JPH066064B2 - ジフルクトース・ジアンヒドリドの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、イヌリン及び／またはイヌリン含有植物抽出
液より固定化酵素を利用してジフルクトース・ジアンヒ
ドリドを連続的に効率よく、かつ高収率で製造する方法
に関するものである。尚、ここでいうジフルクトース・
ジアンヒドリドとはジフルクトース・ジアンヒドリドＩ
（以下ＤＦＡＩという）及びジフルクトース・ジアンヒ
ドリドIII（以下、ＤＦＡIIIという）を含む。

ＤＦＡＩはフラクトース２分子が１，２′及び２，１′
の２箇所で結合している非還元性の２糖類、ＤＦＡIII
は１，２′；２，３′で結合している２糖類である。こ
れらは水に易容で、蔗糖の約半分の甘味を有している
が、これは低甘味を要求する最近の市場動向を満足する
ものである。また分子構造に起因した性質として、非還
元性で人体へは消化、吸収されにくく低カロリーである
こと、かつ熱に対して安定で分解されにくい糖である。
それとともに本発明者らは、ＤＦＡＩ及びＤＦＡIIIに
う蝕予防効果、脹内ビフィズス菌増殖効果があることを
見い出した。

〔従来の技術〕

先に、本発明者らは、イヌリン及び／またはイヌリン含
有植物抽出液にアースロバクター・グロビフォルミスに
属する細菌及び／またはその生産する酵素、イヌリンフ
ラクトトランスフェラーゼを利用してＤＦＡＩ及び／ま
たはＤＦＡIIIを製造する方法を確立した。（特願昭６
１−１１９０８７、同６１−１１９０８８） 〔発明が解決しようとする課題〕 しかし、イヌリン及び／またはイヌリン含有植物抽出液
に菌体、もしくはその産生する酵素を作用させる回分式
の製造方法では、酵素の安定性などの制約により反応時
のpH、温度等の範囲が限定され、また反応終了後酵素を
回収し再利用することが困難であることなど工業的にみ
て非常に不経済である。また反応終了後の精製工程に時
間的損失を生じるという問題がある。

〔課題を解決する為の手段〕

そこで本発明者らは、イヌリンフラクトトランスフェラ
ーゼ、ＤＦＡＩ合成タイプ（以下、ＤＦＡＩ合成酵素と
いう）及び／またはイヌリンフラクトトランスフェラー
ゼ、ＤＦＡIII合成タイプ（以下、ＤＦＡIII合成酵素と
いう）おのおのをキトサンビーズ、またはアルキル化Ｃ
ＰＧを用いて固定化した後、カラムに充填し一定量でイ
ヌリン溶液及び／またはイヌリン含有植物抽出液を通液
することで連続的にかつ高収率でＤＦＡＩ及び／または
ＤＦＡIIIを生産することを見い出した。

本発明を以下に示す。

１）固定化素材としてキトサン、シリカ系担体を用い固
定化したイヌリンフラクトトランスフェラーゼをイヌリ
ン及び／またはイヌリン含有植物抽出液に作用させるこ
とを特徴とするジフルクトース・ジアンヒドリドの製造
方法。

２）架橋剤としてグルタルアルデヒド、ゲニピンを用い
て固定化したイヌリンフラクトトランスフェラーゼを用
いるジフルクトース・ジアンヒドリドの製造方法。

キトサンは、グルコサミンがβ−１，４結合しているセ
ルロース類似の分子構造を持った多糖類で、その分子内
にアミノ基を有している為、グルタルアルデヒド等の架
橋剤を用いて容易に酵素などの蛋白質を固定化すること
が可能である。最近、キトサンをビーズ状に成形した製
品や、キトサンに種々の架橋処理を行い物理的強度や耐
酸性を高めたビーズ状の製品が市販されている。

アルキル化ＣＰＧは、ＣＰＧ（コントロールドボアグラ
ス エレクトロヌクレオニクス社製）をγ−アミノプロ
ピルトリエソキシシランでシラン化したものである。

これら担体をグルタルアルデヒド及び／またはゲニピン
（クチナシ由来の天然架橋剤 サントリー社製）を用い
て酵素との架橋を行った。

以下に固定化方法を述べる。

尚、固定化方法は以下にのべることに限ったものではな
く、担体としてはアミノ基を持つものであれば、本発明
の方法に利用できる。

固定化担体としてキトサンビーズ（キトパールＢＣＷ３
５０７、富士紡績社製、スペーサーとして芳香族ジイソ
シアナート架橋処理がなされている粒径７mmの製品）を
用いた場合は以下のように固定化する。ＤＦＡＩ合成酵
素を産生する菌株、アースロバクター・グロビフォルミ
ス、Ｓ１４−３及び／またはＤＦＡIII合成酵素を産生
する菌株、アースロバクター・グロビフォルミス、Ｃ１
１−１を３０℃で１４〜１６時間培養し、遠心分離等の
除菌処理して得られた培養上澄を硫安塩折により濃縮し
て固定化用粗酵素液とした。キトビーズに２．５％（Ｗ
／Ｖ）グルタルアルデヒドを加え、室温で１時間架橋反
応を行った後、未反応のグルタルアルデヒドを洗浄除去
し、粗酵素液を加え、室温で２時間、酵素と担体との結
合反応を行った。その後、未反応の酵素を洗し固定化Ｄ
ＦＡＩ合成酵素及び／または固定化ＤＦＡIII合成酵素
が得られた。固定化酵素量は架橋反応条件により異なる
が、通常２１０国際単位であるベッドボリュウムは３．
５ｍｇ担体である。得られたキトサンビーズ固定化ＤＦ
ＡＩ合成酵素及び／またはキトサンビーズ固定化ＤＦＡ
III合成酵素をカラムに充填し、極低速から１時間当り
固定化酵素量の２０倍量迄の範囲でイヌリン及び／また
はイヌリン合有植物抽出液を通液とすると、イヌリンは
ほぼ完全に分解され、反応液としてオリゴ糖や単糖類を
含んだＤＦＡＩおよび／またはＤＦＡIII溶液が連続的
に得られた。通液は昇流、あるいは降流のいずれでもよ
い。

また、１０％（Ｗ／Ｖ）のイヌリン溶液を１ケ月間固定
化ＤＦＡＩ合成酵素及び／または固定化ＤＦＡIII合成
酵素を充填したカラムに昇流式で１時間当り固定化酵素
量の５倍の流速で通液した結果、いずれの固定化酵素も
活性の低下は殆んど見られず、充分実用に耐え得ること
が判明した。

ＣＰＧの場合も、１０％（Ｗ／Ｖ）γ−アミノプロピル
トリエソキシシランでシラン化しアミノ基を導入した
後、上述と同様の操作を行い固定化酵素が得られ、カラ
ムに充填しイヌリン溶液を通液することができる。

ゲニピンを架橋剤として用いる場合は、ゲニピンを１％
（Ｗ／Ｖ）となし、担体とＤＦＡＩ及び／またはＤＦＡ
III合成酵素との架橋反応は４０℃で一夜行った。

この他の共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法、架
橋法、包括法など各種の固定化法による固定化ＤＦＡ合
成酵素でも本発明の方法を適用できる。

イヌリン原料としては、キクイモ、ダリア、チコリー、
ゴボウなどのイヌリン含有植物の抽出液が考えられるが
濾過、脱色等の部分精製したものを直接、固定化ＤＦＡ
Ｉ合成酵素及び／または固定化ＤＦＡIII合成酵素を充
填したカラムに通液することができる。この他にも微生
物起源のフラクトースポリマー、例えばバチルス・ヴル
ガタスのレバンなども原料として考えられる。

植物からのイヌリン抽出液には、色素とペクチン様物質
も含まれるが陰イオン交換樹脂カラムにより容易に除去
でき、無色透明とすることができる。また、ペクチン様
物質はカラムにアルカリ溶液を通すことにより回収でき
る。

以下に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１． 市販イヌリンを熱水中に溶解し１０％（Ｗ／Ｖ）とな
し、pH５．５に調整後、本発明のキトサンビーズ（商品
名、キトパールＢＣＷ３５０７、富士紡績社製）にゲニ
ピンを架橋剤として固定化したＤＦＡＩ合成酵素充填カ
ラムに昇流式でＳＶ４（１時間当りカラム体積の４倍の
流量）で、かつ５０℃の温度をかけて反応を行った。

反応液をカラムに充填したイオン交換樹脂で連続的に脱
塩後、処理液中の糖組成を高速液体クロマトグラフィー
で分析したところ、DFAI:87.9%、フラクトオリゴ糖：1
1.1%、その他：1.0%であった。

実施例２ 市販イヌリンを原料として用い、pH５でキトサンビーズ
にグルタルアルデヒドを架橋剤として固定化したＤＦＡ
III合成酵素充填カラムに昇流式でＳＶ６の流速で、か
つ６０℃の温度をかけて連続的に反応を行った。

反応液を実施例１と同様にして分析したところＤＦＡII
I：88.2%、フラクトオリゴ糖：10.8%、その他：1.0%で
あった。

実施例３ 市販イヌリンを原料として用い、pH５．５でアルキル化
ＣＰＧにグルタルアルデヒドを架橋剤として固定化した
ＤＦＡＩ合成酵素充填カラムにＳＶ４の流速で、かつ５
０℃の温度をかけて連続的に反応を行った。

反応液を実施例１と同様にして分析したところＤＦＡ
Ｉ：86.9%、フラクトオリゴ糖：12.0%、その他：1.5%で
あった。

実施例４ キクイモ５００ｇに水２５０mlを加え、ホームミキサー
で磨砕した後、ガーゼで濾過し、濾液を得た。これを遠
心分離し、その上澄に２０ｇのセライトを加え濾過した
後、得られた濾液に１５ｇの活性炭を加え７０℃で脱
色、濾過を行い濾液を得た。この濾液３１０mlはpH５．
９糖濃度7.9%であった。

この部分精製を行った原液を本発明のキトサンビーズ固
定化ＤＦＡIII合成酵素を充填したカラムに昇流式で、
１時間当りビーズ量の５倍の流速で、かつ６０℃の温度
をかけて通液し、連続的に反応を行った。このようにし
て得られた反応液をイオン交換樹脂、ＩＲ１２０Ｂ、Ｉ
ＲＡ９３、ＭＢ３をそれぞれ充填したカラムに順時通液
し、脱塩、脱色操作を行った。これを濃縮して水分２５
％のＤＦＡIII含有シロップ２８．１ｇを得た。

液体クロマトグラフィーにより糖組成を求めたところＤ
ＦＡIII：46.2%、フラクトオリゴ糖：46.1%、シューク
ロース：6.2%、グルコース：0.8%、フラクトース：0.7%
であった。

実施例５ キクイモ５００ｇを実施例３と同様の部分精製を行い原
料液を得た。

これを本発明のキトサンビーズ固定化ＤＦＡＩ合成酵素
充填カラムに昇流式で、ＳＶ４の流速で、かつ５５℃の
温度をかけて通液し、連続的に反応を行った。このよう
にして得られた反応液を実施例３と同様にして、脱塩、
脱色操作を行った。これを濃縮して水分２５％のＤＦＡ
Ｉ含有シロップ２５．３ｇを得た。

液体クロマトグラフィーで求めた糖組成は、ＤＦＡＩ：
46.1%、フラクトオリゴ糖：46.0%、シュークロース：6.
3%、フラクトース：0.8%、グルコース：0.8%であった。

〔発明の効果〕

ＤＦＡ合成酵素を固定化することで酵素の繰り返し利用
ができ、経済性が著しく高まるとともに、pH、熱に対す
る安定性が増すことにより広範囲の条件で反応が行える
ようになった。また反応至適温度が５℃程上昇し、より
高温で反応がおこなえるようになったことは微生物汚染
防止効果もあり、サニタリーの面でも向上したといえ
る。

固定化酵素カラムにより得られた反応液は通常の脱塩、
脱色工程、例えば陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹
脂等のカラムに通液することで連続的に精製することが
できる。

したがって、固定化ＤＦＡ合成酵素を用いた反応工程
と、その後の精製工程とを連続的に、時間的損失なくし
て運転することができる。

本発明の方法によれば、イヌリン含有植物抽出液からＤ
ＦＡＩ及び／またはＤＦＡIIIにオリゴ糖や、単糖類を
含んだ製品が得られるが、さらにＤＦＡＩ及び／または
ＤＦＡIIIの純度を高めるには、固定化酵素反応工程
と、市販のゲル濾過剤やイオン交換樹脂、活性炭等のカ
ラムクロマトグラフィー、または種々の膜を用いた膜分
離濃縮などと組み合わせることも考えられる。カラムク
ロマトグラフィー、または膜分離等で得られたフラクト
オリゴ糖等は、副産物として既存の利用を行うこともで
きる。

フロントページの続き (72)発明者 門間 充 茨城県つくば市吾妻２丁目1506番地809― 307 (72)発明者 高野 敏弥 茨城県つくば市竹園３丁目643番地111― 202 (72)発明者 永田 一志 鹿児島県鹿児島市中山町3129番地53 日澱 中山社宅西の１ (72)発明者 本坊 慶吉 鹿児島県鹿児島市薬師１丁目７番33号 (56)参考文献 特開 昭62−275693（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−275694（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】固定化素材としてキトサン、シリカ系担体
   を用い固定化したイヌリンフラクトトランスフェラーゼ
   をイヌリン及び／またはイヌリン含有植物抽出液に作用
   させることを特徴とするジフルクトース・ジアンヒドリ
   ドの製造方法。
2. 【請求項２】固定化架橋剤としてグルタルアルデヒド、
   ゲニピンを用いる請求項１記載の製造方法。