデング熱 ウィルス構築物を改変することにより改良されたデング熱ウィルスワクチンを作 製することを当業者に教示する。これらの改変は、キメラウィルス構築物に同様 に組み込まれることは言うまでもない。本発明は、さらに、デング熱ウィルスの 非構造領域および少なくとも１つの構造領域を、別のワラビウィルスからの構造 遺伝子領域と組合せて含むキメラウィルスの作製ならびに試験を教示する。特に 、４型デング熱ウイルスからの１つの構造領域ならびに非構造領域と、ＴＢＥＶ からの２つの構造タンパク質をコードする配列とを含むキメラウィルスを含む、 ＴＢＥＶのためのワクチンが開示されている。
ＴＢＥＶ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４についてこれまでに観察された、励みになる成果 は、これらの技術が、ＴＢＥＶよりもデング熱ウィルスにより密接に関連したウ ィルスに対するワクチンを作製する際にも有用であることを示唆している。この ような例の１つは、極東において依然として大きな公衆衛生問題である日本脳炎 ウィルスである。すなわち、さらなる実施例において、本発明の技術は、ＤＥＮ ４ｃＤＮＡ非構造領域を、目構造領域ィルスからの少な（とも１つの構造遺伝子 とＤＥＮ４の残りの構造遺伝子領域に組合せるために用いられる。
さらに、本発明の技術を用いて、異なるフラビウイルス間の非構造領域および構 造領域の他の組合せを同様にして作製し試験することができることは言うまでも ない。たとえば、日本脳炎ウィルスの組換え構築物を、ウィルス非構造領域はそ のままにして、１つ又はそれ以上の構造領域をダニ媒介脳炎ウィルスからの対応 する遺伝子配列で置換するように改変することができる。同様に、ダニ媒介脳炎 ウィルスをコード化する組換えｃＤＮＡを生成し、構造領域を、デング熱つィル ス構造タンパク質をコード化する少なくとも１つの遺伝子で置換することができ る。
ここにおよび下記の実施例において引用されるすべての刊行物は参照として取り 入れられる。以下、本発明の特別な実施例を詳細に検討し、本発明の範囲内での 可能な変型について言及する。本発明を成功裡に実施することのできる、さまざ まな代替技術や手順が当業者には知られている。
実施例およびそれに関連する一般情報 ウイルス　：　４型デング熱ウイルス株８１４６６９を用いて、完全長感染性Ｒ ＮＡ転写物の転写源として用いられる完全長ｃＤＮＡを構築した（Ｅ、Ｍａｃｋ ｏｗ他（１９８７）Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁、Ｂ、　Ｚｈ ａＯ他（１９８６）Ｖｉ　ｒｏ１ｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁）。アヵゲザル 胎児肺細胞継代培養レベル９の１型デング熱つィルス西太平洋株（ＤＩＷＰ）の 標本は、Ｋ、Ｅｃｋｅｌｓ博士の好意により提供された（ＷＲＡＩＲ，ワシント ンＤＣ）（Ｋ、Ｔ、ＭｃＫｅｅ他（１９８７）Ａｍ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｈ ｙｇ。
第３６巻４３５〜４４２頁）。マウス脳継代培養レベル３８の、マウス神経毒性 ２型デング熱ウイルスニユーギニアＣ株（Ｄ２ＮＧＣ）のマウス脳標本は、Ｄ。
Ｄｕｂｏ　ｉ　ｓ博士の好意により提供された（ＷＲＡＩＲ，ワシントンＤＣ） （Ａ。
Ｂ、５ａｂｉｎ　（１９５２）Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、第１ 巻３０〜５０頁）。１型および２型デング熱ウイルスは、Ｃ６／３６蚊細胞内で １回、継代培養することにより増幅された。つぎに、これらの３つのウィルスは 、ＬＬＣＭＫ！サル腎臓細胞内で１回、継代培養された。得られたウィルス懸濁 液はプラーク形態観察およびマウス神経毒性の研究に用いられた。
クローニングベク　−　：　４型デングゲノムの５′側半分を含むプラスミドｐ ５′−２を、３つの構造タンパク質遺伝子の置換を容易にするために改変した（ Ｃ，Ｊ、　Ｌａ　ｉ他（１９９１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁）。まず、唯一のＸｈｏ１部位 が、部位特異的突然変異誘発により、Ｅの３′末端の近くの、４型デング配列の ヌクレオチド２３４２　（Ａ−Ｇ）に導入され、ｐ５’　−２（Ｘｈｏ　Ｉ）を 作製した。このヌクレオチド変更はアミノ酸配列を変更するものではなかった。
このベクターはつぎに、デング配列内の唯一のＢｓｔＢ１部位において、および 、ｐ５’　−２内のデンゾ配列の直後の唯一のＡｓｐ７１８部位において、消化 された。断片はデンゾ４ゲノムの３゛側半に連結され、完全長１）２Ａ（Ｘｈｏ Ｉ）を作製した。第２に、フラビウイルスに保存されている、ヌクレオチド８８ のＢｇ１１１部位は、ｐ５゜−２内の他の３つのＢｇｌｌｒ部位を除（ことによ り、唯一の部位とされた。ｐＢＲ３２２およびＳＰ６プロモーター間の接合部に おけるＢａｌｌＩ部位は、Ｎｏｔ■リンカ−を挿入することにより除去された。
４１２８および４２７７の他の２つの部位は、最近導入された３４７３のＰｓｔ １部位までベクターを短くすることにより、除去された（Ｋ、Ｔ、ＭｃＫｅｅ他 （１９８７）Ａｍ、Ｊ、ＴｒｏｐＭｅｄ、Ｈｙｇ　第３６巻４３５〜４４２頁） 。つぎに、プラスミドｐ５’　−２（Ｘｈｏ　１．　Ｐｓ　ｔ　Ｉ）をフラグメ ント交換に用い、キメラｃＤＮＡを作製した。
図１は、構築された完全長デンゾｃＤＮＡを含む、以下のプラスミドを示す。
ｐ２Ａ　（Ｘｈｏ　Ｉ）は、４型デングゲノムの完全なｃＤＮＡコピーであり、 唯一のＸｈｏ１部位がＥ遺伝子の３°末端の近くに創製された。ｐ２Ａ（ＤＩＷ Ｐ）は、ｐ２Ａ（Ｘｈｏｌ）から、５゛非コード領域内のＢｇｌ１１部位と唯一 のＸｈｏｒ部位との間の配列を、１型デング西太平洋株の対応するｃＤＮＡで置 換することにより、得られた。ｐ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）は、同様にして、Ｂ　ｇ 　ｌ　ＩＩ−Ｘｈｏｌ断片を、２型デングニユ一ギニアＣ株からの対応するｃＤ ＮＡで置換することにより、作製された。Ｂ：Ｂｇｌｌｌ、Ｘ：ＸｈｏＩ、Ａ： Ａｓｐ７１８制限酵素部位。
キメラｃＤＮＡ　：　Ｃ６／３６蚊細胞内で増殖したｌ型または２型デング熱ウ イルスを精製し、Ｂ、Ｚｈａｏ他（１９８６）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７ ７〜８８頁）により説明された手順にしたがってピリオンＲＮＡを抽出した。１ 型デング配列のヌクレオチド２３０６〜２３３８にハイブリダイズするネガティ ブセンスオリゴヌクレオチドを用いて、逆転写により、１型デング第１鎖ｃＤＮ Ａを合成した。このプライマー配列は、上記のｐ５’　−２（Ｘｈｏｌ、Ｐｓ　 ｔ　Ｉ）内の４型デングＥ遺伝子内の部位に対応する位置にＸｈｏ１部位を創製 するために、ヌクレオチド２３１６におけるサイレントな第３塩基変更（Ａ−Ｇ ）を含んでいた。つぎに、１型デングｃＤＮＡを鋳型として、ネガティブセンス オリゴヌクレオチドおよび１型デングヌクレオチド５１〜７ｏにハイブリダイズ する保存されたＢｇ１１１部位を含むポジティブセンスプライマーを用いて、Ｐ ＣＲにより２本鎖ＤＮＡを合成した。ＰＣＲ産物をＢａｌｌＩおよびＸｈｏｌで 消化し、つぎに、ｐ５’　−２（Ｘｈｏｌ、Ｐｓｔｌ）にクローン化し、対応す る４型デング配列を置換した。つぎに、１型デング配列を含むＣ１ａｌ−Ｘｈｏ ｌ断片をｐ２Ａ（Ｘｈｏｌ）からの残りの４型デングｃＤＮＡに連結し、完全長 キメラｐ２Ａ（ＤＩＷＰ）を創製した。同様に、２型デングヌクレオチド２３１ ０〜２３６４にノゾブリダイズするネガティブセンスプライマーを用いて、２型 デング第１鎖ｃＤＮＡを合成した。このプライマーは、２３３３におけるＴ−Ｃ ，２３３６におけるＡ−Ｇ、２３３７におけるＣ−Ａの、３つの塩基変更を含む 。これらの変更は、上述した４型デング遺伝子におけるＸｈｏ１部位に対応する 位置にＸｈ。
■部位を創製する。これらの変更はアミノ酸配列を変えるものではなかった。Ｐ ＣＲによる２本鎖ＤＮＡ合成のために、ネガティブセンスプライマーが用いられ 、１型デングに対してはポジティブセンスプライマーが同じく用いられた。ＰＣ Ｒ産物をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏｌで消化し、ｐ５’　−２（Ｘｈｏｌ）にクロ ーン化し、Ｃ１ａｌ−Ｘｈｏｌ断片を用いてｐ２Ａ（Ｘｈｏｌ）の対応する断片 を置換してｐ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）を作製した。
ＲＮＡ　１　トランスフエ　シ　ン　およびウィルスの口　：　完全長ＲＮＡ転 写物を用いた細胞のトランスフェクションは、Ｃ，Ｊ、Ｌａｉ他（１９９１）Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁 に記載されているようにして実施された。トランスフェクションの１０日後、細 胞はトリプシン処理され、６穴プレートおよびチェンバースライドに移された。
２日後、免疫蛍光検査（ＩＦＡ）により、デング熱ウィルス抗原の存在について 、スライド上の細胞を試験した。はとんどの細胞が感染したことがＩＦＡにより 示された場合には、６穴プレート内の細胞をトリプシン処理し、６倍量の非感染 細胞と混合し、通常６〜７日後に細胞病理効果（培地内の多数の死亡細胞の出現 ）があられれるまで、インキュベートした。つぎに、培地を取り出し、細胞をか きとり、標準容積の５０％Ｅａｇｌｅ最小必須培地１５０％血清に再懸濁し、凍 結することにより、感染細胞を収穫した。他方、陽性細胞の割合が小さい場合に は、細胞をトリプシン処理し、新鮮培地に１：３で希釈し、非感染細胞を添加上 ずに増殖させる。感染細胞の割合を週ベースで評価し、間隔をおいて細胞溶解物 を収穫しウィルスの力価を測定した。
ｆ２ＪｆＵ！１フ歪ルス抗原少秩辺　感染細胞は、血清型特異的モノクローナル 抗体（ｍａｂ）ＩＦＩ　（１型デング）、３Ｍ５　（２型デング）、５Ｄ４　（ ３型デング）、ＩＨＩＯ（４型デング）およびＮＳＩ特異的ｍａｂｌＧ６　（４ 型デング）を用いて、ＩＦＡにより分析された。これらは、もともとＭ、　Ｋ、 　Ｇｅｎ　ｔ　ｒｙ博士およびＥ、Ｈｅｎｃｈａｌ博士により作製されたもので ある（ＷＲＡＩＲ。
ワシントンＤＣ）（Ｅ、Ａ、Ｈｅｎｃｈａｌ他（１９８２）Ａｍ、Ｊ、Ｔｒｏｐ 。
Ｍｅｄ、Ｈｙｇ　第３１巻５４８〜５５５頁）。モノクローナル抗体は、１：５ ０〜１：３００の希釈で用いた。一方、フルオレセイン接合抗マウス抗血清（Ｋ ｉｅｒｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド 州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）はｌ　１００で用いた。結果は写真で記録した。
各ｍａｂについて、陰性結果を生じた感染細胞を、陽性細胞と同じ露光時間で写 真撮影した。親（野生型）デング熱ウィルスと子孫ウィルスｖ２Ａ　（Ｘｈｏ　 Ｉ）のタンパク質を分析するため、６穴プレート内のコンフルエントＬＬＣ−Ｍ Ｋ２細胞をＭＯＩ　Ｏ，２でウィルスに感染させた。感染の６日後、６時間にわ たり５０μＣｉ／ウエルのＳ−メチオニンを含まない培地で細胞を標識した。つ ぎに、ＲＩＰＡ緩衝液に細胞を溶解した。キメラウィルスｖ２Ａ（ＤＩＷＰ）に ついては、細胞のほぼ１００％が感染したときに、標識化を実施した。一方、ｖ ２Ａ（Ｄ２ＮＧＯ）については、約３０％が感染したときに標識化を実施した。
適当な同型または異型高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）を用いて溶解物を沈殿さ せ、５ＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。
プ乏ユタ形悪：　ウィルスは、Ｌ　Ｌ　Ｃ−ＭＫ！細胞上でのプラーク形態につ いて調べられた（Ｗ、Ｈ，Ｂａｎｃｒｏｆ　を他（１９７９）Ｐａｎ、Ａｍ、Ｈ ｌ　ｔｈ。
Ｏｒｇ、Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ　第３７５巻１７５〜１７８頁）。プラーク形態の分 析の前に、各親ウィルスをＬＬＣＭＫｘ細胞内で１回、継代培養した。インキュ ベーションの６〜９日後に、ニュートラルレッドを培養物に重層した。
乳１マウスにお番るキメラウィルスの　：　生後３日のスイスマウスに、２００ ０ｐｆｕの親またはキメラデング熱ウィルスを、ウィルスに感染したＬＬＣ−Ｍ Ｋ２細胞を希釈した溶解物の形で、脳内接種した。陰性対照マウスには非感染細 胞の溶解物を注射した。親４型デング熱ウィルス（８１４６６９）、１型デング 熱ウイルスＷＰ１または２型デング熱ウイルスＮＧＣについて、１リツトルが接 種された。ｖ２Ａ　（Ｘｈｏ　Ｉ）　、ｖ２Ａ　（ＤＩ　ＷＰ）　、またはｖ２ Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）について、２リツトルが接種された。２１日間にわたり、脳炎 の徴候および死亡について接種されたマウスを監視した。
実施例１ キメラｃＤＮＡおよびウィルス 完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡ　（ｐ２Ａ）を用い、構造遺伝子配列を１ 型または２型デング熱ウイルスの対応する配列により置換したキメラウィルスを 構築した。この目的のために選択された１型ウイルス（ＷＰ）は、マウスの脳内 での増殖に適さなかった低レベルの継代組織培養株であった。２型株（ＮＧＯ） は、マウスにおける脳内連続継代培養の間に選抜された神経毒性の高い突然変異 体であった。２型突然変異体がこの研究のために選択されたのは、マウス神経毒 性の遺伝的決定基のマツピングの可能性を提供するからである。
プラスミド構築体ｐ２Ａ　（ＸｈｏＩ）　、ｐ２Ａ　（ＤＩＷＰ）　、またはｐ ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を用いた大腸菌ＨＤ１５２８株の形質転換により、安定なプ ラスミド集団が創製された。これらのプラスミドの推定された構造は図１に示さ れている。これらの構造は制限酵素マツピングにより証明された。
第１２日月のデング熱ウィルス抗原に対する免疫蛍光染色により、ｐ２Ａ（Ｘｈ ｏｔ）からのＲＮＡ転写物でトランスフェクションされたＬＬＣＭＫｘ細胞のほ ぼ半数が陽性であった（図２Ａ）。
図２は、（Ａ）ｐ２Ａ　（ＸｈｏＩ）　、ｐ２Ａ　（ＤＩＷ）　、まりｌ！ｐ　 ２　Ａ　（Ｄ　２ＮＧＣ）からのＲＮＡ転写物を同一濃度で用いてトランスフェ クションしたＬＬＣＭＫ２細胞を示す。トランスフェクション後のウィルス感染 細胞のパーセンテージは、新鮮培地中に移した後でＩＦＡにより測定された。（ Ｂ）細胞の大多数がＩＦＡで陽性となったときに感染細胞を収穫した。ウィルス の力価測定はプラーク検定により実施された（Ｗ、Ｈ，Ｂａｎｃｒｏｆｔ他（１ ９７９）ＰａｎＡｍ、Ｈｌ　ｔｈ、Ｏｒｇ、Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ、第３７５巻１７ ５〜１７８頁）。
以前の研究において、ｐ２Ａおよびｐ２Ａ　（Ｐｓ　ｔ　Ｉ）からの転写物を用 いたトランスフェクションの１２日後に、２０〜５０％の範囲の同様な割合の抗 原陽性細胞が観察された。いずれの場合にも野生型表現型をもつウィルスが産生 された（Ｃ，Ｊ、　Ｌａ　ｉ他（１９９１）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｊ、ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁）。一方、ｐ２Ａ　（ＤＩＷＰ）ま たはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）からの転写物を用いてトランスフェクションされた細 胞は、１２日目に、その１９６未満が陽性であった。ｖ２Ａ　（ＤＩＷＰ）に感 染した細胞の割合は、１９日目にほぼ５９６．２６日目に３０％、３３日目に８ ０％に増加した。
このとき、トランスフェクションされた細胞内に存在するウィルスの力価は５Ｘ １０’ｐｆｕ／ｍＬであった（図２Ａおよび２Ｂ）。また、ｖ２Ａ　（Ｄ２ＮＧ Ｃ）はよりゆっくりと増殖した。我々は、１９日目に細胞の１％が陽性であると 算定したが、５４日目までに感染したのは細胞の３分の１に満たなかった。ウィ ルス力価は３０日目（こは１．５ｘ１０２ｐｆｕ／ｍＬ、４４日目１こは２．５ ｘ１０２１こ過ぎなかった。１０’ｐ　ｆｕ／ｍＬに到達したのは５８日目であ った。トランスフェクションの７２日後に、細胞の大多数が感染し、細胞懸濁液 の力価が１０２ｐ　ｆｕ／ｍＬであることが認められた。
ｐ２Ａ　（Ｘｈｏ　Ｉ）ＲＮＡ転写物（１０’ｐｆｕ／ｍＬ）でトランスフェク ションした細胞により生成されるウィルスの力価は、細胞培養に４型ウイルスを ＭＯｌ　０．１で感染させたときに観察されたものと同じであった。さらに、１ 型／４型キメラ（５ｘ　１０６ｐ　ｆ　ｕ／ｍＬ）でトランスフェクションされ た培養により生成されるウィルスの最高力価は、１型ウイルス（１，５ｘｌＯ’ ｐｆｕ／ｍＬ）をＭＯＩｏ、１で用いて細胞培養を感染させた後に観察されたも のと同じであった。トランスフェクション（１０’ｐｆｕ／ｍＬ）の後に生成さ れる２型／４型キメラの最高力価は、ＭＯＩｏ、５で親２型ウィルスに感染させ た細胞培養により生成されたものと同じであった。
実施例２ キメラ　′　ンパ　の 図３に示すように、子孫ウィルスを調べるために、間接的免疫蛍光検査を実施し た。
図３は、ｖ２Ａ　（ＸｈｏＩ）　、ｖ２Ａ　（ＤＩＷＰ）　、または、ｖ２Ａ（ Ｄ２ＮＧＣ）に感染させたＬＬＣ−ＭＫ！細胞、もしくは非感染細胞上で実施さ れた免疫蛍光検定を示す。モノクローナル抗体は、１：５０〜１：３００の希釈 で用いた。
一方、フルオレセイン接合抗マウス抗体は１：１００で用いた。モノクローナル 抗体の血清型特異性は左側に示されている。
ｖ２Ａ（Ｘｈｏｌ）に感染させた細胞は、ＩＦＡにより、４型デング特異的ｍａ ｂｌＨ１０で染まったが、１型デング特異的ｍａｂ　ＩＦＩまたは２型デング特 異的ｍａｂ　３Ｍ５には結合しなかった。予測されたように、ｖ２Ａ　（ＤＩＷ Ｐ）に感染した細胞はＩＦＩとのみ反応した。ｖ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）に感染し たものは、３Ｈ５のみに染まった。３型デングに特異的なｍａｂ　５Ｄ４は、ど の感染細胞とも反応しなかった。これらの結果は、キメラウィルスの両方とも、 その構造タンパク質遺伝子により特定される免疫原性をあられすことを示した。
期待されるように、４型デング非構造タンパク質ＮＳＩに特異的なｍａｂｌＧ５ は、４型デンゾｃＤＮＡすなわち２Ａ（ＸｈｏＩ）の子孫に感染した細胞を染め た。なお、４型ウイルスに由来するキメラウィルス２Ａ（ＤＩＷＰ）または２Ａ 　（Ｄ２ＮＧＯ）の各々についても同様であった。
親４型デング熱ウィルスの、および、そのｃＤＮＡ由来の子孫ｖ２Ａ（Ｘｈ。
■）のタンパク質は、同型ＨＭＡＦを用いた免疫沈殿検査とその後のポリアクリ ルアミドゲル電気泳動により分析すると、同一のようであった（図４）。図４は 、ウィルス感染ＬＬＣＭＫ２細胞または非感染対照細胞の３８３−メチオニン標 識された溶解物を示し、１型、２型、４型デングに対して作製された高度免疫マ ウス腹水（ＨＭＡＦ）で免疫沈降され、５ＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル （アクリルアミド：ビス＝６０＋１．６）上の電気泳動により分析された。各レ ーンの先頭に、ウィルスが縦に示され、溶解物を免疫沈降させたＨＭＡＦが横に 示されている。マーカー　タンパク質分子サイズマーカーはキロダルトンである 。１型、２型、４型デングのＥおよびｐｒｅ−Ｍグリコタンパク質の位置が示さ れている（図４）。
さらに、親１型デング熱ウィルス（ｗｐ）および２型デング熱ウイルス（ＮＧＣ ）のタンパク質を分析した。１型デングおよび２型デングのＥグリコタンパク質 は共に移動したが、それらは４型デングよりもゆっ（りと移動した。同様に、ｌ 型および２型デングのｐｒｅ−Ｍグリコタンパク質は共に移動したが、やはり４ 型デングのｐｒｅ−Ｍよりもゆっ（りと移動した。Ｅタンパク質の相対的な分子 サイズの相違はほぼ４ｋｄであった。一方、ｐｒｅ−Ｍタンパク質については約 １ｋｄであった。これらＥおよびｐｒｅ−Ｍの分子サイズの相違は、おそらく、 グリコジル化の程度における変化または配座的相違によるものであろう。ｖ２Ａ （ＤＩＷＰ）およびｖ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）ウィルスの免疫沈降されたタンパク 質はハイブリッドパターンを示した。１型デングＨＭＡＦを用いて免疫沈降した Ｖ２Ａ　（ＤＩＷＰ）のｐｒｅ−ＭおよびＥは、親１型デングのｐｒｅ−Ｍおよ びＥと共に移動した。しかし４型デングＨＭＡＦは、４型デング非構造タンパク 質と共に移動したバンドだけを沈降した。親２型デングのｐｒｅ−ＭおよびＥも 同様であったが、４型デングＨＭＡＦは４型ウイルスのものに似ている非構造タ ンパク質を沈降させた。
親４型デング熱ウィルスおよびそのｃＤＮＡ由来の子孫ｖ２Ａ（Ｘｈｏｌ）は、 ＬＬＣ−ＭＫ！細胞（図示せず）上に同様のプラークを生成した。親ウィルスの プラークは、感染の６日後にニュートラルレッドで染色すると明確に目視できた 。
しかし、キメラｖ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）は、その時点では、検出可能なプラーク を生成しなかった。しかしながら、染色を第９日まで遅らせると、非常に小さい Ｖ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）プラークが検出され、これはｖ２Ａ　（Ｘｈｏ　Ｉ）ま たは野生型２型デングＮＧＣのものよりも非常に小さかった（図５）。４型デン グ８１４６６９のプラークは、子孫ウィルスｖ２Ａ（Ｘｈｏｌ）のそれとは異な らなかった。Ｖ２Ａ（ＤＩＷＰ）のプラークは基本的にｖ２Ａ　（ＸｈｏＩ）の ものと同様であった。
図５は、被感染Ｌ　Ｌ　Ｃ−ＭＫｚ細胞の単層を示し、子孫ウィルスｖ２Ａ（Ｘ ｈ。
Ｉ）のものとは異なっている。ｖ２Ａ（ＤＩＷＰ）のプラークは基本的にはｖ２ ２Ａ（Ｘｈｏｌ）のものと同様であった。
図５は、デングウィルスに感染し、ついでアガロースオーバーレイが加えられた ＬＬＣ−ＭＫ、の単層（モルイヤー）を示す（Ｗ、Ｈ，Ｂａｎｃｒｏｆ　を他（ １９７９）Ｐａｎ　Ａｍ、Ｈｌ　ｔｈ、Ｏｒｇ、Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ、第３７５巻 １７５〜１７８頁）。細胞単層の感染の９日後、ニュートラルレッドを重層し、 翌日プラークの写真を撮影した。Ａ：　２Ａ　（ＸｈｏＩ）　、Ｂ　：　２Ａ　 （ＤＩＮＧＣ）、Ｃ１野生型ＮＧＣａ型デング。
実施例３ 乳１マウスに・　るウィルスの キメラｖ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）を、その親ウィルスであるマウス脳適合２型デン グＮＧＣおよびｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）と、マウス神経毒性について比較した。２型 デングＮＧＣはもっとも迅速な致死性をもつことが証明された。接種後第５日ま たは第６日に１０匹のマウスの各々が脳炎で死亡し、平均生存時間は５．１日で あった。一方、キメラｖ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）を接種した１５匹のマウスの各々 は死亡するまで８〜１１日間生存し、平均生存期間９．１日であった（図６）。
図６は、親またはキメラデングウィルス２０００ｐｆｕを、被感染ＬＬＣ−ＭＫ ２細胞を希釈した溶解物の形で脳内接種した生後３日のスイスマウスについて示 す。注射されたマウスの数は＝２型デング（ＮＧＯ）１０匹、ｖ２Ａ　（Ｄ２Ｎ ＧＣ）１５匹、４型デング８１４６６９　１２匹、ｖ２Ａ　（ＸｈｏＩ）１８匹 。陰性対照（マウス１１匹）には非感染細胞の希釈溶解物を注射した。マウスは 、脳炎の徴候および死亡について毎日観察された。
生存分布における差異は大きい（ｐ＝ｏｏｏｏ１、スミルノフ２点統計）。さら に、親ウィルス４型デング８１４６６９は、その子孫ｖ２Ａ　（Ｘｈｏ　Ｉ）と 比較された。親ウィルスを接種した１２匹のマウスのうち５匹が脳炎で死亡し、 最初の死亡は第１１日に起きた。一方、ｖ２Ａ（Ｘｈｏｌ）を接種した１８匹の マウスのうちただ１匹だけが接種の１６日後に死亡し残りは健康を保った。生存 分布は、スミルノフ統計によれば大きく異なってはいない（ｐ＞、１４）が、２ つのグループの生存率はフィッシャー精密試験では異なっている（ｐ＝、０２５ ６）。
このことは、４型デング８１４６６９、または、ウィルス調製におけるピリオン のサブセットが、ある程度の神経毒性を所有していること、および、子孫ウィル スｖ２Ａ（Ｘｈｏｌ）が非神経毒性の下位集団［５ｕｂ−ｐｏｐｕ　Ｉ　ａ　ｔ 　ｉ　ｏｎ３をつくるかクローニングまたはウィルス繁殖の際に生じるヌクレオ チド変化を含むことを示唆している。親１型デング熱ウィルス（ｗｐ）を接種し たマウスと、またはそのキメラ了−孫ｖ　２　Ａ　（Ｄ　ＩＷＰ）を注射した１ ２匹のマウスと、非感染細胞の溶解物を受け入れた１１匹のいずれも、脳炎を起 こさなかったし死亡しなかった。
突然変異分析 我々は、４型デング熱ウイルスゲノムの完全長にわたる一連のデンゾｃＤＮＡイ ンサートをクローン化した。これらは、実施例４にあるように、完全長デンゾＤ ＮＡをクローン化するという最初の試行において用いられた。
実施例４ ＳＰ６プロモーター　むプラスミド　ＢＲ３２２にお（る６　デン　ＤＮＡ　ク ローン化　る　の　−さまざまな４型デングｃＤＮＡインサートを、共有された 制限酵素部位において連結し、ｐＢＲ３２２の同じＰｓｔｌクローニング部位を 用いて、完全長デンジＤＮＡコピーを形成した。インビトロ転写のために、ＳＰ ６ポリメラーゼプロモーター配列を、デンゾ配列の前の５°末端に配置した。Ｒ ＮＡ転写物の予測された５′配列は図７に示されている。第１のデンゾヌクレオ チドのＡ残基は、Ｇで始まる正常ＳＰ６ポリメラーゼ転写物の直後に位置してい る。ゲノムＲＮＡの５°末端に存在するｍ７Ｇキヤツプ構造は、転写反応にｍ７ ＧｐｐｐＧ類似物を添加することにより得られる。このようなりＮＡ構造は、５ ′末端に付加ヌクレオチドを含むデンゾＲＮＡを生成することになるだろう。ラ ンオフ［ｒｕｎ−ｏｆｆ］転写物を作製するために、唯一のＡｓｐ７１８開裂配 列が、デンゾ配列の３′末端に導入された。図７に示すように、鋳型鎖中には、 Ａｓｐ７１８開裂部位の前に５個の付加ヌクレオチドが存在する。転写が最後の ヌクレオチドに進むと、ＲＮＡ転写物には、３゛末端におけるこれらの５個の付 加残基が含まれることになる。
形質転換のための宿主として大腸菌株ＨＢ　１０１を用いたこの研究中に気づい たことは、完全長デンゾＤＮＡを含むプラスミドは、再配列を経た多くの形質転 換体におけるプラスミドとしてしばしば不安定であり、予測された制限酵素パタ ーンをもつクローンＤＮＡを単離するためには多数のコロニーをスクリーニング しなければならないということである。我々は、異なる大腸菌株により作製され るプラスミドの安定性を調べた。研究室ですでに用いられていた、形質転換に高 度に適した市販の大腸菌株ＤＨ５αおよび大腸菌株ＤＢ１５２８を、大腸菌株Ｈ Ｂ１０１と比較した。ＤＢ１５２８株は、ＢＨＩＯＩよりもコロニーサイズが３ 〜４倍大きい形質転換体を産生した。特に、ＤＢ１５２８の形質転換体は、一般 に、予測された制限酵素パターンをもつプラスミドを産生じ、このことは、大腸 菌株ＤＢ１５２８が、安定的にクローン化されたデンゾ完全長ＤＮＡを生成する ための優秀な株であることを示唆している。しかしながら、トランスフェクショ ン細胞上で試験した場合、この第１の完全長デンジＤＮＡクローンから作製され たインビトロＲＮＡ転写物は、デング熱ウィルスを産生じなかった。ここで、免 疫蛍光検定により検出されるように、１００倍低い濃度の、陽性対照としてのピ リオンＲＮＡはデング熱ウィルスを産生じた。
実施例５ ５は　るＤＮＡ　ローン　いた　６　にお番るデン　ＤＮＡセ　メントの 感染性ＲＮＡ転写物を産生できないのは、完全長クローンにおける欠陥突然変異 の存在によるものであると説明された。このような突然変異は、ウィルス株にお ける欠陥集団のクローニングまたはプラスミドのクローニングまたは繁殖の際の 結合エラーから生じると推定される。我々は、１つ又はそれ以上の欠陥突然変異 を含むデングＤＮＡセグメントを、独立にクローン化したデンジＤＮＡ構築物か らの対応するセグメントで置換することに決定した。系統的な置換実験のための フレームワークとして、デング配列の５′および３゛断片を別々にクローン化し た。ヌクレオチド５０６９における唯一のＢｓ　ｔＢ１部位を用いて、完全長デ ング配列を、各々ゲノムの約５０９６を示す２つの断片に分離した。ＳＰ６プロ モーターを含む第１の完全長クローンの５゛断片は、５’−１と呼ばれ、Ｂｓ　 ｔＢｌとＡｓｐ７１８の間の残りの３゛配列は３°−Ａと呼ばれた。第２の５゛ 断片５′−２を含むプラスミドは、独立に由来するひと組のデングｃＤＮＡイン サートから構築された。唯一のＡｓｐ７１８部位は、デング配列のＢｓｔＢ１部 位の下流のｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に導入された。このように、このプラス ミドは、完全長ＤＮＡ構築物に３゛断片を挿入するためのクローニングベクター としても適している。２つの付加３゛断片３°−Ｂおよび３゛−ｃも、デングｃ ＤＮＡインサートの独立したひと組から構築された（図８）。第１の完全長クロ ーン化集団の３゛断片を３’　−Ｂおよび３°　−Ｃ断片で置換すると、２つの 別の完全長クローンＩＢおよびＩＣが作製された。同様に、３つの完全長ＤＮＡ 構築物すべてにおいて５゛断片を５゛−２断片で置換すると、３つの別の完全長 クローン、すなわち、２Ａ、２Ｂ、２Ｃが生成された。これらのプラスミドをＢ ｇｌｌＩ、Ｎ実施例７ ｓ　ｉ　Ｌ　Ａｓｐ７１８で消化すると、図９に示されるように、６個の完全長 クローンすべてについて区別不可能な、予測されたＤＮＡ断片のパターンを示し た。
このように、大腸菌株ＢＤ１５２８中の完全長デングＤＮＡ配列を明らかに含む プラスミドの増殖に成功することによって、培養細胞における感染性の評価のた めのインビトロＲＮＡ転写物の生成が可能となった。
実施例６ インビトロで　さ　たＲＮＡ　の感　こついての　の構築された完全長デンジＤ ＮＡ鋳型から生成されたＲＮＡ転写物は、ＬＬＣ−ＭＫ２のトランスフェクショ ンにより、感染性についてそれぞれ試験された。デング感染細胞は、間接的免疫 蛍光検定により検出されるとおり、２Ａ　ＲＮＡでのトランスフェクションの１ ０日後に容易に観察された。他の４つの完全長ＤＮＡクローンからのＲＮＡ転写 物は、この検定では陰性であり、これらのＤＮＡクローンは、クローンＩＡのよ うに、制限酵素分析では検出できない致死突然変異を含んでいることが示された 。
上述したデング熱ウィルス感染細胞の陽性判定に加えて、感染性デング熱ウィル スを、培地または２ＡＲＮＡトランスフエクシヨン細胞の細胞溶解物がら回収し た。トランスフェクション細胞溶解物中に存在するデング熱ウィルスの力価は１ ０’ｐｆｕ／ｍＬであった。２Ａ　ＲＮＡ転写物をＤＮａｓｅｌを用いて処理し た場合、その感染性には影響がなかったが、ＲＮａｓｅ処理ではその感染性は完 全に損なわれた。ＲＮＡを用いた細胞モルイヤーのトランスフェクションの後、 デング熱ウィルスのプラーク形成は行なわれなかったため、ウィルスの生成は、 ウィルス増幅のための延長されたインキュベーションの後で判定された。この間 接的免疫蛍光検定手順を用いて、感染性は、ゲノムＲＮＡ１ｎｇまたは２Ａ　Ｒ ＮＡ転写物１０ｎｇの最小濃度において検出された。この試験のこれらの結果は 、クローン２Ａから作製されたＲＮＡ転写物が、受容培養細胞のトランスフェク ションの後で、感染性を持つことを示している。
がクローン化集団を提供することを示唆している。子孫ウィルス感染細胞および ＲＮＡ　の　についてのその　の証 クローン３Ａ　ＲＮＡ転写物でトランスフェクションした細胞により、感染性デ ング熱ウィルスが生成されたことを正式に証明するため、デングゲノムのヌクレ オチド３４７３に新たなＰｓｔ１部位を創製するがアミノ酸配列には影響しない ２つの突然変異（Ｇ３４７３−→ＴおよびＣ３４７６−→Ｔ）を、完全長デング クローン２Ａ　ＤＮＡに導入した。この突然変異ＤＮＡから作製されたＲＮＡ転 写物を、ＤＮａ　ｓ　ｅ　Ｉを用いた消耗性消化によりＤＮＡ鋳型を完全に除去 したのち、細胞のトランスフェクションに用いた。トランスフェクションされた 細胞は感染性デング熱ウィルスを生成した。子孫ウィルスから抽出されたゲノム ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡ産物をＰＣＲのための鋳型として用いて、ヌクレオ チド３１９３〜４５３６の間にＤＮＡ断片を生成した。図１０に示すように、Ｐ ＣＲＤＮＡ産物のＰｓｔｌ消化は、ＰｓｔＩ開裂配列の存在により予測されるよ うに、それぞれ２８０個および１０６３個の塩基対の長さの２つの断片を産生じ た。
２Ａ　ＲＮＡ由来のウィルスの対照ＰＣＲＤＮＡ産物は、Ｐｓｔｌ消化に対して は非感受性であった。この観察は、突然変異体２Ａ　ＤＮＡのＲＮＡ転写物に由 来する子孫ウィルスがＰｓｔ１部位を含むことの証拠を提供した。
実施例８ インビトロ−で転写されたｆ　ＲＮＡか口　されたデング執ウィルスクローン２ Ａまたはクローン２Ａ　（Ｐｓ　ｔ）鋳型から作製されたＲＮＡ転写物を用いて トランスフェクションした細胞の溶解物から子孫デング熱ウィルスを分離し、Ｌ 　Ｌ　Ｃ−Ｍ　Ｋ　を細胞単層上でのプラーク形成能力について、親・野生型ウ ィルスと比較した。感染の６日後、子孫ウィルスおよび親ウィルスは、ともに、 さまざまな大きさの特徴的なデングプラークを生成した。蚊細胞内の継代培養に より増殖した親ウィルスでは圧倒的に小型プラークがみられた。一方、子孫ウィ ルスでは混合的でありしかし主に大きいプラークが生成され、回収されたウィル ス親ウィルス感染細胞において生成されたデング特異タンパク質についても比較 を行なった。図１１に示すように、デング高度免疫腹水により沈殿させたＰ　ｒ 　ｅ　ＭｓＥ、ＮＳＩ、ＮＳ２、およびその他未決定のデングタンパク質バンド のプロフィールは、子孫ウィルスおよび親ウィルス双方について識別不可能であ るように見えた。この結果は、回収されたデング熱ウィルスが、ｃＤＮＡクロー ンが由来するもとのウィルスと同じ遺伝子型および表現型を呈することを示すも のである。
Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂接合部におけるアミノ酸置換による活性デング熱ウィルス の加工 実施例９ 真正［ａｕｔｈｅｎｔ　ｉｃ］　ＮＳＩの発現のために構築された中間組換えｐ ＳＣｌ　１−Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ　ＤＮＡをこの研究に用いた。デング熱ウィルス ＤＮＡは、２４アミノ酸Ｎ末端信号のためのコード配列と、ＮＳＩおよびＮ５２ Ａの完全ポリペプチド配列を含んでいた。まず、このプラスミドＤＮＡを、突然 変異を含むＤＮＡセグメントの置換を容易にするために改変した。２つのサイレ ントな突然変異が、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、Ｎ５Ｉ−Ｎ Ｓ２ＡＤＮＡ　（Ｇ、４□、−ＴおよびＣロアロ→Ａ）に導入された。これらの 変更は、ヌクレオチド（ｎｔ）３４７６に新たなＰｓｔＩ部位を作製した。組換 えプラスミドは、デングＮＳＩコード配列中のｎｔ３３２０に唯一のＮｃｏ１部 位を含んでいた。
Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂接合部はｎｔ３４７７に位置している。開裂部位配列にア ミノ酸置換を導入するために、オリゴヌクレオチド誘発突然変異により、ヌクレ オチド変更を行った。一連のオリゴヌクレオチドを合成し、ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）における角鋼プライマーとして用いた。玉鎖プライマーは、５°　 ＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣＡＡＡ３’　（配列番号１）であり、Ｎｃｏ１ 部位の上流に位置していた。たとえば、開裂位置−２（Ｔｈ　ｒ　目２４）にお いて、オリゴＧＣＣＣＴＧ　ＧＣＣＧＧＣＣ：ＴＴ　ＣＡＣＣＴＧＴＧＡ　ＴＴ Ｔ　ＧＡＣＣＡＴ（配列番号２）が、ＴｈｒをＬｙｓで置換するために用いられ た。同様にして、オリゴＧＣＣＣＴＧ　ＧＣＣＧＧＣＣＴＧ　ＣＡＣＣＴＧ　Ｔ ＧＡ　ＴＴＴ　ＧＡＣＣＡＴ（配列番号３）が、ＴｈｒをＧｉｎで置換するため に用いられ、オリゴＧＣＣＣＴＧ　ＧＣＣＧＧＣＣＡＧ　ＣＡＣＣＴＧ　ＴＧＡ 　ＴＴＴ　ＧＡＣＣＡＴ（配列番号４）が、ＴｈｒをＬｅｕで置換するために用 いられた。同様に、オリゴＴＴＣＴＧＡ　ＴＧＴ　ＧＣＣＣＴＧ　ＴＴＣＧＧＣ ＣＧＴ　ＣＡＣＣＴＧＴＧＡ　（配列番号５）が、開裂位置＋１においてＧＩｙ 目１ｏをＧｌｕで置換するために用いられ、あるいは、オリゴＴＴＣＴＧＡ　Ｔ ＧＴ　ＧＣＣＣＴＧＣＣＡ　ＧＧＣＣＧＴ　ＣＡＣＣＴＧ　ＴＧＡ（配列番号６ ）が、開裂位置＋１において同じＧＩｙをＴｒｐで置換するために用いられた。
特定された突然変異を含む中間組換えＤＮＡの構築のため、あらたに作製された Ｐｓｔ１部位と唯一のＮｃｏ１部位の間のＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩおよびＰｓｔ ｌで開裂されたＰＣＲＤＮＡ産物のシリーズで置換した。これらの突然変異体Ｎ ５Ｉ−ＮＳ２Ａ配列を発現する組換えワクシニアウィルスは、すでに説明された 手順（Ｂ、Ｚｈａｏ、Ｇ、Ｐｒ　１ｎｃｅＳＲ，Ｈｏｒｓｗｏｏｄ、に、Ｅｃｋ ｅ　Ｉ　ｓＳＰ、ＳｕｍｍｅｒｓＳＲ，Ｃｈａｎｏｃｋ、およびＣ，Ｊ、　Ｌａ ｉ　（１９８７Ｌ組換え体ワクシニアウィルスにょるデング熱つィルス構造タン パク質および非構造タンパク質ＮＳＩの発現、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、第６１巻４０１ ９〜４０２２頁）にしたがって作製された。
実施例１Ｏ Ｎ５上二Ｎ５２Ａ接ム。にお（る　の ６穴プレート内のコンフルエントＣ■−１細胞を、細胞あたり５ｐｆｕの組換え ワクシニアウィルスに感染させ、最小必須培地に２％ウシ胎児血清（ＭＥＭ２） を加えた中に保持した。感染の１６〜２０時間後、培地を取り出してメチオニン 非含有ＭＥＭ２とともに置いた。１時間のインキュベーションの後、この培地は 、ふたたび、１００μの３５８メチオニン（比放射能＞８００μ／ｍｏ＋）を含 む０．７ｍＬのメチオニン遊離ＭＥＭ２とともに置かれた。２時間の標識期間の 後、ＲＩＰＡ緩衝液（デオキシコール酸ナトリウム１％、Ｎｏｎ１ｄｏｔＰ−４ ０を１９６、硫酸ドデシルナトリウム［ＳＤＳ］０．１％、Ｏ，ＩＭ　＋−’Ｊ ス塩酸、ｐＨ７，５，０，１５ＭＮａＣＩ）に細胞を溶解し、溶解物を遠心分離 して細胞砕片を除く。溶解物の澄んだ上澄み液に対して、デング高度免疫マウス 腹水（ＨＭＡＦ）を用いた免疫沈降検査を行ない、デング熱ウィルスを分析した 。免疫沈殿物は、５ＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビ ス比６ｏ：１６）上の電気泳動分離により分析された。標識されたタンパク質バ ンドは、蛍光撮影により視覚化された。非開裂Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａ前駆体および開 裂ＮＳＩ産物に対応するゲルバンドが切り出され、液体シンチレーションカウン ターで放射能が計測された。
Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ接合部における開裂の程度を判定するために、発現したＮ５ｌ −ＮＳ２Ａの総標識は、同じｐｆｕ使用で各突然変異体に感染した細胞において 同じであるという仮定にもとづいて、Ｎ５Ｉ−ＮＳ２ＡおよびＮＳＩの間の免疫 沈降能力差を補正した。野生型Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａは、開裂されたＮＳＩを優勢的 に発現し、Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ前駆体は検出されなかった。野生型ウィルスについ ての開裂度を１００９６と定めた。
実施例１１ ＮＳＩ−ＮＳ２八開ン配ダにお（るアミノ　ｍわζ支秦完全“４型デン　ｃＤＮ Ａの 前項において構築され分析された、Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａ接合部における開裂度が低 下したＮ５Ｉ−ＮＳ２Ａ　ＤＮＡの突然変異体は、このようなアミノ酸置換を含 むデング熱ウィルス突然変異体の構築のために選抜された。すでに構築された以 下の４つの突然変異が採用された。（１）開裂位置＋１におけるＧｌｙをＧｌｕ に置換、（２）−２位置のＴｈｒをＬｙｓに置換、（３）−２位置のＴｈｒをＧ ｉｎに置換、（４）−２位置のＴｈｒをＬｅｕに置換。突然変異体ｐｓｃｌｌ− ＮＳ１−ＮＳ２Ａ　ＤＮＡを、ｎｔ３３３８の５ｐｅｌおよびｎｔ３６１６の５ ｔｕｌで消化し、２７８個を断片として分離した。突然変異を含むこのＤＮＡ断 片は、デングｃＤＮＡ配列の５°側半分を含むプラスミドル５°−２内の対応す る野生型ＤＮＡ断片の置換に用いられた。ＢｓｔＥｌ　（ｎｔ５０６９）と３゜ 末端のＡｓｐ７１８の間の残りの３゛デングｃＤＮＡ断は、共有制限酵素開裂部 位においてｐ５’−２ＤＮＡに連結された。このようにして、完全長ｃＤＮＡが 作製され、ｐＢＲ３２２ベクターを用いてクローン化された。このシリーズのｃ ＤＮＡは、Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂接合部にアミノ酸置換をコード化する突然変異 された配列を含んでいた。
実施例１２ ■昼にｙ５スＡ狽今部仁お（る　適でない　呈　る土製デング熱ウィルス　然 ここで重要なことは、デング熱疾病に対する安全で効果的な弱毒化生菌ウィルス ワクチンの開発に、デング熱ウィルスの分子理解を応用することである。デング 熱ウィルス複製の制限は弱毒化を誘起するであろう。開裂配列またはウィルスプ ロテアーゼ構成要素の改変の結果、ウィルスポリタンパク質の開裂は最適以下と なり、ウィルス増殖が制限される。
ポリタンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂部位は、その非効率的開裂の故に、増殖制 限されたデング熱ウィルス突然変異体を構築するための第１のターゲットとして 選択された。我々は、４型デング熱ウイルスのＮ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂には、開裂 接合部の前のＮＳＩのＣ末端に８アミノ酸配列が必要であることを証明した（Ｈ ，ＨｏｒｉおよびＣ，Ｊ、Ｌａｉ　（１９９０）、デング熱ウィルスＮ５Ｉ−Ｎ Ｓ２Ａの開裂には、ＮＳＩのＣ末端にオクタペプチド配列が必要である。Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ　第６４巻４５７．３〜４５７７頁）。
ワラビウイルス間で８アミノ酸配列を比較すると、Ａｌａ　（−１）　、Ｖａ　 １（−３Ｌ　Ｓｅｒ　（−５）、Ｖａｌ　（−７）、Ｍｅｔ／Ｌｅｕ−８）は正 確に保存されるのに対し、Ｔｈｒ　（−２）、Ｇｉｎ　（−４Ｌ　Ｌｙｓ　（− ６）は変化するという興味深い特色が明らかになった。位置−１のＡｌａ、位置 −２のＴｈｒ。
位置−３のＶａｌ、位置＋ｌのＧＩｙのアミノ酸置換の効果を分析した。この分 析の結果は図１６に示されている。保存された位置−１または−３におけるアミ ノ酸置換は、低レベルの開裂を生じた。非保存位置−２または＋１におけるアミ ノ酸置換は、効果がないかもしくはご（おだやがな開裂低減を呈した。
ある範囲の開裂効率を生じたアミノ酸置換のパネルを、完全長ｃＤＮＡへの組み 込みのために選抜し、インビトロ由来ＲＮＡ転写物をデング熱ウィルス突然変異 体の構築のために用いた。１つのデング熱ウィルス突然変異体は、Ｇｌｙ（＋１ ）のかわりにＧｌｕを含むＤＥＮ４　（Ｇ　Ｉ　ｙ＋＋２ａ＝Ｇ　Ｉ　ｕ）であ り、他の３つの突然変異体は、ＤＥＮ４　（Ｔｈｒｘｔａ−＋Ｌｙｓ）　、ＤＥ Ｎ４　（Ｔｈｒ＋＋ｘａ＝Ｇ　Ｉ　ｎ）　、ＤＥＮ４　（Ｔｈ　ｒ　１１２４” Ｌ　ｅ　ｕ）であり、Ｔｈｒ（２）の置換を含んでいる。これらはトランスフェ クションしたＬＬＣＭＫ２細胞がら回収された。
以下に述べるように、これらの突然変異体の増殖特性は、蚊Ｃ６／３６細胞上の プラーク検定により調べられた。図１２はＤＥＮ４　（Ｇ　Ｉ　Ｙｌ＋！４→Ｇ ｌｕ）および対照親ウィルスに対するこの検定の結果を示す。突然変異体ウィル スのプラークサイズは直径約０．１ｃｍが計測され、親ウィルスの１．１ｃｍの プラークサイズと比較して大きく縮減していた。その他のデング熱ウィルス突然 変異体もプラークサイズの縮減を示し、これらのウィルスが培養細胞において増 殖制限を示すことを示唆している。最適以下の開裂に起因する増殖制限は、感染 宿主におけるウィルス毒性に対して、大きな効果をもつようである。
活性デング熱つィルス３′非コード領域欠失突然変異体の加工実施例１３ １二非ユニ下頌域に５、むデン　ｃＤＮＡのヌクレオチド３８４個の３′非コー ド領域への欠失突然変異の導入を容易にするために、まず、ｎｔｌｏ１０４の唯 一のＢａｍＨＩ部位と３°末端のＡｓｐ７１８部位の間の４型デングｃＤＮＡの ５４０ｎｔのサブフラグメントを、ｐＧＥＭ３クローニングベクターに挿入した 。この組換えプラスミドにおいて、４型デング配列のｎｔ１０４７０の唯一のＡ ｐａ１部位は、３゛非コ一ド配列のほぼ中心点に位置している。この便利な位置 にあるＡｐａ１部位を用いて、２つの欠失突然変異配列を構築した。すなわち、 構築物の１つの配列は、Ａｐａ１部位の下流に欠失を含んでいた。他の配列の欠 失はＡｐａＩ部位の上流に位置していた。
ヌクレオチド３０〜９０個の長さをもっ欠失突然変異の第１の配列を加工するた めに、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発が実施された。
Ａｐａ　Ｉ開裂部位に指定された適当な欠失を含み、下流配列が続く以下のオリ ゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおける玉鎖プライマーとして用いた。
オリゴＣＡＡ　ＡＡＧ　ＧＧＧ　ＧＣＣＣＡＡ　ＧＡＣＴＡＧ　ＡＧＧＴＴＡ　 ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣ−（Δ３°　１７２−１４３）（配列番号７）オリゴＣ ＡＡ　ＡＡＧ　ＧＧＧ　ＧＣＣＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＣＡＧＣＡＴ　ＡＴＴ 　ＧＡＣＧＣＴ　ＧＧＧ−（Δ３’　１７２−１１３）（配列番号８） オリゴＣＡＡ　ＡＡＧ　ＧＧＧ　ＧＣＣＣＡＡ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＴＣＣＴＧＣ ＴＧＣＴＧＴ　ＣＴＣＴＧＣ−（Δ３’　１７２−８３）（配列番号角鋼プライ マーは、オリゴＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＣＣＴＧＴＴ　ＧＧ Ａ　ＴＣＡ　Ａ（配列番号１０）であり、これは、３゛デング配にＡｓｐ７１８ 開裂配列がつづいたものを含んでいる。完全長４型デングｃＤＮＡ（クローン２ Ａ）を鋳型として用いた。これらの欠失突然変異を４型デング配列に導入するた めに、ｐＧＥＭ３組換えプラスミド中のＡｐａｌおよびＡｓｐ７１８部位の間の 野生型ウィルスＤＮＡ断片を、ＡｐａｌおよびＡｓｐ７１８で開裂したＰＣＲＤ ＮＡ産物で置換した。
同様に、ヌクレオチド６１〜２０２個の長さをもつ欠失突然変異の第２の配列を 加工しＡｐａ１部位の上流に配置するために、オリゴヌクレオチド特異的突然変 異誘発を施した。下記のオリゴヌクレオチドが合成され、ＰＣＲにおける角鋼プ ライマーとして用いられた。
オリゴＣＣＴ　ＧＧＣＴＴＧ　ＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡ　ＣＡＧＣＴＴ　ＣＣ Ｇ　ＴＧＧ　ＣＧＣ−（Δ３’　、２４３−１８３）（配列番号１１）オリゴＣ ＣＴ　ＧＧＣＴＴＧ　ＧＧＣＣＣＣＧＧＡ　ＧＣＴ　ＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＧ 　ＧＴＴ−（Δ３°、３０３−１８３）（配列番号１２）オリゴＣＣＴ　ＧＧＣ ＴＴＧ　ＧＧＣＣＣＣＣＧＴ　ＧＧＣＡＣＡＡＧＴ　ＧＧＣＣＴＧ　ＡＣＴ−（ Δ３’　、３３３−１８３）（配列番号１３）オリゴＣＣＴ　ＧＧＣＴＴＧ　Ｇ ＧＣＣＣＣＴＴＡ　ＣＡＧ　ＡＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴ　ＣＴＣＴＧＡ−（Δ３ ’　、３８４−１８３）（配列番号１４） 玉鎖プライマーはオリゴＧＣＣＴＣＣＡＴＧ　ＧＣＣＡＴＡ　ＴＧＣＴＣＡＧＣ （配列番号１５）であり、これは、Ｂａｍ８１部位の上流のヌクレオチド９８８ ５〜９９０７の間に位置している。完全長４型デングｃＤＮＡを鋳型として用い た。先に説明したように、これらの欠失突然変異を４型デング配列に導入するた めに、中間体ｐＧＥＭ３プラスミド中のＢａｍＨＩおよびＡｐａ１部位の間の野 生型ウィルスＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩおよびＡｐａｌで開裂したＰＣＲＤＮＡ 産物で置換した。ｃＤＮＡ鋳型を加工する最終段階において、構築物の両方の配 列からのＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７１Ｂ断片が分離され、残りの４型デング配列でク ローン化された。
実施例１４ ＲＮＡ　トーンスフェ　シ　ン′よび　イルスのロデング熱つィルスｃＤＮＡク ローンは、３゛末端におけるＡｓｐ７１８での消化により線状化され、線状ｃＤ ＮＡは、ＳＰ６ポリメラーゼによるインビトロ転写のための鋳型として用いられ た。ＲＮＡ転写物による細胞のトランスフェクションは、先に説明されているよ うに実施された（Ｌａｉ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　Ｉ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁（１９９１））。トラ ンスフェクションの１０日後、細胞をトリプシン処理し、６穴プレートおよびチ ェンバースライドに移した。２日後、免疫蛍光検査（ＩＦＡ）により、デングウ ィルス抗原の形跡について、スライド上の細胞を試験した。ＩＦＡにより大半の 細胞が感染したことが示された場合には、６穴プレート上の感染細胞は、培地を 取り出し、細胞を掻き取り、標準容積の５０％イーグル最小必須培地１５０％血 清に再懸濁し、凍結させることにより、収穫された。一方、陽性の細胞の割合が 小さい場合には、細胞をトリプシン処理し、新鮮な媒地中に１：３で希釈し、増 殖させた。感染細胞の割合は週ベースで算定され、細胞溶解物を収穫した。
実施例１５ プ之二久形聾戟察 ウィルスは、ＬＬＣＭＫ２細胞または蚊Ｃ６／Ｃ３６細胞上のプラーク形態につ いて調べられた（Ｂａｎｋｃｒｏｆｔ他、Ｐａｎ　Ａｍ、Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇ ａｎ、Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ、第３７５巻１７５〜１７８頁（１９７９）；Ｈｏｋｅ 他、Ａｍ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、）（ｙｇ、第４３巻２１９〜２２６頁（１９ ９０））。プラーク形態の分析の前に、親・野生型ウィルスは、ＬＬＣ−ＭＫ！ 細胞中で１回、継代培養された。すなわち、２９６ウシ胎児血清を含む培地１９ ９中に試験すべきデングウィルス０．２ｍＬを連続１０倍希釈し、これを２５ｃ ｍ′ビンに入れたＬＬＣＭＫ２細胞に注入した。３５℃で１時間の吸着の後、各 単層に、１×培地１９９．０３９６重炭酸ナトリウム、１／２×イ一グル基本培 地ビタミン、１／２Ｘイ一グル基本培地アミノ酸、１０９６ウシ胎児血清、０． ５％アガロースを含む７ｍＬのアガロースを重層した。３５℃で６日間のインキ ュベーションの後、このビンに、０．５％ＭＥアガロースおよびｌニア、５００ ニユートラルレツドを含む通常生理食塩水４ｍＬを２回目のオーバーレイとして かけた。染色から２４時間以内にウィルスプラークがあられれた。Ｃ６／３６細 胞上のプラーク形態観察を行ない、分離されたすべてのウィルス突然変異体が調 べられた。この目的のため、７５ｃｍ２ビンに入れたのコンフルエントなＣ６／ ３６細胞に、２？６ウシ胎児血清を加えたＭＥＭに連続的に希釈された０、５ｍ Ｌのウィルスを接種し、１〜２時間３５℃で吸着させた。つぎに被感染細胞に、 ２０ｍＬ／フラスコのアガロース（ｌｘバンク平衡食塩溶液、０．５％ラクトア ルブミン加水分解物、１０９６ウシ胎児血清、０．１２％重炭酸ナトリウム、０ ．７５％Ｓｅａｋｅｍ”　ＧＴＧアガロース）を重層した。培養を３５℃で７日 間、インキュベートした。つぎに、ＮａＣｌ　８、Ｏｇ／Ｌ、ＫＣＩ　０．４ｇ ／Ｌ、グルコース１．Ｏｇ／ＬＳＮａｚＨＣＯ＊　２２．５ｍｇ／Ｌ、：、−ト ラルレッド３．３ｍｇ／Ｌからなるニュートラルレッド染色液５ｍＬを用いて培 養物を染色した。３５℃で３〜５時間のインキュベーションののち、余分の染色 液を取り除き培養物はインキュベータに戻した。一般に、インキュベータ内で２ ４〜３６時間経過した後プラークがあられれた。
実施例１６ 、Ｅｆコード　に　４　デン　ウィルス　孝ここで、デング組換えＤＮＡ系によ り、ウィルスＤＮＡの５′および３°非コード領域ならびにコード領域における 欠失を含むデングウィルス突然変異体を構築することも可能となる。欠失突然変 異体は、アミノ酸置換突然変異体よりも、表現型の復帰が起きることが少ないと いう利点を提供する。４型デング熱ウイルスゲノムの３゛非コード領域における 欠失突然変異の加工において進展がみられた。他の蚊媒介ワラビウイルスと同様 に、４型デング熱ウイルスは、保存配列１（Ｃ３−１）および保存配列２　（Ｃ ３−２）と呼ばれる伸張した保存配列と、３°非コード領域内の末端ステムアン ドループを取り得る構造を含む。
ヌクレオチド３０〜１２０個の範囲の欠失は、４型デング熱ウイルスＲＮＡのヌ クレオチド３８５個の３′非コ一ド配列のさまざまな位置において作製された。
Ｃ３−１領域に配列を欠いていても、ステムアンドループ構造は維持しているＣ ＤＮＡクローンから転写された突然変異体ＲＮＡは、子孫ウィルスを生成せず、 これは、欠失ウィルスがほとんどの他の欠失構築物から回収されたことを示唆し ている（図１３）。これらの突然変異体および野生型ウィルス対照のプラーク検 定はＣ６／３６細胞上で実施された。
この分析の結果、これらの突然変異体のほとんどが、欠失の位置と程度に応じて １．０〜０．３ｃｍの範囲の縮減サイズのプラークを形成したことが示された（ 図１４および１５）。プラーク形態の変化は、これらの欠失突然変異体が増殖制 限表現型をあられしたことを示すものである。この欠失突然変異体のパネルは、 実験動物およびヒトに対する毒性低減など、その他の興味深い潜在的に重要な特 性をみせる。
実施例１７ 完全′キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４　ｃＤＮＡおよびキメラウィルスの生すでに、 ＴＢＥＶ　（Ｓｏ　ｆ　ｊ　ｉ　ｎ株）のサブゲノムｃＤＮＡ断片がクローン化 され、ヌクレオチド配列が決定された（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌ。
ｇｙ　（１９９０）参照）、ＴＢＥＶ配列のヌクレオチド（ｎｔ）７６〜１９７ ７を含むプラスミドｐＧＥＭ２−ＣＭＥおよびヌクレオチド９６６〜３６７２を 含むｐＧＥＭ２−ＥＮＳｌは、Ｅ、Ｙｕ、Ｄｏｂｒｉｃｏｖａ博士（Ｎｏｖｏｓ ｉｂｉｒｓｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ、ロシア）により、共有される制限酵素部位においてＴＲＥＶセグメン トを連結することにより、プラスミドｐ１０、ｐ４、ｐ１８、ｐ２、ｐＨから（ 前出のＰｌｅｔｎｅｖ他）提供された。プラスミドＤＥＮ４　ｐｓｏ−２および ｐ５’　−２（ΔＰｓｔｌ、Ｘｈｏｌ）および誘導体ｐ５’　−２（ΔＰｓｔｌ 。
Ｘｈｏｌ、ΔＨｉｎｄｌｌｌ）（前出のＢｒａｙ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、（１９９１））が、対応するＤＥＮ４遺伝子に代えて １つ又はそれ以上のＴＢＥＶ遺伝子を置換するための組換えｃＤＮＡ構築物とし て、用いられた。合成オリゴヌクレオチド（オリゴ）は、ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）により２本鎖ＤＮＡを生成するための負または玉鎖プライマーとして 用いられた。ＰＣＲ特異的部位特異的突然変異誘発により、制限酵素開裂配列を 、ＴＢＥＶおよびＤＥＮ４遺伝子間接合部またはその近くに導入した（図１７） 。まず、示されたＴＢＥＶ遺伝子を含む７個の中間キメラプラスミドが構築され 、安定な完全長ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４　ｃＤＮＡが、大腸菌株ＢＤ１５２８　（前 出のＬａｉ他（１９９１）により説明されている）の形質転換後に同定された。
各プラスミド内のＴＢＥＶおよびＤＥＮ４遺伝子の間の接合部を囲む配列は、分 子生物学の分野で公知の技術を用いた核酸配列決定により確認された。すべての キメラプラスミドは、第１のＤＥＮ４ヌクレオチドであるＡ残基が続く転写開始 点Ｇの上流に位置するＳＰ６プロモーターを含んでいた。インビトロ転写の前に 、ＤＥＮ４配列の３′末端の直後の唯一のＡｓｐ開裂部位において、プラスミド を線状化した（前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ　（１９９１）に説明された技術を用いて）。キメラウィルスの回収とその 特性の研究は、ＢＬ−３封じ込め設備において実施された。転写反応は、実質的 に、前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　（ １９９１）に記載されているように実施された。トランスフェクションの前に、 ３７℃で１５分間、４０ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅｌを用いて転写混合物を処理した 。つぎに、ＲＮＡ転写物は、（ｉ）前出のＬａｉ他によりすでに述べられている Ｌｉｐｏｆｅｃｔ　ｉｎ”（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　ＩｎＣ０）、または（ｉｉ）　Ｎ　−［１−（２，３−ジオ レオイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサル フェート（ＤＯＴＡＰ）（Ｂ。
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ）の存在のもとで、セミコンフルエント なサルＬＬＣＭＫｘ細胞のトランスフェクションに用いられた。ＤＯＴＡＰ　ト ランスフェクション条件のもとで、トランスフェクション混合物は、０．０２ｍ ＭのＨｅｐｅｓ緩衝液４０μＬ、ｐＨ７，０５中にＲＮＡ転写物（２μｇ）、お よび、Ｈｅｐｅｓ緩衝液３０μＬ中にＤＯＴＡＰ　１２μＬを含んでいた。室温 において１０分間のインキュベーションの後、１０９６のウシ胎児血清（ＦＢＳ ）を含む２ｍＬの培地１９９を添加した。混合物０．５ｍＬを、２４穴プレート の４つのウェル中の半融合性細胞に分注した。１０日後、細胞をトリプシン処理 し、６穴プレートとチェンバースライドに移し、さらに２日間、増殖培地におい てインキュベーションした。スライド上の細胞を免疫蛍光検定（ＩＦＡ）により 試験し、１：１００希釈のＤＥＮ４特異高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）　、Ｔ ＢＥＦ特異的ＨＭＡＦ、またはＴＢＥＶ特異的ウサギ血清（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 　ｏｆ　Ｐｏ＋ｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、ロシア、モスクワのＡ、Ｓ、Ｋａｒａｖ ａｎｏｖ博士の好意により提供された）を用いてＤＥＮ４またはＴＢＥＶ抗原の 存在を検出した。フルオレセイン接合抗マウスまたは抗ウサギ血清（Ｋｉｒｋｅ ｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ、メリーランド州Ｇａｉ　ｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）を同一 希釈で用いた。
ＩＦＡにより５０〜８０９６の細胞が感染したことが示された場合には、６穴プ レート内の細胞をトリプシン処理し、２倍量の非感染細胞と混合し、１７％フラ スコ中で６日間増殖させた。つぎに、被感染細胞を培地とともに収穫し、同一容 積のウシ胎児血清と混合し、細胞懸濁液として凍結した。解凍された細胞溶解物 を、子孫キメラウィルスの源として用いた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ”またはＤＯ ＴＡＰを用いたトランスフェクション実験により、ＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ およびＴＢＥ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４のみが同定された。子孫ウィルスは免疫蛍 光検定により同定された。
ｖＴＢＥＶ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４と呼ばれる子孫キメラＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥ Ｎ４ウィルスのゲノム構造を証明するために、Ｍａｃｋｏｗ他、Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ第１５９巻２１７〜２１８頁（１９８７）に提供される技術を用いたフェノー ル抽出により、総細胞ＲＮＡを感染ＬＬＣＭＫ２細胞から分離した。ＤＥＮ４配 列のヌクレオチド（ｎｔ）位置５０９０−５１１０　（Ｍａｃｋｏｗ他、Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁１９８７参照）に対して相補的なオリゴ ５゜ＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡＴＴ３°　（配列番号１６）を、 逆転写のためのプライマーとして用いた。一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い、Ｄ ＥＮ４配列のｎｔ位置１８〜４４のオリゴ５’　ＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡ ＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＧＡ３°　（配列番号１７）をＰＣＲの玉鎖プライマー として、ＴＢＥＶ配列のｎｔ位置２１３０〜２１５２のオリゴ５°　ＣＴＴＴＴ ＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴ３’　（配列番号１８）を角鋼プライマー として用いた。
デング熱ウィルスに関連するヌクレオチド位置については、Ｚｈａｏ他、Ｖｉｒ ｏ　ｌ　ｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁１９８６参照。ダニ媒介脳炎ウィルスに 関連するヌクレオチド位置については、前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ（１９９０）を参照。制限酵素部位の存在を証明するため、２１１８塩基対 （ｂｐ）のＰＣＲＤＮＡ産物は、Ｐｓ　ｔ　Ｌ　Ｂｇｌｌｌ　、またはＥｃｏＲ Ｉで消化された。同様に、オリゴ５°　ＧＴＣＣＧＧＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧ ＡＴＴ３’（配列番号１９）およびオリゴ５°ＴＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴ ＴＴＧＧＡＡＡＡＣ３’　（配列番号２０）（これらはそれぞれ、３４５９〜３ ４８０ｎｔのＤＥＮ４ゲノムに相補的、および、９６７〜９８５ｎｔのＴＢＥＶ ゲノムの角鋼に相補的である）を、ＰＣＲに用いた。ＤＮＡ配列を証明するため 、ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓ　ｔ　Ｉ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏｌ、または５ ｐｈＩで消化された。ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ゲノムからのＰＣＲＤＮＡ 産物（２１１８ｂｐ）は、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレア ーゼ酵素を用いて消化された。Ｈｉ　ｎ　ｄｌｌＩ　−Ｂ　ａｍＨＩ−サブフラ グメント（１９２２ｂｐ）をＰＡＧＥにより精製し、相補的な制限部位において ｐＧＥＭ３ベクター内にクローン化した。ＤＥＮ４　（３００〜３９８ｎｔ）の Ｃ遺伝子とＴＢＥＶ　（４１８〜４６０ｎｔ）のｐｒｅＭ遺伝子の間の接合部の 配列は、核酸配列決定により確認された。
ＴＢＥ／ＤＥＮ４キメラＤＮΔの構築に用いられたオリゴヌクレオチドは以下の ものを含む。
ＴＢＥＶ特異的オリゴ ５’　ＣＣＧＧＴＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡ ＡＡＣ＋　（配列番号２１） ５°　ＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＡＣＡＡ ＧＣＣＣ−（配列番号２２） ５°ＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＡＧ ＧＣＣＡＴＴＣＴＧ＋　（配列番号２３）５’　ＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣ ＴＧＣＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＧＧ＋　（配列番号２４） ５°　ＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＧＧＡＴＴＣＣＴＣＧ ＡＧＴＴＣＡＧＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣ−（配列番号２５）５°ＣＣＴＧＧＣ ＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＣＧＡＣＣＡＴＧＴＣ＋ 　（配列番号２６）５°　ＧＴＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＴＴ ＴＴＧＣＣＡＣＧＴＣＴＴＴＧ−（配列番号２７） ＤＥＮ４特異オリゴ ５’　ＴＡＣＧＣＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＧＧＡＴＧＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧ ＣＡＴ−（配列番号２８） ５’　ＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＴＣＡＧＡＡ ＡＣＴ＋　（配列番号２９） ５’　ＣＡＧＣＡＡＴＧＴＴＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＣＧＴＴ Ｃ−（配列番号３０） ５’　ＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＡＡＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣ ＴＴＧＡＴＴＣＣＣ＋　（配列番号３１）配列番号２３は、ＤＥＮ４の５゛非コ 一ド領域／ＴＢＥＶカプシド接合を作製するために用いられ、Ｂ　ｇ　Ｉ　ＩＩ ／Ｂ　ａｍＨ１部位を形成した。配列番号３０および２４は、ＤＥＮ４　Ｃ／Ｔ ＢＥＶ　ｐｒｅＭ接合を作製するために用いられ、Ｐｓｔｌ／Ｐｓｔ１部位を形 成した。配列番号２８および２１は、ＤＥＮ４　ｐｒｅＭ／ＴＢＥＶ　Ｅ接合を 作製するために用いられ、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌｌＩ部位を形成シタ。ＤＥＮ４　 ＮＳＩ／ＴＢＥＶ　ＮＳＩ接合は、配列番号２６を用いて作製され、Ｘｈｏｌ／ ＸｈｏＩ部位を形成した。ＴＢＥＶ　Ｅ／ＤＥＮ４　ＮＳＩ接合は配列番号２５ を用いて作製され、Ｘｈｏｌ／Ｘｈｏ１部位を形成した。ＴＢＥＶ　Ｃ／ＤＥＮ ４　ｐｒｅＭ接合は配列番号２７および３１を用いて作製され、ＰｓｔＩ／Ｐｓ ｔ１部位を形成した。ＴＢＥＶ　ＮＳＩ／ＤＥＮ４　Ｎ５２Ａ接合は配列番号２ ２および２９を用いて作製され、ｓｐｈ　Ｉ／Ｓｐｈ　Ｉ部位を生成した。
配列に付した＋および−の符号は、それぞれ上流および下流のプライマーを示す 。
実施例１８ キメラピリオンの　ンパ ＤＥＮ４ｖ　２Ａ　（ＸｈｏＩ＞　、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡ構築 物、または、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４により生成されるタンパク質を分析 するために、６穴プレート内のコンフルエントなＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、ＭＯＩ 　１．　０で各ウィルスに感染させた。感染の６日後、前出のＬａｉ他、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　（１９９１）に述べられているよ うに、メチオニン非含有ＭＥＭ　（イーグル最小必須培地）中のｓｓＳメチオニ ン（ウェルあたり６０μＣｉ、比放射能６００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）で４時間にわ たり、細胞を標識した。１）ＴＢＥＶ特異的ＨＭＡＦ、２）ＤＥＮ４特異的特異 的８壱ＡＦＴＢＥＶＥに対して作製されたウサギ血清、または、４）ＤＥＮ４　 ｐｒｅＭ、Ｅ、ＮＳ３、または、ＮＳ５タンパク質に特異なウサギ抗血清を用い て、溶解物を免疫降させた。前出のＬａｅｍｍｌｉにより説明される技術を用い て、変性条件下でＰＡＧＥにより免疫沈降物を分析した。
時間に対するタンパク質合成の分析 Ｔｚ、−ｙ−ｙスコに入れたり、ＬＣ−ＭＥ２またはｃ６／３６細胞単層に、Ｍ ＯＩＩで、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４またはＤＥＮ４　（ｖ２Ａ　（Ｘｈｏ Ｉ））を感染させた。３７℃で１時間の吸着の後、ウィルス接種物を取り出し、 新鮮培地を細胞に添加した。タンパク質合成の分析のため、ウィルス吸着後さま ざまな時間（０，４，８，２４，４８時間）経過した被感染細胞を、メチオニン 非含有ＭＥＭとともに、２０分間インキュベートし、同じ培地中で２時間にわた り、１１１８メチオニンで標識した。標識された細胞の溶解物をＤＥＮ４特異的 特異的８壱ＡＦて沈降させ、ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析し た。
実施例１９ キメラ　の 親ＤＥＮ４およびそのキメラウィルスは、サルＬ　Ｌ　Ｃ−Ｍ　Ｋ　ａおよび蚊 ｃ６／３Ｇ細胞上のプラーク検定により、調べられた。プラーク検定の技術は前 出のＢａｎｃｒｏｆｔ他に説明されている。図１９に示されている増殖分析は、 感染後のさまざまな日付に、ＤＥＮ４またはＴＨＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４に感染 したＬＬＣＭＫ２およびＣ６／３６培養中に存在するウィルスの量を計量するこ とにより、実施された。感染およびウィルス吸着の後、培養を収穫し、各培養を プラーク検定によりサンプリングした。Ｌｏ　ｇ　（ｐ　ｆ　ｕ／ｍＬ）で表し たウィルス力価の変化は、時間に対する増殖曲線として与えられている。
実施例２０ ウィルスＲＮＡム　の ウィルスＲＮＡ合成の分析のために、被感染ＬＬＣ−ＭＫ２またはＣ６／３６細 胞（約１０６個の細胞）をウィルス吸着後のさまざまな時間（０，４，８，２４ ，４８時間）に収集し、０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７， ５で洗浄し、ついで、０．３Ｍ　ＮａＡｃ、ｐＨ５，２，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ ％ＳＤＳを含む緩衝液中に溶解した。前出のＭａｎｉａｔｉｓ他により提供され る技術を用いて、フェノール抽出により、総ＲＮＡを細胞溶解物および培地から 分離した。６０℃で１５分間、７．５９６　（ｗｔ／ｖｏ　Ｉ）ホルムアルデヒ ドを含む６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）中でのインキュベーションにより、ＲＮＡ試料は変性され 、ニトロセルロースフィルターＢＡ８５　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよび５ｃｈ ｕｅ　目）に接合された。フィルターは８０℃で１時間焼かれ、６ｘＳＳＣ，３ ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、２５ｍＭのＮａｘＨＰＯａ　（ｐＨ６，５）　、０． １％ＳＤＳ。
２５μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中において、６５℃で１時間、プレ ハイブリダイゼーションされた。ニックトランスレーションされたＳ″Ｐ標識ｐ ＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４　ＤＮＡプローブ（５０ｎ　ｇ／ｍＬ、比放射能３ ．４×１０’ｃｐｍ／μｇ）を含む同じ溶液中で、６５℃で一晩、７％イブリダ イゼーションが続けられた。ハイブリダイゼーションの後、６５℃で、０．１％ ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣ中でフィルターを５回洗浄し、乾燥し、７０℃でＸ 線フィルムに曝した。また、ＲＮＡにハイブリダイズされた３２Ｐ標識ＤＮＡの 放射能が、液体シンチレーションカウンターで計測された。ｐＴＢＥ　（ＭＥ） ／ＤＥＮ４からインビトロで作製されたＲＮＡ転写物が、陽性対照として用いら れた。
実施例２１ ワクチン。　の方′六　とキメラウィルスの　経　主の−ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ ＤＥＮ４および親デング熱ウィルスは、マウスに脳内（ＩＣ）、皮肉（ＩＤ）、 腹腔内（ＩＰ）経路により接種することにより、神経毒性について分析された。
生後３日の乳児Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに、０．０２ｍＬＭＥＭ１０．２ ５９６ヒト血清アルブミン中にウィルス１０”ｐ　ｆ　ｕを加えて、ＩＣ注射で 投与した。生後６週のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌マウスに、（ｉ）１０”ｐｆｕ のウィルスを上記のとおり希釈し、容積０．０３ｍＬにしてＩＣ接種により投与 、または、（ｉｉ）０．１０ｍＬに希釈した１　０”ｐ　ｆ　ｕのウィルスをＩ ＤまたはＩＰ接種した。
マウスは、２１日間、脳炎の徴候や死亡について観察され、生き延びた成体マウ スは、感染の２０日後に採血して接種されたウィルスに対する抗体反応を評価し た。生存マウスに対しては、第２１８１こ、ＢＬ−４封じ込め設備において、１ ０３ＬＤｓｏＴＢＥＶ　（Ｓｏｆ　ｊ　ｉ　ｎ株）をＩＰ投与した。
実施例２２ キメラウィルス　然　の　および　１ 分子生物学の当業者に公知の標準的オリゴＰＣＲ操作手順にしたがい、部位特異 的突然変異誘発を用いて、ＴＢＥＶ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に突然変異を導 入した（下記のオリゴ配列参照）。得られた構築物は、実施例１７に開示された 技術を用いて、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞内にトランスフェクションされた。突然変異 誘発された構築物から回収した子孫ウィルスは、実施例１９において提供されて いる技術を用いてプラーク形態の変化について評価された。キメラウィルスゲノ ムの予め定められた領域内に改変を系統的に達成するために、完全長ＴＢＥ　（ ＭＥ）／ＤＥＮ４ｃＤＮＡ構築物に戦略的突然変異を導入した。６個の突然変異 キメラが、トランスフェクションされたＬ　Ｌ　Ｃ−Ｍ　Ｋ　ａ細胞から回収さ れ、子孫ウィルスが、マウス神経毒性を誘導する能力について分析された。さら に、他のウィルス増殖特性が、培養細胞において評価された。図２３に示すよう に、ＰｒｅＭＳＥ。
または、ＮＳＩグリコタンパク質における切断されたグリコジル化部位を含む４ つのウィルス突然変異が、示された部位におけるグルコシル化欠損を示すものと 予測された。変異”ＰｒｅＭ／Ｍ−は、ＰｒｅＭ／Ｍ遺伝子間接合部において欠 陥開裂配列を含んでいた。変異°Ｅは、２つのアミノ酸置換を含み、これらの置 換が選択された理由は、これらのアミノ酸が蚊媒介ワラビウイルス内にのみ見ら れるからである。
突然変異は、標準的オリゴＰＣＲ起動手順にしたがい、部位特異的突然変異誘発 により、ＴＨＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に導入された。要するに、玉鎖オリ ゴおよびその相補的角鋼オリゴは、それぞれ突然変異配列と唯一の制限酵素部位 を含んでいるが、ＰＣＲにおいて、それぞれ下流または上流プライマ一対のオリ ゴとともに用いられる。両方のＰＣＲ産物は、共有される唯一の制限酵素部位に おいて連結された。このようにして、突然変異された配列を含む、ＤＮＡ断片産 物が作製され、完全長ＴＨＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４　ｃＤＮＡにおける対応する 野生型ＤＮＡ断片を置換した。以下は特異的突然変異体キメラＤＮＡおよび構築 に用いられたオリゴヌクレオチドのリストである。
（１）変異Ｐ　ｒ　ｅＭ／Ｍ−Ｇ　Ｉ　ｃ　：５°　ＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧ ＧＴＧＣＧＴＧＴＣＧＡＴＣＧＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧ＋　 （配列番号３２）５’　ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＧＡＴＣ ＧＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＧＣ−（配列番号３３）（２）変異Ｅ −Ｇｌｃ： ５’　ＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧ ＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡ＋　（配列番号３４）５°　ＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧ ＴＧＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＡＡＴＣＣＣＣＣ−（配列番号 ３５）（３）変異ＮＳＩ　（１）−Ｇｌｃ　：５°　ＴＴＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡ ＧＣＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣ＋　（配列 番号３６）５’　ＧＴＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴ ＴＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡ−（配列番号３７）（４）変異ＮＳＩ　（２） −Ｇｌｃ・ ５’　ＴＧＧＡＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧ ＡＴＡＧＡＧＡ＋　（配列番号３８） （ＬＤ５０）が各ウィルスについて算出され、その値がマウス神経毒性の基盤と ５’　ＴＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴ ＣＴＡＴＣＣＡ−（配列番号３９） （５）変異Ｐ　ｒ　ｅ　Ｍ／Ｍ　： ５°　ＧＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＣＡ ＴＣＣＣＡＣ＋　（配列番号４０） ５’　ＧＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＴ ＣＣＴＴＣＴＴＧ　（配列番号４１） （６）変異Ｅ。
５°　ＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧ ＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡ＋　（配列番号４２）５°　ＧＣＣ’Ｃ ＣＡＧＣＣＴＣＧＡＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＣ：ＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＡ ＣＧＡＣＧＧ−（配列番号４３）さらに、上流プライマーは（配列番号４４）５ °ＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＧＡ＋および下流プラ イマーは（配列番号４５）５°　ＣＴＴＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡ ＡＣＡＧＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＣＡ− 実施例２３ マウスにおＣる　経　のｌ析 さらに、突然変異されたキメラウィルス調製物は、マウスにＩＣ接種され、実施 例２１に提供されている技術を用いて、ＤＥＮ４、ＴＨＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ およびＴＢＥ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４と比較された。試験動物の半数を死亡させ るのに必要な致死量が、突然変異キメラウィルスの各々について比較された。生 後６週間のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの８匹ずつのグループに、さまざまな 変異キメラ、ＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４、ＴＢＥ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４、ま たはＤＥＮ４を、１０００．１００．１０、■、０．１ｐｆｕの投与量で、脳内 接種した。被感染マウスは、３１日間、脳炎の徴候および死亡について観察され た。５０％致死量ルブミンに希釈した合計３Ｘ１０６ｐｆｕのウィルスを接種す る。通常、麻酔されして用いられた。図２４に示すように、親ＴＢＥ　（ＭＥ） ／ＤＥＮ４ウィルスのＬＤ５０は約１０ｐｆｕであった。このレベルのＬＤ５０ は、いくつかの変異ウィルスについても観察された。少なくとも２つの突然変異 体、すなわち’Ｎ５Ｉ（１）−Ｇｌｃ−および”　Ｐ　ｒ　ｅ　Ｍ／Ｍ−のＬＤ ５０は、１００ｐｆｕよりも大きく、これらの突然変異体のマウス神経毒性は１ ００倍以上減少したことを示している。
１−”＃Ｊ１９Ｊｋ−４凹’Ｊ）５Ｌ　ｒ　ｆＸ→ｒ１ｍ　９　。
（２）血液採取・デング熱ウィルスまたはキメラデング熱ウィルスの接種の後、 ３．０ｍＬの血液試料を２週間のあいだ毎日と、３週目、４週目、６週目、８週 目に採取する。
（３）デング熱ウィルスまたは他のフラビウイルスの投与：ウィルス投与が、配 列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人・ 厚生省長官により代表されるアメリカ合衆国レイ、チン−ジュー（アメリカ合衆 国のみ）プレイ、マイケル（アメリカ合衆国のみ）メン、ルーエ（アメリカ合衆 国のみ） ペテル、ミシェル（アメリカ合衆国のみ）（ｉｉ）発明の名称：キメラおよび／ または増殖制限されたワラビウイルス （ｉｉｉ　）配列数；４５ （ｉｖ）通信宛先： （Ａ）名宛人：クノービ、マーテンズ、オルソン　アンド　ベアー（Ｂ）住　所 二ニューボート　センター　ドラ４１６２０番地　１６階 （Ｃ）都　市：ニュー　ポート　ビーチ（Ｄ）州　：カリフォルニア （Ｅ）国　：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９２６６０ （Ｖ）コンピューター読取り形態： （Ａ）媒体種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換 （Ｃ）オペレーティングシステム： ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＨＯ３ （Ｄ）ソフトウェア：Ｐａｔｅｎｔｌｎリリース＃１．０、バージョン＃１２５ （ｖｉ）現在の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）姓名：アルトマン、ダニエル　イー（Ｂ）登録番号：３４，１１５ （Ｃ）参照／書類番号：ＮｌＨＯ２４，０２４ＨＰＣ（ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話番号：　７１４−７６０−０４０４（Ｂ）ファクシミリ番号：　７１ ４−７６０−９５０２（２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセテイカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス、Ｎｏ （ｘｌ）配列記述：配列番号１・ ＾ＡＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣＡＡＡ　１８（２）配列番号２についての情報 ： （ｉ）配列の特ｗＩ： （Ａ）配列の長さ、３３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数−１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス、Ｎｏ （ｘｉ）配列記述：配列番号７゜ ＣＡＡＡＡＧＧＧＧＧ　ＣＣＣＡＡＧＡＣＴＡ　ＧＡＧＧＴＴＡＣＡＧ　Ｇ＾Ｇ ＾印３６（２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝３９塩基対 （Ｂ）配列の型−核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列記述：配列番号８： ＣＡＡＡＡＧＧＧＧＧ　ＣＣＣＡＡＣＡ＾＾Ａ　ＡＣＡＧＣＡＴＡＴＴ　ＧＡＣ ＧＣ”ｒＧＧＧ　３９（２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイボセテイカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列記述：配列番号９： ＣＡＡＡＡＧＧＧＧＧ　ＣＣＣＡＡＣＡＧＡＧ　ＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣ ＴＣＴＧＣ３９（２）配列番号１０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数、１本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 Ｑｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列＝Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。
（ｘｉ）配列記述：配列番号１０： ＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴ　ＴＧＧＡＴＣＡＡ　２８（２）配 列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列二Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列記述：配列番号１１： ＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧ　ＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴ　ＡＣＡＧＣＴＴＣＣＧ　ＴＧＧ ＣＧＣ３６（２）配列番号１２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列記述：配列番号１２− ＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧ　ＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＴ ｒ　３６（２）配列番号１３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝３６塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数二１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイボセティカル配列＝ＮＯ（１〜・）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｌ）配列記述：配列番号１３： ＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧ　ＧＣＣＣＣＣＧＴＧＧ　ＣＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＴＧＡ ＣＴ　３６（２）配列番号１４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列：Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス＝Ｎ。
（ｘｉ）配列記述：配列番号１４： ＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧ　ＧＣＣＣＣＴＴＡＣＡ　ＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣ ＴＣＴＧＡ　３９（２）配列番号１５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ；２３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス・Ｎ。
（ｘｉ）配列記述：配列番号１５； ＧＣＣＴＣＣＡＴＧＧ　ＣＣＡＴＡＴＧＣＴＣＡＧＣ２３（２）配列番号１６に ついての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２１塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列、ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス、Ｎｏ （ｘｉ）配列記述　配列番号１６ ＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴ　ＧＴＡＡＧＴＣＣＡＴ　Ｔ　２１（２）配列番号１７に ついての情報・ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数・１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列−ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列記述：配列番号１７： ＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡ　ＡＡＴＣＧＧＡ　２７（２）配 列番号１８についての情報＝ （ｉ）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ＝２２塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列−ＮＯＵｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列記述：配列番号１８： ＣＴＴｒＴＴＧＧ＾＾　ＣＣＡＴＴＧＧＴＧＡ　ＣＴ　２２（２）配列番号１９ についての情報。
（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数・１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列：Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。
（ｘｉ）配列記述：配列番号１９： ＧＴＣＣＧＧＣＣＧＴ　ＣＡＣＣＴＧＴＧＡＴ　Ｔ　２１（２）配列番号２０に ついての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイボセティカル配列：Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎ。
（ｘｉ）配列記述、配列番号２０： ＴＣＡＣＧＧＴＧＣＡ　ＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡ　ＡＡＡＣ２４（２）配列番号２ １についての情報。
（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列−Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス・Ｎ。
（ｘｉ）配列記述：配列番号２１： ＣＣＧＧＴＴＴＡＴＡ　ＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧ　ＣＡＣＡＣＡＴｒＴＧ　ＧＡ＾ ＾ＡＣ３６（２）配列番号２２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列＝Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。
（ｘｉ）配列記述・配列番号２２： ＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＡ　ＣＡＡＧＣ ＣＣ３７（２）配列番号２３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類　ｃ　ＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列・Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。
（ｘｉ）配列記述、配列番号２３・ ＣＴＴＡＧＧ、ＡＧＡＡ　ＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧ　ＧＧＡＴＧＧＣＣＧＧ　ＧＡ ＡＧＧＣＣＡＴＴ　ＣＴＧ　４３（２）配列番号２４についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列二Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス−Ｎ。
（ｘｌ）配列記述：配列番号２４： ＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡ　ＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴ　ＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡ　ＧＧＴ ＴＧＧ　３６（２）配列番号２５についての情報・ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ一５２塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列　Ｎ。
（１ｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｌ）配列記述：配列番号２５ ＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴ　ＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧ　ＧＴＣＧＧＡＴＴＣＣＴＣＧＡ ＧＴＴＣＡＧ　ＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧ　ＧＣ５２（２）配列番号２６についての 情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・４１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、１本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列　Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列記述：配列番号２６： ＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧ　ＴｒＧＧＧＣＣＧＡＡ　ＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴ　ＣＣＧ ＡＣＣＡＴＧＴ　Ｃ４１（２）配列番号２７についての情報： （ｉ）配列の特徴。
（Ａ）配列の長さ：３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列記述：配列番号２７： ＧＴＣＣＡＧＴＣＴＡ　ＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴ　ＴＣＴＴＴｒＧＣＣＡ　ＣＧＴ ＣｍＧ　３８（２）配列番号２８についての情報。
（ｉ）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ一３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセテイカル配列二ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス・Ｎｏ （ｘｉ）配列記述：配列番号２８： ＴＡＣＧＣＡＴＣＧＧ　ＧＡＴＣＣＧＴＡＧＧ　ＡＴＧＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＣ ＡＴ　３６（２）配列番号２９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジーこ直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列記述：配列番号２９： ＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡ　ＧＧＧＣＡＣＡＴＣＡ　ＧＡＡＡ ＣＴ　３６（２）配列番号３０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝３４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列記述：配列番号３０： ＣＡＧＣＡＡＴＧＴＴ　ＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴｍＴＣＴＣＣＣＧＴＴＣ３４（ ２）配列番号３１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列：ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列記述：配列番号３１： ＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡ　ＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴ　ＡＡＣＡＴＴＧＣＴＧ　ＴＧＣ ＴＴＧＡＴｒＣＣＣ４２（２）配列番号３２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・４６塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＣＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列、ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列記述：配列番号３２： ＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＧＴＧＴ　ＣＧＡＴＣＧＴＧＧＣＡＣＣＴＧ ＴＧＴＧＡ　ＴＣＣＴＧＧ　４６（２）配列番号３３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、４６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、１本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類　ｃ　ＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセテイカル配列・Ｎｏ（ｉｖ）アンチセンス・Ｎｏ （ｘｉ）配列記述：配列番号３３゜ ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＡ　ＣＧＡＴＣＧＡＣＡＣＧＣＡＣＣ ＴＧＧＧＴ　ＴＧＣＣＧＣ４６（２）配列番号３４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列記述：配列番号３４： ＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＣＡ　ＣＡＧＴＧ ＧＡＡＧ＾ＡＡ＾　４３（２）配列番号３５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列：ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列記述：配列番号３５： ＴＴＴＴＣＴｒＣＣＡ　ＣＴＧＴＧＡＧＴＣＴ　ＣＴＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＧ ＴＡＡＴＣＣＣＣＣ４３（２）配列番号３６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ＞配列の長さ＝４３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列　Ｎ。
（１ｖ）アンチセンス・Ｎ。
（ｘｉ）配列記述：配列番号３６： ＴｒＣＡＣＣＣＣＡＧ　ＡＡＧＣＡＡＧＧＡＴ　ＣＣＧＣＡＣＡＴＴｒ　ＴＴＡ ＡＴＡＧＡＣＧ　ＧＡＣ４３（２）配列番号３７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・４３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列・Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。
（ｘｉ）配列記述　配列番号３７゜ ＧＴＣＣＧＴＣＴＡＴ　ＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧ　ＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧ　ＣＴＴ ＣＴＧＧＧＧＴ　Ｇ＾＾　４３（２）配列番号３８についての情報・ （ｉ）配列の特徴。
（Ａ）配列の長さ・４０塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列、Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス・Ｎ。
（ｘｉ）配列記述：配列番号３８二 ＴＧＧＡＴＡＧＡＧＡ　ＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴ　ＣＣＡＧＡＣＴｒＧＧ　ＣＡＧ ＡＴＡＧＡＧＡ　４０（２）配列番号３９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、３５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列二Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列記述：配列番号３９： ＣＣＣＡＴＡＴＡＴＡ　ｍＴＴＣＣＣＣＴ　ＴＴＡＣＡＣＴＣＴＧ　ＴＣＡＴＣ ３５（２）配列番号４０についての情報・ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイボセティカル配列　Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス＝Ｎ。
（ｘｉ）配列記述：配列番号４０： ＧＧＡＴＣＡＡＧＡＡ　ＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴ　ＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＣＡＴ ＣＣＣＡＣ３９（２）配列番号４１についての情報・ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝４１塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ノゾポセテイカル配列二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列記述：配列番号４１： ＧＡＴＧＧＧＡＴＣＡ　ＧＣＡＣＴＡＣＧＣＧ　ＴＣＴＴＧＴＴＣＴＴ　ＧＡＴ ＣＣＴｒＣＴＴ　Ｇ　４１（２）配列番号４２についての情報・ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝５１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセテイカル配列　Ｎｏ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列記述：配列番号４２： ＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡ　ＧＣＧＡＴＣＧＡＧＧ　ＣＴＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＴ ＧＴＧＧＡＴ　ＴＴｍＧＧＡＡＡ　Ａ　５１（２）配列番号４３についての情報 ： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：４５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイボセテイカル配列・Ｎ。
（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列記述：配列番号４３： ＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴ　ＣＧＡＴＣＧＣＴＣＴ　ＧＧＴＣＴＣＴＣＴＴ　ＡＣＡ ＣＡＣＴｒＡＣＧＡＣＧＧ　４５（２）配列番号４４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列二Ｎ０（４ｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列記述：配列番号４４： ＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＡＧＴｒＣＣＡ　ＡＡＴＣＧＧＡ　２７（２）配 列番号４５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝４９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数＝１本鎖鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）ハイポセティカル配列二ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列記述：配列番号４５： ＣＴＴＧＡＡＣＴＧＴ　ＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡ　＾＾ＣＡＧＡＧＴＧＡ　ＴｒＣ ＣＴＣＣ＾＾ＣＡＧＣＴＡＴＧＣ八　４９図１ 図２Ａ 図２Ｂ ＲＮΔトランスフェクション後の日数 図３ 図４ 図５ 図６ 図９ Ｍ　ＩＡ　ＩＢ　ＩＣ２Ａ　２Ｂ　２ＣＭ図１０ ＋　＋　Ｐｓｔｌ ２Ａ　２Ａ（円　２Ａ　２Ａ（Ｐ）　Ｍ図１１ 一一書一一− 図１２ う回 図１４ ダミー　Δ３’、　１７２−１１３　Δ３’、　１７２−１４３　野生型図１５ 野生型　△３’、　２４３−１８３　Δ３°、　３０３−１８３　Δ３°、　３ ８４−１８３図１６ 開裂 図１８ １４−−Ｌ−一一一□− 図２０ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１＆４条の８）１．特許出願の表示 国際出願番号　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０７９１６２、発明の名称 住　所　アメリカ合衆国、ｚｏｓｓｚ、ワシントン、ディー、シー。
国　籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住　所〒１．０３東京都中央区東日本橋３丁目４番１０号第３〜第５頁： 他（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁；Ｂ、Ｚｈａｏ他 （１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁；に、Ｏｓａ’ｔｏｍ＋ およびＨ，Ｓｕｍｉ　ｙｏｓｈｉ　（１９９０）Ｖｉ　ｒｏＩｏｇｙ第１７６巻 ６４３〜６４７頁；Ａ、１ｒｉｅ他（１９８９）Ｇｅｎｅ第７５巻１９７〜２１ １頁；Ｐ。
児Ｍａｓｏｎ他（１９８７）Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ第１６１巻２６２〜２６７頁；Ｙ 、Ｓ、Ｈａｈｎ他（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１６２巻１６７〜１８０頁） 。
これらの研究の成果は、デング熱ウィルスの４つの血清型が共通のゲノム構成を もつことを示している。４型デング熱のカリブ株８１４６６９のゲノムは１０６ ４６個のヌクレオチドを含むことがわかっている（Ｅ、　Ｍａ　ｃ　ｋ　ｏｗ他 （１９８７）Ｖｉ　ｒｏＩｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２Ｂ頁；Ｂ、Ｚｈａｏ他 （１９８６）Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁）。５゛末端における最 初の１０１個のヌクレオチドおよび３′末端における最後の３８４個はコードし ていない。残りの配列は、３３８６個のアミノ酸ポリタンパク質をコードしてお り、これには、３つの構造タンパク質、すなわち、カプシド（Ｃ）、プレメンブ レン（ｐｒｅ−Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）がそのＮ末端に含まれ、７個の非構造 タンパク質が上述した順序で続いている。これは、これまでに識別されたすべて のフラビウイルスゲノムに共通している。ポリタンパク質は、細胞信号ペプチダ ーゼにより、および、ウィルスプロテア− ゼにより、１１個以上のウィルスタンパク質を生じるようにプロセス（Ｌ。
Ｍａｒｋｏｆｆ　（１９８９）Ｊ、Ｖｉ　ｒｏｂ、第６３巻３３４５〜３３５２ 頁：Ｂ、Ｆａ１ｇｏｕｔ他（１９８９）Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、第６３巻１８５２〜１ ８６０頁；Ｂ、Ｆａ１ｇｏｕｔ他（１９９１）Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、第６５巻２４６ ７〜２４７６頁；Ｈ，ＨｏｒｉおよびＣ，Ｊ、Ｌａｉ　（１９９０）Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌ。
第６４巻４５７３〜４５７７頁）。
我々はすでに、感染性ＲＮＡの転写のための鋳型として用いることのできる完全 長デング熱ウィルスｃＤＮＡを構築した。我々は、安定的にクローンされた完全 長デング熱ウィルスｃＤＮＡを得、ＤＮＡ鋳型から派生した（インビトロ）試験 管内ＲＮＡ転写物が培養中の細胞に対して感染性をもつことがわかった。しかし ながら、この感染性構築物と、そこから生成された感染性ＲＮＡ転写物は病原性 である。さらに、これまでに生成された弱毒化デング熱ウィルスは遺伝学的に不 安定で、時間がたつと病原性形態に逆戻りする可能性を有している。それでも、 弱毒化ウィルスは望ましい。その理由は、弱毒化ウィルスにより長期間持続する 免疫が得られることが一般に知られているからである。したがって、この構築物 またはキメラ構築物を病原性の低いウィルスの産生を導くように改変すれば、弱 毒化フラビウイルスワクチン技術において相当の進歩となるだろう。したがって 、我々は、ここに開示するとおり、ｃＤＮＡの３゛非コード領域において一連の 欠失を構築し、活性デング熱ウィルス突然変異体を回収して増殖特性を分析した 。
ワラビウイルス科のその他のウィルスもやはり病原性である。その例としては、 ダニ媒介脳炎ウィルスおよび日本脳炎ウィルスがあげられる。弱毒化デング熱ウ ィルスワクチンのように、弱毒化ダニ媒介脳炎ウィルス（ＴＢＥＶ）ウィルスは 、遺伝学的に不安定で免疫性に乏しい傾向があった。したがって、他の弱毒化フ ラビウイルスワクチンも、技術におけるかなりの前進となるであろう。すなわち 、本発明は、さらに、他のワラビウイルスに対するワクチン製造のための遺伝子 操作およびキメラウィルス開発のフレームワークとして、デング熱ウィルスや別 のフラビウイルスの改変完全長組換えｃＤＮＡ構築物を採用する。
ダニ媒介脳炎ウィルス（Ｔ　Ｂ　Ｅ　Ｖ）は、ダニによってのみ媒介され、血清 学的に区別できる２つのサブタイプに分類される。ロシアのシベリア地方と極東 地方に優勢な東部サブタイプ（プロトタイプ株５ｏｆｊｉｎ）と、ヨーロッパ東 部および中央部に見られる西部サブタイプ（プロトタイプ株Ｎｅｕｄｏｒｆ　］ ）である。ＴＢＥＶは、死亡率が１〜３０％の重い脳炎を引き起こす。ＴＢＥＶ の詳細についてはＣａ１ｉｓｈｅｒ他（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、第７０巻３７ 〜４３頁）を参照されたい。現在、ＴＢＥＶのホルマリン不活化により製造され た試験的ＴＢＥワクチンが入手できるが、このワクチンはいくつかの制約を有し ている。
たとえば、このワクチンの免疫原性は十分ではないため、防御免疫反応を生じさ せるためには繰返し接種が必要である。ワクチンに対する抗体反応があった場合 でも、このワクチンは、個体群の２０％において、ウィルスに対する防御反応を 提供することができない。したがって、より改良されたＴＢＥＶワクチンが必要 とされている。
光吸例概要 一態様において、本発明は、少なくとも２つのワラビウイルスから由来した核酸 を含む、組換えＤＮＡ構築物を提供する。この構築物は、ダニ媒介脳炎ウィルス （ＴＢＥＶ）からの２つ以下の構造タンパク質を作動可能（ｏｐｅｒａｂｌｙ） にコード化する核酸領域を含む。この領域は、ＴＢＥＶ以外のワラビウイルスか らの構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域に結合する。好ましくは 、この構築物は、ダニ媒介脳炎ウィルスからの２つ以下の構造タンパク質を作動 可能にコード化する核酸領域に結合する、ワラビウイルスカプシドタンパク質を 作動可能にコード化する核酸領域を含む。カプシドタンパク質および非構造タン パク質をコード化する核酸領域は、好ましくは、４型デング熱ウイルスなどのデ ング熱ウィルス由来のものである。好ましい形態において、この構築物は、少な くとも２つのフラビウイルスに由来する核酸内に、少な（とも１つの突然変異を 含む。
この好ましい形態の一実施例において、突然変異は、ＮＳＩ　（１）タンパク質 グリコジル化を排除する。この形態の別の実施例において、突然変異は、成熟フ ラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害する。突然変異がウィルス増殖 速度に影響することが好ましい。さらに、本発明は、これらの組換えＤＮＡ構築 物に対応するＲＮＡ転写物を含む。
本発明の別の態様において、フラビウイルス由来のゲノムを有するキメラウィル スが得られる。このキメラウィルスは、ダニ媒介脳炎ウィルスからの２つ以下の 構造タンパク質をコード化する核酸領域と、他のフラビウイルスからの非構造タ ンパク質をコード化する核酸領域とを含む。好ましくは、このウィルスは、ワラ ビウイルスファミリーの他のメンバーからのカプシドタンパク質をコード化する 核酸領域を含む。ダニ媒介脳炎ウィルスからの核酸は、プレメンブレンおよび／ またはエンベロープタンパク質など、多数のタンパク質のどれでもコード化する ことができる。他のフラビウイルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸 は、好ましくは、４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウィルスである。一実施 例において、本発明の本態様のキメラウィルスは、核酸内に少なくとも１つの突 然変異を含む。この突然変異は、ＮＳＩ　（１）タンパク質グリコジル化を排除 する突然変異や、成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害する突 然変異など、多数の形態のいずれをとってもよい。突然変異がウィルス増殖速度 に影響することが好ましい。
本発明の別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウィルスのプレメンブレンおよびエン ベロープタンパク質をコード化する核酸領域と、別のフラビウイルスからのカプ シドタンパク質をコード化する核酸領域と、同じフラビウイルスからの非構造タ ンパク質をコード化する核酸領域とを含むキメラウィルスが得られる。フラビウ イルスは、たとえば、４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウィルスである。
本発明の本態様において、好ましい形態のキメラウィルスは、ダニ媒介脳炎ウィ ルスのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質をコード化する核酸領域内 に少なくとも１つの突然変異を含む。突然変異は、成熟フラビウイルスメンブレ ンタンパク質の産生を妨害するものを用いることができる。別の好ましい形態に おいて、キメラウィルスは、他のワラビウイルスからの核酸領域内に少なくとも １つの突然変異を含む。この突然変異は、ＮＳＩ　（１）タンパク質グリコジル 化を排除するものを用いることができる。
さらに別の態様において、本発明によれば、を推動物において防御免疫反応を生 起することのできる、本発明のキメラウィルスからなるダニ媒介脳炎に対するヒ ト用ワクチンが得られる。すなわち、本発明は、さらに、ワラビウイルスに対す るヒト用ワクチンを製造する方法を含み、フラビウイルスからのプレメンブレン およびエンベロープタンパク質と、デング熱ウィルスからのカプシドおよび非構 造タンパク質とをコード化することのできるＤＮＡ構築物を作製し、上記ＤＮＡ 構築物から感染性ＲＮＡ転写物を生成し、上記ＲＮＡ転写物を細胞に導入し、上 記細胞内でＲＮＡ転写物を発現させ、上記細胞からウィルスを収穫し、上記ウィ ルスをを推動物において試験し、上記ウィルスをヒトに接種することを含む。
本発明の好ましい態様によれば、日本脳炎ウィルスのプレメンブレンおよびエン ベロープタンパク質をコード化する核酸領域と、別のワラビウイルスからのカプ シドタンパク質をコード化する核酸領域と、デング熱ウィルスなどの、同じワラ ビウイルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むキメラウィ ルスが得られる。
第７頁〜第１１頁。
ａ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコード化する核酸領域と、１型 デング熱ウイルスの構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むゲノムをも つキメラウィルス、ｂ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコード化す る核酸領域と、２型デング熱ウイルスの構造タンパク質をコード化する核酸領域 とを含むゲノムをもつキメラウィルス、ｃ）４型デング熱ウイルスの非構造タン パク質をコード化する核酸領域と、３型デング熱ウイルスの構造タンパク質をコ ード化する核酸領域とを含むゲノムをもつキメラウィルス、ｄ）弱毒化４型デン グ熱ウイルス。
本発明のさらなる態様によれば、４型デング熱ウイルスの非構造領域と、１型デ ング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウィル ス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、および別のワラビウイルスのう ちの１つからの構造領域とを含むＤＮＡセグメントが得られる。本発明の好まし い実施例において、ＤＮＡセグメントは、構造および非構造領域に作動可能に結 合するプロモーターを含む。別の好ましい実施例において、ＤＮＡセグメントは 、プロモーターとしてＳＦ３またはＴ７プロモーターを含む。さらに別の実施例 において、ＤＮＡセグメントはｐ２Ａ　（ＤＩＷＰ）またはｐ２Ａ　（Ｄ２ＮＧ Ｃ）である。
本発明の他のいくつかの態様によれば、他のキメラＤＮＡセグメントが得られる 。本発明のこれらの態様によるＤＮＡセグメントは、１型デング熱ウイルス、２ 型デング熱ウイルス、または３型デング熱ウイルスの非構造領域を含んでいる。
これらのＤＮＡセグメントは、さらに、以下のウィルスのうちの１つからの構造 領域を含んでいる。１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング 熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、ダニ 媒介脳炎ウィルス、フラビウイルス。ただし、構造領域と非構造領域は同一ウィ ルス由来ではないことを条件とする。
本発明のさらなる態様によれば、ＤＮＡセグメントは、黄熱病ウィルス、日本脳 炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、および別のワラビウイルスのうちの１つか らの非構造領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、４型デング 熱ウイルス、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルス、およ び別のフラビウィルスのうちの１つからの構造領域とを含み、構造領域は非構造 領域とは異なるウィルス由来である。
本発明の別の態様によれば、フラビウイルスの非構造領域またはその一部、およ び異なるフラビウイルスの構造領域またはその一部からなるＤＮＡセグメントが 得られる。
本発明のさらに別の態様によれば、を推動物においてウィルスに対する防御免疫 反応を生起することのできるワクチンが得られる。このワクチンは、安全かつ免 疫学的に有効な量のキメラウィルスを含む。このウィルスのゲノムは、ダニ媒介 脳炎ウィルスからの構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸と、デング熱 ウィルスからの非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸とを含む。
本発明のさらに別の態様によれば、別のキメラウィルスが得られる。この態様に おいて、キメラウィルスは、ダニ媒介脳炎ウィルス構造タンパク質および４型デ ング熱ウイルス非構造タンパク質とを作動可能にコード化するウィルスのゲノム をもつ。好ましい実施例において、ウィルスの構造タンパク質はダニ媒介脳炎ウ ィルス由来のものである。
本発明のさらに別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウィルス構造タンパク質および ４型デング熱ウイルス非構造タンパク質を作動可能にコード化するＤＮＡセグメ ントが得られる。
本発明のさらなる態様によれば、感染性４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化 する、分離されたＤＮＡ断片が得られる。本発明のさらに別の態様によれば、い 実施例において、ベクターはプラスミドである。本発明のさらなる態様によれば 、ＤＮＡ断片の発現を可能とするようにして本発明の組換えＤＮＡ構築物で安定 的に形質転換された宿主細胞が得られる。好ましい実施例において、宿主細胞は 原核細胞である。
本発明の別の態様によれば、４型デング熱ウイルスの突然変異を作製する方法が 得られる。この方法は、（ｉ）部位特異的突然変異誘発により４型デング熱つイ ルスのゲノムに突然変異を導入し、（ｉｉ）突然変異を有する感染性４型デング 熱ウイルスを回収し、（ｉｉｉ　）回収したウィルスを評価するステップを含む 。本方法の一実施例において、回収されたウィルスは、弱毒化または無毒性の表 現型について評価される。
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチ ンが得られる。このワクチンは、疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の無 毒性４型デング熱ウイルスと、薬学的に受容可能な担体とを含む。好ましい実施 例において、無毒性４型デング熱ウイルスは、ウィルスゲノム内の重要な領域に おいて突然変異を加工することにより得られる。
本発明のさらに別の態様によれば、キメラフラビウイルスＲＮＡをコード化する ＤＮＡ断片が得られる。キメラＲＮＡは、たとえば、１型デング熱ウイルス、２ 型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルスからなる群から選択されたウィルス を含んでいる。
本発明のさらに別の態様によれば、キメラデング熱ウィルスの構築のための方法 が得られる。この方法は、本発明の方法により得られた４型デング熱ウイルスＤ ＮＡのＤＮＡ断片を、異なるフラビウイルスからの、対応する遺伝子全体または その両分［ｆ　ｒａｃｔ　ｉｏｎ］で置換することを含んでいる。好ましい実施 例において、異なるフラビウイルスは以下のウィルスの１つである。１型デング 熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス。別の好ましい実施 例において、４型デング熱ウイルスは少なくとも１つの突然変異を含む。
本発明は、デング熱ウィルスに対するヒト用ワクチンを提供する別の態様を含む 。本態様において、本発明は、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量の感染 性キメラウィルスと、薬学的に受容可能な担体とを含む。キメラウィルスは、た とえば、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス 、あるいは４型デング熱ウイルスに由来する。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片と、ベクターからなる組 換えＤＮＡ構築物が得られる。１つの好ましい実施例において、ベクターはプラ スミドである。本発明のさらに別の態様によれば、ＤＮＡの発現を可能とするよ うにして、本発明の方法により得られた組換えＤＮＡ構築物で安定的に形質転換 された宿主細胞が得られる。好ましい実施例において、宿主細胞は原核細胞であ る。
本発明のさらに別の態様によれば、非構造タンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａの開裂部 位のＮＳＩのＣ末端における８個のアミノ酸のうちの１つ又はそれ以上をコード 化する配列内に置換突然変異を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化す るＤＮＡ断片が得られる。
本発明のさらなる態様によれば、非構造タンパク質Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａの開裂部位 のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部位に置換を含む、４ 型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片が得られる。
本発明のさらなる態様によれば、３゛側非コード領域内に欠失を含む、４型デン グ熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片が得られる。好ましい実施例にお いて、欠失は、ヌクレオチド３０〜２０２個分の長さをもつ。
本発明の別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片のいずれかとベクターとを含む 組換えＤＮＡ構築物が得られる。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤ ＮＡ断片の感染性ＲＮＡ転写物が得られる。本発明のさらなる態様によれば、Ｄ ＮＡ断片の発現を可能とするようにして、本発明のＤＮＡ構築物でトランスフェ クションされた宿主細胞が得られる。このような宿主細胞には哺乳類または昆虫 の細胞を用いることができる。
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチ ンが得られる。本発明の本態様において、このワクチンは、疾病に対して免疫を 誘発するのに十分な量の、毒性低減化突然変異４型デング熱ウイルスを含む。
好ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウイルスは、ウィルスゲノムに おける３°側非コード領域内に欠失突然変異を加工することにより得られる。別 の好ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウイルスは、非構造タンパク 質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳＩのＣ末端における８個のアミノ酸のうち の１つ又はそれ以上をコード化するウィルスＤＮＡ配列内に置換突然変異を加工 することにより得られる。さらに別の好ましい実施例において、突然変異４型デ ング熱ウイルスは、非構造タンパク質Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａの開裂部位のつぎの＋１ 位置の部位である、グリシンをコード化するウィルスＤＮＡ部位に置換を加工す ることにより得られる。
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、異なるワラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその両分で置換するこ とを含む、キメラデング熱ウィルスの構築方法が得られる。好ましい実施例にお いて、異なるフラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス 、３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介脳炎ウィルスの１つであ る。別の好ましい実施例において、キメラデング熱ウィルスの構築方法は、本発 明による４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、異なるフラビウイルスか らの対応する遺伝子全体またはその画分て置換することを含む。好ましくは、ワ ラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱 ウイルス、日本脳炎ウィルスからなる群から選択される。さらに好ましくは、キ メラデング熱ウィルスの構築方法は、本発明による４型デング熱ウイルスＤＮＡ のＤＮＡ断片を、フラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその両分で置 換することを含む。好ましい方法において、フラビウイルスは、１型デング熱ウ イルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウィルス、ダ ニ媒介脳炎ウィルスからなる群から選択される。
本発明のさらに１つの態様によれば、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量 を投与される、デング熱ウィルスに対するワクチンが得られる。このワクチンは 、毒性が低減したキメラウィルスを含み、上記キメラウィルスは、３゛側非コー ド領域に欠失を含む４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片を含 む。好ましい実施例において、キメラウィルスは２型デング熱ウイルス、３型デ ング熱ウイルス、４型デング熱ウイルスからなる群から選択される。
本発明のさらなる態様は、以下の発明の詳細な説明を参照することにより、当業 者にとって明らかになるであろう。
照面Ω悦叫 図１は、キメラデング熱ウィルスの作製に用いられる完全長デング熱ウィルスｃ ＤＮＡの構造を示す。
図２は、ＲＮＡ転写物を用いたトランスフェクション後の、ウィルス感染細胞の パーセンテージとウィルスの力価［ｔｉｔｅｒ］を示す。
図３は、キメラデング熱ウィルスの血清型分析を示す。
図４は、親またはキメラのデング熱ウィルスにより生成された１型、２型、また は４型ウイルスタンパク質のポリアクリルアミドゲル分析を示す。
図５は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞上のウィルスプラークの形態観察を示す。
図６は、親２型ＮＧＣまたは４型デング熱ウイルスまたは２型／４型キメラウイ ルスのマウス神経毒性を示す。
図７は、感染性ＲＮＡの転写に用いられるクローン化された完全長デング熱ウィ ルスｃＤＮＡの末端配列を示す。
合計１０６４６個のヌクレオチドの長さをもつ完全長デング熱ウィルスｃＤＮＡ は、図示のように、ＳＰ６ポリメラーゼのためのプロモーター配列および唯一の Ａｓｐ７１８開裂部位に隣接してクローン化される。ここで、１０４４８および １０４４９の間の位置に付加Ｃ残基が、１０４７０および１０４７１の間に付加 Ｇ残基が存在する。これらはもとの４型デング熱つィルス配列にはなかったもの である。ＲＮＡ転写物の予測５′末端および３°末端の近くの配列も示されてい る。転写開始のＧは、太字体で示される３°デデン配列の前に配置されていた。
Ａｓｐ７１８開裂配列ＧＧＴＡＣＣは、太字体で示される３′デデン配列の直後 に位置していた。
図８は、完全長デングｃＤＮＡクローンおよび制限エンドヌクレアーゼ消化パタ ーンを示す。
図には、５゛端にＳＰ６プロモーター、３′端にＡｓｐ７１８開裂部位を含む完 全長デングｃＤＮＡクローンが示されている。ヌクレオチド５０６９のＢｓｔＢ １開裂部位により、デングゲノムは５°および３°断片に分離される。完全長ク ローンＩＡの断片を、対応する５゛−２，３°−Ｂ、または３°−Ｃ断片で置換 することにより、図示されている他の完全長の組合せが得られる。
図９は、Ｂｇ　ＩＩＩ、　Ｎｓ　ｉ　Ｉ、およびＡｓｐ７１８で消化された完全 長デングｃＤＮＡクローンの制限エンドヌクレアーゼパターンを示し、消化物は アガロースゲル上での分離により分析された。Ｍは、キロ塩基対の分子サイズマ ーカーとしてのλＨｉ　ｎ　ｄｌｌｌ　ＤＮＡ断片を示す。
図１０は、感染ＲＮＡから回収されたデング熱ウィルスが鋳型ＤＮＡのゲノム配 列を含むことの実例を示す。
子孫デング熱ウィルスは、クローン２ＡＤＮＡ　（野生型対照（コントロール） ）から、または、デング配列のヌクレオチド３４７３のＰｓｔ１部位を含むクロ ーン２Ａ　（Ｐ）ＤＮＡから転写されたＲＮＡでトランスフエクシタンしたＬＬ Ｃ−ＭＫｚ細胞から回収された。
第１７頁 後述の実施例１７は、実施例１に説明するキメラデング熱ウィルス製造のための 方法につづいて４型デング熱ウイルスの非構造領域をダニ媒介脳炎ウィルスの構 造領域に組み合わせたキメラウィルス（ＴＢＥＶ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４）の作 製を開示している。これらの方法により作製されたウィルスは培養中で複製され 、組織培養細胞または実験動物の感染に用いられた。
神経毒性に影響するデングゲノムにおける突然変異我々は、細胞培養における増 殖特性およびプラーク形態の変化を示す、３′非コード領域における欠失を含む 一連の活性デング熱ウィルス突然変異体を加工した。同様に、我々は、ウィルス ポリタンパク質の非構造タンパク質領域の新規な開裂部位配列内に核酸酸置換を 含む、別の一連の、増殖制限されたデング熱ウィルス突然変異体を加工した。複 製能力が低下したデング熱ウィルス突然変異体は、生菌ウィルスワクチンに用い るための適格性を判定するために、実験動物における毒性の低下について評価を 受ける。
本発明において、３′非コード領域内に欠失を含む増殖制限された４型デング熱 ウィルス突然変異体の構築は、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡクローンを 用いて重要な領域内に欠失を加工することにより実行される。欠失突然変異は、 アミノ酸置換突然変異に比べて、表現型の逆転が少ないという利点をもっている 。
他の蚊媒介フラビウイルスと同様に、４型デング熱ウイルスは、指定された保存 配列１　（Ｃ３−１）および保存配列２　（Ｃ５−２）の保存領域と、潜在的末 端ステム・アンド・ループ構造とを含む３′非コ一ド配列を有している。ヌクレ オチド３〜２０２個の範囲の欠失は、４型デングｃＤＮＡのヌクレオチド３８４ 個の３°非コ一ド配列内のさまざまな位置に導入することができる。Ｃ３−１領 域のｃＤＮＡクローン欠損配列から作製され、しかしステム・アンド・ループ構 造をとどめているＲＮＡ転写物は、子孫ウィルスを生じることがなく、欠失が致 死的であることを示している。一方、たいていの他の３′非コード領域欠失構築 物からは、感染性ウィルスを回収することができる。
これらの突然変異体および野生型ウィルスのプラーク検定は、蚊細胞（ｃ６／験 霊長類に対して低下した毒性を示す突然変異体は、ワクチンウィルス候補として 選択され、ヒトにおける評価を受ける。
第２０頁〜第２１頁 熱を引き起こした。
本発明は、活性キメラデング熱ウィルスを構築する方法を提供する。本発明は、 さらに、４型ウイルス５゛および３′非コＴド配列と、その７個の非構造タンパ 有効なワクチンを製造する方法を提供する。
この目的のため、我々は、３′非コード系に、あるいは、非構造タンパク質遺伝 子の１つに欠失を含む４型デング熱ウイルスを構築し、これらのデング熱ウィル ス突然変異体が複製能力の大幅な抑制を示すことを証明した。したがって、満足 できる程度の弱毒化をもたらす突然変異をこれらの共通領域内において加工する ことができ、その結果、４つのデング熱血清型特異性を別々に発現することにな る４個のクローン化された弱毒化デング熱ウィルスのひと組が得られる。これら のウィルスには、親４型ウィルス、１型（構造タンパク質遺伝子領域）−４型キ メラ、同様な２型−４型キメラ、および同様な３型−４型キメラ、ならびに、日 本脳炎およびダニ媒介脳炎のキメラが含まれる。
不活化合デング熱ウィルスワクチンは、十分な免疫原性を欠くことが示されてい た。細胞培養における連続継代培養により弱毒化された生菌ウィルスワクチンは 、不十分な弱毒化、遺伝学的不安定性、過度の弱毒化などの欠点をもっていた。
２型デング熱ワクチンは、まだ、開発の初期段階にある。残りの３つの血清型の 生菌ワクチンは得られていない。本発明は、ウィルスゲノム内に指定された突然 変異をもつデング熱ウィルスを構築する能力における技術的進歩を提供する。
キメラダニ媒介脳炎ウィルスワクチン カプシド、メンブレン、エンベロープの３つの構造タンパク質配列を、デング熱 ウィルス非構造タンパク質をコード化する配列を含むデング熱ウィルス構築物に 組み込むことにより、ダニ媒介脳炎キメラウィルスが作製された。
デング熱／ダニ媒介脳炎ウィルス（ＴＢＥＶ）の組合せは、デング熱ウィルスと ＴＢＥＶウィルスタンパク質および核酸配列の協力を必要とするようである。
構築物のウィルスは、それぞれ対応する天然のウィルスより感染性が低がった。
ＤＥＮ４およびＴＢＥＶは、同じゲノム構成をもち、遺伝子発現の同じ戦略を共 有する。しかし、２つのウィルス間の配列を比較すると、配列相同性が比較的低 いことが示される（Ｐｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１７４巻２５０〜２ ６３頁（１９９０）をここに参考として取り入れる）。たとえば、２つのウィル スの間のアミノ酸同一性は、カプシドタンパク質（Ｃ）については１５．４％、 メンブレンタンパク質（Ｍ）については１５．９％、エンベロープグリコタンパ ク質（Ｅ）については３６．５％、非構造タンパク質（ＮＳＩ）については３９ ゜１％である。以下の実施例に、改良されたキメラＴＢＥＶワクチンを開示する 。
我々は、すでに、感染性ＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型として用いること のできるクローン化された完全長デング熱ウィルスｃＤＮＡについて説明した。
これは、ｐＢＲ３２２ベクターを用いて大腸菌株内に安定な完全長デング熱ｃＤ ＮＡコピーをクローン化することにより達成された。デング熱ウィルスは、ｃＤ ＮＡのインビトロＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションした受容細胞から 回収された。デング熱ｃＤＮＡの感染性ＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクシ ョンした細胞により生成されたウィルスの特性は、ｃＤＮＡクローンが由来した もとのウィルスの特性と同一であった。
さらに、我々は、本発明において、１つの血清型のデング熱ウィルスの非構造タ ンパク質遺伝子と、別の血清型のデング熱ウィルスからの構造タンパク質遺伝子 とを含むゲノムを有するキメラデング熱ウィルスの作製を開示した。キメラデン グ熱ウィルスの１例として、１つのデング熱ウィルスからのカプシド、ｐｒｅＭ （メンブレン）、エンベロープ遺伝子配列を用いて、組換えｃＤＮＡ構築物にお ける４型デング熱ウイルスの対応する遺伝子を置換した。この構築物でトランス フェクションした細胞内で生成されたウィルスは、同型デング熱ウィルスに対す るワクチンの作製において有用である。上述したように、本出願は、さらに、デ ング熱ウィルスの非構造領域と別のフラビウィルスの構造領域に対応する遺伝子 配列を含むキメラウィルスの構築を開示している。特に、キメラダニ媒介脳炎ウ ィルスが開示されている。「キメラフラビウイルスの生成」と題した項において 概説した本発明の方法は、ＴＢＥＶからの３つの構造タンパク質を組み込んだ組 換えデング熱ウィルス構築物の製造を開示している。この構築物でトランスフェ クションした細胞から生成されるウィルスは、生菌ウィルスワクチンのためのウ ィルス候補である。
本出願に係る発明は、キメラフラビウイルス作製の技術に対する重要かつ予想外 の改良と、この新規なワクチン戦略の有用性についてのあらがえない証拠を提供 する。当業者であれば、１つのウィルスの構造タンパク質のすべてを第２のウィ ルスの非構造要素に組み込んだキメラフラビウイルス組合せが容易に回収可能で あり、培養細胞において効率的に複製することを期待できる。これは、関連性の 離れたフラビウイルス由来の構造タンパク質の機能的協力という要件の可能性が あるためである。しかしながら、予期せぬことに、本発明は、ＴＢＥＶゲノムか らの２つの構造タンパク質（すなわちＭおよびＥ）を、デング熱ウィルスからの 第３の構造タンパク質（すなわちＣ）と組み合わせたキメラＴＥＥＶウィルス（ ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４）を識別する。
第２３頁： この構築物は、Ｌａｉ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、第８８巻５ １３９〜５１４３頁、１９９１）により開示された技術を用いて、インビトロ転 写により転写された。図１７のキメラ構築物からの転写物は、サルＬＬＣ−ＭＫ ！細胞にＲＮＡをトランスフェクションすることにより、感染性について試験さ れた。
トランスフェクション処理には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ　ｉｎ”（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、メリーランド州Ｇａ 　ｉ　ｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）またはＤＯＴＡＰ　（Ｎ−［１−（２，３−ジオレ オイロキシ）プロピル−Ｎ、Ｎ、　Ｎ−１−リメチルアンモニウム硫酸ジメチル 、ＢＯｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリ ス）のいずれかを用い、キメラＲＮＡ転写物を受容細胞に導入した。サルＬＬＣ −ＭＫ２細胞の培養をこれらの処理に用いたが、ＴＲＥＶ複製のための受容細胞 型のどれでもかわりに用いることができることは言うまでもない。トランスフェ クションされた培養は、ＴＢＥＶ特異的ウサギ血清または高度免疫マウス腹水を 用いた免疫蛍光検査により、時間に対するウィルスの存在について、評価された 。
ｐＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４　（ＴＢＥＶ（７）プレメンフレンオヨヒエンベ ロープタンパク質からの配列をＤＥＮ４のカプシドタンパク質および非構造配列 に連結したものを含む）のＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションされた細 胞は、ＴＢＥＶ特異的ウサギ血清、ＴＢＥＶ特異的高度免疫マウス腹水（ＨＭＡ Ｆ）、およびＤＥＮ４特異的特異的８マＡＦ性に染まった。ＤＥＮ４のみに感染 した対照培養は、免疫蛍光標識されたＴＢＥＶ特異的血清に対しては、陰性であ った。
このことは、キメラｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４がＴＢＥＶおよびＤＥＮ４双 方の特異抗原を発現したことを示す。
キメラウィルスをトランスフェクションｖＴＢＥＶから分離し、ＴＢＥ　（ＣＭ Ｅ）／ＤＥＮ４　（ＴＢＥＶのカプシド、メンブレン、エンベロープ遺伝子と、 ＤＥＮ４の非構造配列とを含むゲノム構築物）と、ｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ ４と呼ぶ。実施例１７に開示したように、ＴＢＥ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４のＲＮ Ａによるトランスフェクションの１６日後、約１９６の細胞が、ＴＢＥＶおよび ＤＥＮ４特異抗原に対して陽性に染まった。陽性細胞の割合は時間とともに増加 し、トランスフェクション後２６８目に６Ｘ１０’ｐｆｕ／ｍＬのピーク力価を 示し、８０９６の細胞がトランスフェクションされた。一方、ＴＨＥ　（ＭＥ） ／ＤＥＮ４のＲＮＡを用いてトランスフェクションした細胞はより迅速にウィル スを生成し１６日目に培養の１００％が感染した。トランスフェクション細胞内 に存在するＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウィルス（ｖ　ＴＢＥ　（ＭＥ）／（Ｄ ＥＮ４）で示す）の力価は、感染後２６日目に４　ｘ　１０’ｐ　ｆ　ｕ／ｍＬ であった。さらに、キメラ構築物に感染させた細胞から生成された子孫ウィルス の配列決定により、図１７に示すように、キメラピリオン（ウィルス粒子）から のゲノム断片のＤＥＮ４およびＴＢＥＶ接合部が、キメラ構築物の接合部に符合 することが確認された。
ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ウィルスの性質 実施例１７において提供された方法を用いて、キメラウィルスの性質を調べた。
キメラＴＥＥＶ／ＤＥＮ４ウィルスを用いたすべての作業は、ＢＬ−３封じ込め 設備において実施された。
キメラウィルスから製造されたタンパク質を、４型デング熱ウイルスから作製さ れたタンパク質と比較した。完全長ＤＥＮ４ｃＤＮＡクローンから回収した４型 デング熱ウイルスのタンパク質は、「キメラフラビウイルス」と題する項におい て同定され、図４に示され、Ｂｒａｙ他（前出のＰｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　］、Ａｃ ａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　（１９９１））に開示されている。
第２８頁 キメラｖＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４の神経毒性の改変上記の「神経毒性に影響 するデングゲノムにおける突然変異」と題する項において説明したように、組換 えデング熱ウィルス構築物を、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲなどによる 突然変異誘発により改変し、神経毒性特性が低減したことによりワクチン接種に 適した改変ウィルスを生成する。ここに開示するように、同様な技術を用いて、 ｖＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ゲノムを改変して神経毒性を低減させることができ、これ により、ＴＢＥＶに対する弱毒化ウィルスワクチンの安全性が改善される。
ＴＢＥＶの防御抗原を維持し、かつ、ＴＢＥＶの周辺侵入性を欠く、活性ＴＢＥ 　Ｖ／Ｄ　Ｅ　Ｎ　４キメラを構築することができれば、この重要な病原体の免 疫予防のための新規な戦略、すなわち、弱毒化ＴＢＥＶワクチンの開発の基盤が 得られる。しかしながら、このゴールに到達するには、まず、キメラのさらなる 改変を達成しなければならない。すなわち、ウィルスの脳内への直接接種により 測定される、ＣＮＳに対する神経毒性の除去である。ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４キメラ は、親ＴＢＥＶの神経毒性を維持しているため、キメラゲノムのＤＥＮ４または ＴＢＥＶ部分において戦略的突然変異を加工し、マウス神経毒性に対するそれら の効果を評価することにより、この特性を無効にする必要があった。これらの突 然変異体は、ウィルスゲノム内の位置のいくつにでも導入される突然変異を潜在 的に含んでいる。初期の研究は、以下の突然変異をもっキメラウィルスを評価し た。すなわち、（１）　５’非コード領域における欠失、（２）ｐｒｅＭ−Ｍ開 裂部位またはｐｒｅＭあるいはＥあるいはＮＳＩタンパク質のグリコジル化部位 を除去する突然変異、（３）Ｅ遺伝子における点突然変異である。これまでに試 験された突然変異は図２４に含まれている。
ＴＢＥ　（ＭＥ）ＤＥＮ４構築物を系統的に改変し、神経毒性に対する遺伝子的 変更の効果について試験を行なうという研究の一部として、タンパク質配列に１ つ又はそれ以」二の変化を含む、６個の異なる構築物を作製した。実施例２２参 照。
当業者であれば、本発明において提供される技術を用いて、ＴＢＥ　（ＭＥ）／ ＤＥＮ４構築物に対して任意の数の置換、挿入、欠失を作製し、神経毒性におけ る変化を試験することができる。同様に、当業者であれば、遺伝子組成における 好ましくは少なくとも１つの変更を有するキメラ構築物を、天然の配列を組合せ たキメラ構築物と比べて試験するために、図２３に示す突然変異をこれらのまた はその他の突然変異と組合せることが容易に行なえる。
突然変異体キメラウィルスの作製を導く突然変異構築物の能力を評価する研究に おいて、トランスフェクションされたＬＬＣＭＫｖ細胞がら６個の突然変異体キ メラを回収し、プラーク形態観察における変化についてウィルスを分析した。
・・・の子孫 第３０頁〜第３１頁 さらに、本発明は、部位特異的突然変異誘発などを用いてデング熱ウィルス構築 物を改変することにより改良されたデング熱ウィルスワクチンを作製することを 当業者に教示する。
これらの改変は、キメラウィルス構築物に同様に組み込まれることは言うまでも ない。本発明は、さらに、デング熱ウィルスの非構造領域および少な（とも１つ の構造領域を、別のワラビウィルスからの構造遺伝子領域と組合せて含むキメラ ウィルスの作製ならびに試験を教示する。特に、４型デング熱ウイルスからの１ つの構造領域ならびに非構造領域と、ＴＢＥＶからの２つの構造タンパク質をコ ードする配列とを含むキメラウィルスを含む、ＴＢＥＶのためのワクチンが開示 されている。
ＴＢＥＶ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４についてこれまでに観察された、励みになる成果 は、これらの技術が、ＴＢＥＶよりもデング熱ウィルスにより密接に関連したウ ィルスに対するワクチンを作製する際にも有用であることを示唆している。この ような例の１つは、極東において依然として大きな公衆衛生問題である日本脳炎 ウィルスである。すなわち、さらなる実施例において、本発明の技術は、ＤＥＮ ４ｃＤＮＡ非構造領域を、非木造領域ィルスからの少なくとも１つの構造遺伝子 とＤＥＮ４の残りの構造遺伝子領域に組合せるために用いられる。
さらに、本発明の技術を用いて、異なるフラビウイルス間の非構造領域および構 造領域の他の組合せを同様にして作製し試験することができることは言うまでも ない。たとえば、日本脳炎ウィルスの組換え構築物を、ウィルス非構造領域はそ のままにして、１つ又はそれ以上の構造領域をダニ媒介脳炎ウィルスからの対応 する遺伝子配列で置換するように改変することができる。同様に、ダニ媒介脳炎 ウィルスをコード化する組換えｃＤＮＡを生成し、構造領域を、デング熱つィル ス構造タンパク質をコード化する少なくとも１つの遺伝子で置換することができ る。
ここにおよび下記の実施例において引用されるすべての刊行物は参照として取り 入れられる。以下、本発明の特別な実施例を詳細に検討し、本発明の範囲内での 可能な変型について言及する。本発明を成功裡に実施することのできる、さまざ まな代替技術や手順が当業者には知られている。
実施例およびそれに関連する一般情報 ウイルス　、４型デング熱ウイルス株８１４６６９を用いて、完全長感染性ＲＮ Ａ転写物の転写源として用いられる完全長ｃＤＮＡを構築した（Ｅ、Ｍａｃｋｏ ｗ他（１９３７）Ｖｉ　ｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁、Ｂ、　Ｚｈ ａＯ他（１９８６）Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁）。アヵゲザル胎 児肺細胞継代培養レベル９のｌ型デング熱つィルス西太平洋株（ＤＩＷＰ）の標 本は、Ｋ、Ｅｃｋｅｌｓ博士の好意により提供された（ＷＲＡＩＲ，ワシントン ＤＣ）（Ｋ、Ｔ、ＭｃＫｅｅ他（１９８７）Ａｍ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙ ｇ。
第３６巻４３５〜４４２頁）。マウス脳継代培養レベル３８の、マウス神経毒性 ２型デング熱ウイルスニユーギニアＣ株（Ｄ２ＮＧＣ）のマウス脳標本は、Ｄ。
Ｄｕｂｏ　ｉ　ｓ博士の好意により提供された（ＷＲＡＩＲ，ワシントンＤＣ） （Ａ。
Ｂ、５ａｂｉｎ　（１９５２）Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｔｒａｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、第１ 巻３０〜５０頁）。１型および２型デング熱ウイルスは、Ｃ６／３６蚊細胞内で １回、継代培養することにより増幅された。つぎに、これらの３つのウィルスは 、ＬＬＣＭＫ２サル腎臓細胞内で１回、継代培養された。得られたウィルス懸濁 液はプラーク形態観察およびマウス神経毒性の研究に用いられた。
ローニングベ　ター　：　４型デングゲノムの５′側半分を含むプラスミドｐ５ ′−２を、３つの構造タンパク質遺伝子の置換を容易にするために改変した（Ｃ ，Ｊ、　Ｌａ　ｉ他（１９９１）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ第８８巻５１３９〜５１４３頁）。まず、唯一のＸｈｏＩ部位が、部位特異的 突然変異誘発により、Ｅの３′末端の近くの、４型デング配列のヌクレオチド２ ３４２（Ａ−Ｇ）に導入され、ｐ５°−２（ＸｈｏＩ）を作製した。このヌクレ オチド変更はアミノ酸配列を変更するものではなかった。このベクターはつぎに 、デング配列内の唯一のＢｓｔＢ１部位において、および、ｐ５°−２内のデン グ配列の直後の唯一のＡｓｐ７１８部位において、消化された。断片はデング４ ゲツムの３°側半分に連結され、完全長ｐ２Ａ（Ｘｈｏｌ）を作製した。第２に 、ワラビウイルスに保存されている、ヌクレオチド８８のＢｇｌ１１部位は、ｐ ５゜−２内の他の３つのＢｇ１１１部位を除くことにより、唯一の部位とされた 。ｐＢＲ３２２およびＳＰ６プロモーター間の接合部におけるＢａｌｌＩ部位は 、ＮｏｔＩリンカ−を挿入することにより除去された。４１２８および４２７７ の他の２つの部位は、最近導入された３４７３のＰｓｔ１部位までベクターを短 くすることにより、除去された（Ｋ、Ｔ、ＭｃＫｅｅ他（１９８７）Ａｍ、Ｊ、 Ｔｒｏｐ。
Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、第３６巻４３５〜４４２頁）。つぎに、プラスミドｐ５’　− ２（Ｘｈｏ　Ｔ、　Ｐｓ　ｔ　Ｉ）をフラグメント交換に用い、キメラｃＤＮＡ を作製した。
図１は、構築された完全長デンゾｃＤＮＡを含む、以下のプラスミドを示す。
ｐ２Ａ　（Ｘｈｏ　Ｉ）は、４型デングゲノムの完全なｃＤＮＡコピーであり、 唯一のＸｈｏ１部位がＥ遺伝子の３°末端の近くに創製された。ｐ２Ａ　（ＤＩ ＷＰ）は、ｐ２Ａ（Ｘｈｏｌ）から、５゛非コード領域内のＢｇ１１１部位と唯 一のＸｈｏ１部位との間の配列を、１型デング西太平洋株の対応するｃＤＮＡで 置換することにより、得られた。ｐ２Ａ　（Ｄ２ＮＧＣ）は、同様にして、Ｂ　 ｇ　Ｉ　ＩＩ−Ｘｈｏｌ断片を、２型デングニユ一ギニアＣ株からの対応するｃ ＤＮＡで置換することにより、作製された。Ｂ：Ｂｇｌｌｌ、Ｘ：ＸｈｏＬ　Ａ ：Ａｓｐ７１８制限酵素部位。
キメラｃＤＮＡ　：　Ｃ６／３６蚊細胞内で増殖した１型または２型デング熱ウ イルスを精製し、Ｂ、Ｚｈａｏ他（１９８６）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７ ７〜８８頁）により説明された手順にしたがってピリオンＲＮＡを抽出した。ｌ 型デング配列のヌクレオチド２３０６〜２３３８にハイブリダイズするネガティ ブセンスオリゴヌクレオチドを用いて、逆転写により、１型デング第１鎖ｃＤＮ Ａを合成した。このプライマー配列は、上記のｐ５°−２（Ｘｈｏｌ、Ｐｓ　ｔ 　Ｉ）内の４型デングＥ遺伝子内の部位に対応する位置にＸｈｏ１部位を創製す るために、ヌクレオチド２３１６におけるサイレントな第３塩基変更（Ａ−Ｇ） を含んでいた。つぎに、１型デングｃＤＮＡを鋳型として、ネガティブセンスオ リゴヌクレオチドおよび１型デングヌクレオチド５１〜７０にハイブリダイズす る保存されたＢｇ１１１部位を含むポジティブセンスプライマーを用いて、ＰＣ Ｒにより２本鎖ＤＮＡを合成した。ＰＣＲ産物をＢ　ｇ　Ｉ　Ｉ鳩よびＸｈｏｌ で消化し、つぎに、ｐ５°　−２（Ｘｈｏ　Ｉ、Ｐｓ　ｔ　Ｉ）にクローン化し 、対応する４型デング配列を置換した。つぎに、１型デング配列を含むＣｌ　ａ 　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片をｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）からの残りの４型デングｃＤＮＡに 連結し、完全長キメラｐ２Ａ（ＤＩＷＰ）を創製した。同様に、２型デングヌク レオチド２３１０〜２３６４に／％（ブリダイズするネガティブセンスプライマ ーを用いて、２型デング第１鎖ｃＤＮＡを合成した。このプライマーは、２３３ ３におけるＴ−Ｃ，２３３６におけるＡ−Ｇ、２３３７におけるＣ−Ａの、３つ の塩基変更を含む。これらの変更は、上述した４型デング遺伝子におけるＸｈｏ １部位に対応する位置にＸｈ。
１部位を創製する。これらの変更はアミノ酸配列を変えるものではながった。
第３８頁〜第４０頁 図７に示すように、鋳型鎖中には、Ａｓｐ７１８開裂部位の前に５個の付加ヌク レオチドが存在する。転写が最後のヌクレオチドに進むと、ＲＮＡ転写物には、 ３°末端におけるこれらの５個の付加残基が含まれることになる。
形質転換のための宿主として大腸菌株）ｆＢ　１０１を用いたこの研究中に気づ いたことは、完全長デンゾＤＮＡを含むプラスミドは、再配列を経た多くの形質 転換体におけるプラスミドとしてしばしば不安定であり、予測された制限酵素パ ターンをもつクローンＤＮＡを単離するためには多数のコロニーをスクリーニン グしなければならないということである。我々は、異なる大腸菌株により作製さ れるプラスミドの安定性を調べた。研究室ですでに用いられていた、形質転換に 高度に適した市販の大腸菌株ＤＨ５αおよび大腸菌株ＤＥ１５２８を、大腸菌株 ＨＢ１０１と比較した。ＤＢ１５２８株は、ＨＢ　１０１よりもコロニーサイズ が３〜４倍大きい形質転換体を産生じた。特に、ＤＢ１５２８の形質転換体は、 一般に、予測された制限酵素パターンをもつプラスミドを産生じ、このことは、 大腸菌株ＤＢ１５２８が、安定的にクローン化されたデンゾ完全長ＤＮＡを生成 するための優秀な株であることを示唆している。しかしながら、トランスフェク ション細胞上で試験した場合、この第１の完全長デンジＤＮＡクローンから作製 されたインビトロＲＮＡ転写物は、デング熱ウィルスを産生じなかった。ここで 、免疫蛍光検定により検出されるように、１００倍低い濃度の、陽性対照として のピリオンＲＮＡはデング熱ウィルスを産生じた。
実施例５ 独立に　るＤＮＡ　ローン　いた　：金ｍｌ迎トリ査デングＤＮＡセ　メントの 感染性ＲＮＡ転写物を産生できないのは、完全長クローンにおける欠陥突然変異 の存在によるものであると説明された。このような突然変異は、ウィルス株にお ける欠陥集団のクローニングまたはプラスミドのクローニングまたは繁殖の際の 結合エラーから生じると推定される。我々は、１つ又はそれ以上の欠陥突然変異 を含むデンジＤＮＡセグメントを、独立にクローン化したデンジＤＮＡ構築物か らの対応するセグメントで置換することに決定した。系統的な置換実験のための フレームワークとして、デンゾ配列の５′および３゛断片を別々にクローン化し た。ヌクレオチド５０６９における唯一のＢｓ　ｔＢ１部位を用いて、完全長デ ンゾ配列を、各々ゲノムの約５０９６を示す２つの断片に分離した。ＳＰ６プロ モーターを含む第１の完全長クローンの５゛断片は、５゛−１と呼ばれ、Ｂｓ　 ｔＢｌとＡｓｐ７１８の間の残りの３゛配列は３’−Ａと呼ばれた。第２の５゛ 断片５°　−２を含むプラスミドは、独立に由来するひと組のデンゾｃＤＮＡイ ンサートから構築された。唯一のＡｓｐ７１８部位は、デンゾ配列のＢｓ　ｔＢ １部位の下流のｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に導入された。このように、このプ ラスミドは、完全長ＤＮＡ構築物に３゛断片を挿入するためのクローニングベク ターとしても適している。２つの付加３′断片３′　−Ｂおよび３’　−Ｃも、 デンゾｃＤＮＡインサートの独立したひと組から構築された（図８）。第１の完 全長クローンＩＡ内の３゛断片を３゛−Ｂおよび３゛−ｃ断片で置換すると、２ つの別の完全長クローンＩＢおよびＩＣが作製された。同様に、３つの完全長Ｄ ＮＡ構築物すべてにおいて５゛断片を５°−２断片で置換すると、３つの別の完 全長クローン、すなわち、２Ａ、２Ｂ、２Ｃが生成された。これらのプラスミド をＢｇｌＩＬＮｓ　ｉ　Ｌ　Ａｓｐ７１８で消化すると、図９に示されるように 、６個の完全長クローンすべてについて区別不可能な、予測されたＤＮＡ断片の パターンを示した。
このように、大腸菌株ＤＢ１５２８中の完全長デンジＤＮＡ配列を明らかに含む プラスミドの増殖に成功することによって、培養細胞における感染性の評価のた めのインビトロＲＮＡ転写物の生成力側能となった。
実施例６ インビトロで作　されたＲＮＡ　の感　についての　の証構築された完全長デン ジＤＮＡ鋳型から生成されたＲＮＡ転写物は、ＬＬＣ−ＭＫ２のトランスフェク ションにより、感染性についてそれぞれ試験された。デンゾ感染細胞は、間接的 免疫蛍光検定により検出されるとおり、２Ａ　ＲＮＡでのトランスフェクション の１０日後に容易に観察された。他の４つの完全長ＤＮＡクローンからのＲＮＡ 転写物は、この検定では陰性であり、これらのＤＮＡクローンは、クローンＩＡ のように、制限酵素分析では検出できない致死突然変異を含んでいることが示さ れた。
上述したデング熱ウィルス感染細胞の陽性判定に加えて、感染性デング熱ウィル スを、培地または２ＡＲＮＡ）ランスフエクション細胞の細胞溶解物から回収し た。トランスフェクション細胞溶解物中に存在するデング熱ウィルスの力価は１ ０’ｐ　ｆｕ／ｍＬであった。２Ａ　ＲＮＡ転写物をＤＮａｓｅＪを用いて処理 した場合、その感染性には影響がなかったが、ＲＮａｓｅ処理ではその感染性は 完全に損なわれた。ＲＮＡを用いた細胞モルイヤーのトランスフェクションの後 、デング熱ウィルスのプラーク形成は行なわれなかったため、ウィルスの生成は 、ウィルス増幅のための延長されたインキュベーションの後で判定された。この 間接的免疫蛍光検定手順を用いて、感染性は、ゲノムＲＮＡ　１　ｎ　ｇまたは ２ＡＲＮ八転写へ１０ｎｇの最小濃度において検出された。この試験のこれらの 結果は、クローン２Ａから作製されたＲＮＡ転写物が、受容培養細胞のトランス フェクションの後で、感染性を持つことを示している。
実施例７ 尺ＮＡ−転写艷の感染性についてのその　の証拠クローン２Ａ　ＲＮＡ転写物で トランスフェクションした細胞により、感染性デング熱ウィルスが生成されたこ とを正式に証明するため、デンゾゲノムのヌクレオチド３４７３に新たなＰｓｔ Ｉ部位を創製するがアミノ酸配列には影響しない２つの突然変異（Ｇ３４７３− →ＴおよびＣ３４７６−→Ｔ）を、完全長デンゾクローン２Ａ　ＤＮＡに導入し た。この突然変異ＤＮＡから作製されたＲＮＡ転写物を、ＤＮａ　ｓ　ｅ　Ｉを 用いた消耗性消化によりＤＮＡ鋳型を完全に除去したのち、細胞のトランスフェ クションに用いた。トランスフェクションされた細胞は感染性デング熱ウィルス を生成した。子孫ウィルスから抽出されたゲノムＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡ産 物をＰＣＲのための鋳型として用いて、ヌクレオチド３１９３〜４５３６の間に ＤＮＡ断片を生成した。図１０に示すように、ＰＣＲＤＮＡ産物のＰｓｔｌ消化 は、Ｐｓｔｌ開裂配列の存在により予測されるように、それぞれ２８０個および １０６３個の塩基対の長さの２つの断片を産生じた。
２Ａ　ＲＮＡ由来のウィルスの対照ＰＣＲＤＮＡ産物は、Ｐｓｔｌ消化に対して は非感受性であった。この観察は、突然変異体２Ａ　ＤＮＡのＲＮＡ転写物に由 来する子孫ウィルスがＰｓｔＩ部位を含むことの証拠を提供した。
実施例８ インビトロで　７されｔ；ｍ　ＲＮＡから口　されたデン　１、ウィルスクロー ン２Ａまたはクローン２Ａ　（Ｐｓ　ｔ）鋳型から作製されたＲＮＡ転写物を用 いてトランスフェクションした細胞の溶解物から子孫デング熱ウィルスを分離し 、Ｌ　Ｌ　Ｃ−ＭＫ２細胞単層上でのプラーク形成能力について、親・野生型ウ ィルスと比較した。感染の６日後、子孫ウィルスおよび親ウィルスは、ともに、 さまざまな大きさの特徴的なデンゾプラークを生成した。蚊細胞内の継代培養に より増殖した親ウィルスでは圧倒的に小型プラークがみられたが、子孫ウィルス では混合的でありしかし主に大きいプラークが生成され、回収されたウィルスが クローン化集団を提供することを示唆している。子孫ウィルス感染細胞および親 ウィルス感染細胞において生成されたデング特異タンパク質についても比較を行 なった。図１１に示すように、デンゾ高度免疫腹水により沈殿させたＰ　ｒ　ｅ 　Ｍ、ＬＮＳＩ、ＮＳ２、およびその他未決定のデンゾ、タンパク質バンドのプ ロフィールは、子孫ウィルスおよび親ウィルス双方について識別不可能であるよ うに見えた。
この結果は、回収されたデング熱ウィルスが、ｃＤＮＡクローンが由来するもと のウィルスと同じ遺伝子型および表現型を呈することを示すものである。
Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａ開裂接合部におけるアミノ酸置換による活性デング熱ウィルス の加工 実施例９ 開　。１配　にお番るアミノ　る Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ　ＤＮＡの　− 真正［ａｕｔｈｅｎｔ　ｉｃ］　ＮＳＩの発現のために構築された中間組換えｐ ＳＣｌ　１−Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａ　ＤＮＡをこの研究に用いた。デング熱つィルス ＤＮＡは、２４アミノ酸Ｎ末端信号のためのコード配列と、ＮＳＩおよびＮ５２ Ａの完全ポリペプチド配列を含んでいた。
第４３頁 実施例１２ ＮＳＩ−ＮＳ２Ａ　・ム。にお（る　適でない　呈　る４　デン　、ウィルス　 、 ここで重要なことは、デング熱疾病に対する安全で効果的な弱毒化生菌ウィルス ワクチンの開発に、デング熱ウィルスの分子理解を応用することである。デング 熱ウィルス複製の制限は弱毒化を誘起するであろう。開裂配列またはウィルスプ ロテアーゼ構成要素の改変の結果、ウィルスポリタンパク質の開裂は最適以下と なり、ウィルス増殖が制限される。
ポリタンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂部位は、その非効率的開裂の故に、増殖制 限されたデング熱ウィルス突然変異体を構築するための第１のターゲットとして 選択された。我々は、４型デング熱ウイルスのＮ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂には、開裂 接合部の前のＮＳＩのＣ末端に８アミノ酸配列が必要であることを証明した（Ｈ ，ＨｏｒｉおよびＣ，Ｊ、Ｌａｉ　（１９９０）、デング熱ウィルスＮ５Ｉ−Ｎ Ｓ２Ａの開裂には、ＮＳＩのＣ末端にオクタペプチド配列が必要である。Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、第６４巻４５７３〜４５７７頁）。
フラビウィルス間で８アミノ酸配列を比較すると、Ａｌ　ａ　（−１）　、Ｖａ 　１（−３）　、Ｓｅｔ　（−５）　、Ｖａ　Ｉ　（−７）　、Ｍｅｔ／Ｌｅｕ −８）は正確に保存されるのに対し、Ｔ１１ｒ　（−２）、Ｇｌｎ　（−４）、 Ｌｙｓ　（−６）は変化するという興味深い特色が明らかになった。位置−１の Ａｌａ、位置−？のＴｈｒ。
位置−３のＶａｌ、位置＋１のＧｌｙのアミノ酸置換の効果を分析した。この分 析の結果は図１６に示されている。保存された位置−１または−３におけるアミ ノ酸置換は、低レベルの開裂を生じた。非保存位置−２または＋１におけるアミ ノ酸置換は、効果がないかもしくはごくおだやかな開裂低減を呈した。
ある範囲の開裂効率を生じたアミノ酸置換のパネルを、完全長ｃＤＮＡへの組み 込みのために選抜し、インビトロ由来ＲＮＡ転写物をデング熱ウィルス突然変異 体の構築のために用いた。１つのデング熱ウィルス突然変異体は、Ｇｌｙ（＋１ ）のかわりにＧｌｕを含むＤＥＮ４　（ＧＩ　ｙｕｔｏ＝ＧＩ　ｕ）であり、他 の３つの突然変異体は、ＤＥＮ４　（Ｔｈｒ＋＋ｔｉ＝Ｌｙ８）　、ＤＥＮ４　 （Ｔｈｒ＋＋之ａ→Ｇｌ　ｎ）　、ＤＥＮ４　（Ｔｈｒ目１４−Ｌｅｕ）であり 、Ｔｈｒ（２）の置換を含んでいる。これらはトランスフェクションしたＬ　Ｌ 　Ｃ−Ｍ　Ｋ　２細胞から回収された。
以下に述べるように、これらの突然変異体の増殖特性は、蚊Ｃ６／３６細胞上の プラーク検定により調べられた。図１２はＤＥＮ４　（ＧＩ　ｙｍａ−〇ｌｕ） および対照親ウィルスに対するこの検定の結果を示す。突然変異体ウィルスのプ ラークサイズは直径約０．１ｃｍが計測され、親ウィルスの１．１ｃｍのプラー クサイズと比較して大きく縮減していた。その他のデングウィルス突然変異体も プラークサイズの縮減を示し、これらのウィルスが培養細胞において増殖制限を 示すことを示唆している。最適以下の開裂に起因する増殖制限は、感染宿主にお けるウィルス毒性に対して、大きな効果をもつようである。
第４６頁 実施例１５ プ之二之形皿観察 ウィルスは、Ｌ　Ｌ　Ｃ−ＭＫ２細胞または蚊Ｃ６／Ｃ３６細胞上のプラーク形 態について調べられた（Ｂａｎｋｃｒｏｆｔ他、Ｐａｎ　Ａｍ、Ｈｅａｌｔｈ　 Ｏｒｇａｎ、Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ、第３７５巻１７５〜１７８頁（１９７９）；Ｈ ｏｋｅ他、Ａｍ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、第４３巻２１９〜２２６頁（ １９９０））。プラーク形態の分析の前に、親・野生型ウィルスは、ＬＬＣ−Ｍ Ｋ！細胞中で１回、継代培養された。すなわち、２％ウシ胎児血清を含む培地１ ９９中に試験すべきデングウィルス０．２ｍＬを連続１０倍希釈し、これを２５ ｃｍ２ビンに入れたＬＬＣＭＫ２細胞に注入した。３５℃で１時間の吸着の後、 各単層に、ＩＸ培地１９９．０．３％重炭酸ナトリウム、１／２Ｘイ一グル基本 培地ビタミン、１／２Ｘイ一グル基本培地アミノ酸、ｌＯ％ウシ胎児血清、０． ５％アガロースを含む７ｍＬのアガロースを重層した。３５℃で６日間のインキ ュベーションの後、このビンに、０．５％ＭＥアガロースおよび１ニア、５００ ニユートラルレツドを含む通常生理食塩水４ｍＬを２回目のオーバーレイとして かけた。染色から２４時間以内にウィルスプラークがあられれた。Ｃ６／３６細 胞上のプラーク形態観察を行ない、分離されたすべてのウィルス突然変異体が調 べられた。この目的のため、７５ｃｍ２ビンに入れたのコンフルエントなＣ６／ ３６細胞に、２９６ウシ胎児血清を加えたＭＥＭに連続的に希釈された０、５ｍ Ｌのウィルスを接種し、１〜２時間３５℃で吸着させた。つぎに被感染細胞に、 ２０ｍＬ／フラスコのアガロース（１×バンク平衡食塩溶液、０．５％ラクトア ルブミン加水分解物、１０％０％ウシ胎清、０．１２％重炭酸ナトリウム、０， ７５％Ｓｅａｋｅｍ”　ＧＴＧアガロース）を重層した。培養を３５℃で７日間 、インキュベートした。つぎに、ＮａＣ１８，Ｏｇ／Ｌ、ＫＣＩ　０．４ｇ／Ｌ 、グルコース１．Ｏｇ／Ｌ、ＮａｚＨＣＯｚ　２２．５ｍｇ／Ｌ、−ユートラル レッド３．３ｍｇ／Ｌからなるニュートラルレッド染色液５ｍＬを用いて培養物 を染色した。３５℃で３〜５時間のインキュベーションののち、余分の染色液を 取り除き培養物はインキュベータに戻した。一般に、インキュベータ内で２４〜 ３６時間経過した後プラークがあられれた。
実施例１６ 且二非三二下領域長公失モ　４　デン　１、ウィルス　然ここで、デング組換え ＤＮＡ系により、ウィルスＤＮＡの５°および３゛非コード領域ならびにコード 領域における欠失を含むデングウィルス突然変異体を構築することも可能となる 。欠失突然変異体は、アミノ酸置換突然変異体よりも、表現型の復帰が起きるこ とが少ないという利点を提供する。４型デング熱ウイルスゲノムの３′非コード 領域における欠失突然変異の加工において進展がみられた。他の蚊媒介フラビウ イルスと同様に、４型デング熱ウイルスは、保存配列１（Ｃ３−１）および保存 配列２　（Ｃ３−２）と呼ばれる伸張した保存配列と、３゛非コード領域内の末 端ステムアンドループを取り得る構造を含む。
第５３頁 ５’　ＧＴＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＴＴ ＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡ−（配列番号３７）（４）変異ＮＳＩ　（２）−Ｇｌ　ｃ 　：５’　ＴＧＧＡＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣ ＡＧＡＴＡＧＡＧＡ＋　（配列番号３８） ５°ＴＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＣ ＴＡＴＣＣＡ−（配列番号３９） （５）変異Ｐ　ｒ　ｅ　Ｍ／Ｍ　： ５°ＧＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＣＡＴ ＣＣＣＡＣ＋　（配列番号４０） ５’　ＧＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＴ ＣＣＴＴＣＴＴＧ　（配列番号４１） （６）変異Ｅ： ５°ＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＴ ＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡ＋　（配列番号４２）５°ＧＣＣＣＣＡＧ ＣＣＴＣＧＡＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＡＣＧＡＣ ＧＧ−（配列番号４３）さらに、上流プライマーは（配列番号４４）５’　ＧＡ ＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＧＡ＋および下流プライマー は（配列番号４５）５°　ＣＴＴＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡ ＧＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＣＡ− 実施例２３ マウスにお番る　経　の さらに、突然変異されたキメラウィルス調製物は、マウスにＩＣ接種され、実施 例２１に提供されている技術を用いて、ＤＥＮ４、ＴＨＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ およびＴＨＥ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４と比較された。試験動物の半数を死亡させ るのに必要な致死量が、突然変異キメラウィルスの各々について比較された。生 後６週間のＢＡＬＢ／ｃマウスの８匹ずつのグループに、さまざまな変異キメラ 、ＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４、ＴＢＥ　（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４、またはＤＥＮ ４を、１０００．１００．１０．１、Ｏ，１ｐｆｕの投与量で、脳内接種した。
被感染マウスは、３１日間、脳炎の徴候および死亡について観察された。５０％ 致死量（ＬＤ５０）が各ウィルスについて算出され、その値がマウス神経毒性の 基盤として用いられた。図２４に示すように、親ＴＢＥ　（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウ ィルスのＬＤ５０は約１０ｐｆｕであった。このレベルのり、Ｄ５０は、い（つ かの変異ウィルスについても観察された。少なくとも２つの突然変異体、すなわ ち”Ｎ５Ｉ（１）−Ｇｌｃ−および”ＰｒｅＭ／Ｍ−のＬＤ５０は、１００ｐｆ ｕよりも大きく、これらの突然変異体のマウス神経毒性は１００倍以上減少した ことを示している。
この発見は、キメラウィルスゲノムにおけるＮＳＩ　（１）−Ｇｌｃ−またはＰ ｒｅＭ／Ｍ−突然変異は、それぞれ、マウス神経毒性の弱毒化を提供することを 示すものである。これらの突然変異ウィルスは、個別にまたは組合わせて、ワク チン候補としての有用性のさらなる評価に有益であろう。
請求の範囲 １、ダニ媒介脳炎ウィルス（ＴＢＥＶ）からのプレメンブレンタンパク質および エンベロープタンパク質を作動可能にコード化する核酸領域を含み、前記核酸領 域は、デング熱ウィルスからのカプシドタンパク質および弁構造タンノくり質を コード化する核酸領域に作動可能に連結することを特徴とする組換えＤＮＡ構築 物。
２、前記デング熱ウィルスは４型デング熱ウイルスであることを特徴とする請求 の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ構築物。
３、前記構築物は、前記核酸内に少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴と する請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ構築物。
４、前記突然変異は、プレメンブレンタンノ々り質、エンベロープタンノくり質 、またはＮＳＩ　（１）タンパク質のグリコジル化を減少させる１つ又（よそれ 以上の突然変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質への開裂を 減少させる１つ又はそれ以上の突然変異、ポリタンパク質Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａ開裂 部位のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部位ζこおける１ つ又ζよそれ以上の置換、３°非コード末端の最も３゛寄りのヌクレオチドを第 １番としたとき、ヌクレオチド１１３番から３８４番までの間（１１３番および ３８４番を含む）の少なくともヌクレオチド３０個からなる１つ又はそれ以上の 欠失、ＮＳ１のＣ末端開裂部位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコ ードイヒする配列内の１つ又はそれ以上の突然変異からなる群から選択されるこ とを特徴とする請求の範囲第３項に記載の組換えＤＮＡ構築物。
５、ゲノムを有するキメラウィルスにおいて、前記ゲノムは、ダニ媒介脳炎ウィ ルス（ＴＢＥＶ）からのプレメンブレンタンパク質およびエンベロープタンパク 質をコード化する核酸領域と、デング熱ウィルスからのカブシドタンノ々り質と 非構造タンパク質をコードイヒする核酸領域とを含むことを特徴とするキメラウ ィルス。
６　前記デング熱ウィルスは４型デング熱ウイルスであることを特徴とする請求 の範囲第５項に記載のキメラウィルス。
７、前記ゲノムは、前記核酸における少なくとも１つの突然変異を含むことを特 徴とする請求の範囲第５項に記載のキメラウィルス。
８、前記突然変異は、プレメンブレンタンパク質、エンベロープタンパク質、ま たはＮＳＩ　（１）タンパク質のグリコジル化を減少させる１つ又はそれ以上の 突然変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質への開裂を減少さ せる１つ又はそれ以上の突然変異、ポリタンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂部位の つぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部位における１つ又はそ れ以」−の置換、３゛非コード末端の最も３′寄りのヌクレオチドを第１番とし たとき、ヌクレオチド１１３番から３８４番までの間（１１３番および３８４番 を含む）の少なくともヌクレオチド３０個からなる１つ又はそれ以上の欠失、Ｎ Ｓ１のＣ末端開裂部位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード化す る配列内の１つ又はそれ以上の突然変異からなる群から選択されることを特徴と する請求の範囲第７項に記載のキメラウィルス。
９　を推動物において防御免疫反応を起こすことのできる、請求の範囲第５項の キメラウィルスを含む、ダニ媒介脳炎ウィルスに対するワクチン。
１０、第１のワラビウイルスに対してヒトを免疫化する方法において、前記第１ のフラビウイルスからのプレメンブレンタンパク質およびエンベロープタンパク 質と、第２のウィルスからのカプシドタンパク質および非構造タンパク質を作動 可能にコード化するＤＮＡ構築物を調製し、前記ＤＮＡ構築物から感染性ＲＮＡ 転写物を生成し、前記ＲＮＡ転写物を細胞内に導入し、 前記ＲＮＡ転写物を前記細胞内で発現させてウィルスを生成し、前記細胞から前 記ウィルスを収穫し、 を推動物において前記ウィルスを試験し、前記ウィルスをヒトに接種する工程を 含むことを特徴とする方法。
１１、前記調製工程は、前記ＤＮＡ構築物に１つ又はそれ以上の突然変異を導入 する工程をさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
１２、前記突然変異は、プレメンブレンタンパク質、エンベロープタンパク質、 またはＮＳＩ　（１）タンパク質のグ刃コシル化を減少させる１つ又はそれ以上 の突然変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質への開裂を減少 させる１つ又はそれ以上の突然変異、ポリタンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂部位 のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部位における１つ又は それ以上の置換、３°非コード末端の最も３°寄りのヌクレオチドを第１番とし たとき、ヌクレオチド１１３番から３８４番までの間（１１３番および３８４番 を含む）の少なくともヌクレオチド３０個からなる１つ又はそれ以上の欠失、Ｎ Ｓ１のＣ末端開裂部位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード化す る配列における１つ又はそれ以上の突然変異からなる群から選択されることを特 徴とする請求の範囲第７項に記載の組換えＤＮＡ構築物。
１３、ダニ媒介脳炎ウィルス（Ｔ　Ｂ　Ｅ　Ｖ）からのプレメンブレンタンパク 質およびエンベロープタンパク質を作動可能にコード化する核酸領域を含み、前 記核酸領域は、デング熱ウィルスからのカプシドタンパク質および非構造タンパ ク質をコード化する核酸領域に連結することができることを特徴とするＲＮＡセ グメント。
１４　前記デング熱ウィルスは４型デング熱ウイルスであることを特徴とする請 求の範囲第１３項のＲＮＡセグメント。
１５、前記構築物は前記核酸内に少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴と する請求の範囲第１３項に記載のＲＮＡセグメント。
１６、前記突然変異は、プレメンブレンタンパク質、エンベロープタンパク質、 またはＮＳＩ　（１）タンパク質のグリコジル化を減少させる１つ又はそれ以上 の突然変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質への開裂を減少 させる１つ又はそれ以上の突然変異、ポリタンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂部位 のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部位における１つ又は それ以上の置換、３′非コード末端の最も３′寄りのヌクレオチドを第１番とし た、ヌクレオチド１１３番から３８４番までの間（１１３番および３８４番を含 む）の少なくともヌクレオチド３０個からなる１つ又はそれ以上の欠失、ＮＳＩ のＣ末端開裂部位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード化する配 列における１つ又はそれ以上の突然変異からなる群から選択されることを特徴と する請求の範囲第１５項に記載のＲＮＡセグメント。
１７、安定な、完全長の、感染性４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化する、 単離された組換えＤＮＡ構築物。
１８、さらにベクターを含むことを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の単離 された組換えＤＮＡ構築物。
１９、前記ベクターはプラスミドであることを特徴とする請求の範囲第１８項に 記載の分離された組換えＤＮＡ構築物。
２０、前記ＤＮＡ構築物の発現を可能とするように、請求の範囲第１８項による 組換えＤＮＡ構築物で安定的に形質転換された宿主細胞。
２１、前記細胞は原核細胞であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の 宿主細胞。
２２、少なくとも１つの突然変異をさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１ ７項に記載のＤＮＡ構築物。
２３、安定な、完全長の感染性４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化する単離 された組換えＤＮＡ構築物において、少なくとも１つの突然変異をさらに含み、 前記突然変異は、プレメンブレンタンパク質、エンベロープタンパク質、または ＮＳＩ　（１）タンパク質のグリコジル化を減少させる１つ又はそれ以上の突然 変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質への開裂を減少させる １つ又はそれ以上の突然変異、ポリタンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ開裂部位のつぎ の＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部位における１つ又はそれ以 上の置換、３゛非コード末端の最も３゛寄りのヌクレオチドを第１番としたとき 、ヌクレオチド１１３番から３８４番までの間（１１３番および３８４番を含む ）の少なくともヌクレオチド３０個からなる１つ又はそれ以上の欠失、ＮＳＩの Ｃ末端開裂部位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード化する配列 における１つ又はそれ以上の突然変異からなる群から選択されることを特徴とす る分離された組換えＤＮＡ構築物。
２４．４型デング熱ウイルスに対するワクチンにおいて、請求の範囲第２３項の 前記ＤＮＡ構築物と、薬学的に許容可能な担体とを含み、前記ワクチンは、４型 デング熱ウイルス感染に対してを推動物に防御免疫反応を起こすことができるこ とを特徴とするワクチン。
２５、組換えＤＮＡ構築物から転写された安定な完全長の感染性４型デングゲノ ムを含む、単離されたＲＮＡセグメント。
２６、少なくとも１つの突然変異をさらに含むことを特徴とする請求の範囲第２ ５項に記載のＲＮＡセグメント。
２７、組換えＤＮＡ構築物から転写された安定な完全長の感染性４型デングゲノ ムを含む単離されたＲＮＡセグメントにおいて、少なくとも１つの突然変異をさ らに含み、前記突然変異は、プレメンブレンタンパク質、エンベロープタンパク 質、またはＮＳＩ　（１）タンパク質のグリコジル化を減少させる１つ又はそれ 以上の突然変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質への開裂を 減少させる１つ又はそれ以上の突然変異、ポリタンパク質Ｎ５ｌ−ＮＳ２Ａ開裂 部位のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部位における１つ 又はそれ以上の置換、３′非コード末端の最も３°寄りのヌクレオチドを第１番 としたとき、ヌクレオチド１１３番から３８４番までの間（１１３番および３８ ４番を含む）の少なくともヌクレオチド３０個からなる１つ又はそれ以上の欠失 、ＮＳＩのＣ末端開裂部位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード 化する配列における１つ又はそれ以上の突然変異からなる群から選択されること を特徴とする分離されたＲＮＡセグメント。
２８、あるサブタイプのデンゾからの構造タンパク質と、異なるサブタイプのデ ンゾからの非構造タンパク質とを作動可能にコード化する核酸領域を有するゲノ ムをもち、前記ゲノムはさらに、プレメンブレンタンパク質、エンベロープタン パク質、またはＮＳＩ　（１）タンパク質のグリコジル化を減少させる１つ又は それ以上の突然変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質への開 裂を減少させる１つ又はそれ以上の突然変異、ポリタンパク質Ｎ５Ｉ−ＮＳ２Ａ 開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部位における １つ又はそれ以上の置換、３′非コード末端の最も３′寄りのヌクレオチドを第 １番とした、ヌクレオチド１１３番および３８４番までの間（１１３番および３ ８４番を含む）の少なくともヌクレオチド３０個からなる１つ又はそれ以上の欠 失、ＮＳＩのＣ末端開裂部位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコー ド化する配列における１つ又はそれ以上の突然変異からなる群から選択される当 然変異を含むことを特徴とするキメラウィルス。
２９、デング熱に対するワクチンにおいて、請求の範囲第２８項の前記キメラウ ィルスと、薬学的に許容可能な担体とを含み、前記ワクチンは、デング熱つィル スに対してを推動物に防御免疫反応を起こすことのできることを特徴とするワク チン。
フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ ／／（Ｃ１２Ｎ　１５／４０ Ｃ１２Ｒ１：９２） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ 、ＣＡ、ＪＰ、ＵＳ（７２）発明者　プレトネフ、アリグザンダー　ジー。
アメリカ合衆国、　２０８１４．メリーランド。
ベセスダ、モントローズ　アベニュー。
＃１０２　１０４２３番地 Ｉ （７２）発明者　メン、ルーエ アメリカ合衆国、　２０８９５．メリーランド。
ケシシントン、コネチカット　アベニュー、ノースウェスト　１１３４４番地 （７２）発明者　ペテル、ミシェル アメリカ合衆国、　２１４０１．メリーランド。
アナポリス、ドリームス　ランディングウェイ　９０２番地

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも２つのフラビウイルスに由来する核酸を含む組換えＤＮＡ構築物 において、 ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）からの２つ以下の構造タンパク質を作動可能 にコード化する核酸領域を有し、この核酸領域は、ＴＢＥＶ以外のフラビウイル スからの構造タンパク質をコード化する核酸領域に作動可能に連結することを特 徴とする組換えＤＮＡ構築物。 ２．前記構築物は、フラビウイルスカプシドタンパク質を作動可能にコード化す る核酸領域を有し、この核酸領域は、前記ダニ媒介脳炎ウイルスからの２つ以下 の構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域に連結することを特徴とす る、請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ構築物。 ３．請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ構築物のＲＮＡ転写物。 ４．カプシドタンパク質および非構造タンパク質をコード化する各々の前記核酸 領域はデング熱ウイルス由来であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の 組換えＤＮＡ構築物。 ５．前記デング熱ウイルスは４型デング熱ウイルスであることを特徴とする請求 の範囲第４項に記載の組換えＤＮＡ構築物。 ６．前記構築物は、少なくとも２つのフラビウイルスから由来した核酸内に少な くとも１つの突然変異を含むことを特徴とする請求の範囲第２項に記載の組換え ＤＮＡ構築物。 ７．前記突然変異はウイルス増殖速度に影響することを特徴とする請求の範囲第 ５項に記載の組換えＤＮＡ構築物。 ８．前記突然変異は、ＮＳＩ（１）タンパク質グリコシル化を排除するかもしく は成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の生成を阻害するものであることを 特徴とする請求の範囲第５項に記載の組換えＤＮＡ構築物。 ９．フラビウイルス由来のゲノムを有するキメラウイルスにおいて、ダニ媒介脳 炎ウイルスからの２つ以下の構造タンパク質をコード化する核酸領域と、 別のフラビウイルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むこ とを特徴とするキメラウイルス。 １０．前記ウイルスはさらに、前記別のフラビウイルスからのカプシドタンパク 質をコード化する核酸領域を有することを特徴とする請求の範囲第９項に記載の キメラウイルス。 １１．前記ダニ媒介脳炎ウイルスからの核酸は、プレメンブレンタンパク質をコ ード化することを特徴とする請求の範囲第９項に記載のキメラウイルス。 １２．前記ダニ媒介脳炎ウイルスからの核酸は、エンベロープタンパク質をコー ド化することを特徴とする請求の範囲第９項に記載のキメラウイルス。 １３．前記ダニ媒介脳炎ウイルスからの核酸は、プレメンブレンおよびエンベロ ープタンパク質をコード化することを特徴とする請求の範囲第９項に記載のキメ ラウイルス。 １４．前記別のフラビウイルスからの構造タンパク質をコード化する核酸は、デ ング熱ウイルス由来であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のキメラ ウイルス。 １５．前記デング熱ウイルスは４型デング熱ウイルスであることを特徴とする請 求の範囲第１４項に記載のキメラウイルス。 １６．前記ゲノムは、前記核酸内に少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴 とする請求の範囲第９項に記載のキメラウイルス。 １７．前記突然変異はウイルス増殖速度に影響することを特徴とする請求の範囲 第１６項に記載の組換えＤＮＡ構築物。 １８．前記突然変異はＮＳ１（１）タンパク質グリコシル化を排除するかもしく は成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の生成を阻害するものであることを 特徴とする請求の範囲第１７項に記載の組換えＤＮＡ構築物。 １９．ダニ媒介脳炎ウイルスからのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク 質をコード化する核酸領域と、 別のフラビウイルスからのカプシドタンパク質をコード化する核酸領域と、同じ フラビウイルスからの非構造領域をコード化する核酸領域とを含むキメラウイル ス。 ２０．前記フラビウイルスはデング熱ウイルスであることを特徴とする請求の範 囲第１９項に記載のキメラウイルス。 ２１．前記デング熱ウイルスは４型デング熱ウイルスであることを特徴とする請 求の範囲第２０項に記載のキメラウイルス。 ２２．ダニ媒介脳炎ウイルスのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質を コード化する前記核酸領域内に、さらに少なくとも１つの突然変異を有すること を特徴とする請求の範囲第１９項に記載のキメラウイルス。 ２３．前記突然変異は成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の生成を妨げる ものであることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載のキメラウイルス。 ２４．前記フラビウイルスからの前記核酸領域内に少なくとも１つの突然変異を 有することを特徴とする請求の範囲第１９項に記載のキメラウイルス。 ２５．前記フラビウイルスはデング熱ウイルスであることを特徴とする請求の範 囲第２４項に記載のキメラウイルス。 ２６．前記突然変異は、ＮＳ１（１）タンパク質グリコシル化を排除するもので あることを特徴とする請求の範囲第２４項あるいは第２５項に記載のキメラウイ ルス。 ２７．脊椎動物において防御免疫反応を起こすことのできる、請求の範囲第１９ 項のキメラウイルスを含むダニ媒介脳炎ウイルスに対するヒト用ワクチン。 ２８．脊椎動物において防御免疫反応を起こすことのできる、請求の範囲第２４ 項のキメラウイルスを含むダニ媒介脳炎ウイルスに対するヒト用ワクチン。 ２９．フラビウイルスに対してヒトにワクチン接種する方法において、前記フラ ビウイルスからのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質と、デング熱ウ イルスからのカプシドおよび非構造タンパク質を作動可能にコード化するＤＮＡ 構築物を調製し、 前記ＤＮＡ構築物から感染性ＲＮＡ転写物を生成し、前記ＲＮＡ転写物を細胞内 に導入し、 前記ＲＮＡ転写物を前記細胞内で発現させ、前記細胞から前記ウイルスを収穫し 、 脊椎動物において前記ウイルスを試験し、前記ウイルスをヒトに接種する工程、 を含むことを特徴とする方法。 ３０，前記調製工程は、ＤＮＡ構築物に突然変異を導入する工程をさらに含むこ とを特徴とする請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３１．日本脳炎ウイルスからのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質を コード化する核酸領域と、 別のフラビウイルスからのカプシドタンパク質をコード化する核酸領域と、同じ フラビウイルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むキメラ ウイルス。 ３２．前記フラビウイルスはデング熱ウイルスであることを特徴とする請求の範 囲第３１項に記載のキメラウイルス。 ３３．ＲＮＡゲノムを有するキメラウイルスにおいて、前記ゲノムは、４型デン グ熱ウイルスの非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域と、 １型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病 ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および別のフラビウイル スからなる群から選択されるウイルスの構造タンパク質を作動可能にコード化す る核酸領域とを含むキメラウイルス。 ３４．前記キメラウイルスのゲノムは、４型デング熱ウイルス構造タンパク質を 作動可能にコード化する核酸を実質的に含まないことを特徴とする請求の範囲第 ３３項に記載のキメラウイルス。 ３５．前記キメラウイルスはｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）ＲＮＡを含むことを特徴とする 請求の範囲第３３項に記載のキメラウイルス。 ３６．前記キメラウイルスはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）ＲＮＡを含むことを特徴とす る請求の範囲第３３項に記載のキメラウイルス。 ３７．ＲＮＡゲノムを有するキメラウイルスにおいて、前記ゲノムは、１型デン グ熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、および３型デング熱ウイルスからなる群 から選択される非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域と、 １型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デ ング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、 およびフラビウイルスからなる群から選択されるウイルスの構造タンパク質を作 動可能にコード化する核酸領域とを含み、非構造タンパク質を作動可能にコード 化する前記核酸領域は、非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域と は異なるウイルス由来のものであることを特徴とするキメラウイルス。 ３８．ＲＮＡゲノムを有するキメラウイルスにおいて、前記ゲノムは、黄熱病ウ イルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから なる群から選択される非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域と、 １型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デ ング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、 およびフラビウイルスからなる群から選択されるウイルスの構造タンパク質を作 動可能にコード化する核酸領域とを含み、構造タンパク質を作動可能にコード化 する前記核酸領域は、非構造タンパク質を作動可能にコード化する前記核酸領域 とは異なるウイルス由来のものであることを特徴とするキメラウイルス。 ３９．請求の範囲第３３項、第３７項、第３８項のいずれかのウイルスの安全で かつ免疫学的に有効な量と、薬学的かつ免疫学的に受容可能な担体とを含む、脊 椎動物において防御免疫反応を起こすことのできるワクチン。 ４０．安全でかつ免疫学的に有効な量の、ａ）４型デング熱ウイルスの非構造タ ンパク質をコード化する核酸領域と、１型デング熱ウイルスの構造タンパク質を コード化する核酸領域とを含むゲノムをもつキメラウイルスと、 ｂ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコード化する核酸領域と、２型 デング熱ウイルスの構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むゲノムをも つキメラウイルスと、 ｃ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコード化する核酸領域と、３型 デング熱ウイルスの構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むゲノムをも つキメラウイルスと、 ｄ）弱毒化４型デング熱ウイルスとを含む、脊椎動物において防御免疫反応を起 こすことのできるワクチン。 ４１．４型デング熱ウイルスの非構造領域と、１型デング熱ウイルス、２型デン グ熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダ ニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択される構造領域とを有する ＤＮＡセグメント。 ４２．前記セグメントは、前記構造領域および前記非構造領域に作動可能に連結 するプロモーターを含むことを特徴とする請求の範囲第４１項に記載のＤＮＡセ グメント。 ４３．前記プロモーターはＳＰ６またはＴ７プロモーターであることを特徴とす る請求の範囲第４２項に記載のＤＮＡセグメント。 ４４．前記セグメントはｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）であることを特徴とする請求の範囲 第４２項に記載のＤＮＡセグメント。 ４５．前記セグメントはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）であることを特徴とする請求の範 囲第４２項に記載のＤＮＡセグメント。 ４６．１型デング熱ウイルスの非構造領域と、２型デング熱ウイルス、３型デン グ熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダ ニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択される構造領域とを有する ＤＮＡセグメント。 ４７．ａ）２型デング熱ウイルスの非構造領域と、ｂ）１型デング熱ウイルス、 ３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイ ルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択される構造領域と を有するＤＮＡセグメント。 ４８．ａ）３型デング熱ウイルスの非構造領域と、ｂ）１型デング熱ウイルス、 ２型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイ ルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択される構造領域と を有するＤＮＡセグメント。 ４９．ａ）黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および フラビウイルスから選択される非構造領域と、ｂ）１型デング熱ウイルス、２型 デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス 、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択される構造領域とを有 し、前記構造領域は前記非構造領域とは異なるウイルス由来のものであることを 特徴とするＤＮＡセグメント。 ５０．ａ）フラビウイルスの非構造領域またはその部分と、ｂ）別のフラビウイ ルスから選択された構造領域またはその部分とを有するＤＮＡセグメント。 ５１．安全でかつ免疫学的に有効な量のキメラウイルスを含む、脊椎動物におい て防御免疫反応を起こすことのできるワクチンにおいて、前記ウイルスのゲノム は、ダニ媒介脳炎ウイルスからの構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸 と、デング熱ウイルスからの非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸と を含むことを特徴とするワクチン。 ５２．ゲノムが、ダニ媒介脳炎ウイルス構造タンパク質と４型デング熱ウイルス 構造タンパク質とを作動可能にコード化することを特徴とするウイルス。 ５３．前記ウイルスの構造タンパク質はダニ媒介脳炎ウイルス由来であることを 特徴とする請求の範囲第５２項のウイルス。 ５４．請求の範囲第５２項のウイルスを含む、脊椎動物において防御免疫反応を 起こすことのできるワクチン。 ５５．ダニ媒介脳炎ウイルス構造タンパク質と４型デング熱ウイルス構造タンパ ク質を作動可能にコード化するＤＮＡセグメント。 ５６．感染性４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化する、単離されたＤＮＡ断 片。 ５７．（ｉ）請求の範囲第５６項によるＤＮＡ断片と、（ｉｉ）ベクターと、 を有する組換えＤＮＡ構築物。 ５８．前記ベクターはプラスミドであることを特徴とする請求の範囲第５７項に 記載の組換えＤＮＡ構築物。 ５９．前記ＤＮＡ断片の発現が可能なように、請求の範囲第５８項による組換え ＤＮＡ構築物で安定的に形質転換された宿主細胞。 ６０．前記細胞は原核細胞であることを特徴とする請求の範囲第５９項に記載の 宿主細胞。 ６１．（ｉ）部位特異的突然変異誘発により、４型デング熱ウイルスのゲノムに 突然変異を導入し、 （ｉｉ）前記突然変異を宿す感染性４型デング熱ウイルスを回収し、（ｉｉｉ） 回収したウイルスを評価する工程を含むことを特徴とする４型デング熱ウイルス の突然変異を作製する方法。 ６２．前記回収されたウイルスは、弱毒化または無毒化の表現型について評価さ れることを特徴とする請求の範囲第６１項に記載の方法。 ６３．疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の無毒性４型デング熱ウイルス と、薬学的に許容可能な担体とを含む、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワ クチン。 ６４．前記無毒性４型デング熱ウイルスは、ウイルスゲノムの戦略的領域に突然 変異を加工することにより得られることを特徴とする、請求の範囲第６３項に記 載のワクチン。 ６５．キメラフラビウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片。 ６６．前記キメラＲＮＡは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、お よび３型デング熱ウイルスからなる群から選択されたウイルスの一部を含むこと を特徴とする請求の範囲第６５項に記載の断片。 ６７．請求の範囲第６０項に記載の４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、フラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で置換する工程を含 むことを特徴とするキメラデング熱ウイルスの構築方法。 ６８．前記フラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、 および３型デング熱ウイルスからなる群から選択されることを特徴とする請求の 範囲第６７項に記載の方法。 ６９．前記４型デング熱ウイルスは少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴 とする請求の範囲第６７項に記載の方法。 ７０．疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の感染性キメラウイルスと、薬 学的に許容可能な担体とを含む、デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチン。 ７１．前記キメラウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、 ３型デング熱ウイルス、および４型デング熱ウイルスからなる群から選択される ことを特徴とする請求の範囲第７０項に記載のワクチン。 ７２．（ｉ）請求の範囲第６５項に記載のＤＮＡ断片と、（ｉｉ）ベクターと、 を含む、組換えＤＮＡ構築物。 ７３．前記ベクターはプラスミドであることを特徴とする請求の範囲第７２項に 記載の組換えＤＮＡ構築物。 ７４．前記ＤＮＡの発現を可能とするように、請求の範囲第７３項による組換え ＤＮＡ構築物で安定的に形質転換された宿主細胞。 ７５．前記細胞は原核細胞であることを特徴とする請求の範囲第７４項に記載の 宿主細胞。 ７６．４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片において、非構造 タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳ１のＣ末端における８個のアミノ 酸の１つ又はそれ以上をコード化する配列内に置換突然変異を含むことを特徴と する、ＤＮＡ断片。 ７７．４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片において、ＮＳ１ −ＮＳ２Ａの非構造タンパク質の開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グリ シンをコード化する部位に置換を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。 ７８．４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片において、前記Ｄ ＮＡ断片は３′非コード領域に欠失を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。 ７９．前記欠失の配列の長さはヌクレオチド３０〜２０２個であることを特徴と する請求の範囲第７８項に記載のＤＮＡ断片。 ８０．（ｉ）請求の範囲第７６項、第７７項、第７８項、第７９項のいずれかに 記載のＤＮＡ断片と、 （ｉｉ）ベクターと、 を含む、組換えＤＮＡ構築物。 ８１．請求の範囲第７６項、第７７項、第７８項、第７９項のいずれかに記載の ＤＮＡ断片の感染性ＲＮＡ転写物。 ８２．前記ＤＮＡ断片の発現を可能とするように、請求の範囲第８０項によるＤ ＮＡ構築物で形質転換された宿主細胞。 ８３．前記細胞は哺乳類または昆虫の細胞であることを特徴とする請求の範囲第 ８２項に記載の宿主細胞。 ８４．前記細胞は哺乳類または昆虫の細胞であることを特徴とする請求の範囲第 ８３項に記載の宿主細胞。 ８５．疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の、毒性が低下した突然変異４ 型デング熱ウイルスを含む、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチン。 ８６．前記突然変異４型デング熱ウイルスは、ウイルスゲノムの３′非コード領 域内に欠失突然変異を加工することにより得られることを特徴とする請求の範囲 第８５項に記載のワクチン。 ８７．前記突然変異４型デング熱ウイルスは、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２ Ａの開裂部位のＮＳ１のＣ末端における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコ ード化するウイルスＤＮＡ配列内に置換突然変異を加工することにより得られる ことを特徴とする請求の範囲第８５項に記載のワクチン。 ８８．前記突然変異４型デング熱ウイルスは、ＮＳ１−ＮＳ２Ａの非構造タンパ ク質の開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化するウイル スＤＮＡ部位に置換を加工することにより得られることを特徴とする請求の範囲 第８５項に記載のワクチン。 ８９．請求の範囲第５６項に記載の４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、フラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で置換する工程を含 むことを特徴とするキメラデング熱ウイルスの構築方法。 ９０．前記フラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、 ３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、およびダニ媒介脳炎ウイルスからな る群から選択されることを特徴とする請求の範囲第８９項に記載の方法。 ９１．請求の範囲第５７項に記載の４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、フラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で置換する工程を含 むことを特徴とするキメラデング熱ウイルスの構築方法。 ９２．前記フラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、 ３型デング熱ウイルス、および日本脳炎ウイルスからなる群から選択されること を特徴とする請求の範囲第９１項に記載の方法。 ９３．請求の範囲第５８項に記載の４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を 、フラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で置換する工程を含 むことを特徴とするキメラデング熱ウイルスの構築方法。 ９４．前記フラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、 ３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、およびダニ媒介脳炎ウイルスからな る群から選択されることを特徴とする請求の範囲第９３項に記載の方法。 ９５．疾病に対する免疫を誘導するのに十分な量投与される、デング熱ウイルス に対するワクチンにおいて、前記ワクチンは、毒性が低下したキメラウイルスか らなり、前記キメラウイルスは、３′非コード領域に欠失を含む４型デング熱ウ イルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片を含むことを特徴とするワクチン。 ９６．前記キメラウイルスは、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、 および４型デング熱ウイルスからなる群から選択されることを特徴とする請求の 範囲第９５項に記載のワクチン。
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