JPH0657718B2 - ポリペプチドの分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はポリペプチド（たとえばタンパク質）の分離方
法、さらに特に第１ポリペプチド分画および第２ポリペ
プチド分画を含有する混合溶液中の第２ポリペプチドか
ら第１ポリペプチド分画を、これらの分画の一方の選択
的沈殿により分離する方法に関する。

ポリマー系沈殿剤を使用する従来開示されているタンパ
ク質精製用の単相法は両方共にタンパク質の溶解度の差
に基づくものである２種の一般的方法に分けられる。一
つの方法では中性ポリマーをタンパク質溶液に加えて目
的タンパク質の溶解度を減少させ、これにより溶液から
沈殿させる。「目的タンパク質」なる用語はポリマー系
沈殿剤とのその相互反応の結果として溶液から沈殿され
るタンパク質またはタンパク質分画を意味する。中性ポ
リマー系沈殿方法は重大な欠点を有する。中性ポリマー
を使用する沈殿は通常、非常に非選択性である。中性ポ
リマー系沈殿剤の使用は多くの場合に、有意の沈殿を達
成するためには溶液のpHが目的タンパク質の等電点に近
いことが必要である。さらに、この方法はタンパク質お
よび中性ポリマーの両方の濃度が比較的高いことが通
常、沈殿の生起に要求されるので、稀タンパク質溶液に
は適用できない。

もう一つの方法では、帯電ポリマーを使用して、目的タ
ンパク質と複合体を生成させる。この複合体は、通常、
非複合化目的タンパク質よりはるかに溶解度が低いの
で、溶液から沈殿する。帯電ポリマー系沈殿剤は目的タ
ンパク質に対してさらに特異性であり、化学量論的量だ
けのポリマーを必要とするが、沈殿は多くの場合にに非
常に狭い範囲の操作条件、すなわちpH、タンパク質濃度
およびポリマー濃度でだけ生起する。さらに、沈殿は尿
素のようなカオトロピツク剤（chaotropic agent）の存
在で減少される。

水性２相系を使用するタンパク質沈殿方法がまた開示さ
れている。これらの方法は水性溶液中のポリマーの非両
立性およびその他の汚染的タンパク質に対する目的タン
パク質の分配係数にもとづいている。この非両立性の原
因はポリマー鎖（coil）が相互に貫通できないためであ
ると信じられる。この結果、ポリマーＡを非両立性ポリ
マーＢと充分に高いポリマー濃度で混合すると、水性２
相系が生成できる。同様に、水性多相系は数種の非両立
性ポリマーを充分に高い濃度で混合することにより得る
ことができる。これらの水性多相系のためのポリマーは
目的タンパク質の溶解度が一方のポリマー相でその他の
ポリマー相よりも高いように選択する。この分配係数は
少量の塩または高分子電解質の添加により幾分増大され
る。残念なことに、多相法はタンパク質に富む相の分
離、次いでそこからのタンパク質の採取を必要とする。

ここに、帯電ポリマー系沈殿剤を使用するポリペプチド
分離効率が帯電ポリマーに加えて、少なくとも一種の可
溶性中性ポリマーを使用することにより増大できること
は見い出された。この帯電ポリマーの効率は目的分画の
沈殿および（または）帯電ポリマー系沈殿剤の目的タン
パク質分画に対する選択性が改善あるいは別様に変えら
れることにより増大される。

従つて、本発明の総体的目的はポリペプチドの改善され
た分離方法を提供することにある。

つまり、本発明の目的は高収率を達成できる分離方法を
提供することにある。

本発明のもう一つの目的は高選択性が得られる分離方法
を提供することにある。

本発明のさらにもう一つの目的は低い目的タンパク質濃
度で操作できる方法を提供することにある。

本発明のさらにもう一つの目的は比較的低い帯電ポリマ
ー濃度で操作できる分離方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的はpHおよびカオトロピツク剤の
ような物質の存在等の点で広範囲の条件下に操作できる
分離方法を提供することにある。

本発明のこれらのおよびその他の目的並びに利点は以下
の記載および実施例から当業者にとつて明白であろう。

第１図は代表的等電的集中分布を単純に示すものであ
る。

本発明は第１ポリペプチド分画および第２ポリペプチド
分画の混合溶液中の第２ポリペプチド分画から第１ポリ
ペプチド分画を、これらの分画の一方の選択的沈殿によ
り分画する方法を提供する。本発明の方法においては、
少なくとも一種の可溶性帯電ポリマーを使用してポリペ
プチド分画の一種を沈殿させるとともに、少なくとも一
種の可溶性中性ポリマーを使用して帯電ポリマー沈殿剤
の効率を増大させる。本明細書で使用するかぎりにおい
て、「可溶性ポリマー」なる用語はこれらのポリペプチ
ド分画の溶液中に可溶であることを意味する。

本発明の方法は帯電ポリマーおよび中性ポリマーを適当
に選択することにより、特定のポリペプチド分画を沈殿
させることができるとともに、溶液中の他のポリペプチ
ドを溶液中に残すことができる。本発明の方法の実施に
使用できるポリマーはホモポリマー、コポリマーまたは
ブロツクポリマーのような所望の沈殿を実施できる全て
のポリマーを包含する。選択されるポリマーの分子量は
以後で説明するが、重合体の固有の化学的性質が主とし
て考慮されるべきであることが以後の記載から明白にな
るであろう。

本発明が非常に広い用途を有することは以下の記載から
明白であるが、選択されるポリマーとの選択的相互反応
はポリペプチド分画間のイオン的性質の差違が減少する
ほど困難になる。本発明の方法を一般的にポリペプチド
について説明するが、この方法の適用が実施不能である
場合を構成しまたは発見することは予知できることであ
る。たとえば、特定のポリペプチドの対立形（allelic
form）の分離は、かなりの場合に、主要配置の差違がポ
リペプチド分画間の化学的性質における充分の差違をも
たらすに充分でないと、実施不能である。ポリペプチド
分画が化学的特徴の点で極めて近似している場合には、
分画の一つを選択的に誘導体化して、２種の分画間に本
発明の方法の適用を可能にするに充分なイオン的差違を
付与することができる。

本発明はタンパク質のような高分子量ポリペプチドを含
む２種の分画間の混合溶液に非常に容易に適用される
が、この方法がこのような場合に制限されないものと明
白に理解されるべきである。むしろ、本発明は充分なイ
オン的性質の差違が存在するかぎり、ジペプチド、ゴリ
ペプチド、テトラペプチドおよび高級ポリペプチドを含
む混合溶液に適用できる。重要な生物学的に活性なポリ
ペプチドには、これらに限定されないが、インターフエ
ロン、成長ホルモン放出性因子、プロラクチン類、胎盤
性ラクトゲン、インシユリン（またはその各ポリペプチ
ド鎖のどちらか）およびソマトメジン類、並びに１種ま
たは２種以上のアミノ酸が置き換えられている天然産出
分子の同族体が包含される。ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ
および鳥類（たとえばニワトリ）ソマトトロピンのよう
なソマトトロピン（成長ホルモン）が特に重要である。

「混合溶液」なる用語は目的ポリペプチド分画と汚染性
ポリペプチド分画とを含有する溶液を意味する。各分画
は少なくとも１種のポリペプチドを含有する。混合溶液
としては、これらに限定されないが、細胞抽出物およ醗
酵ブロスを含む溶液が包含される。適当な細胞抽出物は
細菌、酵母、植物および動物細胞の破解により得られる
抽出物を包含する。細胞は天然産出のものであつてもあ
るいは非生来のポリペプチドを生成させるために遺伝子
的に転換されたものであつてもよい。細胞抽出物を本発
明の実施に使用する場合に、細胞抽出物は慣用の方法に
より予備処理して、核酸および（または）不溶性の汚染
性細胞物質を除去して、帯電ポリマーとの競合的相互反
応を最低にすると好ましい。

明確におよび簡潔にするために、以下の本発明の説明お
よび実施例は単一工程操作について行なう。しかしなが
ら、本発明の方法は要求される分離が単一工程では達成
できない場合には、多工程方式で操作できることが理解
されるべきである。さらにまた、本発明の利点が多工程
実施態様の種種の工程で異なるポリマーの組合せを使用
できることが理解されるべきである。これはタンパク質
系溶液の組成が工程毎に変化せざるをえないからであ
る。多工程操作は目的分画が複数のポリペプチドを含有
する場合に有用である。このような操作では、各工程で
目的タンパク質の一成分を沈殿させることができる。

帯電ポリマーは既定の操作pHにおけるその電荷が目的ポ
リペプチド分画の電荷と反対の極性であるようにして、
目的分画と相互反応させて沈殿を生成させるように選択
する。帯電ポリマーの選択にあたつては、先ずポリペプ
チド含有混合溶液の電荷分布を測定すべきである。ポリ
ペプチドは通常、各アミノ酸上に含まれているイオン化
性置換基の存在により帯電している分子である。しかし
ながら、或るpHでは、ポリペプチドがゼロの固有電荷
（net charge）を有し、および両性イオンとして挙動す
る。ポリペプチドが固有電荷を有しないpHは等電点（p
I）と称される。ポリペプチドのpIはポリペプチドを含
むアミノ酸の各pK値に依存して変わる。そのpI以上のpH
では、ポリペプチドは負の固有電荷を有する。そのpI以
下のpHでは、ポリペプチドは陽の固有電荷を有する。pI
値からの既定の逸脱についての電荷の範囲は特定のポリ
ペプチドに依存して変わる。

ポリペプチド含有溶液の相対pI値は等電点集中法（isoe
lectric focusing）により決定できる。特定のpI値を有
するポリペプチドの大体の量は差動走査濃度計を使用す
ることにより分光光度的に測定できる。第１図は等電点
集中法からの実験結果を示すものである。

第１図(a)では、目的分画は汚染的分画のpI値よりも低
いpI値を有する。このような場合に、汚染的分画のpIよ
り低いが目的分画のpI以上のpIで分離方法を実施でき
る。汚染的分画は負の固有電荷を有し、そして目的分画
は陽の固有電荷を有する。目的分画を沈殿させるために
は、分離走査pHで負電荷を有するポリマーを選択する。

第１図(b)では、目的分画が汚染的分画以上のpI値を有
する。このような場合には、目的分画のpI値以下であつ
て、汚染的分画のpI値以上のpI値で実施する。汚染的分
画は陽の固有電荷を有し、他方目的分画は負の固有電荷
を有する。目的分画を沈殿させるためには、分離操作pH
で陽電荷を有するポリマーを選択する。

第１図(c)では、目的分画が１種の汚染的分画のpI値以
上であつて、もう１種の汚染的分画のpI値以下のpI値を
有する。このような場合には、分離は一工程より多い工
程で分離を実施すると好ましい。先ず目的分画のpI値以
下であるが、汚染的分画の一方のpI値以上のpHで分離を
行なう。既定のpHで陽電荷を有するポリマーおよび以後
で説明するとおりに選ばれる適当な中性ポリマーを使用
して、溶液から一方の汚染的分画を沈殿させ、目的分画
および他の汚染的分画を溶液中に残す。第２段階の分離
は目的分画のpI値以上であるが、他の分画のpI値以下の
pHで行なう。操作pHで負電荷を有するポリマーを選択し
て目的分画を以後で説明するとおりに選ばれる適当な中
性ポリマーと組合せて、溶液から沈殿させる。しかしな
がら、前工程からの上澄液が次の工程における分離を干
渉する場合には、ポリマー系材料の洗浄を行なわなけれ
ばならないことがあることは理解されるべきである。

或る種の場合には、全ポリペプチドが操作可能pH範囲内
で同一極性を有する。このような場合には、目的分画と
汚染的分画との間の電荷の差を最少にするpHを選択す
る。分画の一方が既定pHで大きい方の固有電荷を有する
べきであるので、このpHで反対の極性を有する帯電ポリ
マーがこの分画と強力に相互反応する。さらに、目的ポ
リペプチド分画と相互反応するに充分なだけの帯電ポリ
マーが存在するように、化学量論的量の帯電ポリマーを
使用する。

帯電ポリマーについての主要パラメーターは操作pHにお
けるその極性にあるので、帯電ポリマー沈殿剤の選択に
おいて考慮されるべきその他のパラメーターはこれに限
定されないが、ポリマー上の帯電基のタイプ、ポリマー
分子当りの帯電基の数で示される電荷濃度、ポリマーの
分子量および溶液のpHを包含する。帯電基のタイプは各
種基のpK値が特定の操作pHにおけるこのポリマーの固有
電荷を決定するので、重要である。ポリマー沈殿剤上の
帯電基の数は沈殿能がかなりの場合に、固有電荷が高く
なるに従い増大することから重要である。帯電ポリマー
の分子量は分子量の高いポリマーが分子量の低いポリマ
ーに比較して、全てのその他の性質が均等である場合
に、低いポリペプチド濃度で沈殿を生じさせることがで
きることから重要である。通常、一種類だけの帯電ポリ
マーが使用されるが、２種以上の帯電ポリマーを使用す
ることもできる。本発明の実施に適当な帯電ポリマー沈
殿剤の選択に用いられるパラメーターは帯電ポリマーを
単独で使用する場合と或る程度までほとんど同一であ
る。しかしながら、以後で説明するように、帯電ポリマ
ーと中性ポリマーとの間の相互反応がまた考慮される。

目的ポリペプチド分画のその他の汚染的ポリペプチドに
対する相対電荷は溶液のpHを目的ポリペプチド分画のpI
値と近いかまたは離れたレベルに調整することにより増
大または減低することができる。同様に、目的ポリペプ
チド分画の極性は溶液のpHをポリペプチド分画のpI値以
上または以下に調整することにより変えることができ
る。実質的に化学的論的量の帯電ポリマーが本発明の実
施に使用できることは明白であるべきである。しかしな
がら、特定の最適濃度は使用するポリマー系および操作
条件に必ず依存する。使用できる帯電ポリマーとして
は、これらに限定されないが、ポリアクリル酸、デキス
トランスルフエート、カルボキシメチルセルロース、ポ
リメタアクリル酸、ジエチルアミノエチルデキストラン
およびポリエチレンイミンが包含される。別法として、
前記の要求される性質を有する帯電ポリマーが特定の用
途に応じて容易に合成できる。

本発明は帯電ポリマー系沈殿剤を使用するポリペプチド
分離効率が帯電ポリマーに加えて、少なくとも１種の可
溶性中性ポリマーを使用することにより格別に増大させ
うるという驚くべき発見を包含する。帯電ポリマーの効
率は目的分画の沈殿および（または）目的ポリペプチド
分画の沈殿に対する帯電ポリマー系沈殿剤の選択性を改
善または別様に変更することにより増大させることがで
きる。中性ポリマーは(1)中性ポリマーおよび帯電ポリ
マーと目的ポリペプチド分画との相互反応生成物の間、
および（または）中性ポリマーと溶液中に残すポリペプ
チド分画との間の非イオン的特性の差異によつて、停電
ポリマー沈殿剤の効率を増大する。本発明の実施に利用
される好ましい非イオン的性質の差異は疎水性度／親水
性度差異である。対象分画、並びに基本的中性および帯
電ポリマーの相対的疎水性度／親水性度は逆転相クロマ
トグラフイにより決定できる。この技法は文献に詳しく
説明されており、特に次の文献に記載されている：レグ
ラーら（Regnier）のアナリイテイカル バイオケミス
トリイ（Anal.Biochemistry）１０３、１〜２５頁（１
９８０年）；レグナー（Regnier）のサイエンス（Scien
ce）、２２２、４６２１号、２４５〜２５２頁（１９８
３年）；およびフアースナフら（Fausnaugh）のアナリ
イテイカル バイオケミストリイ、１３７、４６４〜４
７２頁（１９８４年）。本発明の実施に使用する中性ポ
リマーの選択にあたつては、その疎水性／親水性特性が
帯電ポリマーと目的分画との相互反応生成物のこの特性
と実質的に反対であると好ましいが、これは必須ではな
い。相互反応生成物の非イオン的特性は帯電ポリマーお
よび相互反応生成物を含む目的分画の非イオン的性質お
よびそれらの特別の配座的相互作用に依存して変わる。
この相互反応生成物の非イオン的性質はかなりの場合
に、帯電ポリマー幹鎖の非イオン的性質によりほぼ推定
できる。この推定の精度は帯電ポリマーの濃度を最適に
した系についてさらに補正できる。「帯電ポリマー幹
鎖」なる用語は帯電置換基で誘導体化する前のポリマー
を意味する。たとえば、デキストランは帯電ポリマー
ジエチルアミノエチルデキストランの幹鎖ポリマーであ
る。帯電ポリマー幹鎖が基本的に親水性である場合に
は、疎水性の中性ポリマーが好ましい。充分に理解され
ていないが、中性ポリマーと相互反応生成物との間の疎
水性／親水性差が目的ポリペプチド分画の沈殿度をさら
に増加させることにより帯電ポリマー沈殿剤の増大され
た効率を多くの場合にもたらす。

かなりの場合に、中性ポリマーの存在は帯電ポリマー単
独では沈殿の生成に失敗する場合に目的ポリペプチド分
画の沈殿を達成させることができる。その他の場合に、
中性ポリマーの存在は帯電ポリマー沈殿剤の低濃度での
分離を実施可能にできる。この目的には、中性ポリマー
の濃度およびその分子構造が考慮されるべき２つの最も
重要なパラメーターである。中性ポリマーの濃度が高い
と、多くの場合に、目的分画の濃度が低い溶液からの沈
殿を生じさせ、または増大させる。中性ポリマーの高い
濃度に対する応答は比較的高濃度で目的分画を含有する
溶液に対してはあまり劇的ではない。線状構造を有する
中性ポリマーが一般に、同一分子量を有する分枝鎖状構
造を有するものよりもさらに有効な沈殿剤である。その
他の性質の全部が均等である場合に、高分子量の中性ポ
リマーがさらに有効な第２沈殿剤になる。

中性ポリマーが溶液中に残すポリペプチド分画のものと
類似する非イオン的特性を有するとまた好ましい。充分
に理解されていないが、この関係は多くの場合に、目的
分画に対する帯電ポリマー沈殿剤の増大された選択性を
もたらす。

水溶性中性ポリマーが一般に、本来親水性であることは
当業者にとつて明白であり、これらのポリマーは逆転相
クロマトグラフイのような技法によりおよび溶解度測定
により疎水性度について順位をつけることができる。こ
の点については、ザスラブスキイ（Zaslavsky）らのジ
ヤーナル オブ クロマトグラフイ（J.Chromatograph
y）、２８５、６３〜６８頁（１９８４年）を参照でき
る。たとえば、慣用の水溶性中性ポリマーとしては、
（疎水性度の大きい順に）、デキストラン スルフエー
ト、カルボキシメチル デキストラン、デキストラン、
ヒドロキシプロピルデキストラン、メチルセルロース、
ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールおよび
ポリプロピレングリコールが包含される。市販されてい
ない中性ポリマーが適当であると見い出された場合に
は、必要な非イオン的性質を有する中性ポリマーを合成
できる。多くの場合に１種だけの中性ポリマーを使用す
るが、１種以上の中性ポリマーを使用するように選択す
ることができる。

本発明の実施においては、混合溶液を既定の中性ポリマ
ーの存在下に既定の帯電ポリマー沈殿剤と接触させると
好ましい。これは混合溶液を既定の重合体の生成混合物
に加えることにより達成できる。添加方法は本発明の実
施要件と解釈されるべきではないが、この方法の重要性
は系の反応性度および沈殿生成速度に依存する。

本発明の方法は前記の指示に従い、汚染性タンパク質を
溶液から沈殿させるか、または所望のポリペプチド分画
を溶液から沈殿させることにより実施できる。ポリペプ
チド溶液の状態に応じて、一つの任意条件が別の条件よ
りもさらに都合が良いことがあることは当業者にとつて
明白である。本発明を次の代表的態様の水性系について
説明するがこれらに限定されないことは充分に理解され
るべきである。本発明は前記指示に従い非水性溶剤中で
実施することもできる。有機溶剤の使用が本発明の実施
に必要な性質の差異を拡大させうることは確かなことで
ある。

次例は本発明の実施をさらに明らかにするものである。
これらの例は説明の目的だけでここに包含されているの
であつて、いずれの点でも本発明の範囲を制限しようと
するものではない。

例１ 本発明をシーバーグ（Seeburg）らにより２(1)デイエヌ
エイ（ＤＮＡ）３７〜４５頁（1983年）に記載のとおり
にして生成したＮ−メチオニル ウシ ソマトトロピン
（ＭＢＳ）を汚染的大腸菌（E.coli）タンパク質から分
離することにより成功裏に証明された。約９〜１２のpH
で、ＭＢＳは僅かに負に帯電しており、汚染的大腸菌タ
ンパク質よりも疎水性である。この汚染性タンパク質は
陽に帯電したポリマー系沈殿剤により溶液から沈殿させ
ることができる。これは陽に帯電したポリマーがこれら
のタンパク質に対しＭＢＳに比較して強力に相互反応す
るからである。比較的疎水性の中性ポリマーはこの帯電
ポリマー沈殿剤の効率を増大させる。

ＭＢＳ2.3mg／ｍおよび汚染的大腸菌タンパク質4.3mg
／ｍを含有する水性タンパク質含有溶液を使用する。
この溶液は10.5のpHを有し〔4.5Ｍ尿素、５０ｍＭトリ
ス（ヒドロキシメチルアミノメタン）〕、０〜４℃の温
度に保持する。比較的疎水性の中性ポリマーであるポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ；分子量：３５００〜４０
００）をその濃度が中性および帯電ポリマーの両方を含
有する生成混合物にもとづき１０重量％であるように加
える。ジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥ−
デキストラン；３個のグルコース単位毎に１個のＤＥＡ
Ｅ置換基を有し、見掛け平均分子量500,000を有する）
を汚染的タンパク質１mg当り約0.2mgの量で加える。沈
殿した汚染タンパク質は低速遠心分離により除去する。
分光光度計および高速液体クロマトグラフイの両方によ
り上澄液を分析すると、９５重量％の純度を有するＭＢ
Ｓ収率９５重量％を示した。本発明の方法により得られ
たこのＭＢＣの収率および純度はどちらかのポリマーを
単独で使用した場合に優る有意の改善を示している（例
Ａ、例Ｂおよび比較例Ｃ参照）。

例２ ポリエチレングリコール濃度が約6.6重量％である以外
は例１に概述した方法を使用する。清明な上澄液の分析
は純度８７重量％のＭＢＳの収率９４重量％を示した。

例３ ポリエチレングリコールをその溶液中の最終濃度が最終
混合物の全重量にもとづき1.0重量％であるように加え
る以外は例１に記載の方法に従う。清明な上澄液の分析
は純度７８重量％のMBSの収率９６重量％を示した。

例４ ＤＥＡＥ−デキストランの濃度が汚染的タンパク質mg当
り0.35mgである、およびＰＥＧ（平均分子量：〜１５０
０）を使用する以外は例２に記載の方法に従う。清明な
上澄液の分析は純度９３重量％のＭＢＳの収率７８重量
％を示した。

例５ 溶液のpHを水酸化ナトリウム水溶液を用いて12.2に調整
し、および汚染性タンパク質１ｇ当り1.0ｇのＤＥＡＥ
−デキストランを使用する以外は例１に記載の方法に従
う。上澄液の分析は純度９８重量％のＭＢＳの収率９８
重量％を示した。

例６ 実験を室温（２５℃）で行なう以外は例１に記載の方法
に従う。上澄液の分析は例１について得られた結果と実
質的に同一のＭＢＳ収率および純度を示した。

例７ ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ；分子量４２５）を
ポリエチレングリコールの代りに使用する以外は例１に
記載の方法に従う。上澄液の分析は純度９３重量％のＭ
ＢＳの収率８７重量％を示した。

例８ ポリビニルアルコール（ＰＶＡ；分子量5,000）および
汚染的タンパク質１ｇ当り0.32ｇのＤＥＡＥ−デキスト
ランを使用する以外は例２に記載の方法に従う。上澄液
の分析は純度９０重量％のＭＢＳの収率７５重量％を示
した。

例９ ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；分子量40,000〜60,000）
をＤＥＡＥ−デキストランの代りに使用する以外は例１
に記載の方法に従う。ＰＥＩの使用濃度は汚染的タンパ
ク質１ｇ当り0.225ｇである。上澄液の分析は純度９９
重量％のＭＢＳの収率６３重量％を示した。

例１０ カチオン性ポリアミン樹脂〔モンサント社（Monsanto C
ompany）によりサントフロツク（ＳＡＮＴＯＦＬＯ
Ｃ ）Ｃの商品名で市販されているもの〕をＤＥＡＥ−
デキストランの代りに使用する以外は例１に記載の方法
に従う。ポリアミンの使用濃度は汚染的タンパク質１ｇ
当り0.1ｇである。上澄液の分析は純度９９重量％のＭ
ＢＳの収率６５重量％を示した。

例１１ 汚染的タンパク質１ｇ当り0.5ｇのＤＥＡＥ−デキスト
ランを使用する以外は例２に記載の方法に従う。清明な
上澄液の分析は純度９６重量％のＭＢＳの収率５４重量
％を示した。

例Ａ 中性ポリマーを使用しない以外は例１に記載の方法に従
う。溶液はＤＥＡＥ−デキストランを添加すると混濁し
た。上澄液の分析は純度６９重量％のＭＢＳの収率９６
重量％を示した。

例Ｂ 汚染的タンパク質１mg当り0.5mgのＤＥＡＥ−デキスト
ランを使用する以外は比較例Ａに記載の方法に従う。上
澄液の分析は純度６６重量％のＭＢＳの収率８８重量％
を示した。

比較例Ｃ ＰＥＧだけを使用する（帯電ポリマーは使用しない）以
外は例１に記載の方法に従う。沈殿は見られなかった。

比較例Ｄ ＰＥＧ濃度を約５０重量％まで変える以外は比較例Ｃに
記載の方法に従う。この場合にもまた、沈殿が帯電ポリ
マーの不存在下に見られなかつた。

例１２ フイコシアニン（分子量：〜103,000；pI：〜5.2〜5.
3）およびヘモグロビン（分子量：〜64,500；pI：〜6.8
〜7.0）をリン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ）中に含
有するタンパク質混合水溶液を製造する。この混合物は
7.5のpHおよびフイコシアニンが約２０重量％である６m
g／ｍの総タンパク質濃度を有する。このpHで量タン
パク質は負に帯電しているけれども、フイコシアニンは
ヘモグロビンよりも実質的に低いpI値を有するので、フ
イコシアニンが最も負に帯電している。逆転相クロマト
グラフイによりタンパク質組成を分析すると、フイコシ
アニンがヘモグロビンよりもさらに疎水性であることを
示した。それで、ＤＥＡＥ−デキストランのような陽に
帯電したポリマーを中性ポリマーとともに使用してフイ
コシアニンタンパク質を選択的に沈殿させることができ
る。ＤＥＡＥ−デキストランは最終混合物がフイコシア
ニン１ｇ当りＤＥＡＥ−デキストラン（平均分子量：〜
500,000；〜１ＤＥＡＥ単位／３グルコース単位）0.4ｇ
を含有するように、ＰＥＧ（平均分子量：〜8,000：５
重量％濃度）の存在下にタンパク質混合物に加える。沈
殿の組成を上澄液の分析により測定すると、沈殿物中の
フイコシアニン収率が４５重量％であり、純度が８８重
量％であることを示した。比較例ＥおよびＦではどちら
かのポリマーを単独で添加すると沈殿が生じないことに
注目されるべきである。

例１３ ＰＥＧが１０重量％の濃度で存在する以外は例１２に記
載の方法に従う。上澄液の分析による沈殿物組成の測定
は沈殿物中のフイコシアニンの収率は８０重量％であ
り、純度が４０重量％であることを示した。

中性ポリマー（ＰＥＧ）およびヘモグロビンタンパク質
は疎水性／親水性特性で実質的に異なつているが、ＰＥ
Ｇ（比較的疎水性）とＤＥＡＥ−デキストランとフイコ
シアニンとの相互反応生成物（デキストラン幹鎖により
示されるように比較的親水性）との間の非イオン的特性
の差異が収率の増加によるフイコシアニン沈殿の増大を
もたらす。ＰＥＧの不存在では沈殿は生成せず、例１１
の５重量％ＰＥＧ濃度で見られた結果と比較して、１０
重量％のＰＥＧ濃度では沈殿が増加することは確かであ
る。

例１４ デキストラン（平均分子量：〜70,000）をＰＥＧの代り
に１０重量％の濃度で使用する以外は例１２に記載の方
法に従う。上澄液の分析による沈殿物組成の測定は沈殿
物中のフイコシアニン純度が８０重量％であり、収率が
３４重量％であることを示した。

例１５ デキストランが２０重量％の濃度で存在する以外は例１
４に記載の方法に従う。上澄液の分析による沈殿物組成
の測定は沈殿物中のフイコシアニン純度が７５重量％で
あり、収率が６７重量％であることを示した。

例１１および１２と比較して、中性ポリマーであるデキ
ストランはヘモグロビンタンパク質（親水性）と同様の
疎水性／親水性特性を有する。この中性ポリマーを使用
すると、生成する沈殿の高い純度により示されるように
ＰＥＧよりも高い選択性が得られる。さらにまた、２０
重量％のデキストランは実質的に同一の純度を保持しな
がら１０重量％実験（例１３）よりも実質的に高い収率
が得られる。

比較例ＥおよびＦ ＤＥＡＥ−デキストランおよびＰＥＧを別々に使用する
以外は例１２に記載の方法に従う。

ＤＥＡＥ−デキストランを単独で添加しても沈殿は生じ
ない。同様にＰＥＧを単独で添加しても沈殿は生じな
い。

例１６ インシユリン（分子量：〜6,000；pI：5.3）およびウシ
血清アルブミン（分子量：〜67,000；pI：4.8）を酢酸
ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ）中に含有する水性タンパ
ク質混合物を製造する。この混合物は3.8のpHおよびそ
の約４０重量％がインシユリンである3.5mg／ｍの総
タンパク質濃度を有する。このpHで両タンパク質は陽に
帯電しており、それらの各pIが非常に近接しているので
多分、類似の固有電荷を有する。疎水性クロマトグラフ
イはウシ血清アルブミンよりもインシユリンがさらに疎
水性であることを示した。ポリアクリル酸のような負に
帯電したポリマーを中性ポリマーと組合せて使用して２
種のタンパク質の一方を選択的に沈殿させることができ
る。この選択性は中性ポリマーの疎水性度に強力に依存
する。ポリアクリル酸（平均分子量：〜90,000）を最終
混合物が1.2×１０^−２重量％のポリアクリル酸を含有
するように、デキストラン（平均分子量：〜10,000）の
存在下にタンパク質混合物に加える。非常に親水性のポ
リマーであるデキストランは疎水性のインシユリンを溶
液から沈殿させるのに好適である。上澄液の分析による
沈殿物組成の測定は沈殿中のインシユリンの純度９１重
量％および収率５１重量％を示した。比較例ＧおよびＫ
ではデキストラン単独で沈殿が生起せず、ポリアクリル
酸を単独で使用しても沈殿中のインシユリンの純度の有
意の改善が得られないことが注目される。

例１７ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；平均分子量：〜8,00
0）をデキストランの代りに使用する以外は例１６に記
載の方法に従う。ＰＥＧはデキストランよりもさらに疎
水性の中性ポリマーであるので、インシユリンよりもウ
シ血清アルブミンの沈殿に好適である。上澄液の分析に
よる沈殿物組成の測定は７３重量％の純度を有するウシ
血清アルブミンの５８重量％の収率を示した。

比較例ＧおよびＨ 中性ポリマーだけを使用し、帯電ポリマーが存在しない
以外は例１６および１７に記載の方法に従う。デキスト
ランを単独で添加しても沈殿は生じない。同様に、ＰＥ
Ｇを単独で添加しても沈殿は生じない。

比較例Ｋ 中性ポリマーを使用しない以外は例１６に記載の方法に
従う。ポリアクリル酸を添加すると沈殿が生じる。上澄
液の分析による沈殿物組成の測定はインシユリンについ
て４３重量％の純度および４９重量％の収率を示した。
従つて、ポリアクリル酸単独では精製は達成されない。
これは沈殿中のウシ血清アルブミンとインシユリンとの
相対量が原料溶液のものとほとんど同一であつたことに
よるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は代表的等電的集中分布を単純に示すものであ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】汚染的大腸菌タンパク質からウシ ソマト
   トロピンを選択的に分離する方法であって、汚染的大腸
   菌タンパク質およびウシ ソマトトロピンを含有する混
   合溶液を、該溶液から汚染的大腸菌タンパク質を沈殿さ
   せるに有効な一定量のジエチルアミノエチルデキストラ
   ンと混合し、次いで生成する沈殿を残りの溶液から分離
   することを含む方法。
2. 【請求項２】ソマトトロピンがＮ−メチオニル ウシ
   ソマトトロピンである特許請求の範囲第１項の方法。