JPH0659208B2 - バイオメカニカル微細構造体形成用固形非生物的基体とこれを用いた微細構造体並びに微細構造体への細胞配置方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、バイオメカニカル微細構造およびその形成に
関する。

［従来の技術と解決すべき課題］ 細胞より下位のレベルと細胞相互間のレベルにおける生
物体組織の機能と作用に関する研究とこの研究の人工装
置への応用のためには、バイオメカニカル微細構造を、
個々の細胞と非生物的基質との間に予め定められた連結
関係が成立するように形成する必要がある。顕微鏡的レ
ベルでも、この方向への若干の前進はすでにとげられて
いるが、一般的には前進は巨視的構造のレベル、すなわ
ち骨や弁の人工器官においてのみに止まり、個々の細胞
の配置関係的な特徴を利用できるまでには至っていな
い。

［発明の目的］ 本発明の目的は、前記の相互連結を果す上での問題の回
避または軽減を図り、ことに非生物的基質上に、細胞相
互間の空間的配置が予め決定された関係になるように細
胞を付着させたバイオメカニカル構造を形成することに
ある。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、バイオメカニカル微細構造体の形成の使用に
好適な固形非生物的基体であって、概して平坦に延びる
表面を有する基体に、予め定められた関係位置で実質的
に互いに間隔をもって少なくとも細胞着生力の高い領域
及び／又は細胞着生を定位する領域を0.2〜20ミクロン
の幅の多数の表面不連続部分を備えていることを特徴と
する。

また、概して平坦に延びる表面を有する固形非生物的基
体からなり、該基体は、予め定められた関係位置で実質
的に互いに間隔をもって少なくとも細胞着生力の高い領
域及び／又は細胞着生を定位する領域を0.2〜20ミクロ
ンの幅で、前記表面の前記領域に多数の細胞を付着させ
た多数の表面不連続部分を備えていることを特徴とする
バイオメカニカル微細構造体にかかるものである。

さらに、本発明は、固形非生物的基体に予め定められた
関係位置で互いに間隔をおいた位置に多数の細胞を配置
する方法であって 予め定められた関係位置で実質的に互いに間隔をもって
少なくとも細胞着生力の高い領域及び／又は細胞着生を
定位する領域を0.2〜20ミクロンの幅の多数の表面不連
続部分を備えた概して平坦に延びる表面を有する固形非
生物的基体を用意し、 前記基体表面に生理的に好適な多数の細胞を接触する ことを特徴とする配置方法である。

［発明の作用］ 前記の表面不連続体を設けることは、基体表面への細胞
着生を高め及び／又は不連続体に対し優先的な定位（or
ientation）の細胞着生を起こさせ、したがって細胞装
置間での相対的にそのような方向をとらせるものと考え
られ、その理由は細胞と基体表面の間の配置関係的相互
反応が若干容易となることによるものと思われる。前記
の不連続体が予め決定された配置に設けられる結果、細
胞は予め決定された配列をなして形成することができ、
このことがさらに個々の細胞と非生物的電気回路など非
生物的細胞構造との間の接触面をも、また細胞自体相互
関係をも支配調整を容易ならしめる。

本明細書において「不連続体」とは、何らかの形の表面
不規則形状であって、例えば縁に丸味のあるうね状体の
ように、実際には数学的不連続性のないものをも含む。
本発明に用いられる可能性のある表面不連続体諸形態と
しては、段階、溝、断面の概して直角をなすうね状体な
どが挙げられ、それらの長さは種々であり、それらは幅
と長さが似ているいわば概して円形または多角形をなす
突起と窪みも含み、窪みには基体の他方側まで貫通して
いる窪みすなわち、せん孔をも含む。さらに、不連続体
が大体において細長いときには、概して直線形をなす
が、ある場合は弓形が好ましいこともあり、弓形はらせ
ん形、ことに対数的らせん形をなす場合がある。らせん
形の不連続体の利点は、これに付着する細胞がらせん形
に沿って移動して、曲率半径の最大部分に向かって進む
ことであり、したがって細胞が当初付着した個所のどこ
であるかに拘らず、らせんの半径方向外側末端まで至ら
せることが可能である。さらに２個以上の不連続体を相
互連結させて、枝状の不連続体を形成させることもでき
る。一般に不連続体は５ナノメートル以上の高さ又は深
さを有するもので、数百ミクロンに達することもある。
しかし不連続体は50ナノメートルから２〜３ミクロンま
での高さ又は深さを有することが好ましい。

本発明のバイオメカニカル構造は、種々の生物細胞を含
みうるものであるが、細胞がある程度分極していること
と不安定性の顕著でないような細胞骨格を有することが
好ましい。好適な細胞としては、神経細胞、繊維芽細
胞、グリアの又は神経膠の細胞等があるが、比較的不安
定及び／又は非分極化の細胞骨格の細胞、例えば白血
球、リンパ球及び大食細胞等は概して好適でない。また
細胞は所要の位置において基体に付着させることがで
き、付着は直接にもまた、神経細胞の場合の樹状突起の
上に細胞の形成過程を通じても行なわれることが注目さ
れる。さらに、細胞が異なればその大きさと配置関係に
違いがあるので、与えられた不連続体の形状、大きさ及
び表面物質に応じて得られる細胞着生の強さも異なり、
したがって特定種類の細胞には特定の好ましいこれら特
徴の組合せがあるうる。その上、たとえ十分な程度の細
胞着生が得られても、不連続体の形状が細胞の非常にひ
ずんだ又は不自然な形状を生ずるようなものは、概して
好ましくない。なぜならこのような細胞形状は細胞の正
常な機能を妨げる恐れがあるからである。

但し、多少の程度の細胞変形は、基体の特定の個所で付
着し易くなるなどの利点を実際に持つ場合もありうる。

基体は一般的にはいかなる便宜の固体物質でもよいが、
但し、前記不連続体の箇所の基体表面は、そこに付着す
る細胞に対して概して不活性的かつ非毒性であって、細
胞のそこへの付着を甚しくは抑制していることのないも
のであることを要する。好適な物質には、シリカ、各種
ガラス、各種シリコン、エポキシ樹脂、ピリテトラフル
オロエチレン、ポリアミド類、部分的にヒドロキシル化
されたポリアミド類、ポリオレフィン類、ポリスチレ
ン、ポリイミド類、ポリメタクリレート類、セルロース
及び再構成されたセルロース類、黒鉛、炭素繊維及び後
述するような金属類、金属酸化物類等が挙げられる。あ
る場合は基体表面に付着する細胞のうち特定のものの方
向を指定するだけで十分なこともあるが、他の場合に
は、細胞の特定位置への着生力を高めたいこと（方向指
定とは無関係のこともありうる）、及び／又は積極的に
他の位置への細胞着生を抑制したいこともある。後者の
目的に有利な点は、本発明の方法が前記不連続体以外の
部分の前記基体表面の少なくとも一部分に対して、細胞
着生抑制物質、例えば不活性プラスチック材料を配置で
きる特徴を有することである。着生力抑制物質は、例え
ば純ｎ−パラフィン・ワックス、未処理状態の通常のポ
リスチレン又はポリプロピレン、未処理のポリオレフィ
ン類、部分加水分解されたポリビニルアセテート、さら
に高度に負荷電した表面を持つ重合体物質例えば高度に
ニトロ化された硝酸セルロースとカルボキシメチル・セ
ルロース等がある。

以上の代替として、または以上に追加して、基体上には
前記不連続体に細胞着生増進物質を選択的に配置するこ
とが好ましい。好適な細胞着生増進物質を例示すれば、
シリカ、黒鉛、炭素繊維、金、バナジウム、白金及びイ
リジウム等のような金属類、アルミナやチタン酸化物、
モリブデン酸化物、タンタル酸化物のような金属酸化物
類（対応する金属上に生成する酸化物の表面層を含
む）、適当に処理されたプラスチック材料例えば、表面
に複数のヒドロキシル基を持つよう、例えば1000平方ナ
ノメートル当り、500〜6000個のヒドロキシル基を持つ
よう表面処理したポリプロピレン又はポリスチレンさら
に部分的にヒドロキシル化されたポリイミド類、表面に
ヒドロキシル基及び／又はアミノ基を含有するよう処理
されたポリアミド類及びポリメタクリレート類を挙げる
ことができる。また、一部の物質はこれへの細胞着生の
度合は良好であるにも拘らず、他の理由例えば細胞との
科学反応によって細胞を被毒させなどの理由で、望まし
くない物質である。これら物質は、例えばヒ化ガリウム
及び銅であって、したがってこれらは通常は本発明のバ
イオメカニカル構造においては避けるべきである。その
ほか、未処理ポリスチレンのような物質は、血清等の細
胞培地中に存在することのあるα−１−トリプシン等の
蛋白質を選択的に吸収する傾向を持つので多少とも基体
への細胞着生力を妨げる場合がある。

基体には、前記不連続体に導電体又は半導体物質の突起
のその横幅が0.2〜20ミクロンの範囲内、高さも概して
同様のものを１個以上備えることが望ましい。これら突
起の形成と配置は、突起に付着する細胞に多少とも食菌
性を発揮させるようなものであることが、最も望まし
い。表面不連続体の形成は、所要の不連続体種類を形成
するに好適な方法で行なえばよい。したがって、溝の場
合は、適当に案内される精密に焦点を結ぶレーザービー
ム又はイオンビーム例えば酸素イオンビーム等を用いる
ことができる。但し、大抵の形態の不連続体はリングラ
フィの方法で形成されることが望ましい。該方法は一般
的には、光、電子又はＸ線の感受性を持つレジストによ
って適当なパターンを形成し、次に除去的及び／又は添
加的方法によって所望の材料の浮彫り構造を出現させる
ものである。除去的加工処置では、所望の材料をレジス
トで被覆した後に露光させ、露光後にイオンビーム蝕刻
等の液相又は気相的方法でエッチングを行なう。他方、
添加的加工処置では、レジストに浮彫りパターンが形成
された後に、例えば真空蒸着により、又は電気めっき等
のめっきにより、所望の材料を添加する。

当然ながら本発明は本発明の方法で生じたバイオメカニ
カル構造をも、その内容とする。

本発明のバイオメカニカル構造は種々の用途を有し、実
例としては少数の細胞、ことに神経細胞、例えばいわゆ
る神経細胞網をすなわち細胞内又は細胞間レベルにおけ
る機能及び作用上のモードに特に関連して研究する場合
とか、或いは人工器官装置、特に知覚補助機能を持つ人
工器官と外部的（電気的）駆動をつかさどる生物構造体
を研究するために資する処が大で本発明はかかる用途を
包含するものである。

［実施例］ 本発明の望ましい特徴と利点は、さらに下記の詳細な説
明から明らかである。以下の若干の好ましい実施例を、
添付図面を参照して説明する。

第１図は本発明のバイオメカニカル微細構造を示し、溶
融シリカ製の小さい平板形の基体２があり、その上部表
面３の上には２本の互いに離れた隆起構造４が金製の指
の形をなして並んでおり、各指の幅は６ミクロン、厚さ
は0.4ミクロンである。指と指との相互間隔は２〜20ミ
クロンの範囲にある。指は表面３に金をイオンビームで
エッチングして作られたものである。金製の指４の両側
においてはシリカ基体が厚さ約0.1ミクロンの未処理ポ
リスチレン層によって任意的に被覆されている。このポ
リスチレン被膜（図示省略）はトルエン溶液からの蒸発
によってシリカ表面３に塗布されたものである。ニワト
リヒヨコの脳から培養された神経細胞の懸濁液（水溶液
１ミリリットル当り細胞２〜10×10⁴。この水溶液はＨ
ａｍ塩分量Ｆ10で、１％のウシ胎児血清を含有し、かつ
トランスフェリン、インシュリン、及び神経成長因子が
添加されたもの）を前記の基体表面に塗布し、37℃で60
分間にわたり表面との接触を維持した。次いで過剰の溶
液を流し去り、基体を新鮮な培地で洗滌した。

続いて基体を検査したところ、多数の神経細胞５が基体
に対して金製ワイヤの部分に選択的に付着しており、こ
とに近接する一対のワイヤが交差する部分（図示省略）
に付着しているのが見られた。

第２図は別のバイオメカニカル微細構造11であって、溶
融シリカ基体12の上部表面14に溝13がエッチングされて
いる。この蝕刻は基体上部表面14にアルゴン・イオン・
ビームを、光レジスト層に刻まれた顕微鏡写真を通して
照射して行った。

溝の幅は約0.5〜10ミクロンの範囲である。溝内部には
金製の複数の上向き突起15がある。

各突起15の高さは約0.1〜0.5ミクロン、厚さは0.02〜0.
1ミクロンである。

これら突起には非常に平滑な表面を持たせることによっ
て、突起が容易に細胞壁を貫通して細胞壁が突起の周囲
をシールするようにすることが望ましい。突起は適当な
ホトリソグラフィ技術によって製作することができる。
突起の製作は、金その他の金属の薄い層（20〜30ナノメ
ートル）を炭化水素重合体の柱状物に沈着させることが
便宜であり、柱状物を製作するには真空形成用ポンプの
真空ポンプ油からの空胞形成的使用における電子ビーム
の重合化効果によって生ずる炭化水素重合体の柱状物に
重合させて行なう（参照文献１）。

神経細胞16を、前述と同様の方法で基体表面に塗布し
て、溝13に付着させる。図に示すように、特定の突起15
は細胞によって食作用を受け、突起は細胞内部と直接機
械的及び電気的に接続する。もし所望の導電体物質線
路、半導体物質線路、又はその他の構造体を溝内部及び
／又は溝外部に設けることができれば、細胞着生抑制被
膜を設けることも可能である。

第３図から第６図までは複数の溝17の種々の配置を示
し、これら配置は所望の細胞網18を設定するために使う
ことができる。

第７Ａ図から第７Ｉ図までは第８図から第10図までに図
示されている他の基体構造を製作するに好適なリソグラ
フィ製造工程における主要な諸段階を、系統的に図示し
たものであって、この基体構造は、細胞内部との直接の
電気的接続を果すために好適である。この工程に用いら
れる基本的なリソグラフィ技術は、先行技術として知ら
れているから、ここには簡略に説明するにとどめる。

アルミニウム金属を１枚のガラス基体上に蒸着させて、
厚さ約50ナノメートルの金属膜20を形成させる。その上
に重ねて同様の厚さの１層のホトレジスト２２を塗布
し、マスク（図に示されない）を通して露光させる。マ
スクは針までの導線のパターン（後述）を設定するため
のものである。

次にホトレジスト２１を現像することによって、保護パ
ターン22を第７Ａ図に示すように製作する。このパター
ンは、保護されていない金属20の化学的エッチングと、
これに続くレジスト・パターン22除去との結果として、
金属製導線パターン23を第７Ｂ図のように残す。続い
て、処理済の基体表面に光レジストを塗布し、レジスト
を第１のマスクのネガを当てて照射したところ、現像後
にはレジスト24は、金属製の導線パターン23以外の箇所
では全部残った（第７Ｃ図参照）。重合された混成物の
針形コラム25が導電線路（導線パターン）23が導電線路
25の所望の地点に形成される（第７Ｄ図参照）。柱状体
形成は前記地点に電子ビームの焦点をあてることによっ
て行なう。これによって形成される柱状体25は、直径が
ビーム直径の数倍あり、高さはビーム直径の多数倍の大
きさに達することがある。（参照文献１）。真空中の残
留炭化水素は、電子ビームによって重合化される。次
に、処理済の基体が更に重ねて金属で被覆されて、針先
がこれで金属化され、電気的に導電線路パターン23に接
続されたものとなる（第７Ｅ図参照）。次いで光レジス
ト24が強力な溶液中で溶解されて、レジストもまたその
上に載っている不必要な金属27も共に除去される（第７
Ｆ図参照）。こうして生じた処理済の基体を更に重ね
て、ポリイミドで被覆し、350℃で焼成して、絶縁層28
を形成する。絶縁層の厚さは、絶縁層の内部に埋った導
電線路23の高さより高く、導電線上に立っている金属化
された針26の高さよりも高い。このポリイミドの用いら
れる役割は二つあり、その一つは細胞の着生する隆起部
を形成すること、他の一つは針の導線にとって絶縁体と
なることである。次にポリイミド層28の上に重ねて、ま
ずアルミニウム29で被覆し、次に光レジスト30で被覆す
る（第７Ｇ図参照）。そしてポリイミドの隆起パターン
を設定するためのマスクを通して露光を行なう。光レジ
ストの現像とアルミニウムの化学的エッチングの後は、
この処理済基体を反応性酸素プラズマ中に置く。ポリイ
ミドのうち、アルミニウムで保護されていない部分はエ
ッチングされて消失し、ポリイミドの隆起パターン31が
残り、隆起部の壁はほぼ垂直のものとなっている（第７
Ｈ図参照）。

保護アルミニウム層29はすでに酸素プラズマエッチング
マスクとしての役割を果し終ったので、化学的エッチン
グによって除去される。次に、処理済の基体は再び酸素
プラズマエッチング装置に戻され、更にポリイミドの除
去を設け、針26がポリイミドの隆起部31上に突出してい
る状態にまで至らせる（第７Ｉ図参照）。

次に処理済基体の上には更に重ねてレジストを塗布し、
電気スクリーン・パターンを設定するマスクを用いての
露光を行なう。レジストを現像し、新たに１枚の金属層
で上を被覆し、レジスト・パターンとその上にある不必
要な金属を、共に除去した後、金属スクリーン層32で細
胞を支持させるポリイミド隆起及び接触パッド以外の試
料全体を覆う（第10図及び、特に第11図参照）。最後に
特に選定されたガラス管33を、処理済基体に接着材で取
付け、中心の生物領域、すなわち細胞の支持培地34を含
む部分で、今後は湿潤部となるところと、この周囲の電
気的領域とを分離する。針への導線35は、導電線路23の
遠い末端に接続しているものであるが、塩分を含む溶液
である細胞支持培地34からは、周囲全部が接地（アー
ス）平面の介在によって電気的に絶縁され、例外は金属
化された針26のそばの数ミクロン部分だけとなる。しか
もこの部分でさえ、針の先端36だけが絶縁されていない
のであって、先端部は、細胞支持のポリイミド隆起部31
に細胞37が付着することによって、食作用を受けた針
は、培地34から絶縁されることになる。（第９図参
照）。

第12図は本発明のその他の基体構造の概略図を示し、こ
の基体構造は、リソグラフィにより、イオンビームを適
当なマスクを通して照射することによって、ガラス板42
の表面41に、一連の対数螺旋形の溝40を形成した基体構
造である。溝40の幅は10ミクロン、深さは0.5ミクロン
である。螺旋形の最小曲率半径（内側末端43）は20ミク
ロンであり、最大曲率半径（外形末端44）は250ミクロ
ンである。この基体に対し、ＢＨＫフィブロブラスト細
胞45を、血清を含有する培地（イーグルのＭＥＭ培地。
10％トリプトーゼ・リン酸ブイヨン、及び10％ウシ血
清）中で塗布した後、37℃で２日間培養した。この期間
に螺旋40を含む領域に対しては、経時記録ビデオ記録撮
影を行ない、撮影には位相差顕微鏡写真と、非常に低照
度用のビデオカメラを用いた。後者を用いた理由は、顕
微鏡ランプからの光又は熱の照射が悪影響を及ぼす可能
性を少なくするためである。溝では細胞が僅か15〜30分
間で定着するのが見られ、溝の縁辺46上においてこの領
域上の螺旋40の半径方向との関係で拡散形を呈するのが
見られた。溝の小半径端43にある細胞47は正常に拡散す
ることがなく、無移動状態のままであったのに反し、半
径のより大な部分に定着した細胞48はこの領域の曲率半
径との相対的関係でかなりの程度まで延伸し、溝の縁辺
46に沿って外側方向に移動して、最大半径端44へと向っ
た。

本発明のバイオメカニカル構造の更に他の用途は、特に
細胞着生増大領域のバイオメカニカル構造が他の生物物
質からの細胞、及び／又は異種類の細胞から分れて来た
細胞を、形態的細胞骨格的の変化性の違いによって識別
することに関するものである。細胞及び／又は特定細胞
種類で、基体が選択的に選びとったものだけが、混合物
中から基質に癒着し、混合物のうちその他の成分から脱
離する。

第７図から第11図までの実施例に関しては、ことに第11
図の掲げる導電線路23の遮蔽体に関しては、留意すべき
ことは、ポリイミドの（又はその他の誘導性の）シース
31は導電線路23及び金属製外側遮蔽体32の寸法との関係
で相対的に決定すべきであり、またシースの誘導特性と
の関係で相対的に決定すべきであって、これによりこの
電気接続のための好適な特性インピーダンスを得るよう
にすることである。接続は、特性インピーダンスが25〜
200オームの範囲内にあるようにすることが望ましい。
ここに掲げた例では（注：第７図から第11図までは縮尺
通り描かれていない）導電線路23の厚さは約0.2ミクロ
ンとし、ポリイミド絶縁シース31の厚さは１〜２ミクロ
ンの範囲と、導電体外側遮蔽32の厚さは約0.3ミクロン
とすることが望ましい。

［参照文献１］ アプライド フィジックス レターズ［App.Phys.Lets.
29 296-298(1976)］ エイ エヌ ブラワーズ ほか［A.N.Brouers et al.］

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のバイオメカニカル構造の第１実施例の
一般的概略透視図、第２図は第２実施例の同様の透視
図、第３図から第６図まではその他の各実施例の平面
図、第７Ａ図から第７Ｉ図までは、本発明の基体構造の
製作のための過程の主要諸段階の断面図、第８図は、第
７Ａ図から第７Ｉ図までの過程によって製作された構造
の平面図、第９図、第10図および第11図は、第８図にお
ける線Ｂ−Ｂ′、Ａ−Ａ′及びＣ−Ｃ′にそれぞれ沿う
垂直断面図、第12図は本発明の螺旋状溝構造の平面図で
ある。 １：微細構造体、２：基体 ３：表面、４：隆起構造 ５：細胞

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】バイオメカニカル微細構造体の形成の使用
   に好適な固形非生物的基体（２）であって、概して平坦
   に延びる表面を有する基体（２）に、予め定められた関
   係位置で実質的に互いに間隔をもって少なくとも細胞着
   生力の高い領域及び／又は細胞着生を定位する領域を0.
   2〜20ミクロンの幅の多数の表面不連続部分（４）を備
   えていることを特徴とする固形非生物的基体。
2. 【請求項２】概して平坦に延びる表面を有する固形非生
   物的基体（２）からなり、 該基体（２）は、予め定められた関係位置で実質的に互
   いに間隔をもって少なくとも細胞着生力の高い領域及び
   ／又は細胞着生を定位する領域を0.2〜20ミクロンの幅
   で、前記表面の前記領域に多数の細胞を付着させた多数
   の表面不連続部分（４）を備えていることを特徴とする
   バイオメカニカル微細構造体。
3. 【請求項３】固形非生物的基体（２）の予め定められた
   関係位置で互いに間隔をおいた位置に多数の細胞（５）
   を配置する方法であって、 予め定められた関係位置で実質的に互いに間隔をもって
   少なくとも細胞着生力の高い領域及び／又は細胞着生を
   定位する領域を0.2〜20ミクロンの幅の多数の表面不連
   続部分（４）を備えてた概して平坦に延びる表面を有す
   る固形非生物的基体（２）を用意し、 前記基体表面に生理的に好適な多数の細胞（５）を接触
   する ことからなる細胞の配置方法。