JPH0656887A - 神経ペプチド - Google Patents
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- JPH0656887A JPH0656887A JP3295234A JP29523491A JPH0656887A JP H0656887 A JPH0656887 A JP H0656887A JP 3295234 A JP3295234 A JP 3295234A JP 29523491 A JP29523491 A JP 29523491A JP H0656887 A JPH0656887 A JP H0656887A
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規神経ペプチドを提供し、新たな薬理学
的研究の手段を与える。 【構成】 アミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．（１） （式中、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定め
る３文字表記により示し、ＸａａはＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖ
ａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ或いは単結合のいずれかを示し、
アミノ酸に光学異性体が存在する場合は、特に明記しな
い限りＬ体を示す。）で表されるペプチドは、ユムシ体
壁の内側輪状筋を収縮させる新規神経ペプチドである。
このうち、ＸａａがＡｌａであるトリペプチドはユムシ
の腹側神経索よりからも得られるが、これらの化合物は
いずれも、通常の液相法または市販の自動ペプチド合成
機による固相法でも合成できる。本発明のペプチドは、
神経ペプチドである他、アセチルコリンエステラーゼの
反応速度を低下させる作用を有し、その反応速度をコン
トロールするという、全く異なった切り口から、新たな
医薬および農薬へのアプローチを提供するものである。
的研究の手段を与える。 【構成】 アミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．（１） （式中、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定め
る３文字表記により示し、ＸａａはＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖ
ａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ或いは単結合のいずれかを示し、
アミノ酸に光学異性体が存在する場合は、特に明記しな
い限りＬ体を示す。）で表されるペプチドは、ユムシ体
壁の内側輪状筋を収縮させる新規神経ペプチドである。
このうち、ＸａａがＡｌａであるトリペプチドはユムシ
の腹側神経索よりからも得られるが、これらの化合物は
いずれも、通常の液相法または市販の自動ペプチド合成
機による固相法でも合成できる。本発明のペプチドは、
神経ペプチドである他、アセチルコリンエステラーゼの
反応速度を低下させる作用を有し、その反応速度をコン
トロールするという、全く異なった切り口から、新たな
医薬および農薬へのアプローチを提供するものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な神経ペプチドに関
し、更に詳細にはユムシの神経索から得られる新規な抑
制ペプチドおよびその類縁ペプチドに関する。
し、更に詳細にはユムシの神経索から得られる新規な抑
制ペプチドおよびその類縁ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】ユムシ（Ｕｒｅｃｈｉｓ ｕｎｉｃｉｎ
ｃｔｕｓ）は、タイ、カレイ、チヌ等の釣餌に使用され
る環形動物近隣の水棲動物であるが、環形動物に較べて
その神経生物学的研究は殆ど為されていない。しかし本
発明者らは、このユムシの神経系において、その生理的
な活動に関与している伝達物質の探索を精力的に進めて
きた。その結果、古典的伝達物質についてはアセチルコ
リン、ドパミン、セロトニンの他に、ノルアドレナリン
を含むことを見出している。
ｃｔｕｓ）は、タイ、カレイ、チヌ等の釣餌に使用され
る環形動物近隣の水棲動物であるが、環形動物に較べて
その神経生物学的研究は殆ど為されていない。しかし本
発明者らは、このユムシの神経系において、その生理的
な活動に関与している伝達物質の探索を精力的に進めて
きた。その結果、古典的伝達物質についてはアセチルコ
リン、ドパミン、セロトニンの他に、ノルアドレナリン
を含むことを見出している。
【０００３】これらの古典的伝達物質の他に、最近はペ
プチド性の伝達物質も注目されてきている。例えば、釜
谷等は、アフリカマイマイの神経節からＤ−アミノ酸を
含むテトラペプチドであるアカチン−Ｉを見出しており
（Ｋａｍａｔａｎｉ ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖｏｌ．１６
０，ｐ１０１５，１９８９）、ユムシにもこの様なペプ
チド性の伝達物質の存在が示唆されている。
プチド性の伝達物質も注目されてきている。例えば、釜
谷等は、アフリカマイマイの神経節からＤ−アミノ酸を
含むテトラペプチドであるアカチン−Ｉを見出しており
（Ｋａｍａｔａｎｉ ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖｏｌ．１６
０，ｐ１０１５，１９８９）、ユムシにもこの様なペプ
チド性の伝達物質の存在が示唆されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、約１，８
００匹のユムシ腹側神経索から、その体壁筋の電気刺激
による単一収縮の抑制を指標に、ユムシの内因性神経ペ
プチドを単離すべく鋭意研究を行い、アミノ酸配列式
（２）： Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．（２） （本明細書中において、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣおよ
びＩＵＢの定める３文字表記により示し、アミノ酸に光
学異性体が存在する場合は、特に明記しない限りＬ体を
示すものとする。）で表される新規トリペプチド（以
下、ＡＬＴと称する）を分離、精製し、その化学構造を
決定すると共に、その類縁ペプチドにも同様の活性があ
ることを見出し、本発明を完成した。
００匹のユムシ腹側神経索から、その体壁筋の電気刺激
による単一収縮の抑制を指標に、ユムシの内因性神経ペ
プチドを単離すべく鋭意研究を行い、アミノ酸配列式
（２）： Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．（２） （本明細書中において、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣおよ
びＩＵＢの定める３文字表記により示し、アミノ酸に光
学異性体が存在する場合は、特に明記しない限りＬ体を
示すものとする。）で表される新規トリペプチド（以
下、ＡＬＴと称する）を分離、精製し、その化学構造を
決定すると共に、その類縁ペプチドにも同様の活性があ
ることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】このＡＬＴは、ユムシ腹側神経索を原料と
して、以下の方法により単離、精製することができる。
例えば、ユムシ腹側神経索を４％酢酸中でホモジナイズ
し、得られたホモジネートを遠心分離し、得られた上清
をゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー等に付し、目的とするペプチドを分離、精製すること
ができる。
して、以下の方法により単離、精製することができる。
例えば、ユムシ腹側神経索を４％酢酸中でホモジナイズ
し、得られたホモジネートを遠心分離し、得られた上清
をゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー等に付し、目的とするペプチドを分離、精製すること
ができる。
【０００６】また、ＡＬＴおよび本発明のＡＬＴ類縁ペ
プチドは、オリゴペプチドであるため、通常の液相法ま
たは固相法により容易に合成することができる。例え
ば、液相法としてはカルボジイミド−ＨＯＢｔ法が例示
でき、固相法としては、市販のペプチド合成機（例えば
アプライドバイオシステム社製ペプチド合成機４３０Ａ
型）を用いる固相合成法が例示できる。これらの方法で
得られた粗ペプチドは、Ｃ−１８逆相高速液体クロマト
グラフィー等に付し、目的とするペプチドを分離、精製
することができる。
プチドは、オリゴペプチドであるため、通常の液相法ま
たは固相法により容易に合成することができる。例え
ば、液相法としてはカルボジイミド−ＨＯＢｔ法が例示
でき、固相法としては、市販のペプチド合成機（例えば
アプライドバイオシステム社製ペプチド合成機４３０Ａ
型）を用いる固相合成法が例示できる。これらの方法で
得られた粗ペプチドは、Ｃ−１８逆相高速液体クロマト
グラフィー等に付し、目的とするペプチドを分離、精製
することができる。
【０００７】
【作用】本発明のペプチドは、ユムシ体壁筋の電気刺激
による単一収縮を抑制すると共に、驚くべきことに、ウ
シのアセチルコリンエステラーゼに対して阻害活性を有
することが判明した。すなわち、本発明のペプチドは、
神経伝達系研究用の試薬としてだけでなく、アセチルコ
リンエステラーゼ阻害様式の究明、その阻害剤のドラッ
グデザイン等、薬理学の実験における有用な試薬として
利用することができる。
による単一収縮を抑制すると共に、驚くべきことに、ウ
シのアセチルコリンエステラーゼに対して阻害活性を有
することが判明した。すなわち、本発明のペプチドは、
神経伝達系研究用の試薬としてだけでなく、アセチルコ
リンエステラーゼ阻害様式の究明、その阻害剤のドラッ
グデザイン等、薬理学の実験における有用な試薬として
利用することができる。
【０００８】
【実施例】次に実施例によって本発明をさらに説明する
が、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではな
い。
が、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではな
い。
【０００９】実施例１ ＡＬＴの精製 ユムシ（体重１５〜３０ｇ、釣餌業者より購入）１，８
００匹分の腹側神経索（約８５ｇ）を分離し、４％酢酸
中０℃下でホモジナイズし、４℃で４０分間、２８，０
００×ｇで遠心分離した。得られた沈澱は再度、同一条
件でホモジナイズ後遠心分離した。この手順を３回繰り
返し、集めた上清を再度同一条件で遠心分離し５７０ｍ
ｌの抽出液を得た。
００匹分の腹側神経索（約８５ｇ）を分離し、４％酢酸
中０℃下でホモジナイズし、４℃で４０分間、２８，０
００×ｇで遠心分離した。得られた沈澱は再度、同一条
件でホモジナイズ後遠心分離した。この手順を３回繰り
返し、集めた上清を再度同一条件で遠心分離し５７０ｍ
ｌの抽出液を得た。
【００１０】この抽出液を１２等分し、それぞれを直列
に連結した２個のＳｅｐ−ＰａｋＣ−１８カートリッジ
（日本ミリポア・リミッテド社製）に通液し、カートリ
ッジを４％酢酸で洗浄した。通過液と洗液とを合わせ、
８００ｍｌの非吸着画分を得た。
に連結した２個のＳｅｐ−ＰａｋＣ−１８カートリッジ
（日本ミリポア・リミッテド社製）に通液し、カートリ
ッジを４％酢酸で洗浄した。通過液と洗液とを合わせ、
８００ｍｌの非吸着画分を得た。
【００１１】この非吸着画分を３ｍｌに減圧濃縮し、セ
ファデックスＧ−１５（ファルマシア社製）カラム（φ
２５×４００ｍｍ）にかけ、０．１Ｎ酢酸を用い、流速
１．５ｍｌ／ｍｉｎで展開した。４ｍｌづつ分画し、ユ
ムシ体壁筋抑制活性を用いた生物活性検定試験を行う
と、Ｎｏ．２５〜３９の画分に活性が認められた。
ファデックスＧ−１５（ファルマシア社製）カラム（φ
２５×４００ｍｍ）にかけ、０．１Ｎ酢酸を用い、流速
１．５ｍｌ／ｍｉｎで展開した。４ｍｌづつ分画し、ユ
ムシ体壁筋抑制活性を用いた生物活性検定試験を行う
と、Ｎｏ．２５〜３９の画分に活性が認められた。
【００１２】この活性画分を集めて１．５ｍｌに濃縮
し、２０ｍｌのエタノールで再抽出して４℃で１６，０
００×ｇで遠心分離した。上清を濃縮し、Ａｓａｈｉｐ
ａｋ−ＯＤＰ５０（アサヒケミカル社製、φ６．０×２
５０ｍｍ）を用いたＣ−１８逆相高速液体クロマトグラ
フィーにかけ、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．９）
中、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１２０分間で０％から
６０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。１
ｍｌづつ分画し、ユムシ体側筋抑制活性を用いた生物活
性検定試験を行うと、Ｎｏ．６〜８の画分に活性が認め
られた。
し、２０ｍｌのエタノールで再抽出して４℃で１６，０
００×ｇで遠心分離した。上清を濃縮し、Ａｓａｈｉｐ
ａｋ−ＯＤＰ５０（アサヒケミカル社製、φ６．０×２
５０ｍｍ）を用いたＣ−１８逆相高速液体クロマトグラ
フィーにかけ、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．９）
中、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１２０分間で０％から
６０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。１
ｍｌづつ分画し、ユムシ体側筋抑制活性を用いた生物活
性検定試験を行うと、Ｎｏ．６〜８の画分に活性が認め
られた。
【００１３】この活性画分を、Ａｓａｈｉｐａｋ−ＧＳ
３２０（アサヒケミカル社製、φ７．６×５００ｍｍ）
を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、０．０１
％トリフルオロ酢酸（以下ＴＦＡと称す）（ｐＨ２．
２）流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで展開した。活性はサンプ
ル導入後２９〜３１分に溶出される分画に認められた。
３２０（アサヒケミカル社製、φ７．６×５００ｍｍ）
を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、０．０１
％トリフルオロ酢酸（以下ＴＦＡと称す）（ｐＨ２．
２）流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで展開した。活性はサンプ
ル導入後２９〜３１分に溶出される分画に認められた。
【００１４】活性画分を濃縮し、ＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ
８０ＴＭ（東ソー社製、φ４．６×１５０ｍｍ）を用い
たＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、流速０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎで、アセトニトリルの濃度を最初の２０分間は０
％、次の１５分間で０％から３％に、さらに次の５７分
間で３％から６０％に変化させる直線濃度勾配で溶出し
た。活性は、アセトニトリル約１０〜１１％の画分に認
められた。
８０ＴＭ（東ソー社製、φ４．６×１５０ｍｍ）を用い
たＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、流速０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎで、アセトニトリルの濃度を最初の２０分間は０
％、次の１５分間で０％から３％に、さらに次の５７分
間で３％から６０％に変化させる直線濃度勾配で溶出し
た。活性は、アセトニトリル約１０〜１１％の画分に認
められた。
【００１５】この活性画分を、Ｆｉｎｅｐａｋ−Ｃ８５
（ジャスコ社製、φ４．６×２５０ｍｍ）を用いたＣ−
８逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、０．１％Ｔ
ＦＡ（ｐＨ２．２）中、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、６
０分間で０％から２０％のアセトニトリルの直線濃度勾
配で溶出した。活性は、アセトニトリル約３．５〜４．
５％の画分に認められた。
（ジャスコ社製、φ４．６×２５０ｍｍ）を用いたＣ−
８逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、０．１％Ｔ
ＦＡ（ｐＨ２．２）中、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、６
０分間で０％から２０％のアセトニトリルの直線濃度勾
配で溶出した。活性は、アセトニトリル約３．５〜４．
５％の画分に認められた。
【００１６】この活性画分を、ＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ８
０ＴＭを用いたＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにかけ、１０．５％のアセトニトリルを含む０．１％
ＴＦＡ（ｐＨ２．２）を用い、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ
で展開した。活性は、保持時間１７分の紫外吸収ピーク
（２２０ｎｍ）に一致して認められた。
０ＴＭを用いたＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにかけ、１０．５％のアセトニトリルを含む０．１％
ＴＦＡ（ｐＨ２．２）を用い、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ
で展開した。活性は、保持時間１７分の紫外吸収ピーク
（２２０ｎｍ）に一致して認められた。
【００１７】得られたＡＬＴは、ＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ
８０ＴＭを用い、９．５％のアセトニトリルを含む０．
１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）を流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで
展開するＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィーによ
り分析する時、図１に示すように、保持時間１８．５分
近辺に、単一の紫外吸収ピーク（２２０ｎｍ）を与え
る。
８０ＴＭを用い、９．５％のアセトニトリルを含む０．
１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）を流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで
展開するＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィーによ
り分析する時、図１に示すように、保持時間１８．５分
近辺に、単一の紫外吸収ピーク（２２０ｎｍ）を与え
る。
【００１８】実施例２ ＡＬＴの同定 ＡＬＴのアミノ酸組成は、日立Ｌ−８５００型アミノ酸
分析機により分析したところ、Ｌｅｕ（ロイシン）１．
０，Ｔｈｒ（スレオニン）０．９１，Ａｌａ（アラニ
ン）０．６７であった。また、アプライドバイオシステ
ム社の４７７Ａ型気相シークエンサーによる自動エドマ
ン分解により、ＡＬＴのアミノ酸配列は、Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ と決定された。さらに日本電子ＪＭＳＨＸ
−１００型ＦＡＢ質量分析機により測定した、ＡＬＴの
ＦＡＢ−ＭＳスペクトルにより、〔（Ｍ＋Ｈ）＋＝３０
４．１ｍ／ｚ〕と観測されたため、ＡＬＴの分子量は３
０３と決定された。このことから、ＡＬＴは次のアミノ
酸配列式（２）： Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（２） で表されることが明らかになった。
分析機により分析したところ、Ｌｅｕ（ロイシン）１．
０，Ｔｈｒ（スレオニン）０．９１，Ａｌａ（アラニ
ン）０．６７であった。また、アプライドバイオシステ
ム社の４７７Ａ型気相シークエンサーによる自動エドマ
ン分解により、ＡＬＴのアミノ酸配列は、Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ と決定された。さらに日本電子ＪＭＳＨＸ
−１００型ＦＡＢ質量分析機により測定した、ＡＬＴの
ＦＡＢ−ＭＳスペクトルにより、〔（Ｍ＋Ｈ）＋＝３０
４．１ｍ／ｚ〕と観測されたため、ＡＬＴの分子量は３
０３と決定された。このことから、ＡＬＴは次のアミノ
酸配列式（２）： Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（２） で表されることが明らかになった。
【００１９】実施例３ 固相法によるＡＬＴの合成 この配列式（２）で示されるトリペプチドを、ｔ−ＢＯ
Ｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＰＡＭ−樹脂を担体として、ｔ
−ＢＯＣ−Ａｌａおよびｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕを用い、ア
プライドバイオシステム社の全自動ペプチド合成機４３
０Ａ型を用い、ＮＭＰ−ＨＯＢｔ／ｔ−ＢＯＣ法により
固相合成した。（但し、ｔ−ＢＯＣ＝ｔ−Ｂｕｔｙｌｏ
ｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ，Ｂｚｌ＝Ｂｅｎｚｙｌ，ＰＡＭ
＝Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅｍｅｔｈｙｌ，ＮＭ
Ｐ＝Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ，ＨＯＢ
ｔ＝Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅを示
す。）
Ｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＰＡＭ−樹脂を担体として、ｔ
−ＢＯＣ−Ａｌａおよびｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕを用い、ア
プライドバイオシステム社の全自動ペプチド合成機４３
０Ａ型を用い、ＮＭＰ−ＨＯＢｔ／ｔ−ＢＯＣ法により
固相合成した。（但し、ｔ−ＢＯＣ＝ｔ−Ｂｕｔｙｌｏ
ｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ，Ｂｚｌ＝Ｂｅｎｚｙｌ，ＰＡＭ
＝Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅｍｅｔｈｙｌ，ＮＭ
Ｐ＝Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ，ＨＯＢ
ｔ＝Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅを示
す。）
【００２０】反応終了後、ペプチド樹脂を０℃で１０％
ｐ−クレゾール／フッ化水素で処理して脱保護および切
断を行い、エーテルを加えてペプチドを沈澱させ、沈澱
をエーテルで洗浄した後にＴＦＡに溶解し、再びエーテ
ルで沈澱させて粗ペプチドを得た。粗ペプチドはＣ−１
８逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。精
製ペプチドはＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭおよびＦｉ
ｎｅｐａｋ−Ｃ８５を用いる逆相クロマトグラフィー
で、保持時間が天然品と全く一致した。また、ユムシの
体壁筋の単一収縮に対しても、天然品と同様の活性を示
した。
ｐ−クレゾール／フッ化水素で処理して脱保護および切
断を行い、エーテルを加えてペプチドを沈澱させ、沈澱
をエーテルで洗浄した後にＴＦＡに溶解し、再びエーテ
ルで沈澱させて粗ペプチドを得た。粗ペプチドはＣ−１
８逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。精
製ペプチドはＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭおよびＦｉ
ｎｅｐａｋ−Ｃ８５を用いる逆相クロマトグラフィー
で、保持時間が天然品と全く一致した。また、ユムシの
体壁筋の単一収縮に対しても、天然品と同様の活性を示
した。
【００２１】 実施例４ 固相法によるＡＬＴ類縁ペプチドの合成 アミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．（１） において、ＸａａがＧｌｙ，Ｖａｌ，ＬｅｕおよびＩｌ
ｅであるＡＬＴ類縁トリペプチドを、実施例３と同様の
方法で合成した。即ち、 ｔ−ＢＯＣ−Ａｌａに代えてｔ−ＢＯＣ−Ｇｌｙを用い
て（３） Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（３）を、ｔ−ＢＯＣ−Ａｌａに代えてｔ−ＢＯＣ−Ｖ
ａｌを用いて（４） Ｈ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（４）を、ｔ−ＢＯＣ−Ａｌａに代えてｔ−ＢＯＣ−Ｌ
ｅｕを用いて（５） Ｈ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（５）を、ｔ−ＢＯＣ−Ａｌａに代えてｔ−ＢＯＣ−Ｉ
ｌｅを用いて（６） Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（６）をそれぞれ合成した。
ｅであるＡＬＴ類縁トリペプチドを、実施例３と同様の
方法で合成した。即ち、 ｔ−ＢＯＣ−Ａｌａに代えてｔ−ＢＯＣ−Ｇｌｙを用い
て（３） Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（３）を、ｔ−ＢＯＣ−Ａｌａに代えてｔ−ＢＯＣ−Ｖ
ａｌを用いて（４） Ｈ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（４）を、ｔ−ＢＯＣ−Ａｌａに代えてｔ−ＢＯＣ−Ｌ
ｅｕを用いて（５） Ｈ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（５）を、ｔ−ＢＯＣ−Ａｌａに代えてｔ−ＢＯＣ−Ｉ
ｌｅを用いて（６） Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．
（６）をそれぞれ合成した。
【００２２】 実施例５ 液相法によるＡＬＴ類縁ペプチドの合成 アミノ酸配列式（１）において、一番目のアミノ酸残基
を欠く（７）：Ｈ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ
．．．．．．．．（７）を、液相法により合成した。
即ち、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）・ＯＢｚｌ・ｈｅｍｉｏｘａｌ
ａｔｅ（３８９ｍｇ＝１ｍｍｏｌ）とｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅ
ｕ・Ｈ２Ｏ（２４９ｍｇ＝１ｍｍｏｌ）をジメチルホル
ムアミド５ｍｌに溶解し、１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（１５０ｍｇ＝１．１ｍｍｏｌ）を加えて−２０
℃に冷却し、水溶性カルボジイミド（２００μｌ＝１．
１ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一昼夜攪拌した。反応終
了後、常法処理して得た保護ジペプチドを、ＴＦＡ処理
および水素添加により脱保護し、Ｃ−１８逆相高速液体
クロマトグラフィーにより精製して、ほぼ定量的に標記
化合物を合成した。
を欠く（７）：Ｈ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ
．．．．．．．．（７）を、液相法により合成した。
即ち、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）・ＯＢｚｌ・ｈｅｍｉｏｘａｌ
ａｔｅ（３８９ｍｇ＝１ｍｍｏｌ）とｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅ
ｕ・Ｈ２Ｏ（２４９ｍｇ＝１ｍｍｏｌ）をジメチルホル
ムアミド５ｍｌに溶解し、１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（１５０ｍｇ＝１．１ｍｍｏｌ）を加えて−２０
℃に冷却し、水溶性カルボジイミド（２００μｌ＝１．
１ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一昼夜攪拌した。反応終
了後、常法処理して得た保護ジペプチドを、ＴＦＡ処理
および水素添加により脱保護し、Ｃ−１８逆相高速液体
クロマトグラフィーにより精製して、ほぼ定量的に標記
化合物を合成した。
【００２３】実施例６ ユムシ体側筋抑制活性検定試験 ユムシ体壁筋抑制活性を用いた生物活性検定試験は次の
ように行った。ユムシ体壁の内側輪状筋を筋の走行に沿
って短冊状に切り取り、検定の標本とした。標本に１０
分毎に１５Ｖ，３ｍｓｅｃの電気刺激を与え、この刺激
によっておこる筋肉の収縮を記録した。検定すべき検体
は、人工海水に溶解して、刺激の９分前に投与した。図
２に示すように、ＡＬＴは電気刺激によるユムシ体壁の
内側輪状筋の収縮を抑制する。
ように行った。ユムシ体壁の内側輪状筋を筋の走行に沿
って短冊状に切り取り、検定の標本とした。標本に１０
分毎に１５Ｖ，３ｍｓｅｃの電気刺激を与え、この刺激
によっておこる筋肉の収縮を記録した。検定すべき検体
は、人工海水に溶解して、刺激の９分前に投与した。図
２に示すように、ＡＬＴは電気刺激によるユムシ体壁の
内側輪状筋の収縮を抑制する。
【００２４】 実施例７ アセチルコリンエステラーゼ阻害活性の測定 ムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）の足
糸前牽引筋は、アセチルコリンにより顕著な収縮を示す
ので、アセチルコリンエステラーゼ阻害による残存アセ
チルコリンの検出に用いた。
糸前牽引筋は、アセチルコリンにより顕著な収縮を示す
ので、アセチルコリンエステラーゼ阻害による残存アセ
チルコリンの検出に用いた。
【００２５】アセチルコリンエステラーゼの反応は次の
ように行った。 （１）本発明のペプチド溶液（１ｍＭ） ２０μｌ （２）１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８） ２μｌ （３）１０ｍＭアセチルコリン溶液 ２μｌ （４）アセチルコリンエステラーゼ（仔ウシ赤血球由来・和光純薬製） ０．１ｍｇ／ｍｌ溶液 ２μｌ 以上を良く混和し３７℃で所定時間反応させた後、人工
海水で２ｍｌに希釈してムラサキイガイ足糸前牽引筋の
系でアセチルコリンを検出する。なお、ブランクとして
（１）および（４）の代わりに純水を用い、コントロー
ルとして（１）の代わりに純水を用いて同様に処理し
た。
ように行った。 （１）本発明のペプチド溶液（１ｍＭ） ２０μｌ （２）１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８） ２μｌ （３）１０ｍＭアセチルコリン溶液 ２μｌ （４）アセチルコリンエステラーゼ（仔ウシ赤血球由来・和光純薬製） ０．１ｍｇ／ｍｌ溶液 ２μｌ 以上を良く混和し３７℃で所定時間反応させた後、人工
海水で２ｍｌに希釈してムラサキイガイ足糸前牽引筋の
系でアセチルコリンを検出する。なお、ブランクとして
（１）および（４）の代わりに純水を用い、コントロー
ルとして（１）の代わりに純水を用いて同様に処理し
た。
【００２６】ムラサキイガイ足糸前牽引筋の摘出標本に
ブランクの検体を加えると、図３−Ａに示すように、残
存する約１０μＭのアセチルコリンのため、顕著な収縮
を示す。これに対してコントロールでは、図３−Ｂに示
すように、アセチルコリンが完全に分解されているた
め、収縮は起こらない。一方、本発明のＡＬＴを加えて
９０分間反応させた検体では、図３−Ｃに示すように、
ブランクの約６０％の収縮を示すが、２１０分反応させ
た検体では、アセチルコリンが殆ど分解されているた
め、僅かな収縮しか示さなかった。
ブランクの検体を加えると、図３−Ａに示すように、残
存する約１０μＭのアセチルコリンのため、顕著な収縮
を示す。これに対してコントロールでは、図３−Ｂに示
すように、アセチルコリンが完全に分解されているた
め、収縮は起こらない。一方、本発明のＡＬＴを加えて
９０分間反応させた検体では、図３−Ｃに示すように、
ブランクの約６０％の収縮を示すが、２１０分反応させ
た検体では、アセチルコリンが殆ど分解されているた
め、僅かな収縮しか示さなかった。
【００２７】また、ＡＬＴ類縁ペプチドである、Ｈ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ（３）（以下、ＧＬＴと称
する）は、図３−Ｄに示すように、９０分間反応でブラ
ンクの約１８％の収縮を示した。さらに、一番目のアミ
ノ酸残基を欠くジペプチドである、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−ＯＨ（７）も同様にアセチルコリンエステラーゼ阻害
活性を示したが、三番目のアミノ酸残基を欠くジペプチ
ドであるＨ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ベーリング社製）
は、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を示さなかっ
た。
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ（３）（以下、ＧＬＴと称
する）は、図３−Ｄに示すように、９０分間反応でブラ
ンクの約１８％の収縮を示した。さらに、一番目のアミ
ノ酸残基を欠くジペプチドである、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−ＯＨ（７）も同様にアセチルコリンエステラーゼ阻害
活性を示したが、三番目のアミノ酸残基を欠くジペプチ
ドであるＨ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ベーリング社製）
は、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を示さなかっ
た。
【００２８】以上のことから、本発明のＡＬＴおよびそ
の類縁ペプチドは、アセチルコリンエステラーゼ活性を
完全に抑制するのではなく、その反応速度を低下させる
作用があることが明らかとなった。
の類縁ペプチドは、アセチルコリンエステラーゼ活性を
完全に抑制するのではなく、その反応速度を低下させる
作用があることが明らかとなった。
【００２９】
【発明の効果】本発明のＡＬＴおよびその類縁ペプチド
は、ユムシ体壁の内側輪状筋の収縮を抑制し、アセチル
コリンエステラーゼの反応速度を低下させる作用を有
し、神経伝達系を解明するための生化学試薬として有用
である。
は、ユムシ体壁の内側輪状筋の収縮を抑制し、アセチル
コリンエステラーゼの反応速度を低下させる作用を有
し、神経伝達系を解明するための生化学試薬として有用
である。
【００３０】さらに、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ（７）
とＨ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨとの比較により、アセチル
コリンエステラーゼ阻害活性の発現には、Ｃ末端の−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨの構造が必要であることが明らかに
なった。このことは、本発明のＡＬＴおよびその類縁ペ
プチドは、神経伝達系における構造−活性相関を明らか
にすることに結び付き、また、生体内の重要な酵素であ
るアセチルコリンエステラーゼの反応速度を低下させる
作用を有するため、この酵素を非可逆的に阻害するので
はなく、その反応速度をコントロールするという、全く
異なった切り口から、新たな医薬および農薬へのアプロ
ーチを提供するものである。
とＨ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨとの比較により、アセチル
コリンエステラーゼ阻害活性の発現には、Ｃ末端の−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨの構造が必要であることが明らかに
なった。このことは、本発明のＡＬＴおよびその類縁ペ
プチドは、神経伝達系における構造−活性相関を明らか
にすることに結び付き、また、生体内の重要な酵素であ
るアセチルコリンエステラーゼの反応速度を低下させる
作用を有するため、この酵素を非可逆的に阻害するので
はなく、その反応速度をコントロールするという、全く
異なった切り口から、新たな医薬および農薬へのアプロ
ーチを提供するものである。
【図１】図１は、逆相高速液体クロマトグラフィーにお
ける最終の活性成分の溶出パターンを示す図面である。
ける最終の活性成分の溶出パターンを示す図面である。
【図２】図２は、電気刺激によるユムシ体壁の内側輪状
筋の収縮を示した図面であり、ＡＬＴは電気刺激による
ユムシ体壁の内側輪状筋の収縮を抑制する。
筋の収縮を示した図面であり、ＡＬＴは電気刺激による
ユムシ体壁の内側輪状筋の収縮を抑制する。
【図３】図３は、ムラサキイガイ足糸前索引筋の摘出標
本の収縮を示した図面であり、図３−Ａは、ブランク
（アセチルコリンエステラーゼおよび検体無添加） 図３−Ｂは、コントロール（検体無添加） 図３−Ｃは、ＡＬＴ添加、９０分間処理 図３−Ｄは、ＧＬＴ添加、９０分間処理 における、ムラサキイガイ足糸前索引筋の摘出標本の収
縮を示した図面である。
本の収縮を示した図面であり、図３−Ａは、ブランク
（アセチルコリンエステラーゼおよび検体無添加） 図３−Ｂは、コントロール（検体無添加） 図３−Ｃは、ＡＬＴ添加、９０分間処理 図３−Ｄは、ＧＬＴ添加、９０分間処理 における、ムラサキイガイ足糸前索引筋の摘出標本の収
縮を示した図面である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年７月２３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
Claims (1)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ ．．．．．．．．（１） （式中、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定め
る３文字表記により示し、ＸａａはＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖ
ａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ或いは単結合のいずれかを示
す。）で表される新規ペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3295234A JPH0656887A (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 神経ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3295234A JPH0656887A (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 神経ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0656887A true JPH0656887A (ja) | 1994-03-01 |
Family
ID=17817955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3295234A Pending JPH0656887A (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 神経ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0656887A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100457897C (zh) * | 2006-03-28 | 2009-02-04 | 中国海洋大学 | 一种血栓溶解酶的制备方法及其应用 |
| CN110235921A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-09-17 | 山东大学 | 一种海鲜肠衣的制备方法及其应用 |
-
1991
- 1991-08-23 JP JP3295234A patent/JPH0656887A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100457897C (zh) * | 2006-03-28 | 2009-02-04 | 中国海洋大学 | 一种血栓溶解酶的制备方法及其应用 |
| CN110235921A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-09-17 | 山东大学 | 一种海鲜肠衣的制备方法及其应用 |
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