JPH0659239B2 - コレステリンエステラーゼ基質、およびコレステリンエステラーゼを光学的に測定するための方法および試薬 - Google Patents

コレステリンエステラーゼ基質、およびコレステリンエステラーゼを光学的に測定するための方法および試薬

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JPH0659239B2
JPH0659239B2 JP1027750A JP2775089A JPH0659239B2 JP H0659239 B2 JPH0659239 B2 JP H0659239B2 JP 1027750 A JP1027750 A JP 1027750A JP 2775089 A JP2775089 A JP 2775089A JP H0659239 B2 JPH0659239 B2 JP H0659239B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、コレステリンエステラーゼ基質、およびコレ
ステリンエステラーゼを光学的に測定するための方法お
よび試薬に関する。
〔従来の技術〕
コレステリンエステラーゼ（コレステリンエステルヒド
ロラーゼＥＣ３．１．１．１３）は、親油性相と水相間
の境界面で長鎖の脂肪酸の乳化されたコレステリンエス
テルを加水分解する。コレステリンエステラーゼは、ヒ
トの組織中並びに微生物中にも存在する。特にコレステ
リンエステラーゼは、研究試薬として生化学分析に屡々
使用されている。殊に、このコレステリンエステラーゼ
は、多数の（診断用）酵素試験において助酵素として使
用されている。従つて、コレステリンエステラーゼ測定
は、臨床化学、さらには生化学、微生物学および食品化
学にとつて著しく重要である。従つてこのために酵素の
製造および単離の場合には、特別の複雑でない試験が必
要となる。
すでに一連のコレステリンエステラーゼ測定法が周知で
あるが、これらはコレステリンエステルの分解時に生成
された分解生成物の測定に基づいている。従つて、放射
能標識したコレステリンエステルの場合、基質として放
射能標識した遊離酸が測定できる（Biochim.Biophys.Ac
ta６１７、４４６（８０））。この方法は高価で支障を
生じやすく、煩雑である。
ＵＶでの光度測定は、公知である。遊離コレステリンは
コレステリンオキシダーゼを用いて酸化されコレステノ
ンになるが、こえはλ＝２４０nmにおける吸光度増加に
基づいて測定できる（Bergmeyer，Methods of Enzymati
c Analysis、第３版II巻、１６８頁）。また、この酸化
の際に生成された過酸化水素は、呈色反応によつて測定
される（Staehler，Med．Lab．３０，２９（７７））。
これらの方法は煩雑で同様に支障を生じやすい。
螢光性基質、例えばコレステリンのピレン酪酸エステル
もしくはピレンデカン酸エステルも使用されている。分
解後、螢光収量の変化を確認することができる（Uste
r，Arch．Biochem．Biophys．２０９，３８５（８
１））。しかしながらこの方法は著しく支障を生じやす
く、多くの研究所は、螢光測定装置を装備していない。
さらに色原体基質、例えばフルオレセインジラウレート
またはメチルウンベリフエリルエステルが、コレステリ
ンエステラーゼの定量に使用されることは、公知である
（Meyer-Bertenrath，Enzyme第２８巻、３３６（８
２）；Ａ．Negre，Biochim．Biophys．Acta７９４，８
９（８４））。しかしながらこれらの基質は非特異性で
エステラーゼによつても分解される。
従つて、簡単な機器で実施でき、かつ直接に可視的制御
のできる呈色反応の必要性が生ずる。
〔発明が解決しようとする課題〕
ところで、本発明は、基質およびこの基質の使用下にコ
レステリンエステラーゼを測定するための呈色反応を提
供するという課題を基礎とし、この呈色反応は、周知の
呈色反応の欠点を有さず、正確な結果をもたらし、操作
が簡単で、高い感度を有し、かつ僅かな遅滞期のみを示
すので、種々の自動分析システムへの適応は困難ではな
い。
〔課題を解決するための手段〕
この課題は本発明によれば、一般式Ｉ： 〔式中、ＡはＣ−原子数１〜２０を有するアルキレン基
またはアルケニレン基を表わし、Cholは３−コレステリ
ン基を表わし、Ｘは芳香族ヒドロキシ化合物またはチオ
ール化合物の基を表わし、Ｙは-S-または-O-を表わす〕
のコレステリンエステラーゼ基質によつて解決される。
本発明の範囲内で３−０−基によりエステル化されて存
在する全ての非置換または置換のステロイド基は、３−
コレステリン基として理解されるが、これはコレステリ
ンエステラーゼによつて加水分解される。このようなス
テロイド基は、例えばコレステリン、コレスタノール、
ジヒドロコレステリン、β−シトステリン、スチグマス
テリンまたはエルゴステリンである。
コレステリンエステラーゼの作用下で、本発明によるコ
レステリンエステルは、基Ｘに相当する芳香族ヒドロキ
シ化合物またはチオール化合物を遊離しながら分解さ
れ、該化合物は、直接光学的に測定されるか、または適
当な発色団または発螢光団と結合してその結合物質が測
定される。Ａの鎖長がＣ−原子数４を上回る場合には、
特にエステラーゼは、助酵素として反応の促進のために
添加される。適当なエステラーゼは、例えばカルボキシ
ルエステラーゼまたはアリールエステラーゼである。
本発明によるコレステリンエステラーゼ基質は、さらに
ジカルボン酸COOH-A-COOH〔但し、Ａは特にＣ−原子数
３〜７を有するものとする〕の基を含有する。Ａが誘導
される酸の例は、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、ア
ジピン酸、ピメリン酸、コルク酸、アゼライン酸、セバ
シン酸、ノナンジカルボン酸、デカンジカルボン酸およ
びウンデカンジカルボン酸である。Ｃ−原子数が３〜７
であるＡに相当するグルタル酸からアゼライン酸までの
酸は、上記で述べたように有利である。
Ｘは芳香族ヒドロキシ化合物またはチオール化合物の基
であり、該化合物は、発色団であることができるか、ま
たは連続反応によつてはじめて色素に変換することがで
きる。典型的な例はフエノール、チオフエノール、ナフ
トール、チオナフトールおよびそれらの誘導体、並びに
自体色原体化合物、例えばレゾルフイン基、クロルフエ
ノールレツド基、インドキシル基またはチオフルオレセ
イン基である。適当なヒドロキシ化合物またはチオール
化合物名を列挙し尽くすことは、その数の多さゆえに不
可能であるが、しかしながら直接の発色団または発色団
に変換可能の芳香族ヒドロキシ化合物またはチオール化
合物は、当業者に知られている。
色素に対して記載した連続反応は、直接結合（例えばジ
アゾニウム塩、例えば４−クロル−２−メチルベンゾー
ルジアゾニウム塩（フアストレツド）、４−ベンズアミ
ド−２−メトキシ−５−メチルベンゾール−ジアゾニウ
ム塩（フアストバイオレツト）、ジアゾ化スルフアニル
酸、２，４−置換および２，５−置換フエニルジアゾニ
ウム塩、例えば２，４−ジクロル−フエニルジアゾニウ
ム−１，５−ナフタリン−ジスルホン酸との直接結合）
によつて行なうことができるか、または例えば４−アミ
ノアンチピリンもしくは別のアミノピラゾロン（例えば
トリメチルアミノピラゾロン、ジアミノアンチピリン）
またはMBTHS（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン−
ヒドラゾン−６−スルホン酸）との酸化結合によつて行
なうことができる。
好ましいのは、僅かな極性を有しかつ親油性である発色
団である。上記発色団の親油性の性質は、例えばアルキ
ル基を用いるような適当な置換によつてプラスの影響を
及ぼされうる。殊にレゾルフイン基に適当な置換基とし
ては、とりわけメチル基、ジメチル基およびエチル基並
びに臭素が好適であることが判明した。
本発明によるコレステリンエステラーゼ基質の製造は、
自体公知の方法によつて行なうことができる。すなわ
ち、例えば一般式： HOOC−Ａ−COOH 〔式中、Ａは前記の意味を表わす〕のジカルホン酸から
導出される、コレステリンおよび無水ジカルボン酸か
ら、無水媒体例えばクロロホルム／ピリジン中で半エス
テルを合成することができる。
無水ジカルボン酸を製造するのに適当な方法は、ホウベ
ン−ワイル−ミユラ−の“メトーデン デア オルガニ
ツシエン ヒエミ−” （Methoden der organischen Chemie）第IV／４巻、７
８６頁に記載されている。
こうして得られた半エステルと、基Ｘが導出される芳香
族ヒドロキシ化合物またはチオール化合物とのエステル
化は、脱水剤例えばジシクロヘキシルカルボジイミドの
存在下で、ジカルボン酸モノエステルと芳香族アルコー
ルまたはチオールとの直接反応によつて実施できる。選
択的にはジカルボン酸モノエステルは最初活性化エステ
ル、例えばヒドロキシスクシンイミドエステルまたはイ
ミダゾリドに変換され、次いでこの活性化エステルは芳
香族アルコールまたはチオールと反応される。
同様に、まずジカルボン酸と芳香族アルコールまたはチ
オールとのモノエステル、例えばアジピン酸−モノニト
ロフエニルステルまたはクルタル酸モノフエニルエステ
ルを製造し、次にこれを例えば酸塩化物、酸無水物また
は活性化エステルの中間生成を通して、コレステリンと
エステル化することも可能である。芳香族アルコールま
たはチオールとのジカルボン酸モノエステルの製造は、
例えばモル比１：１の酸無水物と芳香族化合物とから
か、活性化ジカルボン酸と芳香族化合物とからか、また
は容易に脱離可能な保護基を有するジカルボン酸モノエ
ステルと芳香族化合物とから行なうことができる。適当
な方法は、例えばアルヒーフ・デア・フア−マツイ−・
ウント・ベリヒテ・デア・ドイチエン・フアルマツオイ
テイツシエン・ゲゼルシヤフト（Arch.Pharm.）２８
７，５１４（１９５４）に記載されている。
コレステリンエステラーゼを光学的に測定するための本
発明方法は、本発明によるコレステリンエステラーゼ基
質をコレステリンエステラーゼ含有試料に作用させ、遊
離した芳香族ヒドロキシ化合物またはチオール化合物の
量を直接光学的に測定するか、または適当な色原体との
結合後、そこから生成された色素を光学的に測定するこ
とによつて特色づけられる。
この方法の１つの特別の特徴は、有利な実施形におい
て、公知方法でたびたび必要とされる助酵素またはエス
テラーゼ阻害剤が要求されないことにある。この種の添
加物は高価であるばかりでなく、さらに安定性がかなり
低い。
本発明のさらに別の目的は、コレステリンエステラーゼ
を光学的に測定するための、簡単で良好に保管しうる試
薬であり、これは本発明によるコレステリンエステラー
ゼ基質の他に緩衝物質、洗浄剤、特に非イオン性洗浄
剤、色原体結合体および／または塩、例えば塩化ナトリ
ウムを含有する。更に、この試薬は、有利に保存剤およ
び／または活性剤を含有することができる。
この試薬は、有利な組成の場合にそれぞれ試験で直ちに
使用できる溶液に対し 基質 0.05〜２mg／ml、 洗浄剤 １０〜５０μｌ、 ジオキサン １０〜５０μｌ、 緩衝物質 ５０〜５００ mM を含有する。
洗浄剤としてポリエチレングリコール−モノドデシルエ
ステル（Thesit ）が有利である。
緩衝物質としては、本発明による試薬の範囲内でpH値を
5.5〜10.5の間に調節することのできる物質が適当であ
る。有利なpH値範囲は、6.6〜7.8の間にある。適当な緩
衝物質の例は、ジエタノールアミン緩衝液、トリエタノ
ールアミン緩衝液、トリス（Tris）緩衝液、グツドの緩
衝液（Goodpuffer）例えばヘペス（Hepes）緩衝液（凍
結乾燥前の添加に好適）、タプス（Taps）緩衝液、CHES
−緩衝液（２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスル
ホン酸）およびビシンである。特に有利なのは、リン酸
カリウム緩衝液である。有利な緩衝物質量は、５０〜５
００mMの間にある。
本発明による試薬が、乾燥または最終的な組成に希釈す
るように定められた濃縮されたかまたは乾燥された形で
存在する場合、この試薬は、相応する量比で前記物質並
びに有利に保護コロイドを含有する。
保護コロイドとしては、これに関し当業者間で公知の物
質、例えばポリヒドロキシ化合物、血清アルブミン、ポ
リビニルピロリドン、固体酸化ポリエチレン等がこれに
該当する。有利なのは、ポリヒドロキシ化合物、殊に１
分子中にペントースもしくはヘキソース単位１〜１０を
有するモノマーまたはポリマーのペントースまたはヘキ
ソース、および／または室温で固体のポリエチレングリ
コールである。適当なポリヒドロキシ化合物の好ましい
例は、マンニツトおよび類似の糖アルコール、グルコー
スのオリゴ糖、マンノース、マルトヘプタオース、平均
分子量３５００〜７０００のポリエチレングリコール等
である。他の使用可能な保護コロイドは、例えばアラニ
ン等のアミノ酸、植物ゴム例えばアラビアゴム等であ
る。保護コロイドもしくは保護コロイドの混合物の量
は、２０〜９０重量％であるのが有利である。糖アルコ
ールとポリアルキレングリコールとから成る混合物は、
特に好適であることが判明した。
本発明による試薬は、適当な支持材料上に含浸されて存
在していてもよい。吸収性支持材料も膨潤性で可溶性の
被膜を形成する支持材料も考慮に入れられる。本発明に
よる試薬は、前記の形で直接目で見て評価できるか、ま
たは適当な測定器を用いて評価できる試験片の製造を可
能にする。
コレステリンエステラーゼを測定するための本発明によ
る呈色試験は、高い感度で非常に正確な結果をもたら
す。これは操作が非常に簡単であり、かつ試験片に適す
る。この本発明による呈色試験は、極めて僅かな遅滞期
のみを有するかたまは全く遅滞期を有しないので、この
呈色試験は、種々の自動分析システムに容易に適合させ
ることができる。
測定自体は、終点測定としても反応速度論的にも実施で
きる。多くの公知方法に比較して、反応速度論的実施性
の点で停止も、生成された反応物質の除去も実施する必
要がないという利点がある。
〔実施例〕
次に、本発明を実施例および図面につきさらに詳述す
る。
例１ コレステリン−グルタル酸−レゾルフインエステル a)コレステリン−グルタル酸モノエステル コレステリン19.5ｇをクロロホルム１５０mlに溶かし、
この溶液にピリジン１６ml、無水グルタル酸11.5ｇおよ
びジメチルアミノピリジン１シユパーテル量を加える。
６５℃で８時間加熱した後、冷却し、次にクロロホルム
200mlで希釈し、かつ２回２Ｎ塩酸で洗浄し、１回水で
洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮
し、かつシリカゲル（展開剤：酢酸エステル／石油エー
テル１：１）でクロマトグラフイー処理する。
収量：６ｇ 融点：１２５℃1 H-NMR(CDCl3)：．δ〔ppm〕：0.68（ｓ，３Ｈ） ；0.83（ｓ，３Ｈ）； 0.90（ｓ，３Ｈ）；1.02 （ｓ，３Ｈ）；0.95− 1.95（ｍ，３１Ｈ）；2.0 （ｍ，２Ｈ）；2.4（ｍ，４ Ｈ）；4.6（ｍ，１Ｈ）； 5.37（ｄ，１Ｈ）． b)コレステリン−塩化グルタル酸 １a)2.55ｇをクロロホルム２０mlに溶かし、この溶液に
氷冷下に塩化オキサリル2.2mlを加える。続いてジメチ
ルホルムアミド１滴を滴下し、室温で８時間撹拌する。
溶剤を除去し、残分は未精製のまま後加工する。
c)コレステリン−グルタル酸−レゾルフインエステル レゾルフイン1.1ｇをクロロホルム４０ml中に懸濁さ
せ、この懸濁液にジアザビシクロウンデセン0.75mlおよ
びジメチルアミノピリジン0.1mgを加える。氷冷下にク
ロロホルム２０ml中の１b)の溶液を緩徐に滴下し、引続
き室温で８時間撹拌する。次に、クロロホルム５０mlで
希釈し、２Ｎ塩酸５０mlで振出させる。乾燥後、有機相
を硫酸ナトリウム上で濃縮し、残分をシリカゲル（展開
剤：酢酸／石油エーテル１：３）でクロマトグラフイー
処理する。
収量：２００mg ＤＣ：Ｒｆ＝0.6（シリカゲル；酢酸エステル／石油エ
ーテル １：２）1 H-NMR(CDCl3)：．δ〔ppm〕：0.68（ｓ，３Ｈ）； ；0.83（ｓ，３Ｈ）；0.90 （ｓ，３Ｈ）；1.02（ｓ， ３Ｈ）；0.95−2.6（ｍ， ３５Ｈ）；2.70（ｔ，２Ｈ） ；4.62（ｍ，１Ｈ）； 5.37（ｄ，１Ｈ）；6.33 （ｄ，１Ｈ）；6.86（dd， １Ｈ）；7.13（dd，１Ｈ） ；7.17（ｓ，１Ｈ）； 7.43（ｄ，１Ｈ）；7.80 （ｄ，１Ｈ）． 例２ コレステリン−グルタル酸レゾルフインエステル２mg
を、ジオキサン0.5mlおよびテシツト （Thesit）0.5
mlに溶かす。
測定のために、0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）８
５０μｌおよび前記の基質溶液５０μｌをキユベツト中
で十分に混合する。試料（酵素溶液）１００μｌの添加
後、λ＝５７１nmでΔＥ／分を測光法により測定する
（温度＝25℃）。
公知のコレステリンエステラーゼ活性度の標準に関して
評価する場合、試料のコレステリンエステラーゼ活性度
は、次のようにして計算される： 試料のコレステリンエステラーゼ活性度の算出は、次の
式によつても可能である： Ｖｇｅｓ：試験バツチの総容量〔cm3〕 Ｖ試料：試料の容量〔cm3〕 ε：５７１nmにおける色原体の吸光率 ｄ：キユベツトの層厚〔cm〕 ΔＥ／分：５７１nmにおける１分間当りの吸光 度変化 この反応条件では、吸光率は ε＝60.00cm2×μモル−１である。
例３ 比較のために、コレステリンエステラーゼ−試験を、基
質としてのコレステリンオレエートを用いて実施し（Be
rgmeyer，Methods of Enzymatic Analysis，第３版、第
II巻、168頁）、および例２による呈色反応と比較し、
かつ相関度を算出する。結果を第１表および第１図に示
す。
例４ コレステリン−アゼライン酸−レゾルフインエステル a)コレステリン−アゼライン酸モノエステル 例１a)と同様に、コレステリン5.68ｇ、無水アゼライン
酸7.5ｇおよびクロロホルム５０mlとから製造する。
収量：2.8ｇ ＤＣ：Ｒｆ＝0.60（シリカゲル；クロロホルム／メタノ
ール ９：１） b)コレステリン−塩化アゼライン酸 例１b)と同様に、４a)1.26ｇおよび塩化オキサリル１ml
とから製造する。
c)コレステリ−アゼライン酸−レゾルフインエステル 例１c)と同様に、４b)、レゾルフイン0.72ｇおよびジア
ザビシクロウンデセン0.52mlとから製造する。
収量：２１０mg ＤＣ：Ｒｆ＝0.41（シリカゲル；酢酸／石油エーテル
２：３） 例５ ３β−コレスタニル−グルタル酸−レゾルフインエステ
ル 例１a)と同様に、５α−コレスタン−３β−オール19.4
ｇ、無水グルタル酸２３ｇおよびクロロホルム１５０ml
とから製造する。
収量：２２ｇ ＤＣ：Ｒｆ＝0.63（シリカゲル；クロロホルム／メタノ
ール ８：２） b)３β−コレスタニル−塩化グルタル酸 例１b)と同様に、５a)５ｇおよび塩化オキサリル4.5ml
とから製造する。
c)３β−コレスタニル−グルタル酸−レゾルフインエス
テル 例１c)と同様に、５b)、レゾルフイン2.1ｇおよびジア
ザビシクロウンデセン1.5mlとから製造する。
収量：１．２ｇ ＤＣ：Ｒｆ＝0.29（シリカゲル；酢酸／石油エーテル
２：３）
【図面の簡単な説明】
第１図は、コレステリン−オレエート−法および本発明
による基質（コレステリン−３−グルタル酸−レゾルフ
インエステル）の使用下における方法の検量線（基質濃
度mg／mlに対しΔＥ／分）の比較を表わす線図である。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式Ｉ： 〔式中、ＡはＣ−原子数１〜２０を有するアルキレン基
    またはアルケニレン基を表わし、cho1は３−コレステリ
    ン基を表わし、Ｘは芳香族ヒドロキシ化合物またはチオ
    ール化合物の基を表わし、およびＹは-S-または-O-を表
    わす〕のコレステリンエステラーゼ基質。
  2. 【請求項２】コレステリンエステラーゼを光学的に測定
    する方法において、請求項１記載の基質をコレステリン
    エステラーゼ含有試料に作用させ、遊離した芳香族ヒド
    ロキシ化合物またはチオール化合物の量を、直接光学的
    に測定するか、または適当な色原体との結合後、それか
    ら生成された色素を光学的に測定することを特徴とする
    コレステリンエステラーゼを光学的に測定する方法。
  3. 【請求項３】コレステリンエステラーゼを光学的に測定
    するための試薬において、試験で直ちに使用できる溶液
    に対してそれぞれ0.05〜２mg／mlの量の請求項１記載の
    少なくとも１つの基質、洗浄剤１０〜５０μ、ジオキ
    サン１０〜５０μ、緩衝物質（pH5.5〜10.5）５０mM
    〜５００mM、および色原体結合体として結合可能なジア
    ゾニウム塩、４−アミノアンチピリンまたはMBTHSを含
    有することを特徴とするコレステリンエステラーゼを光
    学的に測定するための試薬。
JP1027750A 1988-02-08 1989-02-08 コレステリンエステラーゼ基質、およびコレステリンエステラーゼを光学的に測定するための方法および試薬 Expired - Lifetime JPH0659239B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3803757.2 1988-02-08
DE3803757A DE3803757A1 (de) 1988-02-08 1988-02-08 Cholesterin-esterase-farbsubstrat

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