JPH06511469A

JPH06511469A - 微生物のコロニー化を阻害するためへの宿主細胞リン脂質の使用

Info

Publication number: JPH06511469A
Application number: JP4503224A
Authority: JP
Inventors: クライバン，ハワード　シー．; ニルソン，ボー; リングウッド，クリフォード　エー．
Original assignee: マイクロカーブ　インコーポレイティド; エイチエスシー　リサーチ　アンド　ディベロップメント
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2015-05-22
Also published as: ATE124262T1; EP0563256B1; EP0563256A1; US5411948A; DE69110906D1; HK1007679A1; DE69110906T2; JP3042713B2; CA2098842A1; WO1992011015A1; CA2098842C; DK0563256T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、一般に、微生物と結合するリン脂質のりセブターの使用に関する。

発明の背景微生物が宿主細胞に結合するプロセスは付着または接着と呼ばれ、そしてこのメカニズムが微生物の定着および感染の阻止における重要な段階であることはよく受け入れられている。一般に、宿主細胞は感染性微生物の結合を仲介する構造体（「リセブターＪ）を有する。したがって、宿主の組織上のりセブターは、結合を仲介する微生物上の構造体とちょうど同程度の微生物の感染の決定基である。

ヒトに関する病原性微生物の１例は、トラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）である。この微生物は真核生物細胞の無条件的なバクテリアの寄生生物であり、そして工業化された社会における最も普通の性的に伝播される病原体であることは知られていない（Ｍｏｌｕｄｅｒ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、　Ａ、Ｌ、Ｂａｒｒｏｎ編、ｐ、３−１９、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、フロリダ州ポカレイトン、１９８８　；　５ｃｈａｃｈｔｅｒ、　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、　ｌ）、１５３−１６６．１９８８）　。米国において、４百万以上の人々は毎年クラミジアに関係する病気にかかることが推定された（ＥｉｓｎｅｒおよびＭｏｎａｃｈａｎ、　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎ、Ｔｅｓｔｉｎｇ、２８　：２６−２８．１９９０）。卵管炎、子宮外妊娠、不妊症、慢性の骨盤の痛み、早産、新生児の結膜炎、乳児の肺炎、地方店性トラコーマ、尿道炎および副呆丸炎のすべてはこの生物による感染に直接にまたは間接的に関係づけられてきている（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ　１９８８　；　ＥｉｓｎｅｒおよびＭｏｎａ−ｈａｎ、　１９９０）。

ヒトに関する病原性微生物の他の例は、へりコバフタ−・ピロリ（ｔ（ｅｌｉｃａｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）である。この微生物はヒトの胃の感染性因子である。感染は一次的、慢性の活性胃炎および消化性潰瘍の両者いて十二指腸の病気からの３００．０００以上の新しいケース、３．２００．　Ｑθ０の再発、および３．２００の死亡が存在する（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ、　５ｔａｔｉｓｔｉｃｓｆｏｒ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｒｏｆｅｓｓｉｎａｌｓ、　１９８４）。化アメリカにおけるすべての常習欠勤の１．５％は消化性潰瘍の結果である（Ｊａｎｓｅｎ、　Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、、８１　：４２−４８．１９８６）　、洞胃炎は引き続いて胃腸癌に関連する（　Ｊｏｈａｎｓｅｎｎおよび５ｉｋｊａｙ、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎ、、　８５　：　２４０．１９７７）そして最近の研究はへりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）を胃腸癌と関１０月２１〜２４日、厚約書Ｎα５）。

微生物の病気の予防および処置に対するアプローチにおける困難のために、微生物の病気の予防および処置のための改良された方法および組成物がこの分野において要求されている。本発明はこの要求を満足し、そしてさらに他の関係する利点を提供する。

発明の要約簡単に述べると、本発明は微生物の定着の阻止にｉｎ　ｖｉｖｏで使用するための種々のｉｎ　ｖｉｔｒｏの方法および化合物および組成物を提供する。本発明の１つの面において、生物学的調製物における微生物の定着を阻止する方法が提供される。１つの実施態様において、この方法は、生物学的調製物を、有効量の式。

Ｒ′はアルキル基でありそしてＲは脂肪酸のアルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルケニル基である、を有するリン脂質と接触させることからなる。

他の実施態様において、この方法は生物学的調製物を前述のリン脂質とＧａ１ＮＡｃβＩ　−４Ｇａｌβｌ−４ＧＩｃ−セラミド（Ｃｅｒａｍｉｄｅ）と組み合わせて接触させることからなる。

他の実施態様において、この方法は生物学的調製物を前述のリン脂質とＧａｌβ １−３ＧａｌＮＡｃ／３１−４Ｇａｌβｌ−１−４Ｇ１セラミドと組み合わせて接触させることからなる。

本発明の他の面は、微生物を生物学的調製物から除去する方法を提供する。１つの実施態様において、この方法は、生物学的調製物を、微生物を含有することが疑われる生物学的調製物と、前記生物学的調製物と前記微生物との間の結合を可能とするために十分な条件下にかつ時間の間、接触させることからなり、前記リン脂質は式：Ｒ′はアルキル基でありモしてＲは脂肪酸のアルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルケニル基である、を存し、そして前記リン脂質を前記生物学的調製物から分離し、これにより前記微生物を前記生物学的調製物から除去する、ことからなる。

他の実施態様において、リン脂質をＧａ１ＮＡｃβｌ→４Ｇａｌβ１−４ＧＩｃ −セラミドと組み合わせ、そして分離の工程はリン脂質およびＧａ１ＮＡｃβｌ →４Ｇａ　ｌβ１−４ＧＩｃ−セラミドを生物学的調製物から分離することからなる。

他の実施態様において、リン脂質をＧａｌβｌ→３ＧａｌＮＡｃβｌ→４Ｇａｌ β１−４ＧＩｃ−セラミドと組み合わせ、そして分離の工程はリン脂質およびＧａｌβ１−＋　３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを前記生物学的調製物から分離することからなる。

前記実施態様のいずれかについて、リン脂質、Ｇａ１ＮＡｃβｌ→４Ｇａ　１β １−４ＧＩｃ−セラミドまたはＧａｌβ１　→３ＧａｌＮＡｃβ１　→４Ｇａｌ βｌ−４Ｇｌｃ−セラミドの１または２以上を固体支持体上に固定化することができる。

関係する面の範囲内で、本発明は、温血動物における微生物の定着を阻止するか、あるいは温血動物における微生物の定着を阻止する薬物の製造のために使用する化合物、組成物および方法を提供する。１つの実施態様において、温血動物における微生物の定着を阻止するために使用する組成物は、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤と、式：Ｒ′はアルキル基でありモしてＲは脂肪酸のアルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルケニル基である、を有するリン脂質との組み合わせからなる。

他の実施態様において、組成物はＧａ１ＮＡＣβ１→４Ｇａ　ｌβｌ→４　Ｇｌｃｌモーミドをさらに含有する。

１つの実施態様において、組成物はＧａｌβｌ→３ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ β１−１−４Ｇ１セラミドをさらに含有する。

前述のリン脂質は、また、微生物の定着を阻止する薬物の調製において有用である。

本発明のこれらの面および他の面は、次の詳細な説明を参照すると明らかとなるであろう。

発明の詳細な説明前述したように、微生物の定着および感染の開始において重要な段階は微生物の宿主細胞への付着である。微生物は宿主細胞のりセブターに特異的に結合する。

本発明の範囲内で、リン脂質は微生物のためのりセブターであることが示され、そして微生物の定着を阻止するために使用することができる。

本発明の範囲内で開示するように、種々の微生物はヒトの細胞から分離したリン脂質に特異的に結合する。このような微生物は、次のものを包含する：ストレブトコッキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）　、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）　、ヘンフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘリコバフタ−（Ｈｅｌｉ −ｃｏｂａｃｔｅｒ）　、バステウレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、カンピロバクタ−（Ｃａｍ−ｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）　、エリシペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）　、ガルドネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ）、トレボネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）　、バクテリオデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、フッバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エルシナ（Ｙｅｒｓ　１ｎａ）、コキシエラ（Ｃｏｘ−ｉｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）　、ペブトストレブトコッカス（Ｐｅｐｔｏ−ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　、およびモビルンクス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）。典型的には、これらの微生物の宿主のりセブターは気道、胃腸管ま“たは生殖管の上皮細胞上に存在するか、あるいは血球または表皮細胞上に存在することが発見することができる。代表的な培養した細胞系は、次のものを包含する：ヒト中咽頭の上皮細胞、ヒト気管上皮細胞、ヒト子宮内細胞、胚羊膜細胞、ヒト歯肉線維芽、ＨｅＬａ細胞、およびＭｃＣｏＹ細胞。

結合の原因となるリン脂質（例えば、リセプター」）の精製は、抽出およびクロマトグラフィーの手順の組み合わせにより達成することができる。例えば、簡単に述べると、細胞（例えば、ＨｅＬａ）をリン酸塩緩衝液で洗浄し、そしてクロロホルム／メタノール／水を使用して抽出する。抽出液を遠心し、ペレットを再抽出し、そして上澄み液を組み合わせる（「脂質抽出物」）。この脂質抽出物をアニオン交換樹脂に適用しそして、メタノール洗浄後、リセブター分画を１０〜２０ｍＭのＮＨ，ＨＣＯ，を含有するメタノールで溶離する。溶媒を蒸発させモしてｌ：ｌメタノール−クロロホルムの中に再溶解した後、リセプターの分画を調製用薄層クロマトグラフィーによりさらに精製する。リセブターを含有するバンドをガラスのカラムに移し、クロロホルムで洗浄し、そしてメタノールで溶離する。精製は分析用薄層クロマトグラフィーにより評価することができる。

本発明の開示は、精製したりセブターがエタノールアミンおよびいくつかの異なる脂肪酸を含有する次のリン脂質構造体からなることを示す二重：式中Ｘは−Ｃ−Ｒまたは−Ｃ＝ＣＨ−Ｒ’てあり、Ｒは脂肪酸のアルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルケニル鎖であり、そしてＲ′はアルキル鎖である。

脂肪酸は典型的には多数の表示により略される。例えば、ＣＨｔ　（ＣＨｔ）　Ｉ　ＩＣＨＩＣＯＯＨは１６：０であり、ここでコロンの左は炭素原子の数であり、そして右の数は二重結合の数を示す。ＨｅＬａ細胞から精製したりセブターのリン脂質において同定された脂肪酸は１６：０゜１８：　ｔ、２０：　４、および１８：　９０Ｈ＋１８：　１００Ｈであり、そして、それぞれ、約１６％、１７％、４７％、１％、および１９％の相対比で存在する。リン脂質のこの集まりは微生物に特異的にかつ高い結合活性で結合する。この型のリン脂質は、これらの特定の脂肪酸の１または２以上を失うが、また、微生物に結合する。

前述のリン脂質に加えて、微生物はまた特定のグリコリピドに強く結合する。とくに、グリコリピドのアシアロ−ＧＭＩおよびアシアロ−ＧＭ２の中に見いだされるＧａ１ＮＡｃβ１　→４Ｇａｌβ１　→４Ｇｌｃ配列は、微生物のための第２リセブターを構成するように思われる。アシアロ−ＧＭＩはＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃＢｌ→４Ｇａｌβ１−４ＧＩｃ−セラミドの略号であり、そしてアシアロ−ＧＭ２は末端のＧａｌを欠く同一構造体である。セラミドはアミン上で脂肪酸によりアシル化されたスフィンゴ脂質の塩基である。

本発明のリン脂質は、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤を含む組成物として、微生物の定着の阻止のために、温血動物（例えば、ヒト）に投与することができる。あるいは、このような組成物は前述のグリコリピドの１または２以上を含むことができる。正確な最適な投与量は、使用する特定のリン脂質またはグリコリピドに依存して、変化することができる。しかしながら、一般に、有効量は約０．１〜約１０■／ｋｇ体重であろう。これらのリン脂質およびグリコリピドは、宿主細胞上へ自然のりセブターに対するよりむしろ、例えば、リン脂質およびグリコリピド（すなわち、人工的リセブターとして）に結合するように微生物を「ツーリング（ｆｏｏｌｉｎｇ）ｊすることによって、定着を防止する手段を提供する。

製剤学的に許容されつる担体および希釈剤は、水、生理食塩水、リポソーム、アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびそれらの混合物を包含する。組成物は種々のルート、例えば、経口的、非経口的および経皮的投与により投与することができる。経口的投与のために、組成物は火剤、カプセル剤または液体の形態であることができる。注射による投与のために、生理食塩水は好ましい希釈剤である。経皮的投与のために、ＤＭＳＯは好ましい担体である。

本発明のりセプターのリン脂質は、また、微生物の定着のｉｎ　ｖｉｔｒ。

の阻止のために、例えば、生物学的調製物において、個々にまたは集合的に使用することができる。用語「生物学的調製物」は、１ｎｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏで採った生物学的試料（引き続く操作を含むか、あるいは含まない）ならびに合成的に調製されたものを包含する。

生物学的調製物の代表的な例は、細胞、組織、溶液および体液、例えば（次のものからの）、血液、尿、唾液、汗、滑液、脳を髄液および涙を包含する。簡単に述べると、リセブターのリン脂質の１または２以上を生物学的調製物に添加する。あるいは、このようなリン脂質は前述のグリコリピドの１または２以上を含むことができる。

正確な最適な濃度は、特定の使用するリン脂質またはグリコリピドに依存して、変化することができる。しかしながら、一般に、約１〜１００■／ｍｌの濃度は有効であろう。前述したように、これらのリン脂質およびグリコリピドは宿主細胞上の自然のりセブターへの微生物の結合を防止する。したがって、本発明のこの面の使用のｌっは、生物学的調製物の微生物の定着をその貯蔵の間に防止することである。

固体支持体に固定化されたリン脂質（および／またはグリコリピド）を生物学的調製物に添加することは望ましいことがある。この変法は、生物学的調製物の使用前に、微生物を結合することができるリン脂質（および／またはグリコリピド）の除去を可能とする。

リン脂質（および／またはグリコリピド）は、固体支持体に、吸着または共有結合により固定化することができる。当業者にとって明らかなように、リセプターは種々の方法で、例えば、光活性化またはリンカ−基、例えば、ピアース・ケミカル・カンパニー（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ｘイリノイ州ロックフォード）から入手可能なホモ−およびヘテロ−機能的試薬により共有結合させることができる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。

実施例実施例１脂質へのクラミジア属生物の結合Ａ、クラミジア属生物の増殖および放射線標識っけトラコーマクラミジア（Ｃ，ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）　５ｅｒｏｖａｒ　Ｅの頚部の分離物をＨｅＬａ２２９細胞中で増殖させ、そしてクラミジアの要素の物体（ＥＢ）をレッグラフイン勾配手順の変更した手順により精製した液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、モしてＩＥＢの密度をＰＢＳでマクファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）Ｎｌ１３のそれに調節した。

クラミジアの生物をバクテリアについて記載されているように小さい変更を加えて放射線ヨウ素化した（　Ｋｒ　ｉ　ｖａｎら、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

シアの懸濁液を、０．１■のヨウドゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、　、イリノイ州）でコーティングした管（１０ｘ７５ｍｍ）の中で氷浴上で０．５ｍＣ１のＮａｌｌ５■と反応させた。４〜５分後、懸濁液を５ｍｌのトリス−ＢＳＡ緩衝液（０，１５ＭのＮａＣ１および１％のウシ血清アルブミンを含有する０、０５Ｍのトリス塩酸塩（ｐＨ７，８）　）を含有する遠心管に移した。この管を４°Ｃにおいて３０分間３０．０ＯＯＸ　ｇで遠心した。ペレットを６ｍｌのトリス−ＢＳＡ緩衝液の中に再懸濁させ、そして遠心を反復した。上澄み液を除去し、そしてペレットを５ｍｌのトリス−ＢＳＡ緩衝液の中に再懸濁させた。この懸濁液の放射能をクロマトグラムのオーバーレイのアッセイのために２　ｘ　１０＠ｃｐｍ／ｍｌに調節し、モしてＲＰＭＩ−ＢＳＡ　（１％のＢＳＡを含有するＲＰＭＩ　１６４０培地ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド〕）を使用する固相結合アッセイのために４Ｘ１０’に調節した。

Ｂ、クラミジア属生物の音響的抽出および分画の標識つけ精製したＥＢをマイクロチップを使用して水浴中で７分間超音波処理し、次いで４℃において３０．０００　Ｘ　ｇで３０分間遠心した。上澄み液を音響的抽出物と表示し、そしてそのタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、イリノイ州）により標準としてウシ血清アルブミンを使用して決定した。

音響的抽出物をタンパク質について記載されているように（Ｍａｇｎａｎ　ｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　８３　：　２３５−２４１．１９８２）小さい変更を加えて放射線標識つけした。簡単に述べると、音響的抽出物の３０μｌのＰＢＳ中のｌＯμｇのタンパク質を、前述したように、ヨウドゲンをコーティングした管の中の１００μｌの０．３Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液と混合した。］ｍＣｉのＮａ＋２１１を管に添加し、そして音響的抽出物を氷浴上で２分間頻繁に震盪しながらヨウ素化した。反応混合物を、トリス−ＢＳＡと前板て平衡化したＰＤ−１０セフアデツクス（Ｓｅｌ）ｈａｄｅｘ）Ｇ−２５Ｍカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　、スウェーデン国つプサラ）に移した。この混合物をカラムに通過させた後、１ｍｌのトリス−ＢＳＡを細胞の上部に添加し、次いでさらにトリス−ＢＳＡを添加した。最初の１ｍｌを廃棄し、そして次の５ｍｌを集めた。音響的抽出物の放射能をクロマトグラムのオーバーレイのアッセイのために２　ｘ　１０＠ｃｐｍ／ｍｌに調節し、そしてＲＰＭＩ　−ＢＳＡを使用する固相結合アッセイのために４　ｘ　１０’ｃｐｍ／ｍｌに調節した。

オーバーレイアッセイはバクテリアについて記載されているようルの高性能薄層プレート（ＨＰＴＬＣ；　Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ　ＡＧ、ドイツ国ダーマシュタット）上でクロマトグラフィーにかけ、モしてクロロホルム−メタノール−０，２５％の水性ＫＣＩ（５：　４　：　１）で展開した。プレートをポリイソブチルメタクリレート（ヘキサン中の０．１％）でコーティングし、空気乾燥し、トリス −ＢＳＡ緩衝液中で１時間ソーキングし、そして前述したように室温においてＩ２ｓ■標識したクラミジア属生物またはクラミジアの細胞上分画をオーバーレイした。プレートをおだやかに洗浄して結合しなかった生物を除去し、乾燥し、そしてＸＡＲ−５Ｘ線フイルム（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ、、ニューヨーク州ロチェスター）に４０時間露光した。

４９３−４９６．１９８８に記載されているようにして実施した。簡単に述べると、コレステロールおよびホスファチジルコリン（各々０．１μｌ）を含有するメタノール（２５μｌ）中の精製した脂質の系統的希釈物をポリ塩化ビニルのミクロ希釈ウェル（Ｆａｌｃｏｎ　３９１９；ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎ−ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、　、ニュージャーシイ州パラムス）に添加し、そして蒸発により乾燥した。ウェルをトリス−ＢＳＡで１時間ブロックし、ＲＰＭＩ−ＢＳＡで２回洗浄し、そして１２６　Ｉ標識したクラミジア属生物またはその細胞上分画と室温において２時間インキュベーションした。

ウェルをＰＢＳで５回洗浄した後、ポリ塩化ビニルのウェルをハサミで切断し、そして計数管の中に入れた。結合をガンマカウンターで定量した。

実施例２クラミジアのりセブターの精製および特性決定Ａ、精製ＨｅＬａ２２９をＴＣ−１７５ｃｏｆのフラスコの中で増殖させ、そして温和なトリプシン化または削り取りにより収穫した。細胞を３回０．００６７Ｍのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ　、　ｐＨ７，２）中で洗浄した。ＨｅＬａ２２９の全体の脂質を３体積（細胞の湿潤した重量に対して）の脱イオン水、１０体′　積のメタノールおよび５体積のクロロホルムの添加により抽出した。

この混合物を２分間超音波処理し、そして室温において揺動ベッド上で一夜インキユベーションした。抽出液を４°Ｃにおいて２．００Ｏｒｐｍで５分間遠心した。上澄み液を取って置き、そしてペレットを同一体積の脱イオン水、メタノールおよびクロロホルムの中に再懸濁させた。この懸濁液を３０分間超音波処理し、そして上澄み液を遠心により集めた。第１および第２の上澄み液を丸底フラスコの中に一緒にし、そして回転蒸発器上で乾燥した。

ＨｅＬａ２２９細胞の乾燥した全体の脂質抽出物をｌ＝１メタノール−クロロホルムの中に可溶化した。（０，５ｍｌ／　ｌ　ｇの細胞の湿潤重量）。

全体の脂質の一部分を後の分析のために一２０℃で貯蔵した。残部を窒素雰囲気下に乾燥し、モしてもとの体積のクロロホルム−メタノール−水（３０：６０：８）の中に溶解した。ＨｅＬａ２２９細胞の全体の脂質をＤＥＡＲ−セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ。

スウェーデン国つプサラ）に適用し、そして２０分間結合させた。中性の脂質をまず５ゲル体積のメタノールで溶離し、次いでクラミジアのりセブタ−（「リセブター」）を含有する分画を５ゲル体積の１０〜２０ｍＭのＮＨ４１（ＣＯ，を含有するメタノールで溶離した。リセブターを含有する分画はＨＰＴＬＣにより分析してＣＭＨとＣＤＩとの間で移動し、そして弱くオルシノール陽性であった。リン脂質の分画は、実施例１に記載するクロマトグラムのオーバーレイのアッセイにより分析して、放射線標識した要素の物体に結合する能力により、クラミジアのりセブターを含有すると評価された。他の酸性脂質は５ゲル体積の０．５ＭのＮＨＪＣ島を含有するメタノールで溶離された。各脂質の溶離物を回転蒸発器で乾燥し、モしてｌ：１メタノール−クロロホルムの中に再溶解した。

リセプターを含有する分画をさらにシリカゲルＧ−２０００ミクロンの薄層調製用プレー）　（Ａｎａｌ、Ｔｅｃｈ、、ニュージャーシイ州ネワーク）のクロマトグラフィーにより精製し、５：４：ｌクロロホルム−メタノール−水性０．２５％のＫＣＩで展開した。プレートをブリムリンで噴霧し、そして長波の紫外線により検査した。リセブターを含有するバンドはブリムリンで陽性に染色され、そして実施例１に記載するクロマトグラムのオーバーレイのアッセイにおいてクラミジアに結合する。リセブターのバンドを削り出し、細かく切り、そしてガラスのカラムに詰めた。このカラムを５ゲル体積のカラムで洗浄し、次いでリセブターを１０ゲル体積のメタノールで溶離した。溶離液を、回転蒸発させ、そしてもとの体積の１／２の１＝１メタノール−クロロホルムに再溶解した。リセブターの純度を薄層クロマトグラフィーにより検査し、そしてクラミジアのりセブターとして機能するその能力を、実施例Ｉに記載するクロマトグラムのオーバーレイのアッセイ、両者の手順により評価した。

Ｂ１分析１、　化学的リセブターのアミノ酸分析（Ｓｐａｃｋｍａｎら、Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、　３０　：　１１９０−１２０６．１９５８）は、アミノ酸の不存在およびエタノールアミンの存在（１０〜１５重量％）を明らかにした。ｒｂＰＥＪｃウシの脳からのし一α−ホスファチジルエタノールアミン、Ｐ８６７３０ットＮα６９Ｆ− ８３６５−１゜Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ミゾリー州セントルイス）の脂肪酸分析（ＧａｖｅｒおよびＳｗｅｅｌｅｙ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍ、　、　４２　：　２９４−２９８．１９６５の手順に従う）の結果、およびリセプターを表１に要約する。

表１ｂＰＥおよびリセブターの脂肪酸の組成合計の脂肪酸含量％Ｃ１８：　０　４９．５　４７．２ａ　２つの異なるＣ１８：１不飽和脂肪酸２　質量スペクトル測定マイナスのイオンのモードで急速原子衝突質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）を、ＶＧ　ＺＡＢ−３Ｅ磁気セクター計装で測定した。試料をトリエタノールアミン中に溶解し、そしてステンレス鋼のターゲット上に負荷し、これを８　ＫｅＶの運動エネルギーのキセノン原子を衝突させ、そして１０ｋｖの加速電圧を使用した。電子イオン化モードにおいて気−液クロマトグラフィーー質量スペクトル測定（ＧＬＣ−ＭＳ）を、ＤＢ−１毛管カラム（０，２５Ｍ　ｘ　３０ｍ）を装備したＶＣｌ２−２５０四重極計装で実施した。２００°Ｃのイオン源を使用して７０ｅＶでスペクトルを記録した。火炎イオン化検出器を装備した、気−液クロマトグラフイー（ＧＬＣ）、ヘラレット−パラカード（Ｈｅｗｌｅｔ　ｔ−Ｐａｃｋｅｒｄ）５８９０計装を使用した。

分離はＤＢ−１毛管カラム（０，２５ｍｍ　Ｘ　３０ｍ）で実施した。

ｂＰＥおよびリセブターのマイナスのイオンモードのＦＡＢ−ＭＳは、６００〜９００質量単位の範囲におけるＣＭ−１）イオンの容量なパターンを示した。両者の化合物は脂質部分におけるかなり不均質性をトルを減すると、リセブターはｂＰＥと異なる脂質部分を存することが示された。

３、　８ＭＲスペクトル分析１Ｈおよび”Ｃのスペクトルをブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）　ＡＭ−５００計装で記録した。スペクトルは２７°ＣにおいてＣＤ、Ｏｔｌ中で得られ、そして化学シフトはｏ　ｐｐｍに設定した（’Ｈスペクトルについて）内部のテトラメチルシランに関係して表すか、あるいはＣＤｌ０Ｄ中のメチルの共鳴の中央の信号を４８．９ｐｐｍ（”　Ｃスペクトルについて）に設定した。

今日までのプロトン−プロトンの相関関係のスペクトル測定（ＣＯ３Ｙ）および偏光トランスファーの歪みの増大（ＤＥＰＴ）スペクトルは、ブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）の標準のソフトウェアのプログラムに従い得た。

リセブターの１Ｈスペクトルは、ＣＨ，基をもつ脂質についての特徴ある信号（０，８５ｐｐｎ＋）および脂肪族鎖からのＣ１，信号（１，３１）ｌ）０１）を示した。脂肪酸の鎖の中の実質的な量の不飽和は５．４ｐｐｍ付近の多数の信号から明らかであった。脂肪酸から誘導されないある数の信号は６〜３　ｐｐｍの領域における見られた。等しい強度および同様な特徴をもつ、両者とも５つの信号を含有する２つのスピン系が検出された。

５、　２３ｐｐｍにおいて多重信号をもつ第１の系は、２つのＡＢ系に接続したｃｏｓｙスペクトルにおける交差−ピークを通り（それらのＴ。

緩和から判定してＣＮ３基）、一方は４．４３ｐｐ１１＋に存在し、そして他方は３．９５ｐｐｍに存在した（２つのプロトンから由来した）。これらの特徴は、位置１および２に脂肪酸により置換されそして位置３においてリンのジエステルにより置換されたグリセロールと密接な類似のスピン系は、同様なパターン、５．１７ｐｐｍにおけるＣＨ，および３．９８ｐｐｍにおける２つのプロトンの共鳴を示した。第２ＡＢ系は３．０および３．９５ｐｐｍへの他方のＡＢ系の顕著なシフトを示した。これはアシル化されたＣ１．基からアルキル化されたＣ１１．基への変化を示すことがある。

２つの残りの信号である、４．３５ｐｐｍにおける四重線に接続した５、９７ｐｐｍにおける二重線は、 −Ｏ−ＣＨ＝　ＣＨ−ＣＨ。

の構造的要素の中の二重結合を示す。最後に、２つのグリセロール単位と比較して４：１の比における４、　Ｏ３ｐｐｍおよび３．１５ｐｐｍにおける２つの多重線は、リン酸化されたエタノールアミンの中のＣＨ，基により説明することができる：上のデータはｌ：１の比の次の２つの構造を示唆する：ＲおよびＲ′は、それぞれ、脂肪酸およびプラスマローゲンの炭化水素（またはヒドロキシル化された炭化水素）鎖を表す。この解釈は、ウシ脳から得られそして５４％のブラスマローゲン（すなわち、α、β−不飽和アルキル鎖）を含有すると述べられている、！Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ｂＰＥ）の参照スペクトルを記録することによって確証された。２つのスペクトル（リセブターおよびｂＰＥ）の間の合致はほとんど完全であり、提案した構造を確証した。

（参照は述べた５４％よりむしろ約６７％のブラスマローゲンを含有した）。

実施例３脂質のへりコバフタ−生物の結合Ａ、へりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）の増殖へりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐＹｌｏｒｉ）の分離物ＬＣ３およびＬＣＩＩを、洞の胃炎をもつ子供からの胃粘膜バイオプシーの試料から培養した。

生物を１０％のグリセロールおよび１０％の胎児子ウシ血清を含有するプルセラのブロス中で一７０°Ｃにおいて貯蔵した。培養物は典型的には最大６力月間貯蔵した。培養物をスキロウ（Ｓｋｉｒｒｏｗ）媒質上にプレートし、モして３７ °Ｃにおいて酸素が少ない雰囲気中で２４時間インキュベーションした。プレートからの接種物を、使い捨てエルレンマイヤーフラスコの中の１０％の胎児子ウシ血清を補充した１０ｍ１のプルセラのブロスの中に入れた。フラスコにゆるいねじの栓つけて排気ジャーの中に入れ、そして酸素が少ない雰囲気中で７０ｐｐｍで絶えず震盪しながら３７℃において１６時間インキュベーションした。この方法は首尾一貫して１０４生物／ｍｌの増殖を生じた。バクテリアは、位相差顧微鏡で見たとき、古典的な螺旋状の、鞭毛の形態を有した。

それらはウレアーゼ、オキシダーゼ、およびカタラーゼについて陽形式化したヘリコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）菌株ＬＣ３を１５００ｇのニューシイランド白ウサギに静脈内注射することによって、全細胞のヘリコバフタ−・ピロリ（Ｈ，Ｐ）’Ｉｏｒｉ）多価抗体を生産した。

０．５ｍｌのリン酸塩緩衝液のバクテリア（１０’）を注射し、次いで２および６週後、１ｍｌのリン酸塩緩衝液の中に懸濁させた１０”生物を注射した。最後の注射後２週に静脈カテーテルにより抗血清を採った（ウサギを全身麻酔した）。へりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐ）’１ｏｒｉ）抗体の存在は、６つの別々のへりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）分離物の全細胞の超音波処理物の免疫プロットにより示された。抗体は各分離物からの同一のタンパク質と反応した。

クロロホルメート／メタノール／水、６５：２５：４（容量）中のプラスチックの裏張りシートの薄層クロマトグラフィーにより脂質抽出物（５０μｇ）を分離した（Ｐｏｌｙｇｒａｍ　ＳルーＧ、Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

カナダ国オンタリオ）。プレートを３％のゼラチン中で３７℃において２時間ブロックした。洗浄後、プレートを室温において二酸化炭素／水素の雰囲気中で、成長培地中の新しく培養したへりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）　（１０＠／ｎ１１）とインキュベーションした。２時間インキュベーションした後、プレートを１００ミリモル／ｌの［トリスＪ生理食塩水ｐＨ７，６中で洗浄し、ウサギへりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）抗血清の１　／６００希釈物の中でインキュベージコンし、そして室温においてさらに２時間インキュベーションした。

プレートを再び洗浄し、そしてセイヨウワサビペルオキシダーゼに接合したウサギ免疫グロブリンに対するヤギ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州すッチモンド）と室温において１時間インキュベーションした。洗浄後、結合した生物をペルオキシダーゼの基質である４−クロロ−１−ナフトール（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｉ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、、ミゾリー州セントルイス）に添加することによって可視化した。ヘリコバフタ−・ピロリ（Ｈ，Ｉ）Ｙｌｏｒｉ）の不存在下のインキュベーションを同時に実施した。

実施例４へりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）のりセブターの精製および特性決定Ａ、精製ブタの胃および検死で得られたヒトの粘膜の陳腐な赤血球、スクレイビング、および培養したＨＥｐ２細胞から脂質を抽出した。組織を秤量し、最小の体積の水の中で均質化し、そして２０体積のクロロホルム／メタノール２：１（容量）中で抽出した：次いで抽出物を水に対して分配した。下相の脂質を乾燥し、クロロホルム／メタノール９８：２中に溶解し、そしてクロロホルム中で前辺て平衡化したケイ酸のカラムに適用した。カラムを順次にクロロホルム、アセトン／メタノール９：１（赤血球の抽出物について３：１）およびメタノールでよく洗浄した。分画を乾燥し、そして秤量した。それ以上の精製のために、へりコバフタ− 結合性脂質を含有するメタノールの分画を濃縮し、ケイ酸カラムに再び適用し、そしてクロロホルム／メタノールの１０：１〜２：１の直線の勾配で溶離した。

分画を濃縮し、そして実施例３に記載するように薄層クロマトグラムのオーバーレイのアッセイにより結合について試験した。リセブターを含存する分画をプールした。

Ｂ８分析ヒト赤血球およびへりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，Ｉ）ｙｌｏｒｉ）のリセブパーゼＣ消化メタノーリシス、ＨＰＬＣ，およびＧＬＣの分離およびピークの積分によりＭｙｈｅｒら（」坤並、　２４　：　３９６−４０７．１９８９）に記載されているように分析した。赤血球からのホスファチジルエタノールアミンの脂肪酸分析（ｒＲＢＣＰＥＪ　）の結果を表２に要約する。

表２ＲＥＢ　ＰＨおよびリセブターの脂肪酸組成“１６二〇”　１５．０５　１２．１８″１７：０”　ｏ、　３２　０．２１ ’１８　：Ｏ’　ｓ、　７１　６．１１″１８：１”　１９．６９　１５．７９ “１８：２Ｗ６°　４．４４　５．３７“２０：ｌＷ９”　０．６１　０．３０ “２０：２Ｗ６”　ｏ、　４０　０．２１“２０：３Ｗ６”　１．０１　０．８５”２０　：　４Ｗ６’　１７．６７　２０．３４”２０：５Ｗ３”　ｏ、　１０　０．６０”２２：４Ｗ６’　５．１５ ”２２　：　５Ｗ３”　０．５９　０．８７“２２　：　５Ｗ３”　２．１２　３．１９“２２　：　６Ｗ３“　３．３３　４．６４ＤＭＡ” “１６：０”　５．０５　６．３３ “１７：Ｏ”　０．５０　０．９１ “１８；０“　１１．　Ｏｆ　１１．８５“１８：１”　４．２４　４．６６１　脂肪酸メチルエステル８　ジメチルアセタールヘリコバフタ−・ピロリ（Ｈｌｐｙｌｏｒｉ）のりセブターの構造の特性決定の結果に基づいて、それはホスファチジルエタノールアミンに似た分子である。天然のホスファチジルエタノールアミンをクロマトグラムのオーバーレイのアッセイで試験する（上の実施例４、Ｃに記載されている）とき、異なる源からのホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）へのへりコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）の結合におけるかなりの変動が観察された。天然のＰＨのうちで、大腸菌ＣＥ。

ｃｏｌｉ）からのＰＨは最も有効なりセブターであった。ウシ脳、卵黄および大豆からのＰＥはヘリコバフタ−・ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）により低い程度に認識されたが、ウシ肝臓およびイヌ脳からのＰＥはリセブターの活性をもたなかった。

フロントページの続き（７２）発明者　クライバン、ハワード　シー。

アメリカ合衆国、メリーランド　２０８５５゜ダーウッド、アイロンフォージ　コート（７２）発明者　エルシン、ボースウェーデン国、ニス−２２２５７ルンド。

ユリバーゲン　６２（７２）発明者　リングウッド、クリフォード　ニー。

カナダ国、オンタリオ　エム８エックス２アール９．トロント、キングスウェイクレセント　１６

Claims

【特許請求の範囲】

１．生物学的調製物を、有効量の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中Ｘは▲数式、化学式、表等があります▼または−Ｃ＝ＣＨ−Ｒ′であり、Ｙは▲数式、化学式、表等があります▼であり、そしてＲ′はアルキル基でありそしてＲは脂肪酸のアルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルケニル基である、を有するリン脂質と接触させることからなる、生物学的調製物における微生物の定着を阻止する方法。
２．前記リン脂質をＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ−セラミドと組み合わせる、請求項１に記載の方法。
３．前記リン脂質をＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ −セラミドと組み合わせる、請求項１に記載の方法。
４．生物学的調製物を、微生物を含有することが疑われる生物学的調製物と、前記生物学的調製物と前記微生物との間の結合を可能とするために十分な条件下にかつ時間の間、接触させることからなり、前記リン脂質は式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中Ｘは▲数式、化学式、表等があります▼または−Ｃ＝ＣＨ−Ｒ′であり、Ｙは▲数式、化学式、表等があります▼であり、そしてＲ′はアルキル基でありそしてＲは脂肪酸のアルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルケニル基である、を有し、そして前記リン脂質を前記生物学的調製物から分離し、これにより前記微生物を前記生物学的調製物から除去する、ことからなる、微生物を生物学的調製物から除去する方法。
５．前記リン脂質を固体支持体上に固定化する、請求項４に記載の方法。
６．前記リン脂質をＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ−セラミドと組み合わせ、そして分離の工程は前記リン脂質およびＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ β１→４Ｇｌｃ−セラミドを前記生物学的調製物から分離し、これにより前記微生物を前記生物学的調製物から除去する、ことからなる、請求項４に記載の方法。
７．リン脂質またはＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ−セラミドまたは両者を固体支持体上に固定化する、請求項６に記載の方法。
８．前記リン脂質をＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ −セラミドと組み合わせ、そして分離の工程は前記リン脂質およびＧａｌβ１→ ３ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを前記生物学的調製物から分離し、これにより前記微生物を前記生物学的調製物から除去する、ことからなる、請求項４に記載の方法。
９．リン脂質またはＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ −セラミドまたは両者を固体支持体上に固定化する、請求項８に記載の方法。
１０．製剤学的に許容されうる担体または希釈剤と、式：▲数式、化学式、表等があります▼ 式中Ｘは▲数式、化学式、表等があります▼または−Ｃ＝ＣＨ−Ｒ′であり、Ｙは▲数式、化学式、表等があります▼であり、そしてＲ′はアルキル基でありそしてＲは脂肪酸のアルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルケニル基である、を有するリン脂質との組み合わせからなり、温血動物における微生物の定着を阻止するために使用する組成物。
１１．ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ−セラミドをさらに含有する、請求項１０に記載の組成物。
１２．Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドをさらに含有する、請求項１０に記載の組成物。
１３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中Ｘは▲数式、化学式、表等があります▼または−Ｃ＝ＣＨ−Ｒ′であり、Ｙは▲数式、化学式、表等があります▼であり、そしてＲ′はアルキル基でありそしてＲは脂肪酸のアルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルケニル基である、を有するリン脂質。