JPH0656883A - ヒト血清アルブミンの脱脂方法 - Google Patents
ヒト血清アルブミンの脱脂方法Info
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- JPH0656883A JPH0656883A JP4205636A JP20563692A JPH0656883A JP H0656883 A JPH0656883 A JP H0656883A JP 4205636 A JP4205636 A JP 4205636A JP 20563692 A JP20563692 A JP 20563692A JP H0656883 A JPH0656883 A JP H0656883A
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- hsa
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- degreasing
- human serum
- serum albumin
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＨＳＡ、特に遺伝子操作により産生されるＨ
ＳＡをキレート樹脂、具体的にはポリオール基、ポリア
ミン基またはチオ尿素基から選ばれたキレート能を有す
る交換基をリガンドとして有するキレート樹脂で処理す
ることを特徴とする、ＨＳＡの脱脂方法。 【効果】 本発明によれば、ＨＳＡ、特に遺伝子操作に
より産生されるＨＳＡについて、それに吸着、結合して
いる原料由来のまたは微生物が分泌する脂肪酸またはそ
のエステル類を効率良く除去することができる。従っ
て、脂肪酸またはそのエステル類が混入しないＨＳＡを
提供することができる。
ＳＡをキレート樹脂、具体的にはポリオール基、ポリア
ミン基またはチオ尿素基から選ばれたキレート能を有す
る交換基をリガンドとして有するキレート樹脂で処理す
ることを特徴とする、ＨＳＡの脱脂方法。 【効果】 本発明によれば、ＨＳＡ、特に遺伝子操作に
より産生されるＨＳＡについて、それに吸着、結合して
いる原料由来のまたは微生物が分泌する脂肪酸またはそ
のエステル類を効率良く除去することができる。従っ
て、脂肪酸またはそのエステル類が混入しないＨＳＡを
提供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト血清アルブミン、特
に遺伝子操作により発現されるヒト血清アルブミンの脱
脂方法に関する。
に遺伝子操作により発現されるヒト血清アルブミンの脱
脂方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルブミン、特にヒト血清アルブミン
（以下、ＨＳＡという）は血漿タンパク質の主要な構成
成分である。この蛋白質は肝臓中で作られ、主として血
流中で正常な浸透圧を維持したり、また種々の血清分子
のキャリアーとしての機能を持っている。このため、臨
床におけるＨＳＡ投与の基本的意義は、通常アルブミン
の減少に起因するとされる血液中血漿タンパク量の著し
い減少状態を改善することにある。これを目的として、
例えばショック患者や熱傷患者に対してＨＳＡの頻回投
与が実施されており、この結果減少した血液量は元に戻
り、更に外傷に関連するいくつかの症状をも改善する。
また、低蛋白血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者に
対してもＨＳＡによる治療が有効とされている。
（以下、ＨＳＡという）は血漿タンパク質の主要な構成
成分である。この蛋白質は肝臓中で作られ、主として血
流中で正常な浸透圧を維持したり、また種々の血清分子
のキャリアーとしての機能を持っている。このため、臨
床におけるＨＳＡ投与の基本的意義は、通常アルブミン
の減少に起因するとされる血液中血漿タンパク量の著し
い減少状態を改善することにある。これを目的として、
例えばショック患者や熱傷患者に対してＨＳＡの頻回投
与が実施されており、この結果減少した血液量は元に戻
り、更に外傷に関連するいくつかの症状をも改善する。
また、低蛋白血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者に
対してもＨＳＡによる治療が有効とされている。
【０００３】現在、ＨＳＡは主として人から採取した血
液を分画することによって製造されているが、この方法
は血液の供給が困難であること、不経済であること、ま
た肝炎ウイルス等の夾雑物質の混入などといった様々な
欠点を有している。従って、ＨＳＡの代替の原料を開発
することは臨床上極めて有益なことと考えられる。
液を分画することによって製造されているが、この方法
は血液の供給が困難であること、不経済であること、ま
た肝炎ウイルス等の夾雑物質の混入などといった様々な
欠点を有している。従って、ＨＳＡの代替の原料を開発
することは臨床上極めて有益なことと考えられる。
【０００４】近年、多種多様の有用なポリペプチドが組
換ＤＮＡ技術によって種々の微生物から取得されている
が、ＨＳＡについても同様であり、遺伝子操作の技術に
より大量のＨＳＡが生産され、それを高度精製する技術
も確立されつつある。
換ＤＮＡ技術によって種々の微生物から取得されている
が、ＨＳＡについても同様であり、遺伝子操作の技術に
より大量のＨＳＡが生産され、それを高度精製する技術
も確立されつつある。
【０００５】ところが遺伝子操作においては、発現され
るＨＳＡは培地に起因するあるいは宿主由来の、または
宿主が分泌する脂肪酸またはそのエステル類と吸着また
は結合するという現象が見られる。高い純度のＨＳＡを
得るためには、ＨＳＡへの脂肪酸の結合量を減少せしめ
ることが要求される。従来血漿由来のＨＳＡに関して
は、その脱脂方法として活性炭などを用いる方法（特開
昭５３−１２７８０９号）、陰イオン交換体を用いる方
法（特開平３−８１２９０号）が知られている。しかし
これらの方法は、ＨＳＡの回収率、脱脂効果の度合いな
どの点で充分満足される効果を与えず、特に遺伝子操作
により産生されたＨＳＡに対しても、充分効果があると
は言えないのが実情である。
るＨＳＡは培地に起因するあるいは宿主由来の、または
宿主が分泌する脂肪酸またはそのエステル類と吸着また
は結合するという現象が見られる。高い純度のＨＳＡを
得るためには、ＨＳＡへの脂肪酸の結合量を減少せしめ
ることが要求される。従来血漿由来のＨＳＡに関して
は、その脱脂方法として活性炭などを用いる方法（特開
昭５３−１２７８０９号）、陰イオン交換体を用いる方
法（特開平３−８１２９０号）が知られている。しかし
これらの方法は、ＨＳＡの回収率、脱脂効果の度合いな
どの点で充分満足される効果を与えず、特に遺伝子操作
により産生されたＨＳＡに対しても、充分効果があると
は言えないのが実情である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明はＨＳＡ、特に
遺伝子操作により産生されるＨＳＡに関して、従来の血
漿由来ＨＳＡの精製方法では充分に除去することができ
なかった多種類の脂肪酸またはそのエステル類を効率良
く除去する方法を提供するものである。また、本発明方
法は血漿由来のＨＳＡの脱脂方法としても優れている。
遺伝子操作により産生されるＨＳＡに関して、従来の血
漿由来ＨＳＡの精製方法では充分に除去することができ
なかった多種類の脂肪酸またはそのエステル類を効率良
く除去する方法を提供するものである。また、本発明方
法は血漿由来のＨＳＡの脱脂方法としても優れている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記事情を
鑑みて鋭意研究を進めた結果、ＨＳＡ、特に遺伝子操作
により産生されるＨＳＡをキレート樹脂で処理すること
により、試料中の脂肪酸またはそのエステルが除去で
き、純度の高いＨＳＡが高い回収率をもって得られるこ
とを見出し本発明を完成した。
鑑みて鋭意研究を進めた結果、ＨＳＡ、特に遺伝子操作
により産生されるＨＳＡをキレート樹脂で処理すること
により、試料中の脂肪酸またはそのエステルが除去で
き、純度の高いＨＳＡが高い回収率をもって得られるこ
とを見出し本発明を完成した。
【０００８】即ち本発明は、ＨＳＡ、特に遺伝子操作に
より産生されるＨＳＡをキレート樹脂で処理することを
特徴とする、ＨＳＡの脱脂方法に関する。
より産生されるＨＳＡをキレート樹脂で処理することを
特徴とする、ＨＳＡの脱脂方法に関する。
【０００９】本発明が対象とするＨＳＡは、血漿由来の
もの、また遺伝子操作によって得られるもののいずれで
もよい。
もの、また遺伝子操作によって得られるもののいずれで
もよい。
【００１０】遺伝子操作で得られるＨＳＡに関して、用
いられる遺伝子組換え操作、例えば発現システム（例え
ば宿主、ＨＳＡ発現ベクターなど）、発現方法、培養シ
ステム、及び培養方法等については特に制限されない。
一般に遺伝子操作によるＨＳＡ産生方法は、基本的にＨ
ＳＡ発現ベクターの構築、形質転換体の作成、形質転換
体の培養等の工程からなり、この結果得られたＨＳＡ
は、培養濾液または菌体、細胞からそれぞれ公知の分離
手段により採取される。具体的には、特願平４−１３７
２５０号記載の発現システム、発現方法、培養システム
及び培養方法が使用できる。
いられる遺伝子組換え操作、例えば発現システム（例え
ば宿主、ＨＳＡ発現ベクターなど）、発現方法、培養シ
ステム、及び培養方法等については特に制限されない。
一般に遺伝子操作によるＨＳＡ産生方法は、基本的にＨ
ＳＡ発現ベクターの構築、形質転換体の作成、形質転換
体の培養等の工程からなり、この結果得られたＨＳＡ
は、培養濾液または菌体、細胞からそれぞれ公知の分離
手段により採取される。具体的には、特願平４−１３７
２５０号記載の発現システム、発現方法、培養システム
及び培養方法が使用できる。
【００１１】かくして得られたＨＳＡは、精製工程に移
されるが、本発明の脱脂方法による処理はこの精製工程
において、単独でまたは他の精製方法と組み合わせて使
用される。例えば下記の精製工程と組み合わせることが
好ましい。他の精製方法と組み合わせる場合、本発明の
精製方法はその任意の工程において行えばよい。最も好
適には、下記の精製工程の最後に行われる。
されるが、本発明の脱脂方法による処理はこの精製工程
において、単独でまたは他の精製方法と組み合わせて使
用される。例えば下記の精製工程と組み合わせることが
好ましい。他の精製方法と組み合わせる場合、本発明の
精製方法はその任意の工程において行えばよい。最も好
適には、下記の精製工程の最後に行われる。
【００１２】（１） ＨＳＡの精製 従来、遺伝子操作により産生されたＨＳＡの精製方法と
して、各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離
法、透析等の公知方法が採用されている。本発明のＨＳ
Ａの脱脂方法による処理は、上記精製工程のいずれの段
階において実施されてもよいが、好ましくはその最後に
行われる。
して、各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離
法、透析等の公知方法が採用されている。本発明のＨＳ
Ａの脱脂方法による処理は、上記精製工程のいずれの段
階において実施されてもよいが、好ましくはその最後に
行われる。
【００１３】当該精製工程としては、例えば以下の〜
を含む工程が好適に挙げられる。 ヒト血清アルブミン産生宿主の培養によって、ヒト
血清アルブミンを含む画分（培養上清、または培養細胞
を破砕したのち得られる画分）を分画分子量１０万〜５
０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜を用いて処理す
る。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。
を含む工程が好適に挙げられる。 ヒト血清アルブミン産生宿主の培養によって、ヒト
血清アルブミンを含む画分（培養上清、または培養細胞
を破砕したのち得られる画分）を分画分子量１０万〜５
０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜を用いて処理す
る。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。
【００１４】また、前記工程の代わりに、ｐＨ６〜
８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に
接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５
Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程の代わり
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件
下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩
濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには
前記工程との間、との間、またはの後で、ｐ
Ｈ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、
沈澱画分を回収する工程をさらに含むものであってもよ
い。
８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に
接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５
Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程の代わり
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件
下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩
濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには
前記工程との間、との間、またはの後で、ｐ
Ｈ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、
沈澱画分を回収する工程をさらに含むものであってもよ
い。
【００１５】また血漿由来のＨＳＡに関して、血漿から
のＨＳＡ調製方法は通常の方法を用いることができる。
本発明の脱脂方法による処理は、その調製、精製工程の
いずれの段階において実施されてもよく、好適にはその
最後に行われる。
のＨＳＡ調製方法は通常の方法を用いることができる。
本発明の脱脂方法による処理は、その調製、精製工程の
いずれの段階において実施されてもよく、好適にはその
最後に行われる。
【００１６】（２）ＨＳＡの脱脂 本発明のＨＳＡの脱脂方法は、精製工程において得られ
るＨＳＡ試料を特定のリガンド部を有するキレート樹脂
と接触することにより行われる。本発明でいう処理と
は、当該キレート樹脂との接触操作を意味する。
るＨＳＡ試料を特定のリガンド部を有するキレート樹脂
と接触することにより行われる。本発明でいう処理と
は、当該キレート樹脂との接触操作を意味する。
【００１７】キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する
担体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニル
ベンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重
合体等が挙げられる。一方、リガンド部は、Ｎ−メチル
グルカミン基等のポリオール基、イミノ基、アミノ基、
エチレンイミノ基等を分子内に複数個有するポリアミン
基（この中にはポリエチレンポリアミン等のポリアルキ
レンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙
げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート
樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンと
ジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRB02（リガ
ンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成株式会社
製）、DIAION CR20 （リガンド部；−ＮＨ（ＣＨ2 -Ｃ
Ｈ2 -ＮＨ)nＨ、三菱化成株式会社製）、LEWATIT TP
（リガンド部；−ＮＨＣＳＮＨ2 、バイエル社製）、ア
ンバライトＣＧ４０００好適に使用される。
担体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニル
ベンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重
合体等が挙げられる。一方、リガンド部は、Ｎ−メチル
グルカミン基等のポリオール基、イミノ基、アミノ基、
エチレンイミノ基等を分子内に複数個有するポリアミン
基（この中にはポリエチレンポリアミン等のポリアルキ
レンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙
げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート
樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンと
ジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRB02（リガ
ンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成株式会社
製）、DIAION CR20 （リガンド部；−ＮＨ（ＣＨ2 -Ｃ
Ｈ2 -ＮＨ)nＨ、三菱化成株式会社製）、LEWATIT TP
（リガンド部；−ＮＨＣＳＮＨ2 、バイエル社製）、ア
ンバライトＣＧ４０００好適に使用される。
【００１８】当該キレート樹脂による処理条件は、好適
には次の通りである。 ｐＨ条件： 酸性または中性（ｐＨ３〜９、好ましくは
ｐＨ４〜７) 。 時間： 少なくとも１時間以上、好ましくは６時間以
上。 イオン強度： ５０ｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍ
ｈｏ。 混合比： ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１０
０ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）。
には次の通りである。 ｐＨ条件： 酸性または中性（ｐＨ３〜９、好ましくは
ｐＨ４〜７) 。 時間： 少なくとも１時間以上、好ましくは６時間以
上。 イオン強度： ５０ｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍ
ｈｏ。 混合比： ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１０
０ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）。
【００１９】本発明のキレート樹脂処理により、ＨＳＡ
の脂肪酸吸着量は上記〜および塩析処理、さらにキ
レート樹脂処理を含む工程を経て得られたＨＳＡの脂肪
酸吸着量に対してその１／１０以下、好ましくは１／１
００以下に低減される。
の脂肪酸吸着量は上記〜および塩析処理、さらにキ
レート樹脂処理を含む工程を経て得られたＨＳＡの脂肪
酸吸着量に対してその１／１０以下、好ましくは１／１
００以下に低減される。
【００２０】ＨＳＡに対する脂肪酸またはそのエステル
類の吸着量は、公知方法によって測定することができ
る。この方法としては例えば、Duncombeの抽出法、アシ
ル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）とアシル−ＣｏＡオ
キシターゼ（ＡＣＯＤ）を使用したＡＣＳ−ＡＣＯＤ法
などが挙げられる。
類の吸着量は、公知方法によって測定することができ
る。この方法としては例えば、Duncombeの抽出法、アシ
ル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）とアシル−ＣｏＡオ
キシターゼ（ＡＣＯＤ）を使用したＡＣＳ−ＡＣＯＤ法
などが挙げられる。
【００２１】Duncombeの抽出法は、脂肪酸を銅試薬によ
って銅塩とし、クロロホルムで抽出後、バンクプレイン
で発色させることを測定原理とするものであり、測定キ
ット例えば、ＮＥＦＡ−テストワコー（和光純薬株式会
社製）等を使用することにより簡便に実施できる。ま
た、ＡＣＳ−ＡＣＯＤ法は、アシル−ＣｏＡシンセター
ゼ及びアシル−ＣｏＡオキシターゼと脂肪酸が反応して
生じたＨ2 Ｏ2 を、ペルオキシダーゼが色素の酸化縮合
に利用して発色させることを測定原理とするものであ
り、測定キット例えば、ＮＥＦＡＣ−テストワコー（和
光純薬株式会社製）等を使用することにより簡便に実施
できる。
って銅塩とし、クロロホルムで抽出後、バンクプレイン
で発色させることを測定原理とするものであり、測定キ
ット例えば、ＮＥＦＡ−テストワコー（和光純薬株式会
社製）等を使用することにより簡便に実施できる。ま
た、ＡＣＳ−ＡＣＯＤ法は、アシル−ＣｏＡシンセター
ゼ及びアシル−ＣｏＡオキシターゼと脂肪酸が反応して
生じたＨ2 Ｏ2 を、ペルオキシダーゼが色素の酸化縮合
に利用して発色させることを測定原理とするものであ
り、測定キット例えば、ＮＥＦＡＣ−テストワコー（和
光純薬株式会社製）等を使用することにより簡便に実施
できる。
【００２２】本発明の脱脂方法が対象とするものは、脂
肪酸またはそのエステルであり、それらは特にＨＳＡ製
造のための原料に基づくものであり、例えば、血液、培
養基、宿主に由来するもの、または宿主が分泌するもの
を含む。脂肪酸としては、炭素数８〜２０からなる飽和
脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸）及び炭
素数１６〜２０からなる不飽和脂肪酸（例えば、オレイ
ン酸、リノール酸、アラキドン酸）が挙げられる。本発
明の方法は、上記の脂肪酸またはそのエステルの除去に
有効であり、故にＨＳＡの由来に限定されることなく、
それら脂肪酸またはそのエステル類と結合しているＨＳ
Ａの脱脂に利用できる方法である。
肪酸またはそのエステルであり、それらは特にＨＳＡ製
造のための原料に基づくものであり、例えば、血液、培
養基、宿主に由来するもの、または宿主が分泌するもの
を含む。脂肪酸としては、炭素数８〜２０からなる飽和
脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸）及び炭
素数１６〜２０からなる不飽和脂肪酸（例えば、オレイ
ン酸、リノール酸、アラキドン酸）が挙げられる。本発
明の方法は、上記の脂肪酸またはそのエステルの除去に
有効であり、故にＨＳＡの由来に限定されることなく、
それら脂肪酸またはそのエステル類と結合しているＨＳ
Ａの脱脂に利用できる方法である。
【００２３】本発明方法で処理されたＨＳＡを例えば臨
床使用するにあたっては、該ＨＳＡは公知の手法（限外
濾過、安定化剤の添加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）
により製剤化される。このＨＳＡ製剤は十分臨床使用上
適合しうる製剤であり、注射剤として血漿由来ＨＳＡ製
剤と同様に用いることができる。また、医薬品の安定化
剤あるいは担体、運搬体としても利用可能である。
床使用するにあたっては、該ＨＳＡは公知の手法（限外
濾過、安定化剤の添加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）
により製剤化される。このＨＳＡ製剤は十分臨床使用上
適合しうる製剤であり、注射剤として血漿由来ＨＳＡ製
剤と同様に用いることができる。また、医薬品の安定化
剤あるいは担体、運搬体としても利用可能である。
【００２４】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
【００２５】参考例１ ＨＳＡ産生宿主の培養 (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号に述べられている方法によ
り、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５
（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1 遺伝子領域に、ＡＯＸ1プロモ
ーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つプ
ラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換し
て、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ1 遺
伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培地
での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
り、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５
（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1 遺伝子領域に、ＡＯＸ1プロモ
ーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つプ
ラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換し
て、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ1 遺
伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培地
での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
【００２６】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有
無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２
％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個
のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほ
とんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有
無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２
％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個
のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほ
とんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００２７】(2) 菌株の培養 （前々培養）グリセロール凍結ストック菌株１mlを２０
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。
【００２８】
【表１】
【００２９】（前培養）ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。
【００３０】（本培養）バッチ培養用培地（表２）２５
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m2 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピューターを使用し、培地中
にメタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培
養を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加するこ
とにより、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m2 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピューターを使用し、培地中
にメタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培
養を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加するこ
とにより、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離した変異型ＡＯＸ２
プロモーター [天然型ＡＯＸ２プロモーター（YEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol., 9,1316-13
23 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基がＴ
からＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラスミ
ドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia pa
storis) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ４
２−３株を得た（特願平３−６３５９９号）。参考例１
に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産生
させた。
プロモーター [天然型ＡＯＸ２プロモーター（YEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol., 9,1316-13
23 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基がＴ
からＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラスミ
ドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia pa
storis) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ４
２−３株を得た（特願平３−６３５９９号）。参考例１
に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産生
させた。
【００３４】参考例３ ＨＳＡの精製 [i] 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ） 参考例１、または参考例２で得られた培養液約８００Ｌ
を圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、
分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌ
に濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。この濃縮液を６０℃、３
時間の加熱処理後、急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．
５に調整し、再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用
いて除去した〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量
が３万の限外濾過膜を用いてアルブンミン溶液中の緩衝
液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝
液，ｐＨ４．５に交換した。
を圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、
分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌ
に濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。この濃縮液を６０℃、３
時間の加熱処理後、急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．
５に調整し、再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用
いて除去した〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量
が３万の限外濾過膜を用いてアルブンミン溶液中の緩衝
液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝
液，ｐＨ４．５に交換した。
【００３５】[ii]陽イオン交換体処理 ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。
【００３６】[iii] 疎水性クロマト処理 Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたアルブミン
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミ
ンはフェニルセルロファインを吸着することなく、カラ
ムを通過した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミ
ンはフェニルセルロファインを吸着することなく、カラ
ムを通過した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
【００３７】[iv]陰イオン交換体処理 疎水クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったアル
ブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡
化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加
した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロー
スに吸着することなく、カラムを通過した。
ブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡
化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加
した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロー
スに吸着することなく、カラムを通過した。
【００３８】[v] ＨＳＡの塩析処理 ５％濃度のＨＳＡに塩化ナトリウムを添加して最終濃度
１Ｍとした溶液を、酢酸でｐＨ３．５に調整し、ＨＳＡ
を沈澱させた。この沈澱を遠心により上清と分離し、不
純物を除去した。
１Ｍとした溶液を、酢酸でｐＨ３．５に調整し、ＨＳＡ
を沈澱させた。この沈澱を遠心により上清と分離し、不
純物を除去した。
【００３９】実施例１ 参考例１及び３（または２）を経て得られた精製２０％
組換えＨＳＡ１ｍｌにＤＩＡＩＯＮ ＣＲＢ０２（三菱
化成株式会社製）を１ｇを加え、ｐＨ６．８、イオン強
度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌した。ＤＩ
ＡＩＯＮ ＣＲＢ０２はスチレン−ジビニルベンゼン共
重合体からなる担体部にリガンドとしてＮ−メチルグル
カミン基が結合してなるキレート樹脂である。その後、
樹脂を蒸留水で洗浄後、回収されたＨＳＡの結合脂肪酸
またはエステル類の量を測定した。また、対照として精
製工程において上記キレート樹脂処理を施さなかった組
換えＨＳＡを用い、同様に結合脂肪酸量を求めた。結合
脂肪酸量の測定はＮＥＦＡ−テストワコー（和光純薬社
製）を用いて行った。結果を表４に示す。尚、表におい
てｒＨＳＡとは、遺伝子操作由来のＨＳＡを意味する。
組換えＨＳＡ１ｍｌにＤＩＡＩＯＮ ＣＲＢ０２（三菱
化成株式会社製）を１ｇを加え、ｐＨ６．８、イオン強
度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌した。ＤＩ
ＡＩＯＮ ＣＲＢ０２はスチレン−ジビニルベンゼン共
重合体からなる担体部にリガンドとしてＮ−メチルグル
カミン基が結合してなるキレート樹脂である。その後、
樹脂を蒸留水で洗浄後、回収されたＨＳＡの結合脂肪酸
またはエステル類の量を測定した。また、対照として精
製工程において上記キレート樹脂処理を施さなかった組
換えＨＳＡを用い、同様に結合脂肪酸量を求めた。結合
脂肪酸量の測定はＮＥＦＡ−テストワコー（和光純薬社
製）を用いて行った。結果を表４に示す。尚、表におい
てｒＨＳＡとは、遺伝子操作由来のＨＳＡを意味する。
【００４０】
【表４】
【００４１】実施例２ 実施例１に行った２０％組換えＨＳＡ１ｍｌに対する処
理において、キレート樹脂ＤＩＡＩＯＮ ＣＲＢ０ ２
の代わりにＤＩＡＩＯＮ ＣＲ２０（三菱化成株式会社
製）を使用した以外は実施例１と同様の処理を行った。
ＤＩＡＩＯＮＣＲ２０は、スチレン−ジビニルベンゼン
共重合体からなる担体部にリガンドとして -NH(CH2 CH2
NH)n H 基が結合してなるキレート樹脂である。この処
理によって実施例１と同様な結果が得られた。
理において、キレート樹脂ＤＩＡＩＯＮ ＣＲＢ０ ２
の代わりにＤＩＡＩＯＮ ＣＲ２０（三菱化成株式会社
製）を使用した以外は実施例１と同様の処理を行った。
ＤＩＡＩＯＮＣＲ２０は、スチレン−ジビニルベンゼン
共重合体からなる担体部にリガンドとして -NH(CH2 CH2
NH)n H 基が結合してなるキレート樹脂である。この処
理によって実施例１と同様な結果が得られた。
【００４２】実施例３ 実施例１に行った２０％組換えＨＳＡ１ｍｌに対する処
理において、キレート樹脂ＤＩＡＩＯＮ ＣＲＢ０ ２
の代わりにＬＥＷＡＴＩＴ ＴＰ２１４（バイエル社
製）を使用した以外は実施例１と同様の処理を行った。
ＬＥＷＡＴＩＴＴＰ２１４は、スチレン−ジビニルベン
ゼン共重合体からなる担体部にリガンドとして -NHCSNH
2 基が結合してなるキレート樹脂である。この処理によ
って実施例１と同様な結果が得られた。
理において、キレート樹脂ＤＩＡＩＯＮ ＣＲＢ０ ２
の代わりにＬＥＷＡＴＩＴ ＴＰ２１４（バイエル社
製）を使用した以外は実施例１と同様の処理を行った。
ＬＥＷＡＴＩＴＴＰ２１４は、スチレン−ジビニルベン
ゼン共重合体からなる担体部にリガンドとして -NHCSNH
2 基が結合してなるキレート樹脂である。この処理によ
って実施例１と同様な結果が得られた。
【００４３】
【発明の効果】本発明によれば、ＨＳＡ、特に遺伝子操
作により産生されるＨＳＡについて、それに吸着、結合
している原料由来のまたは微生物が分泌する脂肪酸また
はそのエステル類を効率良く除去することができる。従
って、脂肪酸またはそのエステル類が混入しないＨＳＡ
を提供することができる。
作により産生されるＨＳＡについて、それに吸着、結合
している原料由来のまたは微生物が分泌する脂肪酸また
はそのエステル類を効率良く除去することができる。従
って、脂肪酸またはそのエステル類が混入しないＨＳＡ
を提供することができる。
フロントページの続き (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒト血清アルブミンをキレート樹脂で処
理することを特徴とする、ヒト血清アルブミンの脱脂方
法。 - 【請求項２】 キレート樹脂がポリオール基、ポリアミ
ン基及びチオ尿素基から選ばれたキレート生成能を有す
る交換基をリガンドとして有する請求項１記載のヒト血
清アルブミンの脱脂方法。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4205636A JPH0733398B2 (ja) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | ヒト血清アルブミンの脱脂方法 |
| US08/036,387 US5440018A (en) | 1992-05-20 | 1993-03-24 | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
| DK93108099T DK0570916T3 (da) | 1992-05-20 | 1993-05-18 | Fremgangsmåde til rensning af humant rekombinant serumalbumin |
| ES93108099T ES2170060T3 (es) | 1992-05-20 | 1993-05-18 | Procedimiento para la preparacion de albumina serica humana recombinante. |
| DE69331507T DE69331507T2 (de) | 1992-05-20 | 1993-05-18 | Verfahren zur Reinigung von menschlichem, rekombinantem Serumalbumin |
| EP93108099A EP0570916B1 (en) | 1992-05-20 | 1993-05-18 | Process for the purification of human recombinant serum albumin |
| EP01100133A EP1099708A1 (en) | 1992-05-20 | 1993-05-18 | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
| KR1019930008523A KR940005800A (ko) | 1992-05-20 | 1993-05-19 | 재조합 사람 혈청 알부민, 이의 제조 방법 및 이를 함유하는 약제 |
| CA002096572A CA2096572A1 (en) | 1992-05-20 | 1993-05-19 | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
| KR1019930008523A KR100386762B1 (ko) | 1992-05-20 | 1993-05-19 | 재조합사람혈청알부민의제조방법 |
| US08/202,130 US5521287A (en) | 1992-05-20 | 1994-02-25 | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
| US08/538,471 US5986062A (en) | 1992-05-20 | 1995-10-03 | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4205636A JPH0733398B2 (ja) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | ヒト血清アルブミンの脱脂方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10052296A Division JP3298405B2 (ja) | 1996-04-22 | 1996-04-22 | 脱脂されたヒト血清アルブミン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0656883A true JPH0656883A (ja) | 1994-03-01 |
| JPH0733398B2 JPH0733398B2 (ja) | 1995-04-12 |
Family
ID=16510177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4205636A Expired - Lifetime JPH0733398B2 (ja) | 1992-05-20 | 1992-07-31 | ヒト血清アルブミンの脱脂方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0733398B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007001893A (ja) * | 2005-06-22 | 2007-01-11 | Ito En Ltd | カテキン組成物及びその製造方法 |
| US8077468B2 (en) | 2006-09-20 | 2011-12-13 | Fujitsu Limited | Rail coupling handle, unit support mechanism and electronic device |
| JP2022523962A (ja) * | 2019-03-05 | 2022-04-27 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 製剤中のヒト血清アルブミン |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5082213A (ja) * | 1973-10-31 | 1975-07-03 | ||
| JPH02187144A (ja) * | 1989-01-13 | 1990-07-23 | Japan Atom Energy Res Inst | イミノジ酢酸基と金属との錯体を有するアフィニティ吸着剤の製造方法 |
| JPH0523195A (ja) * | 1991-07-22 | 1993-02-02 | Tosoh Corp | 血清アルブミンの精製方法 |
-
1992
- 1992-07-31 JP JP4205636A patent/JPH0733398B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5082213A (ja) * | 1973-10-31 | 1975-07-03 | ||
| JPH02187144A (ja) * | 1989-01-13 | 1990-07-23 | Japan Atom Energy Res Inst | イミノジ酢酸基と金属との錯体を有するアフィニティ吸着剤の製造方法 |
| JPH0523195A (ja) * | 1991-07-22 | 1993-02-02 | Tosoh Corp | 血清アルブミンの精製方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007001893A (ja) * | 2005-06-22 | 2007-01-11 | Ito En Ltd | カテキン組成物及びその製造方法 |
| US8077468B2 (en) | 2006-09-20 | 2011-12-13 | Fujitsu Limited | Rail coupling handle, unit support mechanism and electronic device |
| JP2022523962A (ja) * | 2019-03-05 | 2022-04-27 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 製剤中のヒト血清アルブミン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0733398B2 (ja) | 1995-04-12 |
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