JPH06511386A - リガンドおよびリガンドのアンタゴニストを同定する方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 リガンドおよびリガンドのアンタゴニストを同定する方法発明の背景 発明の分野 本発明は、一般にリガンドおよびリガンドのアンタゴニストを同定する方法に関 するものである。特に本発明は、クローン化されたＧ、−またはＧ１−関連レセ プター（Ｇ、−、Ｇ＋−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合するりガン トおよびリガンドのアンタゴニストを同定する方法に関するものである。また本 発明は、組換えによるサイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体を含む細胞に 関するものである。

背景情報 ここ数年間にＧ蛋白質に関連するホルモンおよび神経伝達物質に対する多数のｃ ＤＮＡまたは遺伝子がクローン化された。２つだけを例外として−インシュリン 様成長因子ＩＩおよびグルタミン酸に対する各レセプター−５これらのＧ−関連 レセプターはかなり類似しており、それらは大きな′スーパーファミリー′の蛋 白質を構成すると考えられる。細菌性ロドプシンとの類似性により、このスーパ ーファミリーの員子は７個の膜スパンニングドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐ ａｎｎｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ）を含み、かつ多数の高度に保存されたアミノ酸を 有すると考えられる。その結果、新規なレセプター候補をめてｃＤＮＡライブラ リーをスクリーニングするために、クローン化レセプターの共有ドメインを目標 とするオリゴヌクレオチドプローブが低ストリンジエンシーで用いられている。

比較的最近になって、追加候補をクローン化するポリメラーゼ連鎖反応に、これ らのレセプターの保存ドメインを目標とするプライマーが用いられている。

上記により得た、それに対する内在性リガンドが知られていない′オーファンレ セプター（ｏｒｐｈａｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）’をコードするｃＤＮＡを発現さ せなければならず、かつそれらのレセプターが結合するリガンドを同定しなけれ ばならない。これは−見して考えるほどには簡単でない。放射性標識リガンドを 用いるスクリーニングは経費を要する。それは多数の（不安定な）リガンドおよ び大量のトランスフェクションされた細胞を必要とする。一方、機能的スクリー ニング法は、レセプターの構造からそれがどの第２メツセンジヤー系を活性化す るかを推定し得ないという事実が妨げとなる。あるＧ−蛋白質関連レセプターは ホスホリパーゼＣまたはホスホリパーゼＡ２を活性化し、それぞれイノシトール ホスフェートおよびアラキドン酸を増加させる。他はアデニル酸シクラーゼを活 性化しくＧ、−関連）、または活性化を阻害しくＧ、−関連）、これにより細胞 内のサイクリックＡＭＰ水準を上昇または低下させる。本発明は、オーファンＧ 、−またはＧ１−関連レセプターに作用するアゴニストを見出すための簡単かつ 迅速な方法を提供する。

この開発されたアッセイ法は、新規なマウスＬ細胞系統、ＬＶＩＰ２．ＯＺｃを 用いる。これらのし細胞は、安定に組み込まれた融合遺伝子ｐＬＶＩＰ２．ＯＺ プラスミドを含む（リアボウオル（Ｒｉａｂｏｗｏｌ、　Ｋ、　Ｔ、　）ら、　 （１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３６：８３−８６）。これは血管作動性腸ポリ ペプチド（Ｖ　Ｉ　Ｐ）遺伝子由来の２ｋｂフラグメントの転写制御下にある大 腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　１　ａ　ｃ　Ｚ遺伝子からなる。

このＤＮＡセグメントは、ＶＩＰプロモーターおよびサイクリックＡＭＰ応答性 エンハンサ−要素（ＣＲＥ）を含む。フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）は 細胞のサイクリックＡＭＰ水準を高めるので、ＬＶＩＰ２．ＯＺｃレポーター細 胞内のβ−ガラクトシダーゼ酵素を誘導するために用いることができる。細胞を 溶解したのち、色素原基質である０−ニトロフェニル　β−Ｄ−ガラクトピラノ シド（ＯＮＰＧ）の添加により酵素活性を検出することができる。反応生成物で ある０−ニトロフェノールは黄色であり、肉眼で見るか、または４０５ｎｍの波 長での分光測光により測定することができる。このアッセイ法は９６ウ工ル組織 培養プレート内で実施することができ、市販のプレート読取り装置を用いて０− ニトロフェノール水準を測定し、結果を記録することができる。

Ｇ、−関連レセプターを含むと推定される細胞をトランスフェクションすると、 適宜なりガントの添加によりこの酵素を誘導することができる。たとえばβ２− アドレナリン作動性レセプターｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞は、イ ソプロテレノールに応答してそれらのβ−ガラクトシダーゼ水準を高める。これ に対しＧ１−関連レセプターはアデニル酸シクラーゼの活性化を阻害する。適宜 なリガンドの存在下でドーパミンＤ８、ムスカリン性コリン作動性ｍ２、または カンナヒノイＦ　（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ）　トランスフェクションしたレセ プターは、ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞に普通に見られる、フォルスコリン刺激によ るβ−ガラクトシダーゼ増加を有意に減少させる。このようにＬＶＩＰ２．ＯＺ ｃ細胞は、これらの細胞において一時的に発現する′オーファンレセプター′へ の結合に関して多数の推定リガンドをスクリーニングしつる迅速かつ簡便な半自 動化された系を提供する。

発明の概要 本発明の一般的な目的は、リガンドおよびリガンドのアンタゴニストを同定する 方法を提供することである。

本発明の詳細な目的は、Ｇ−蛋白質関連レセプターに結合するリガンドを同定す る方法を提供することである。

本発明の他の目的は、Ｇ−蛋白質関連レセプターに結合するリガンドの、アンタ ゴニストを同定する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、組換えサイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体 を含む細胞を提供することである。

本発明のさらに他の目的および利点は以下の記載から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１．０−二トロフェノールの発色によるβ−ガラクトシダーゼの検出。ＬＶＩ Ｐ２．ＯＺｃ細胞を８時間、コントロール培地（０，５ｍＭ　ＩＢＭＸを含有） （ロ）、または０．５μＭフォルスコリンを含有するコントロール培地（・）、 または１μＭ（■）もしくは１０　ＮＥＣＡ（ム）を含有するコントロール培地 に暴露した。細胞溶解し、基質０ＮＰＧを添加したのち、酵素活性を４０５ｎｍ における光学濃度として種々の時間間隔で測定した。データは幾つかのうち代表 的な１実験から得た平均±Ｓ、　Ｄ、である。

図２．リガンド暴露の期間に対する応答としてのβ−ガラクトシダーゼの誘導。

ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞を１．２．４．６．８．１２．１５および１８時間、コ ントロール培地（０，５ｍＭ　ＩＢＭＸを含有）（ロ）、または０．５μＭ７オ ルスコリンを含有するコントロール培地（・）、または１μＭ　ＮＥＣＡを含有 するコントロール培地（■）、または１μＭ　ＰＧＥ２を含有するコントロール 培地（ム）中でインキュベートした。データは代表的な１実験から得た平均±Ｓ Ｄ　である。

図３．異なる用量のリガンドに対する応答としてのβ−ガラクトシダーゼの誘導 。ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞を８時間、コントロール培地（０，５，ｍＭ　ＩＢＭ Ｘを含有）および０．１または０．２または０．５または１μＭフォルスコリン （・）、コントロール培地および０．１または０．５または１または１０μＭＮ ＥＣＡ　（■Ｌ０．１または０．　５または１または１０μＭ　ＰＧＥ２を含有 するコントロール培地（ム）で処理した。データは代表的な実験から得た平均上 Ｓ、Ｄ、である。

図４．Ａ）β２−アドレナリン作動性レセプターＤＮＡトランスフェクションし たＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞に関する、イソプロテレノールに対する用量応答とし てのβ−ガラクトシダーゼの誘導。細胞を８時間、領　５ｍＭ　ＩＢＭＸ、１０ ０μＭアスコルビン酸および５Ｘ１０−”−１０−’Ｍイソプロテレノールを含 有する培地と共にインキュベートした。データは代表的な実験から得た平均±Ｓ 。

Ｄ、である。　Ｂ）β２−アドレナリン作動性レセプターＤＮＡトランスフエク ンヨンしたＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞に関する、イソプロテレノールに対する時間 応答としてのβ−ガラクトシダーゼの誘導。細胞を２．４．６．８．１２および １８時間、０．５ｍＭ　ＩＢＭＸ、１００μＭアスコルビン酸±１μＭイソプロ テレノールを含有する培地に暴露した。データは代表的な実験から得た平均±Ｓ 。

Ｄ、である。

図５．フォルスコリン仲介によるβ−ガラクトシダーゼ誘導の、異なる暴露期間 に際してのアルドステロン分泌阻害因子による阻害。ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞を １．２．４．６．８．１５および１８時間、コントロール培地（０，５ｍＭＩＢ ＭＸおよび２０ｕｇ／ｍ＋バシトラシンヲ含有）（ロ）　、＊たは０．５．ｃｚ Ｍフォルスコリン＋１μＭＡＳＩＦ（○）もしくは−ＡＳＩＦ（・）を含有する コントロール培地に暴露した。データは代表的な１実験から得た平均±ＳＤ。

である。

図６．Ａ）ドーパミンレセプターＤＮＡでトランスフェクションしたＬＶＩＰ２ 、ＯＺｃ細胞における、異なる濃度のドーパミンまたはキンピロール（ｑｕｉｎ ｐｉｒｏｌｅ）に対する用量応答としての、フォルスコリン仲介によるβ−ガラ クトシダーゼ誘導の阻害。細胞を６時間、０．５ｍＭ　ＩＢＭＸ、および１００ μＭアスコルビン酸、および０５μＭフォルスコリン±１もしくは１０μＭ塩酸 ドーパミン、または１．１０．１００μＭ塩酸キンピロールを含有する培地に暴 露した。データは代表的な実験から得た平均±Ｓ、　Ｄ、である。　Ｂ）カンナ ピノイドレセプターＤＮＡでトランスフェクションしたＬＶ工Ｐ２．ＯＺｃ細胞 におけるフォルスコリン仲介によるβ−ガラクトシダーゼ誘導の、ＣＰ５５９４ ０による阻害。細胞を６時間、０．５ｍＭ　ＩＢＭＸ、０．５ｍＭ　ＢＳＡ。

および０．５μＭフォルスコリン±１μＭ　ＣＰ５５９４０を含有する培地に暴 露した。データは代表的な実験から得た平均±Ｓ、　Ｄ、である。　Ｃ）ヒトム スカリン性アセチルコリン（ｈｍｚ）レセプターＤＮＡでトランスフェクション したＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞におけるフォルスコリン仲介によるβ−ガラクトシ ダーゼ誘導の、カルバコル（ｃａｒｂａｃｈｏ　］）による阻害。細胞を６時間 、０゜５ｍＭ　ＩＢＭＸ、および０．５μＭフォルスコリン±　μＭカルバコル を含有する培地に暴露した。データは代表的な実験から得た平均±Ｓ、　Ｄ、で ある。

発明の詳細な記述 本発明は、（１）Ｇ−蛋白質関連レセプターに結合するリガンドを、および（２ ）これらのリガンドに対するアンタゴニストを同定するための迅速かつ簡単な方 法に関するものである。

１形態においては本方法は、ｉ）サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体を 含む細胞において、Ｇ、−関連レセプター遺伝子を発現させ；ｉｉ）細胞にリガ ンドを添加し：そして１ｉｉ）サイクリックＡＭＰの量をアッセイすることより なる。

一般にこの構造体はレポーター遺伝子に作動的に結合したサイクリックＡＭＰ応 答性調節要素からなる。好ましい形態においては、サイクリックＡＭＰ感受性レ ポーター構造体はプロモーターおよびレポーター遺伝子に作動的に結合したサイ クリックＡＭＰ応答性エンハンサ−要素からなる。適切なサイクリックＡＭＰ応 答性エンハンサ−（ＣＲＥ）要素は当技術分野で周知である。それらには血管作 用性腸ポリペプチド（Ｖ　Ｉ　Ｐ）遺伝子からの２ｋｂ　ＤＮＡフラグメント上 に位置するＣＲＥが含まれるが、これに限定されない。適切なプロモーターも当 技術分野で周知である。それらには本明細書に記載するＶＩＰプロモーターが含 まれるが、これに限定されない。さらに、適切なレポーター遺伝子も当技術分野 で周知である。それらにはＬａｃ　Ｚ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が含ま れるが、これらに限定されない。詳細には、用いられるレポーター構造体はｐＬ ＶＩＰ２．ＯＺであってよい。

細胞内で発現されたＧ−関連レセプター遺伝子は、安定な状態で細胞のゲノム内 へ取り込まれ、細胞内へ一時的にトランスフェクションされ、または細胞に内在 しうる。Ｇ−関連レセプターの例には下記のものが含まれる：ヒトβ２−アドレ ナリン作動性レセプター；ヒトｍ２ムスカリン性アセチルコリンレセプター；ラ ット−カンナピノイドレセプター：ドーパミンＤルセブター；ＶＩＰ；セクレチ ン：パップレシン；オキシトシン：セロトニン：α−アドレナリン作動性：代謝 性グルタメート；およびＩ　Ｌ−８の各レセプター。

適宜なベクターを用いた場合、適切な宿主細胞には下等真核細胞（たとえば酵母 ）および高等真核細胞（たとえば哺乳動物細胞、特にマウス細胞）の双方が含ま れる。好ましくはマウスＬ細胞系統（たとえばＬＶＩＰ２．ＯＺｃ、ＡＴＣＣ受 託番号ＣＲＬ　１０８７１）であって、サイクリックＡＭＰ応答性レポーター構 造体を含むもの（たとえばｐＬＶＩＰ２．ＯＺ）がアッセイに用いられる。

レポーター遺伝子の発現をアッセイするための方法は当技術分野で周知である。

好ましい形態においては、アッセイ工程は色素原性基質を添加し、そしてこの基 質の変化をアッセイすることよりなる。好ましい色素原化合物の一例は０−ニト ロフェニル　β−Ｄ−ガラクトピラノシドである。

さらに好ましい形態においては、本発明はＧ−蛋白質関連レセプターに結合する リガンドのアンタゴニストを同定する方法に関するものである。本方法は、ｉ） サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体を含む細胞において、Ｇ−関連レセ プター遺伝子またはｃＤＮＡを発現させ：　ｉ　ｉ）細胞にリガンドおよびアン タゴニストを添加し：そして１ｉｉ）サイクリックＡＭＰの量をアッセイするこ とよりなる。上記のサイクリックＡＭＰレポーター、レポーター遺伝子、構造体 、および細胞を用いてアンタゴニストを同定することができる。

さらに好ましい形態においては、本発明はアデニリルシクラーゼの刺激を阻害す るレセプターに結合するりガントを同定する方法に関するものである。本方法は 、ｉ）サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体を含む細胞において、ｃＤＮ ＡのＧ、−関連レセプター遺伝子を発現させ；ｊｉ）フォルスコリンおよび候補 リガンドを添加し：そして１ｉｉ）サイクリックＡＭＰの量をアッセイすること よりなる。

さらに好ましい形態においては、本発明はアデニリルシクラーゼの刺激を阻害す るレセプターに結合するリガンドのアンタゴニストを同定する方法に関するもの である。本方法は、ｉ）フォルスコリンおよび特異性リガンドならびに候補アン タゴニストを含む細胞において、Ｇ、−関連レセプターまたはｃＤＮＡを発現さ せ：そして１ｉｉ）サイクリックＡＭＰの量をアッセイし、これによりアゴニス ト誘導によるフォルスコリン活性低下の阻害を調べることよりなる。

本明細書に記載する方法を用いて多数のリガンドをスクリーニングすることがで きる：たとえば２２個ものリガンドを１枚の９６ウエルプレート内で４重分析す ることができる。刺激または刺激阻害は識別しやすく、陽性結果を速やかに確認 しつる。

本発明を以下の限定ではない実施例においてさらに詳述する。

！産男 以下のプロトコールおよび実験の詳細を後記実施例において参照する：乞科、特 に指示しない限り、薬品はシグマから、培地はライツタカー・バイオプロダクツ から人手され、ＡＳＩＦ（アルドステロン分泌阻害因子）［ウシ］はペニンスラ ・ラボラトリーズから購入され、０ＮＰＧ　（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ ラクトピラノシド）はリサーチ・オーガニマウスから入手され、塩酸（−）−− ７’ロパノロール、塩酸ドーパミン、塩酸（−）−キンピロールはＲＢＩから入 手され、ＣＰ５５９４０はファイザー社から寛大に提供された。

安定な細胞系統および細胞培養、　大腸菌１ａｃ　Ｚ遺伝子に融合したヒトＶＩ Ｐ遺伝子からの２ｋｂの５′−フランキング配列を含むｐＶＩＰ２．ＯＺプラス ミド（２０μｇ）を用いて、リン酸カルシウム共沈法により、マウスＬｔｋ細胞 （１０ｃｍの培養皿当たり３Ｘ１０’個）をトランスフェクションした（リアポ ウオル（Ｒｉａｂｏｗｏｌ）ら、　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３６：８３ −８６）　。４μｇのｐｈｙｇ　（スージエン（Ｓｕｇｄｅｎ）ら（１９８５） 　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５：４１０）　、すなわちハイグロマイシンＢ ホスホトランスフェラーゼをコードするプラスミドを用いる同時トランスフェク ション、およびハイグロマイシン中での選択により、優性選択性マーカーが得ら れた。

フォルスコリン（１０μＭ）およびＩ　ＢＭＸ　（０，５μＭ）の添加後に、β −ガラクトシダーゼ誘導用としてハイグロマイシン耐性Ｌｔｋ−クローンをスク リーニングした。１クローンであるＬＶＩＰ２．ＯＺｃをこれらの実験に用いる ものとして選んだ。ｐＶＩＰ２．ＯＺプラスミドによって安定な状態でトランス フェクションされたＬＶＩＰ、ＱＺｃ細胞を、ダルベツコの改良イーグル培地（ ＤＭＥＭ）−−２，５％ウン胎仔血清、７．５％ウシ新生仔血清、２５ｍｇ／ｍ ｌのハイグロマイシン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充−一中で、 ７％ＣＯ２，３７°のフォルマ（Ｆｏｒｍａ）インキュベーター内に維持した。

細胞を週２回、１ｍｌの領　５％トリプシンおよび、５３ｍＭ　ＥＤＴＡ−４Ｎ ａ／１０ｃｍ培養皿でトリプシン処理し、１：１０の比率に分け、１０ｍ１の培 地中で数カ月間にわたって増殖させた。この細胞の表現型は安定であると思われ る。

プラスミドＤＮＡ、　プラスミドＤＮＡは、チェノおよびオカヤマ（Ｃｈｅｎ、 　Ｏｋａｙａｍａ）　（（１９８７）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７ ：２７４５−２７５２）のトランスフェクションプロトコール用に改良されたり ゾチームートリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）法（カップ（Ｋａｔｚ、　Ｌ、　）ら、　 （１９７３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１４：５７７−５９１）により調製 された。以下のレセプター〇Ｄ　Ｎ　ＡがｐｃＤプラスミド（オカヤ７　（Ｏｋ ａｙａｍａ、　Ｂ、　）ら、　（１９８３）　Ｍｏｌ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。

３　：２８０−２８９）に導入された：ヒトβ２−アドレナリン作動性レセプタ ー（コビルカ（Ｋｏｂｉｌｋａ、　Ｂ、　Ｋ、　）ら、　（１９８７）　ＰＮＡ Ｓ　８４：４６−５０）　、ヒトｍ２ムスカリン性アセチルコリンレセプター（ ポンナー（Ｂａｎｎｅｒ、　Ｔ、　１．　）ら（（１９８７）　５ｃｉｅｎｃｅ 　２３７：５２７−５３１）、ラット−カンナピノイドレセプター（マツダ（Ｍ ａｔｓｕｄａ、　Ｌ、　Ａ、　）ら、　（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ３４６：５ ６１−５６４）。ドーパミンＤ、レセプター（モンスマ（Ｍｏｎｓｍａ、　Ｆ、 　Ｊ、　）ら、　（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３４２：９２６−９２９）を、ｐ ＲＣ／ＲＳＶベクター（インビトロジエン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）　、真核細 胞ベクター）内へサブクローン化した。

細胞のトランスフェクション、１μ胞をチェノおよびオカヤマ（Ｃｈｅｎ、　Ｏ ｋａｙａｍａ）のリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコールによりト ランスフェクションした。それぞれのプラスミドＤＮＡ！ｉ製につき、最適なリ ン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿の形成に必要なりＮＡの量は異なる；従って用量応 答試験が望まれる。

Ｇ８−関連レセプターをアッセイする条件を設定するために、ヒトβ２−アドレ ナリン作動性レセプターｃＤＮＡ／１０ｃｍプレートを含有する種々の量（５− ３０μｇ）のｐｃＤプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクションした。これ より小さいか、または大きい培養皿を用いた場合、それに応じてＤＮＡの量を調 整した。５μｇのＤＮＡにより生じた沈殿は通常は極めて粗かった；２５−３０ μｇのＤＮＡを用いた場合、低倍率（４０Ｘ）の顕微鏡により観察すると沈殿は 通常は極めて微細であった。８−２０μｇでは点状の（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）沈 殿が生じ、これは細胞によって効果的に取り込まれると思われた。トランスフェ クション後に細胞を４８時間トリプシン処理し、ペレット化し、新鮮な培地に再 懸濁し、９６ウエルのミクロタイタープレート（平底）に１００μｍの培地中５ −１０ＸＩＯ’細胞／ウェルで接種し、さらに２４時間インキュベートした。次 いでイソプロテレノール（２μＭ）、アスコルビン酸（２００μＭ）およびイソ ブチルメチルキサンチン（１ｍＭ）（ＩＢＭＸ、ホスホジェステラーゼ阻害剤） を含有する培地１００μｍを各ウェルに添加した。各ウェルの培地を交換するよ りむしろ培地を添加する方が、より再現性のある結果を与えた。対照ウェルには 、ＩＢＭＸ／アスコルビン酸、またはフォルスコリン（１μＭ）／ＩＢＭＸ／ア スコルビン酸を含有する培地１００μ】を添加した。Ｇ−結合レセプターのアッ セイ条件を確立するために、前記に従って細胞をドーパミンＤ８プラスミドＤＮ Ａでトランスフェクションし、９６ウエルのミクロタイタープレート内で１００ μｍの培地中に接種し、培地１００μｌ中の適宜なリガンドをフォルスコリン刺 激によるβ−ガラクトシダーゼ活性の阻害につき試験した。各組の条件を４重試 験により実施した。リガンドに８時間暴露したのち、細胞を２００μｍのリン酸 緩衝食塩液で洗浄し、β−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。β−ガラクト ンダーゼアッセイ前に、プレートを一２０℃に２４−７２時間保存することがで きる。

β−ガラクトシダーゼのミクロアッセイ、β−ガラクトシダーゼ活性をミクロプ レート読取り装置（モレキュラー・デバイシズ、バロ・アルド）で測定した。

このアッセイ法は、ベリン（Ｐｅｒｒｉｎ）　（（１９６３）Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８１：６３４９−６３５３）ならびにツートンおよびコフィ ン（Ｎｏｒｔｏｎ、Ｃｏｆｆ１ｎ）　（（１９８５）Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏ ｌ、５：２８１−２９０）の、Ｏ−ニトロフェニル　β−Ｄ−ガラクトシド（Ｏ ＮＰＧ）に基づくアッセイの改良型である。変更には、以下に概説する細胞溶解 法およびアッセイインキュベーション条件が含まれる。内在性ガラクトシダーゼ 活性の抑制および大腸菌酵素の安定化が、アッセイの成功にとって重要である。

ミクロアッセイの工程はすべて室温で実施された。アッセイ緩衝液は１００ｍＭ リン酸ナトリウム、２ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＜、０．１ｍＭ　ＭｎＣ１ｚ（ｐＨ８，０ ）からなる。付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、プレートを排液し、そして２５μ ｍ／ウェルの低張の細胞溶解用緩衝液を各ウェルに添加した（緩衝液１部を水９ 部で希釈）。１０分後に０．５％（ｖ／ｖ）ｔ−リド：／Ｘ−１００および４Ｏ ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有するアッセイ緩衝液１００μｍを添加した 。発泡を避けるように注意を払うべきである。さらに１０分後に、２４μｍの０ ＮＰＧ　（４ｍｇ／ｍｌ、アッセイ緩衝液中：同口調製する）を添加し、各ウェ ルにつき４０５ｎｍにおける光学濃度をプレート読取り装置で測定した。読取り は発色の直線部分内で、４０５ｎｍにおいて１．５０Ｄで行われた。ｍＯＤ／分 として表した初速度は、酵素濃度範囲０．１−１−１Ｏ０（ＩＵは２５°、ｐＨ ７゜５で、毎分１マイクロモルの０ＮＰＧを加水分解する）にわたってβ−ガラ クトシダーゼ酵素濃度に対し直線関係にある。

スクリーニングプロトコールの詳細な記述を表１に提示する。

実施例Ｉ ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞におけるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの検出予備実験にお いて、ｃＡＭＰ水準を高めるためにフォルスコリン（５μＭ）およびＩＢＭＸ　 （０，５ｍＭ）を用いた。細胞を薬物で３．６または１８時間処理し、２％ホル ムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドで室温において１０分間固定し 、色素原性基質Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ −ガラクトシド、０．２ｍｇ／ｍｌ）に３７℃で２時間暴露した。

薬物で６−１８時間処理された細胞の９０％以上が青色を発色した。ＩＢＭＸ単 独で処理した細胞は、数個が青色に変化したにすぎなかった。次いで細胞を、ｐ ｃＤ発現ベクター中のヒトβ２−アドレナリン作動性レセプターｃＤＮＡでトラ ンスフェクションした。ＤＮＡを細胞に添加した７２時間後に、ＩＢＭＸおよび アスコルビン酸（１００μＭ）±イソプロテレノール（１００μＭ）を培地に添 加した。アスコルビン酸はイソプロテレノールの酸化を防止するために添加され た。６．９または１８時間後に細胞を固定し、０．２ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌで 染色した。残念ながらイソプロテレノールおよびＩＢＭＸで処理したのち観察さ れた陽性細胞の数は、フォルスコリンおよびＩＢＭＸで処理したのち観察された 数よりはるかに少なかった。イソプロテレノールおよびＩＢＭＸで処理した細胞 のプレートをＩＢＭＸ単独に暴露したものと区別するのは困難であった。

従って、ｃＡＭＰ仲介によるβ−ガラクトシダーゼ活性増大の定量的アッセイ法 を開発した。このアッセイ法は９６ウエルプレート内で、細胞を可溶化し、基質 ０ＮＰＧと共にインキュベートしたのち実施された。これにより、一定期間にわ たる光学濃度の変化はβ−ガラクトシダーゼ活性水準に正比例した。光学濃度は １．５まで時間と共に直線的に増大した。ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞はＰＧＥ２（ フロスタグランジンＥ２）およびアデノシンに対する内在性のＧ、−関連レセプ ターを含むと判定された。パイロット試験において、トランスフェクションされ ていない細胞をＮＥＣＡ　［５’　−（Ｎ−エチルカルボキシアミド）アデノシ ン、アデノシンＡ２レセプターアゴニスト］またはフォルスコリンの存在下また は不在下にＩＢＭＸで８時間処理して、細胞内ｃ　、Ａ　Ｍ　Ｐ水準を高めた（ 図１）。ＮＥＣＡまたはフォルスコリンで処理した細胞は、ＩＢＭＸで処理した 対照細胞よりかなり高い水準のβ−ガラクトシダーゼ活性を生じた。同様な結果 が、１または１ＯｕＭのＰＧＥ２と共に細胞をインキュベートすることにより得 られた。１μＭ　ＮＥＣＡ、１ＯｕＭ　ＮＥＣＡ、および０．　５μＭフォルス コリンにより生じた酵素水準は、ＩＢＭＸ対照細胞の場合よりそれぞれ８．３ｏ および４８倍高いと判定された。３−６時間後には、差は視覚検査により識別し うるほどであった。

リガンドへの暴露期間およびリガンド用量の最適化パイロット試験において、細 胞をフォルスコリン（０，５μＭ）　、ＮＥＣＡ　（１μＭ）、またはプロスタ グランジンＥ２（１μＭ）の存在下または不在下でＩＢＭＸＩ：２．４．６．８ ．１５または１８時間暴露し、それらのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。

図２に示すように、６−１５時間の薬物／リガンド処理で卓越したシグナル対ノ イズ比が得られた。細胞をフォルスコリン、ＮＥＣＡまたはＰＧＥ２で８時間処 理することにより用量応答データをめた（図３）。後続試験によりリガンドへの ６−８時間の暴露がＧ、およびＧ１双方のアッセイに最適であることが示された 。従って６−８時間の薬物処理を採用した：この様式ではアッセイを１日で実施 することができ、シグナル対ノイズ比が極めて良好である。

フォルスコリンは０．５μＭ濃度でその最大効果を生じた；最大の酵素誘導を達 成するためには、１ＯｕＭのプロスタグランジンＥ２およびＮＥＣＡが必要であ った。

効率の高いチェノおよびオカヤマ（Ｃｈｅｎ、　Ｏｋａｙａｍａ）のトランスフ ェクション法を採用して、レセプターｃＤＮＡを含むプラスミドをＬＶＩＰ２． ＯＺｃ細胞内へ導入することができる。前記のように、細胞のトランスフェクシ ョンに用いるＤＮＡの量は極めて重要である：少なすぎるか、または多すぎるＤ ＮＡは一時的または安定なｃＤＮＡ発現に乏しい。β２−アドレナリン作動性レ セプターｃＤＮＡを含むｐｃＤプラスミド５５−１Ｏｕを、トランスフェクショ ン溶液であるカルシウム／ＢＥＳ緩衝食塩液に溶解し、１０ｃｍの細胞プレート 内の１０ｍ１の組織培養培地に添加した。この量のプラスミドは点状の沈殿を生 じ、これは４０×拡大で容易に見ることができ、１μＭイソプロテレノールに応 答して最良のβ−ガラクトシダーゼ誘導を生じた。イソプロテレノールの存在下 または不在下でＩＢＭＸを用いて観察されたβ−ガラクトシダーゼ活性の増大は 、ＩＢＭＸ単独を用いて観察されたものの２−４倍であった。イソプロテレノー ルにより誘導された増大は、アンタゴニストであるプロプラノロール（１μＭ） との同時インキュベーションによって遮断された。

実施例４ β２−アドレナリン作動性レセプターｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞 におけるβ−ガラクトシダーゼの誘導：イソプロテレノールの用量およびこの化 合物に細胞を暴露する期間の最適化β２−アドレナリン作動性レセプターｃＤＮ Ａを含むプラスミドでトランスフェクションした３日後に、ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ 細胞を９６ウエルプレートに接種し、イソプロテレノール、アスコルビン酸およ びＩＢＭＸと共に８時間インキュベートした。イソプロテレノールの濃度を１０ ”−１０−’Ｍで変化させ、１０−’Ｍで最大効果が見られた；１０−’−Ｍの 濃度では光学濃度にそれ以上の変化は得られなかった；　１０−’−１０−４Ｍ の濃度では光学濃度にそれ以上の変化は得られなかった。イソプロテレノールの ＥＣ，値は１ＯｕＭであると判定された（図４Ａ）。

ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞を上記にしたがってトランスフェクションし、９６ウエ ルプレートに接種し、１μＭのイソプロテレノール、アスコルビン酸およびＩＢ ＭＸと共に２．４．６．８．１２または１８時間インキュベートした。最良のシ グナル対ノイズ比は薬物に６−８時間暴露したのちに認められた（図４Ｂ）。

実施例５ フォルスコリン仲介によるβ−ガラクトシダーゼ誘導の、アルドステロン分泌阻 害因子（ＡＳ　Ｉ　Ｆ）による阻害ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞をＧ、に結合した内 在性レセプターにつきスクリーニングした。これは活性化されると、フォルスコ リンで処理することにより仲介されるβ−ガラクト／ダーゼ活性の増大を阻害す るであろう。試験した多数のアゴニストのうちＡＳＩＦのみが有意の阻害を生じ た。Ｇ、関連レセプターと相互作用しうるリガンドに関するスクリーニングを最 適化する補助としてＡＳＩＦを用いた。細胞をＩＢＭＸＳ　ＩＢＭＸおよびフォ ルスコリン（領　５μＭ）、またはＩＢＭＸ、フォルスコリンおよびＡＳＩＦ（ １μＭ）で、１．２．４．６．８．１５または１８時間処理した。ＡＳＩＦによ る最も強力なフォルスコリン阻害は６−８時間で観察された（図５）。しかしア ッセイにおいて最大の阻害を観察するためには、これより低いフォルスコリン濃 度（０，１−領　５μＭ）を採用すべきである。最高用量のフォルスコリンは低 い方の２用量と同様に阻害されないが、前者の方が再現性のある水準の酵素誘導 を生じる可能性がある。

実施例６ ドーパミンレセプターｃＤＮＡによる細胞のトランスフェクション後におけるフ ォルスコリン仲介によるβ−ガラクトシダーゼ誘導の、ドーパミンまたはキンビ ロールによる阻害細胞を５．１０．１５または２０μｇのり、Ｒｃ／Ｒ８Ｖ、す なわちＤ８レセプターのイソ型を含むプラスミドでトランスフェクションした。

１０ｃｍの培養皿内で１０ｍ１当たり１０μｇのプラスミドが最良と思われる沈 殿を生じ、この皿からのアリコートの細胞懸濁液を９６ウエルプレートに添加し た。トランスフェクションの３日後に、すべてのウェルにＩＢＭＸを添加した。

β−ガラクトシダーゼ活性をフォルスコリン（０，５μＭ）単独で増大させ、ま たはこの増大を遮断するためにドーパミンもしくはＤ２選択性アゴニストである キンビロールと組み合わせた。ドーパミン作動性アゴニストは１−１００μＭの 濃度で添加された。

リガンドの酸化を防止するために１００μＭのアスコルビン酸を培地に添加した （図６Ａ）。ドーパミン作動性アゴニスト単独ではβ−ガラクトシダーゼ水準に ほとんど影響を及ぼさなかった。フォルスコリン刺激にょるβ−ガラクトンダー ゼ活性増大の有意の阻害は、１０μＭのドーパミンまたは１ｏもしくは１００μ Ｍのキンビロールを用いた場合に観察された。予想されたように、キンビロール はドーパミンより強力であった。

上記のトランスフェクションおよびアッセイ法は、カンナピノイド率またはヒト ムスカリン性ｍ２レセプターを″診断′するために有効に用いられた。１μＭの アゴニストＣＰ５５９４０の添加は、カンナピノイドレセプターを発現する細胞 においてフォルスコリン刺激による活性を１５％低下させた（図６Ｂ）。同様な 低下が、ムスカリン性アセチルコリンレセプターを発現する細胞に１ｍＭのカル バコルを添加したのちにも観察された（図６Ｃ）。

表１ スクリーニングプロトコール １日目　指数的増殖期のＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞をトリプシン処理し、５Ｘ１０ ５細胞／１０ｃｍプレートで接種し、１０ｍ１の増殖培地中で一夜インキユベー トする。

２日目　Ｃａ　３　Ｐ　Ｏａ法（参照：材料および方法）を用いて細胞を１０− ２０μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、３５℃で２−４％Ｃｏ ２下に１５−２４時間インキュベートする。

３日目　細胞を増殖培地で２回洗浄し、培地を再度供給し、３７℃で５％Ｃ０２ 下に２４時間インキュベートする。

４日目　細胞をトリプシン処理し、ベレット化し、９６ウエルのミクロタイター プレートに５−１０ＸＩＯ’細胞／ウエルで接種し、１００μｊの増殖培地中で 一夜インキユベートする。

５日目　対照ウェル（たとえば４重試験）には、１μＭフォルスコリンを含有す る（対照刺激）または含有しない（対照基礎）培地１００μｌ＋ＩＢＭＸ　１ｍ Ｍを添加する。残りのウェルには、１μＭフォルスコリンを含有する（Ｇ、関連 ）または含有しない（Ｇ、関連）、培地１００μｌ＋ＩＢＭＸ　１ｍＭ中に、ア ゴニスト（１種または２種以上）を添加する。必要に応じて酸化防止剤および／ またはプロテアーゼ阻害剤を含有させる。３７℃で５％ＣＯＺ下に６−８時間イ ンキュベートする。細胞を２００μｍのＰＢＳで洗浄し、排液する（細胞は一２ ０℃で２４−７２時間保存することができる）。

６日目　希釈されたアッセイ用緩衝液２５μｍ／ウェルを添加し、１０分間待ち 、次いで１００μｍのアッセイ用緩衝液を添加し、１０分間待ち、次いで２５μ ｌの基質を添加する（ＯＮＰＧ　４ｍｇ／ｍｌアッセイ用緩衝液）。発色を視覚 により観察するか、またはプレート読取り装置で４０５ｎｍにおいて分光測光法 により測定する。

以上に述べた刊行物はすべてそれらの全体を本明細書に参考として引用する。

以上、本発明を明確にし、理解するために詳細に記載したが、本発明および請求 の範囲の真の範囲から逸脱することな（その形態および詳細を多様に変更しうる ことは、以上の説明から当業者に明らかであろう。

（４０５ｎｍ） 光学濃度 （４０５ｎｍ） 光学濃度 光学濃度 （４０５ｎｍ） 光学濃度 （４０５ｎｍ） 光学濃度 （４０５ｎｍ　） （４０５ｎｍ） 光学濃度 光学濃度 （４０５ｎｍ） フロントページの続き （７２）発明者　マーシュ、ジョン アメリカ合衆国メリーランド州２０８１７．ベセズダ、ジェファーソン・ストリ ート （７２）発明者　マハン、ローレンス・シーアメリカ合衆国メリーランド州２０ ８１７．ベセズダ、シンディー・レーン　８０１６Ｉ （７２）発明者　ブラウンスタイン、マイケル・ジェイアメリカ合衆国メリーラ ンド州２０８５２．ロックヴイル、オールド・ファーム・レーン（７２）発明者 　フィンク、ジェイ・ステイーブンアメリカ合衆国マサチューセッツ州０２１８ １゜ウェルズレ−、トリンティ・コート　６

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｇ■関連レセプター遺伝子を、サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体 を含む真核細胞内で発現させ； 該細胞にリガンドを添加し；そして サイクリックＡＭＰの量につきアッセイすることよりなる、Ｇ蛋白質関連レセプ ターに結合するリガンドを同定する方法。
2. ２．サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体がサイクリックＡＭＰ応答性エ ンハンサー要素を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体がさらにＬａｃＺ遺伝子を含む 、請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体がｐＬＶＩＰ２．ＯＺである、 請求の範囲第３項に記載の方法。
5. ５．細胞が細胞系統ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ由来の細胞からなる、請求の範囲第４項 に記載の方法。
6. ６．アッセイ工程が、色素原性基質を添加し、そして色素原性基質の変化をアッ セイすることよりなる、請求の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．色素原性基質がＯ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドである、請 求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．Ｇ結合レセプター遺伝子がｃＤＮＡによりコードされる、請求の範囲第１項 に記載の方法。
9. ９．Ｇ関連レセプター遺伝子またはｃＤＮＡを、サイクリックＡＭＰ感受性レポ ーター構造体を含む真核細胞内で発現させ；該細胞にリガンドおよびアンタゴニ ストを添加し；そしてサイクリックＡＭＰの量につきアッセイすることよりなる 、Ｇ蛋白質関連レセプターに結合するリガンドの、アンタゴニストを同定する方 法。
10. １０．サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体がサイクリックＡＭＰ応答性 エンハンサー要素を含む、請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体がさらにＬａｃＺ遺伝子を含 む、請求の範囲第９項に記載の方法。
12. １２．サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体がｐＬＶＩＰ２．ＯＺである 、請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．細胞が細胞系統ＬＶＩＰ２．ＯＺｃ由来の細胞からなる、請求の範囲第１ ２項に記載の方法。
14. １４．アッセイ工程が、色素原性基質を添加し、そして色素原性基質の変化をア ッセイすることよりなる、請求の範囲第９項に記載の方法。
15. １５．色素原性基質がＯ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドである、 請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．Ｇ関連レセプター遺伝子がＧ■関連レセプター遺伝子である、請求の範囲 第９項に記載の方法。
17. １７．ｃＤＮＡのＧｉ関連レセプター遺伝子を、サイクリックＡＭＰ感受性レポ ーター構造体を含む真核細胞内で発現させ；フォルスコリンおよびリガンドを添 加し；サイクリックＡＭＰの量につきアッセイし；そしてアゴニストにより誘導 されたフォルスコリン活性低下を同定することよりなる、Ｇ蛋白質関連レセプタ ーに結合するリガンドを同定する方法。
18. １８．ｃＤＮＡのＧｉ関連レセプター遺伝子を、サイクリックＡＭＰ感受性レポ ーター構造体を含む真核細胞内で発現させ；フォルスコリン、リガンドおよびア ンタゴニストを添加し；サイクリックＡＭＰの量につきアッセイし：そしてアゴ ニストにより誘導されたフォルスコリン活性低下を同定することよりなる、Ｇ蛋 白質関連レセプターに結合するリガンドのアンタゴニストを同定する方法。
19. １９．組換えサイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体を含む、マウスＬ細胞 。
20. ２０．構造体がサイクリックＡＭＰ応答性エンハンサー要素を含む、請求の範囲 第１９項に記載の細胞。
21. ２１．サイクリックＡＭＰ感受性レポーター構造体がＬａｃＺ遺伝子を含む、請 求の範囲第１９項に記載の細胞。
22. ２２．構造体が細胞のゲノムＤＮＡ内へ安定な状態で組み込まれた、請求の範囲 第１９項に記載の細胞。
23. ２３．構造体がｐＬＶＩＰ２．ＯＺである、請求の範囲第１９項に記載の細胞。
24. ２４．細胞がＬＶＩＰ２．ＯＺｃ細胞である、請求の範囲第２３項に記載の細胞 。