JPH0655158B2

JPH0655158B2 - 螢光発生基質

Info

Publication number: JPH0655158B2
Application number: JP58219666A
Authority: JP
Inventors: パイア−・エル・カンナ; チウ・チン・チヤン; エドウイン・エフ・ウルマン
Original assignee: シバ・カンパニ−
Priority date: 1982-11-26
Filing date: 1983-11-24
Publication date: 1994-07-27
Anticipated expiration: 2009-07-27
Also published as: EP0110682B1; DE3382380D1; US4857455A; EP0110682A3; ATE66492T1; JPS59106300A; EP0110682A2; CA1338608C

Description

【発明の詳細な説明】ペルオキシダーゼは、多数の望ましい性質を有する酵素
である。それは入手容易であり、安価であり、実質的な
範囲の化学的・物理的条件に対して安定であり、そして
高い代謝回転速度（基質が酵素によつて反応を受ける速
度）を有する。ペルオキシダーゼの基質の決定のための
明らかな用途のほかに、それは組織中の決定基の部位の
局所化の診断および広範な種類の生理学的媒体の分析物
の測定において使用することができる。多くの分析物
（ａｎａｌｙｔｅ）は極めて小さい濃度でのみ存在し、
そして分析物とその同類の結合性対の構成員との間の単
一の結合事象の結果、信号の高度の増幅を必要とする。
しばしば、結合事象の信号を発する酵素の分子の数は、
測定の条件に基づいて固定され、そして改良された感度
または増大された信号レベルは、高い代謝回転速度を有
しかつ高い信号レベルを提供する基質に依存する。

基質の開発において、多くの拘束が存在する。ペルオキ
シダーゼは比較的低い特異性を有するが、酸化されうる
化合物について制限が存在する。さらに、基質または生
成物は原理的には信号を提供することができるが、低い
信号を高い信号にすることが望ましい。したがって、生
成物が測定される場合検出可能な信号への基質の寄与が
あるとしても、それはほんのわずかであるべきである。
他の考慮は、基質の溶解度および測定すべき試料中で直
前しうる物質との相互作用を包含する。追加の考慮は、
合成の容易性、安定性（貯蔵寿命および測定媒質中の両
者）、ペルオキシダーゼの活性への副生成物（あるい
は、さらには所望の生成物）の生産の影響、および検出
可能な信号を提供する生成物を測定する能力を包含す
る。

ＳａｕｎｄｅｒｓおよびＷａｔｓｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．（１９５０）４６：６２９−６３３は、ペルオ
キシダーゼの基質としてメトキシ置換アニリンを記載し
いている。ＫｅｓｔｏｎおよびＢｒａｎｄｔ．Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９６５）１１：１−５は、ペ
ルオキシダーゼとともに使用するための蛍光発生物質お
よび生成物を記載している。ＺａｉｔｓｕおよびＯｈｋ
ｕｒａ．Ｉｂｉｄ．（１９８０）１０９：１０９−１１
３は、ペルオキシダーゼを用いる蛍光測定において使用
するための種々のフェノール系化合物を記載している。
広範な種類のフェノール系化合物およびアミンは、ペル
オキシダーゼのための発色性および蛍光発生基質として
報告された。

環の活性化置換基を有する酸化を受けやすいアリール・
キャップド（ａｒｙｌ−ｃａｐｐｅｄ）蛍光発生化合物
を用いる、新規な基質の蛍光発生先駆物質が提供され
る。これらの化合物は測定条件下でペルオキシダーゼの
不存在下に安定であるが、ペルオキシダーゼおよび過酸
化水素の存在において、アリール・キャップ（ａｒｙｌ
ｃａｐ）はペルオキシダーゼにより触媒される反応に
おいて除去されて、安定な蛍光発生生成物を提供する。
とくに、ウンベリフェロンおよびヒドロキシキサンテン
の誘導体は、ある結合を介してアリール誘導体へ結合さ
れて、ペルオキシダーゼの基質を提供する。この基質
は、酸化すると、残留する蛍光物質が高い蛍光量子効率
を有する場合、アリール・キャップを除去する。

過酸化水素の存在下に蛍光発生生成物を生成する、ペル
オキシダーゼの基質として使用する、新規な化合物が提
供される。これらの化合物は、蛍光化合物上の酸化され
やすいアリール・キャップを含み、蛍光生成物の励起波
長において、キャップ生成物中に蛍光を発生しない。基
質は、アミノ−またはオキシ−蛍光化合物、これは好ま
しくはペルオキシダーゼが触媒する分解に対して安定で
ある、および異種原子へ結合してペルオキシダーゼのた
めのキャップ基質を形成する活性化された炭素環式アリ
ール基、から調製される。キャップ基質は、活性化アリ
ール基の触媒化酸化的除去および蛍光化合物の形成を受
けやすい、ペルオキシダーゼのための蛍光発生基質の役
目をする。基質を、広範な種類の基で置換して、水溶性
を増大させ、分光性、たとえば、励起・発光の波長、量
子効率およびストークスシフトを変更することができ、
あるいは問題の他の特定の性質、たとえば、蛍光発生基
質の溶解性または光および酵素安定性に影響を及ぼすこ
とができる。

蛍光発生基質は、通常、少なくとも約１５個の炭素原
子、より通常少なくとも約１６個の炭素原子および一般
に６０より少ない炭素原子、より通常約５０より少ない
炭素原子を有し、少なくとも３個の異種原子かつ約１８
個以下の異種原子、通常約１２以下の異種原子、これら
は窒素およびカルコゲン（酸素およびイオウ）、ハロゲ
ン、リンおよびホウ素から選らばれる、を有するであろ
う。

アリール・キャップの環炭素原子に結合し、原子番号７
〜８の原子を有する活性化基（オキシ、ヒドロキシおよ
びエーテルを包含する；およびアミドおよびアミノ、第
一および第二、および第三アミノを包含する）の少なく
とも１つが存在する。また、アリール・キャップへ結合
する異種原子（Ｎ，Ｏ）含有結合が存在するであろう。
こうして、アリール・キャップが酸化されると、結合は
開裂して、キャップが除去された蛍光生成物を残す。

大部分、本発明の化合物は、次式を有するであろう：１、Ｘ−Ａｒ−Ｙ−Ｆ１式中、Ｘは環状環へ結合した酸素または窒素を有する活性化基
であり、Ｘは０〜４、通常０〜３個の炭素原子をもち、
少なくとも１つのＸ基かつ約３つ以下のＸ基が存在し、Ｙはオキシ、またはカルバミルオキシであり、ここでカ
ルバミルオキシ基は−Ｎ（Ｒ）ＣＯ−であり、窒素はＦ
１へ結合しかつＲは水素、低級アルキル（１〜３個の炭
素原子）、または窒素へ炭素原子を介して結合した可溶
化基であり、通常異種原子間に２個の飽和炭素原子が存
在し、そして水可溶化基は低級アルキルまたはフェニル
へ結合していてもよく、Ｙは通常水素であり、Ａｒは活性化基、一般に１〜２個の融合環または非融合
環を有する、通常炭素環式基、とくにフェニル基であ
り、この基はペルオキシダーゼが触媒する酸化の時に、
離脱基の役目をし、Ｆ１は芳香族化合物であり、これはそれが結合する異種
原子（Ｏ，Ｎ）とともに蛍光化合物、Ｆ１−ＯＨまたは
Ｆ１−ＮＨＲまたはそれらの塩を提供し、ＦＩは少なくとも９個の炭素原子、より通常少なくとも
１０個の炭素原子かつ約３０個以下の炭素原子、通常約
２６個以下の炭素原子、および約１６個以下の異種原
子、より通常約１２個以下の異種原子、これは酸素、窒
素、イオウ、ハロゲン、ホウ素およびリンを包含する、
を有する。望ましくは、少なくとも１つかつ約３つ以下
の水可溶化基、一般に約１〜２つの水可溶化基、通常酸
性または塩基性の基、を有し、この基はＲ、アリール
（Ａｒ）基、または蛍光（Ｆ１）基へ結合されていても
よい。

水可溶化基は、大部分、サルフェート、スルホネート、
スルフィネート、アミン類、アミデート類、アンモニウ
ム、ホスフェート、ホスホネート、ポレート、ボロネー
ト、カルボキシアミド、カルボキシレート、ヒドロキシ
アルキル基、たとえば、糖残基などであろう。水可溶化
基は、環炭素原子へ直接結合することができ、あるいは
結合基、一般に１〜４個の原子、通常炭素原子の結合
基、通常脂肪族基により結合されていてもよい。あるい
は、水可溶化基は、芳香族環上に官能的に存在する異種
原子へ結合していてもよく、アルーリ環の活性化または
蛍光発生基の蛍光性に参加する異種原子を含むことがで
きる。

大部分は、本発明の前駆物質の組成物は、次ぎの式を有
するであろう：式中、Ｘ′はオキシまたはアミノであり、置換されたオキシま
たはアミノを包含し、ここでオキシまたはアミノは置換
されていないか、あるいは水素原子の一部分またはすべ
てが１〜４個、通常１〜３個の炭素原子の基、通常脂肪
族不飽和を含まずかつ０〜１／基の置換基、通常水可溶
化基、前述の基からなる、ならびにヒドロキシルおよび
アミノを有する脂肪族基で置換されることができ、ここ
で飽和脂肪族基の炭素原子へ結合した異種原子は少なく
とも２個の炭素原子により分離されており、ｎは０〜６であり、Ｄは１〜３個の炭素原子のアルキル、０〜６個の炭素原
子および１〜６個の異種原子、すなわち、酸素、窒素、
イオウおよびリン、を有する極性基、またはポリオー
ル、これはモノマー（５〜６個の炭素原子）およびポリ
マーのポリオール、たとえば、モノーおよびポリーサッ
カリド、を包含する、であり、そしてＡｒ、Ｆ１または
Ｒへ結合していて、とくに水溶性を提供し、Ｘ′の少なくとも１つは２または４個の炭素原子により
Ｙ′から分離されおり（オルトまたはパラ置換）、Ｙ′はＹと同一であり、ｍは１〜２であり、Ｆ１′で表示する基は、Ｙ′へ環炭素原子において結合
するベンゼンを有する基であり、そしてＹ′の異種原子
と一緒になって蛍光化合物を形成し、この化合物はベン
ンゼン環へ結合するとき、Ｆ１′−Ｙ′の励起波長にお
いて蛍光性に非常に劣る。こうして、蛍光化合物はキャ
ップド・フェノール系またはアニリノ基を有する。環上
の有効炭素原子はいずれも、ハライドを含む置換基およ
び前述の置換基、ならびにアルキル基およびアルコキシ
基、一般に１〜６個の炭素原子を有する、より通常１〜
３個の炭素原子を有する、で置換されることができ、前
記アルキル基およびアルコキシ基は前述の置換基のいず
れかで、とくに水可溶化官能基で置換されることができ
る。

蛍光発生化合物に使用できる化合物は、クロメン、キサ
ンテンなどのアミノまたはヒドロキシル置換誘導体を包
含する。とくに興味あるものは、クマリンおよびキサン
テンの化合物である。

大部分は、クマリン基を有する本発明の化合物は、次ぎ
の式を有するであろう：式中、Ｘ′は上に定義したとおりであり、そして環炭素原子の
いずれも、ならびにＸ′、ここでＸ′はヒドロキシルお
よびアミノである、は前述の置換基のいずれによっても
置換されることができ、適当ならば、異種原子は分離さ
れて安定な化合物を提供すること、および置換基は前駆
化合物がペルオキシダーゼの基質であることを防止する
であろうこと、が理解される。すなわち、異種原子が飽
和炭素原子へ結合されているとき、同一の炭素原子は
Ｘ′へ結合されていないであろう、Ｗは水素、低級アルキル（１〜３個の炭素原子）カルボ
キシ、カルボキシアミドまたはＮ−置換カルボキシアミ
ドであり、ｍは１〜２である。

置換基を前述のように変更して水溶性を増大することが
できることを、理解すべきである。

化合物の第２群は、キサンテン類に基づき、そして大部
分は、次ぎの式を有するであろう、蛍光物質を包含す
る：式中、Ｚは式をもち、式中、Ｘ′は上の定義したとおりであり、それらの少なくとも
１つは２または４個の炭素原子により酸素から分離され
ており、ｍは上に定義したとおりであり、Ｚ′はＺと同一であるかあるいはオキシ、たとえば、ヒ
ドロキシまたは低級アルコキシであり、そして環炭素原子のいずれも前述の置換基のいずれによっても
置換されることができる。

一般に、活性化されたアリール基は、水溶性を増大し、
基質として作用するとき前記基の化学的性質を変更する
ことなどを目的として、環炭素原子へ結合した、あるい
はＸへ結合し、Ｘの水素を置換する、０〜３個、通常０
〜２個の置換基を有するであろう。問題の基は、１〜３
個、通常１〜２個の炭素原子の低級アルキル基、たとえ
ば、メチルおよびエチル、２〜４個、通常２〜３個の炭
素原子のカルボキシアルキル、たとえば、カルボキシメ
チルおよびカルボキシエチル、１〜３個、通常１〜２個
の炭素原子のヒドロキシアルキルまたはアミノアルキ
ル、たとえば、ヒドロキシメチル、アミノエチル、およ
びアミノメチル、またはアルキルスルホン酸を包含す
る。

分子の蛍光発生部分上に基は、より広く変化させて、蛍
光化合物の水溶性、蛍光発生の性質などを変更させるこ
とができる。ある数の例示的蛍光発生誘導体は、米国特
許第４，３１８，８４６号、および「新規なアルキル置
換蛍光化合物および複合体」と題する米国特許出願第７
３，１５８号、１９７９年９月７日出願、（米国特許第
４，３５１，７６０号として特許された）、その開示を
引用によってここに加える、に記載されている。

大部分は、これらの化合物は、２〜６個、通常２〜４個
の置換基を有し、これらの置換基の例は１〜３個、通常
１〜２個の炭素原子のアルキル、１〜３個、通常１〜２
個の炭素原子のアルコキシ、カルボキシおよびハロ、と
くに原子番号９〜１７のハロであり、前記アルキルはま
たカルボキシで置換されることができる。

カルボキシ基は、それ以上の変更の部位、とくに水溶性
を付与するための追加の官能性のための部位として使用
することができる。こうして、カルボキシ、イオウまた
はリンの酸基で置換されかつ１〜４個、通常１〜３個の
炭素原子のアルキル基を有するエステルおよびアミドを
製造することができ、カルボキシ基は２〜４個、通常２
〜３個の炭素原子を有する。

フェノール系基をキャップするために使用できるアリー
ル基は、例示すると次ぎのとおりである：ｐ−アミノフェニル、ｏ−アミノフェニル、ｐ−トルイ
ジニル、ｏ−トルイジニル、４−アミノ−３，５−ジメ
チルフェニル−１、４−アミノ−２−カルボキシフェニ
ル−１、４−アミノ−２−（２′−カルボキシメチル）
−１−フェニル、２，４−ジメトキシフェニル−１、
３，４−ジアミノフェニル−１、３−メトキシ−４−ア
ミノフェニル−１、４−アミノ−３，５−ジメトキシフ
ェニル−１、４−アミノ−７−カルボキシナフチル−
１、ｐ−ヒドロキシフェニル、３，５−ジエチル−４−
ヒドロキシフェニル−１、３−カルボキシメトキシ−４
−ヒドロキシフェニル−１、４−ヒドロキシアニリノ、
２−ヒドロキシ−５−（２′−ジメチルアミノエチル）
−フェニル−１、４−ヒドロキシ−３−（２−スルフォ
ナトエトキシ）−フェニル−１および２−ヒドロキシ−
４−ホスファトメチルフェニル−１。

蛍光化合物について、種々の置換基をもつ、広範な種類
の２−オキソ−７−ヒドロキシおよび７−アミノクマリ
ン類を使用できる。次ぎはアリール基へフェノール系ヒ
ドロキシル基において結合することができるクマリン基
の例である：３−カルボキシ−２−オキソ−７−クロメニルオキシ、
３−（２′−ホスホナトエチル）−２−オキソ−７−ク
ロメニルオキシ、Ｎ−カルボキシメチル３−カルボキシ
アミド−２−オキソ−７−クロメニルオキシ、Ｎ−ホス
ホナトメチル３−カルボキシアミド−２−オキソ−７−
クロメニルオキシ、５（２′−アミノエチル）−２−オ
キソ−７−クロメニルオキシ、および５−カルボキシメ
トキシメチル−２−オキソ−７−クロメニルオキシ、Ｎ
−（２−エチルスルホン酸）−２−オキソ−７−クロメ
ニルアミノ。

ウンベリフェロン化合物は、米国特許第４，２３０，７
９７号中に例示されている。

本発明の化合物は、従来法に従ってアニリノまたはフェ
ノール系蛍光化合物をキャップすることによって、製造
することができる。とくにオルトーまたはパラーニトロ
アリールハライドを蛍光フェノキシドと一緒に使用する
ことができ、ここでハロゲンは置換されてエーテル結合
が形成される。次いで、ニトロ基を従来法に従ってアミ
ノ基に還元することができる。必要に応じて、アミノ基
を次いで置換することができる。ヒドロキシ化合物につ
いて、種々の方法、たとえば、γハロシクロヘキサノン
類との縮合、引き続く脱水素、あるいはベンジン中間体
を用いることなどにより、フェノール系蛍光体への結合
を実施することができる。カルバモイル基は、イソシア
ネート類をフェノール系基とともの使用して得ることが
できる。

上に示したように、本発明の化合物は過酸化物、ペルオ
キシダーゼの測定に、さらに詳しくは標識としてペルオ
キシダーゼを用いる診断測定に使用される。診断の目的
で酵素の使用を記載する多数の特許が存在し、それらの
多くは標識としてペルオキシダーゼの使用を特に記載し
ている。米国特許を例示すると、次ぎのとおりである：
３，８１７，８３７、４，２３３，４０２、４，２７
５，１４９および４，２９９，９１６、これらは単に広
範な特許の例示である。

特に興味あるものは、ペルオキシダーゼ酵素を特異的結
合対の構成員と結合（コンジユゲート）させるアツセイ
であり、この構成員は受容体または配位子でる。配位子
はそのため受容体が存在する問題の分析物であり、一方
受容体は通常抗体であるか、あるいは特定の配位子につ
いて高い特異性をもつ自然に産出する化合物である。結
合物（コンジユゲート）は種々の方法で使用することが
でき、とくにそれが測定媒体中の分析物の量に比例して
ある表面に結合するような場合に使用することができ
る。特定の原案（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に依存して、ペル
オキシダーゼが結合するようになった後、それを試料か
ら除去し、別の溶液中に入れることができ、この溶液は
現像剤溶液と呼ばれ、本発明に従って蛍光発生前駆物質
の基質を含有する。

あるいは、過酸化水素をその場で形成するとき、試薬と
して使用できる組成物として、蛍光発生前駆物質とペル
オキシダーゼ結合物を組み合わせることができるので、
前駆物質は試料の存在下に安定な蛍光物質に酸化され
る。診断の目的に、本発明の蛍光発生前駆物質を個々の
試薬として、あるいは測定系の他の構成員、とくにペル
オキシダーゼ結合物と組み合わせて提供されることがで
きる。

本発明の組成物の使用の例は、オキシダーゼ、たとえ
ば、グルコースオキシダーゼ、が結合される吸水性の担
体であり、この担体は、グルコースが供給されたとき、
担体の表面において過酸化水素源を提供する。吸水性担
体に配位子または受容体も結合され、これらの配位子ま
たは受容体は通常分析物に対して類似体である。測定
は、試料、ペルオキシダーゼ結合物および本発明による
蛍光発生前駆物質を含有する測定媒質を、吸収性担体と
接触させることによって実施される。蛍光発生生成物は
吸水性担体の表面に生成され、かつ担体へ結合するの
で、担体からの蛍光は分析物の存在および量の指標とし
て測定される。本発明の１つの実施態様は、米国特許第
４，２９９，９１６号に記載されている。

別の実施態様は、免疫クロマトグラフであり、これは米
国特許第４，１６８，１４６号に記載されている。この
場合において、免疫クロマトグラフは特異的結合対の構
成員と過酸化水素源、たとえば、グルコースオキシダー
ゼとの組み合わせであろう。分析物をクロマトグラフィ
ーに付した後、ペルオキシダーゼ結合物、本発明による
蛍光発生前駆物質、およびグルコース、たとえば、なら
びに補助的試薬、たとえば、緩衝剤、安定剤などを含有
する溶液を免疫クロマトグラフと接触させ、こうしてペ
ルオキシダーゼ結合物が結合する場合蛍光発生信号の生
成により、分析物の存在または不存在を観測することが
できるであろう。

次ぎの実施例により、本発明をさらに説明する。

実験実施例Ｉ３−カルボキシ−７−（４′−アミノフェノキシ）クマ
リンの製造反応フラスコに、３００mlのトルエン中の１０．６８ｇ
（４５．６ミリモル）の３−カルボエトキシウンベリフ
ェロンを導入し、そして３０mlの蒸留物を共沸的に除去
しながら、この混合物を１時間還流加熱し、次いで冷却
した。次いで冷却した混合物に１．９２ｇの水素化ナト
リウムを加え、混合物を０．５時間還流加熱し、その間
溶液をディー・スターク分離器で除去した。残留物を一
夜真空乾燥した。

ほぼ１５０mlのＤＭＦ中に懸濁させた約５ｇの上の生成
物に、３．８ｇの無水炭酸カリウムを加えた。この混合
物を加熱し、その間約３０mlのＤＭＦ中の２．７２ｇの
ｐ−フルオロニトロベンゼンをゆっくり加えた。２時間
還流付近に加熱した後、ｔｌｃにより反応を検査し、反
応は不完全であった。次いで、さらに２０mlのＤＭＦ中
の１．７６ｇのｐ−フルオロニトロベンゼンを加え、こ
の反応を一夜進行させた。

冷却後、この混合物を氷上に注ぎ、沈殿を濾過により集
め、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。処理すると、５．３
ｇの黄色固体が得られた。この固体の主要部分を、溶媒
としてＣＨ₂Ｃｌ₂を用いて準備した。４．２cm×３４cm
（２００ｇのシカゲル、６０〜２００メッシュ）のカラ
ムで精製した。ほぼ３．５ｇの粗製物質をＣＨ₂Ｃｌ₂溶
液としてカラム上へ適用し、次いで１００mlのＣＨ₂Ｃ
ｌ₂を加え、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂中の５％の酢酸エチルで
溶離した。初めの５０mlのフラクションを集めたが、次
いで１５mlのフラクションを集め、そして所望生成物を
含有するフラクションをｔｌｃにより同定した。フラク
ションを集めて、約１．２５ｇのカルボエトキシ−７−
（４′−ニトロフェノキシ）クマリン、融点１６３℃、
が得られた。

３mlの５０％の水性エタノール中に、３８mgの上の生成
物および５２mgの塩化第一鉄を加えた。この混合物を徐
々に加熱しながら急速にかきまぜ、その間１mlの５０％
の水性エタノール中の５μｌの濃ＨＣ１の溶液をゆっく
り加えた。次いで、この混合物を２時間還流させた。冷
却後、反応混合物を数mlの水で希釈し、エーテルで抽出
した。合わせた抽出液を無水流酸ナトリウムで乾燥し、
溶媒を蒸発させると、１８mgの３−カルボエトキシ−７
−（４′−アミノフェノキシ）クマリン、融点１３６〜
１３８℃、が得られた。ＮＭＲおよびｔｌｃは所望生成
物と一致した。

上のアミノエステルをジオキサン中に溶解し、等体積の
冷２０％の硫酸を加えた。次いで、混合物を一夜還流加
熱した。冷却後、pHを水性水酸化ナトリウムでpH５に調
整し、これにより沈殿が形成し、これを濾過により集め
た。沈殿を大きい体積の沸騰水中に溶解し、急速に熱時
濾過し、冷却すると、表題化合物が沈殿した。融点２１
３〜２１４℃（分解）。

中和した媒質を酢酸エチルまたはジエチルエーテルで抽
出し、生ずる抽出液を精製することにより、増大した収
率を得ることができた。

実施例II ３−カルボキシ−７−（３′−メチル−４′−アミノフ
ェノキシ）クマリンの製造約１０mlの乾燥ＤＭＦ中に、３３０mgの３−カルボエト
キシウンベリフェロンのナトリウム塩を懸濁させ、この
混合物を約１３０℃に加熱し、このとき塩の大部分は溶
解した。ほぼ３００〜４００μｌの３−メチル−４−ニ
トロフルオロベンゼンをゆっくり滴下し（２〜３分／
滴）、その間窒素雰囲気を維持し、温度をゆっくり５時
間にわたり約１７０℃に上げた。次いで反応を停止し、
溶液えを冷却し、氷水を加え、次いでジエチルエーテル
で抽出した。合わせたエーテル抽出液を飽和重炭酸ナト
リウム、プラインで２回洗浄し、次いで無水流酸ナトリ
ウムで乾燥した。溶媒を蒸発すると、個体の黄色物質が
残り、これを分離用ｔｌｃにより精製して、ほぼ１４０
mgの純粋なほぼ白色の化合物、融点１５８℃、が得られ
た。

２５mlのの５０％の水性エタノール中に、１５５mgの上
の生成物および１８０mgの塩化第一鉄および１５μｌの
濃ＨＣ１を加え、これを添加前水性エタノールで希釈し
た。この混合物を３時間加熱還流させ、次いで濾過し、
ＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。抽出液を洗浄し、乾燥し、蒸発
乾固し、そして生成物を分離用ｔｌｃで精製した。芳香
族アミノ化合物は、精製の間分解するように思われた。

１２mlの２０％（ｖ／ｖ）の水性硫酸とジオキサンとの
１：１混合物中に、５０mgの上の生成物を懸濁させ、こ
の混合物を一夜還流加熱した。冷却後、溶液を１Ｎ水酸
化ナトリウムでpH約５に中和した。形成した沈殿を濾過
により集め、約８０mlの水中に懸濁させた。この混合物
を加熱沸騰させ、熱時濾過し、濾液を冷却し、沈殿した
生成物を濾過により単離すると、約１８mgを乾燥後に得
られた。ｔｌｃは、微量の３−カルボキシウンベリフェ
ロンの汚染が存在しうることを、示した。融点２０４〜
２０６℃８（分解）。

実施例III ３−カルボキシ−７−（Ｎ−カルボキシメチル−４′−
アミノフェノキシ）クマリンの製造約５mlの乾燥ＤＭＦ中に、窒素の雰囲気中で２１８mg
（０．６７ミリモル）の３−カルボエトキシフェノキ
シ）クマリンを溶解した。少量の無水炭酸ナトリウムを
加えた後、４２１mgのヨード酢酸エチルを室温において
非常にゆっくり滴下し、次いでこの混合物を室温におい
て数時間かきまぜた。ｔｌｃが少量の生成物を示したの
で、反応混合物を約４０℃に１時間加熱し、次いで室温
に冷却し、かきまぜを２日間続けた。混合物を水上に注
ぎ、ＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出することにより、反応を仕上げ
た。合わせたＣＨ₂Ｃｌ₂抽出液を飽和水性重炭酸ナトリ
ウム、ブラインで洗浄し、次いで無水流酸ナトリウムで
乾燥した。溶媒を除去することにより、ほぼ２５０mgの
オレンジ色の固体残留物が得られた。融点１１８〜１１
９℃。

５mlのジオキサン中に、２１８mgの上の生成物を溶解
し、次いで等体積の冷１０％（ｖ／ｖ）の水性硫酸を加
えた。５時間加熱還流せた後、反応混合物をエーテルの
抽出により仕上げ、鋭い界面を得るとき多少の困難に直
面した。合わせたエーテル抽出液を飽和水性重炭酸ナト
リウムで分配した。水層を分離し、４ＮＨＣｌで酸性
化し、次いでエーテルで抽出した。合わせたエーテル抽
出液を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を真空乾燥する
と、黄色固体が得られた。融点１６５℃（分解、１５０
℃でオレンジ−赤に変わる）。生成物はＨＲＰ基質とし
て有用であることがわかった。

実施例IV ３−カルボキシ−７−（３′−メチル−４′−アミノ−
４′−アミノフェノキシ）クマリンのタウリン誘導体の
製造１．５mlの乾燥ＤＭＦ中に、１０２mg（０．３３ミリモ
ル）の実施例IIの生成物、３８mg（０．３３ミリモル）
のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび７８mgのジシク
ロヘキシルカーボジイミドを加え、この混合物を窒素の
もとに約６時間かきまぜ、次いでガラスウールで濾過し
た。

タウリン（８０mg）を１mlの上流水中に溶解し、pHを
０．１ＮＮａＯＨで約７．５に調整した。次いで、こ
の溶液を徐々に上の混合物に加えた。くもりおよび多少
の沈殿を、ＤＭＦの添加により実質的に除去した。混合
物を熱水浴（約５０℃）中に浸漬し、一夜かきまぜ、そ
の間温度は室温に低下した。

沈殿をガラスウールのプラグを通す濾過により分離し、
濾液を蒸発乾固し、残留物をＤＭＦ中に懸濁させ、濾液
を再蒸発乾固させると、褐色残留物が残った。分離用液
体クロマトグラフィーを、メタノール：塩化メチレン：
水（１０：６０：１）とともに使用し、生成物をＤＭＦ
および水の溶液中に加えた。基線付近の黄色帯をかき取
り、ＤＭＦで溶離した。生成物を乾燥した。大きいバッ
クグラウンドは蛍光汚染物の存在を示したので、生成物
をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１０カラム
（１．１×１１cm）の使用によりさらに精製し、０．５
mlの水中の５mgの生成物の溶液をカラムに加え、生成物
を水で溶離した。フラクション（１ml）を集め、蛍光ス
ペクトルを測定した。低い蛍光を有するフラクションを
集め、プールした。この手順を反復して、バックグラウ
ンドの蛍光を減少させた。

生成物は、上の化合物を水溶液中でＨＲＰおよびＨ₂Ｏ₂
と結合し、そして蛍光発生生成物の発生を観測すること
により、ＨＲＰ基質として有用であることを示した。

実施例Ｖ３−カルボキシ−７−（３′−メチル−４′−アミノフ
ェノキシ）クマリンのグルコサミン誘導体の製造Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを実施例IVに記載するよ
うにして製造した。２−アミノ−２−デオキシグルコー
ス塩酸塩（３９mg、０．１８１ミリモル）を少量の水に
溶解し、pHを０．１Ｎの水酸化ナトリウムで７．５〜
７．６にした。窒素雰囲気のもとで、上のエステル（５
１．９mgの酸、０．１６７ミリモル）のＤＭＦ溶液をか
きまぜながら加え、かきまぜを一夜続けた。前述の溶媒
系を用いて分離溶液体クロマトグラフィー（ＰＬＫＣ
１８Ｆ線状Ｋ逆相板）により、精製を実施した。中央の
Ｒｆ成分をかき取り、メタノールで溶離し、少量のバイ
ンダーを加えた。

試料を焼結ガラスフィルターで濾過して透明溶液を形成
し、溶媒を蒸発させ、残留物を５mlのＤＭＦ中に溶解し
た。次いでこの溶液を蒸発乾固し、１mlのＤＭＦ中に溶
解し、次いで４mlの緩衝液で希釈し、測定を前述のよう
に１００μｌの基質を用いて実施した。生成物はＨＲＰ
基質として有用であることがわかった。

実施例VI ３−カルボキシ−７−（３′−メチル−４′−アミノ−
５′−ブロモフェノキシ）クマリンの製造フラスコに、５９mg（０．１７５ミリモル）の３−カル
ボキシ−７−（３′−メチル−４′−アミノフェノキ
シ）クマリン（実施例II参照）、３４mg（０．１９ミリ
モル）のＮ−ブロモスクシンイミドおよび１．４５mlの
乾燥ＤＭＦを導入し、フラスコを隔壁で密閉し、窒素の
流れを維持した。溶液は暗色のパープルに変わり、この
混合物を室温で一夜かきまぜた。反応混合物を氷水上に
注ぎ、この溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出し、合わせた抽出液
を飽和重炭酸ナトリウム、ブラインで洗浄し、次いで無
水流酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去し、残留物を
ｔｌｃにより精製した。

臭素化生成物（１０〜１５mg）を約１mlのジオキサン中
に溶解し、０．５mlの２０％の硫酸を加え、この混合物
を加熱し、一夜環流した。冷却後、この溶液を沈殿が形
成するまで１Ｎの水酸化ナトリウムで中和し、沈殿を沈
降させ、この混合物を濾過した。固体の沈殿を熱水中に
溶解し、これを沸騰加熱し、次いで濾過した。濾液を冷
却し、次いで約４０mlに真空濃縮し、沈殿を濾過により
集めた。ＤＭＦ中に溶解し、濾過した後、生ずる黄色溶
液を蒸発させると、約１０〜１１mgの生成物が残った。
前述のように測定することにより、生成物は活性なＨＲ
Ｐ基質であることが示された。

実施例VII セイヨウワサビのペルオキシダーゼ抗（ポリリボースホ
スフェート）抗体の製造２０mlの蒸留水中のＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、１５０mg）
に、４mlの０．１モルのＮａＩＯ₄を加え、この混合物
を室温において２０分間かきまぜ、次いで２．４mlの１
モルのグリセロールを加えた。室温において３０分間か
きまぜた後、この反応混合物を３×５００mlの２ミリモ
ルの酢酸ナトリウム、pH４．５、で透析した。

抗ＰＲＰ溶液（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ，ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ．Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔｏｆＨｅａｌｔｈ．ＮｅｗＹｏｒｋＳｔａ
ｔｅ，から入手できる、Ｍ−３ロット２８Ａ）を、
９mlに希釈し、３×５００mlの１０ミリモルのＮａ₂Ｃ
Ｏ₃、pH９．５、で透析した。透析後、１：５０に希釈
して、ＯＤ₂₈₀＝０．６５６（約２３．４３mg/ml）を得
た。

２１．４６ml（６７．７３mg）の活性化されたＨＲＰを
４．６７ml（１０９．４mg）の抗ＰＲＰに加え、この混
合物を１０ミリモルのＮａ₂ＣＯ₃、pH９．６、で２９．
９mlに希釈し、pHを０．１ＮのＮａＯＨで９．６に調整
した。室温において２時間かきまぜた後、この混合物を
氷浴中で冷却し、１．５ml（４mg/ml）のＮａＢＨ₄を加
え、その間反応混合物を光りから保護しかつ０℃におい
て２時間かきまぜた。次いで、この混合物を１のＰＢ
Ｓ緩衝液（１０ミリモルのＰＯ₄、０．１５モルのＮａ
Ｃｌ、pH７．２）に対して透析した。

次いで、この複合体を、コロジオン装置によりＢｉｏｇ
ｅｌＡＳＭカラム（０．５×９０ml）のクロマトグラ
フィーに付し、５mlのフラクションを集め、０．０１％
のＮａＮ₃を含有するＰＢＳで溶離した。フラクション
３９〜４８をプールした。Ａ₂₈₀＝０．６１９；Ａ₄₀₃＝
０．３３２。

本発明の蛍光発生前駆物質の実用性を立証するために、
次ぎの典型的な測定を実施した。マイクロタイタープレ
ートのウエルを、アミン変性グルコースオキシダーゼ
（１：１９０の希釈、７．６mg/ml原溶液）およびポリ
リボースホスフェートに対する抗体（６０ミリモルの炭
酸塩緩衝液、pH９．６、中の１：２０００希釈）の溶液
（２５０μｌ／くぼみ）でコーティングした。１夜静置
後、０．０５％のツイーン２０（ｗ／ｖ）を含有するＰ
ＢＳでウエルを洗浄した。

原溶液を実施例IIの蛍光発生基質から調製した。３．３
mg／１０mlのＤＭＦ溶液（１．２２ミリモル）を、使用
前にＰＢＳ緩衝液で１：１０に希釈した。５００μｌの
前記原溶液、６９４μｌの１．８モルのグルコース、お
よび４００μｌの原カタラーゼ溶液を含有する基質混合
物を調製し、そして体積をＰＢＳ緩衝液で２mlにした。
カタラーゼ（Ｃ−Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳ pH７．２中で
透析することにより、原カタラーゼ溶液（３．１〜４mg
/ml）を調製した。

次いで、次ぎの原案を測定に用いた。アミノグルコース
オキシダーゼ（米国特許出願第３９８，５０５号、１９
８２年７月１５日出願：および欧州特許出願第８３．３
０４０９４．２号、１９８３年７月１４日出願、カナダ
国特許出願第４３２４４６号、１９８３年７月１４日出
願、および特願昭５８−１２７０６９号、１９８３年７
月１４日出願、参照）および抗ＰＲＰをコーティングし
た各マイクロタイタープレートのウエルの中に、１００
μｌの５０ng/mlのＰＲＰまたは１００μｌのＰＢＳ緩
衝液（pH７．２）を加え、この混合物を１時間室温で保
温した。この時間の終りにおいて、５０μｌのＨＲＰ−
抗ＰＲＰ複合体を加え、次いでさら１時間保温した。こ
の時間の終りにおいて、１００μｌの基質混合物を加
え、次いで振盪しながら３７℃において１０分間保温
し、その後２００μｌの保温混合物を１．８mlの０．１
モルのリン酸塩緩衝液（pH８．０）で希釈し、蛍光を読
取った。

下表は、ＰＲＰの存在および不存在において、ＨＲＰ−
抗ＰＲＰ複合体の濃度を変化したときの結果を示す。

次ぎの測定にいおいて、実施例１の蛍光発生前駆物質を
使用した。この試験により、実施例１の化合物がＨＲＰ
の基質であることが証明された。実施例１の発色化合
物、過酸化水素、セイヨウワサビのペルオキシダーゼお
よび緩衝液（０．１モルのリン酸塩、pH８．０）からな
る測定溶液を調製し、そしてこの溶液の蛍光の変化を６
０秒の間隔で測定した。加えた基質溶液は緩衝液中の
３．９mg／１００mlの濃度であり、過酸化物は９．８×
１０^-4モルであり、ＨＲＰ溶液は０．５mgＢＳＡ／mlを
含有する６．６ng/mlであり、そして緩衝液は０．１モ
ルのリン酸塩、pHであった。下表に結果を示す。

上の結果から明らかなように、主題の組成物はＨＲＰの
ための効率よい基質である。蛍光発生前駆物質は蛍光発
生生成物に急速に転化される。アリール・キャップから
生ずる生成物は、蛍光発生生成物の蛍光を妨害せず、し
かも酵素反応を阻害しない。さらに、セイヨウワサビの
ペルオキシダーゼが高い活性を有する適当なpHにおい
て、蛍光発生生成物は安定であり、かつ高い量子効率を
有する。こうして、主題の蛍光発生基質は不均質または
均質のいずれにおいても、問題の広範な種類の分析物の
蛍光測定を実施する、便利なかつ簡単な方法を提供す
る。

理解を明瞭とする目的で、例示および実施例により、本
発明を詳述してきたが、特許請求の範囲の範囲内である
種の変化および変更を行なうことができることは、明ら
かであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/535 8310−2Ｊ (56)参考文献ＩｎｄｉａｎＪＣｈｅｍ，12 （５），Ｐ．450−451，1974

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ペルオキシダーゼの基質から生成され且つ
蛍光測定信号を発生する生成物の量を測定することによ
り、ペルオキシダーゼの触媒の活性を決定する方法にお
いて、蛍光発生基質として、アリール・キャップド・アリール
蛍光化合物から成るジアリール有機化合物を使用し、前記アリール蛍光化合物は環炭素原子へ結合した窒素ま
たは酸素をもつ結合基を有し、そして前記ジアリール有
機化合物は、前記キャップとして炭素環式アリール基が
結合したとき、前記アリール蛍光化合物の励起波長にお
いて非蛍光性であり、前記炭素環式アリール基のキャッ
プは、前記結合基へ結合した環炭素原子から、２または
４個の環炭素原子によって、分離された環炭素原子上に
オキシまたはアミノ含有置換基を有するものであり、前記炭素環式アリール基をペルオキシダーゼの触媒作用
で除去して前記アリール蛍光化合物を生成する、ことを特徴とする方法。
【請求項２】前記炭素環式アリール基がヒドロキシフェ
ニルである、特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】前記炭素環式アリール基がアミノフェニル
である、特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】前記基がパラ位置に存在する、特許請求の
範囲第２または３項記載の方法。
【請求項５】標識としてペルオキシダーゼを使用する試
料中における分析物の存在の測定方法であつて、前記ペルオキシダーゼが受容体または配位子に結合して
おり、前記分析物がその分析物と前記ペルオキシダーゼ
に結合した受容体または配位子からなる特異的結合対の
１員であり、そして前記ペルオキシダーゼに結合した受容体または配位子、
前記試料、過酸化水素源および検出可能な信号を発生す
る生成物を生じるペルオキシダーゼの基質を組み合わせ
る工程、ならびに前記試料中における分析物の量に関係する生成された生
成物の量を測定する工程を含んでなる方法において、蛍光発生基質として、アリール・キャップド・アリール
蛍光化合物から成るジアリール有機化合物を使用し、前
記アリール蛍光化合物は環炭素原子へ結合した窒素また
は酸素をもつ結合基を有し、そして前記ジアリール有機
化合物は、前記キャップとして炭素環式アリール基が結
合したとき、前記蛍光化合物の励起波長において非蛍光
性であり、前記炭素環式アリール基のキャップは、前記
結合基へ結合した環炭素原子から、２または４個の環炭
素原子によって、分離された環炭素原子上のオキシまた
はアミノ含有置換基を有し、前記炭素環式アリール基を
ペルオキシダーゼの触媒作用で除去して前記アリール蛍
光化合物を生成する、ことを特徴とする方法。
【請求項６】前記過酸化水素源がオキシダーゼと前記オ
キシダーゼの基質との組み合わせである、特許請求の範
囲第５項記載の方法。
【請求項７】前記炭素環式アリール基がヒドロキシアリ
ールである、特許請求の範囲第５または６項記載の方
法。
【請求項８】前記炭素環式アリール基がアミノアリール
である、特許請求の範囲第５または６項記載の方法。
【請求項９】前記炭素環式アリール基がフェニルであ
る、特許請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項１０】式Ｘ−Ａｒ−Ｙ−Ｆｌ式中、Ｘはオキシまたはアミノ含有置換基であり、少なくとも１つのＸが存在し、Ａｒは１〜２個の環をもつ炭素環式アリール基であり、Ｙはオキシ（−Ｏ−）または窒素原子が基Ｆｌに結合す
るカルバモイルオキシ（−ＮＲ−ＣＯ−、ここでＲは水
素、低級アルキルまたは窒素へ炭素原子を介して結合し
た可溶化基である）であり、そしてＦｌはＹのＯまたはＮと一緒になつて蛍光性を示す芳香
族化合物残基である、の化合物。
【請求項１１】式式中、Ｘ′はオキシまたはアミノ含有置換基であり、Ｆｌ′は７−ヒドロキシクロメノンおよび３，６−ジヒ
ドロキシキサンテン類から成る群より選ばれたフェノー
ル系蛍光化合物であり、ｍは１または２であり、ｎは０〜６であり、そしてＤは１〜３個の炭素原子のアルキルであるかまたは水溶
性を増大しかつ０〜６個の炭素原子と１〜６個の異種原
子を有する極性基である、の特許請求の範囲第１０項記載の化合物。
【請求項１２】Ｘがパラ位置に存在する、特許請求の範
囲第１０項記載の化合物。
【請求項１３】Ｘがヒドロキシである、特許請求の範囲
第１０項記載の化合物。
【請求項１４】Ｘがアミノである、特許請求の範囲第１
０項記載の化合物。
【請求項１５】Ｆｌ′が９−フェニル置換３，６−ジヒ
ドロキシキサンテンである、特許請求の範囲第１１項記
載の化合物。
【請求項１６】Ｆｌ′が７−ヒドロキシクロメノンであ
る、特許請求の範囲第１１項記載の化合物。
【請求項１７】式式中、Ｘ′はヒドロキシまたはアミノ含有置換基であり、そし
て少なくとも１つのＸ′は式中に示されている酸素から
２または４個の環員により分離されており、ｍは１または２であり、そしてＷは水素、カルボキシ、カルボキシアミドまたはＮ−置
換カルボキシアミドであり、Ｘ′または環炭素原子は１
〜３個の炭素原子のアルキル、１〜３個の炭素原子のア
ルコキシ、およびカルボキシから成る群より選ばれた構
成員で置換されることができ、前記カルボキシはさらに
置換されて、１〜４個の炭素原子の酸性基置換アルカノ
ールまたはアルキルアミンのエステルまたはアミドを形
成することができる、の特許請求の範囲第１０項記載の化合物。
【請求項１８】式式中、Ｚは式であり、ここでＸ′はオキシまたはアミノ含有置換基で
あり、そして２または４個の炭素原子により該酸素から
分離されており、Ｚ′はＺと同一であるかあるいはオキシであり、そしてＸ′または環炭素原子は、１〜３個の炭素原子のアルキ
ル、１〜３個の炭素原子のアルコキシ、およびカルボキ
シから成る群より選ばれた構成員で置換されることがで
き、前記カルボキシはさらに置換されて、１〜４個の炭
素原子の酸性基置換アルカノールまたはアルキルアミン
のエステルまたはアミドを形成することができる、の特許請求の範囲第１０項記載の化合物。
【請求項１９】３−カルボキシ−７−（３′−アミノフ
ェノキシ）クマリンである特許請求の範囲第１０項記載
の化合物。
【請求項２０】３−カルボキシ−７−（３′−メチル−
４′−アミノフェノキシ）クマリンである特許請求の範
囲第１０項記載の化合物。
【請求項２１】３−カルボキシ−７−（Ｎ−カルボキシ
メチル−４′−アミノフェノキシ）クマリンである特許
請求の範囲第１０項記載の化合物。
【請求項２２】式Ｘ−Ａｒ−Ｙ−Ｆｌ式中、Ｘはオキシまたはアミノ含有置換基であり、少なくとも
１つのＸが存在し、Ａｒは１〜２個の環をもつ炭素環式アリール基であり、Ｙはオキシ（−Ｏ−）または窒素原子が基Ｆｌに結合す
るカルバモイルオキシ（−ＮＲ−ＣＯ−、ここでＲは水
素、低級アルキルまたは窒素へ炭素原子を介して結合し
た可溶化基である）であり、そしてＦｌはＹのＯまたはＮと一緒になつて蛍光性を示す芳香
族化合物残基である、の化合物を製造する方法であって、活性化された炭素環
式アリール基Ｘ−Ａｒ（式中ＸおよびＡｒは前記におい
て定義したとおりである）を、アミノ−またはオキシ−
蛍光化合物に結合することを特徴とする方法。
【請求項２３】式Ｘ−Ａｒ−Ｙ−Ｆｌ式中、Ｘはオキシまたはアミノ含有置換基であり、少なくとも
１つのＸが存在し、Ａｒは１〜２個の環をもつ炭素環式アリール基であり、Ｙはオキシ（−Ｏ−）または窒素原子が基Ｆｌに結合す
るカルバモイルオキシ（−ＮＲ−ＣＯ−、ここでＲは水
素、低級アルキルまたは窒素へ炭素原子を介して結合し
た可溶化基である）であり、そしてＦｌはＹのＯまたはＮと一緒になつて蛍光性を示す芳香
族化合物である、の化合物を含んでる、試料中のペルオキシダーゼの触媒
活性または分析物の存在を測定するための試薬。