JPH0662430B2 - マラリアの抗体 - Google Patents

マラリアの抗体

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JPH0662430B2
JPH0662430B2 JP57085659A JP8565982A JPH0662430B2 JP H0662430 B2 JPH0662430 B2 JP H0662430B2 JP 57085659 A JP57085659 A JP 57085659A JP 8565982 A JP8565982 A JP 8565982A JP H0662430 B2 JPH0662430 B2 JP H0662430B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗原性物質、その抗原性物質を含むワクチン、
およびマラリアに対する免疫能を与えるそのワクチンの
使用に関する。
マラリア寄生体とは、プラズモジウム（Plasmodium）属
に属する原生動物のことである。寄生体の複雑な生活環
の中には、宿主脊椎動物の赤血球における無性生殖増殖
環が含まれ、これがマラリアとして知られている病気を
ひき起こす。宿主脊椎動物は次に、血液性寄生体に有効
な防御性免疫応答を示す。したがつて、血液型寄生体は
感染宿主または免疫宿主中で、特異的な防御抗体の産生
をひき起こすような抗原を合成していることが示唆され
る。
赤血球性無性増殖応答サイクル中、遊離の寄生体（分裂
小体）は赤血球表面を認識かつ特異的に結合し、原形質
膜の陥入により赤血球中に侵入する。この感染を受けた
赤血球は栄養体として知られる。該寄生体は細胞内分化
で核が繰返し分裂し、分裂前体を形成する。核分裂にひ
きつづき細胞質の分裂が起き、いくつかの赤血球内単核
分裂小体を形成する。分裂前体膜が溶解すると、分裂小
体は血漿中に放出され、新しい赤血球宿主に結合し、侵
入する。
マラリアに対する免疫は、分裂前体および／あるいは分
裂小体型の寄生体に結合した寄生体抗原に特異的な抗体
によつて媒介されると信じられている（たとえばCohe
n，Proc．Ｒ．Soc．LondonＢ，１９７８，２０３；３２
３−３４５、およびFreeman and Parish，Exp．Parasit
ol，１９８１，５２，１８−２４を参照）。
核分裂前体膜に結合したいくつかの寄生体抗原が、超免
疫血清に対する可溶化分裂前体物質の交差免疫電気泳動
で検出されている（たとえばDeans，Dennis and Cohe
n，Parasitology，１９７８，７７ ３３３−３４４、
およびSchmidt-Ullrich，Wallach and Lightholder，
Ｊ．exp．Med．１９７９，１５０，８６−９９を参
照）。特に後者のグループはプラズモジウムノウレシ
（Plasmodium knowlesi）分裂前体から、分子量が６
５，０００，９０，０００および１２５，０００の３つ
の抗原を検出した。これらの抗原は、Ｐ．ノウレシ
（Ｐ．knowlesi）やＰ．フアルシパラム（Ｐ．falcipar
um）免疫血清によつて沈降させられる。Ｐ．ノウレシ
（Ｐ．knowlesi）およびＰ．フアルシパラム（Ｐ．falc
iparum）に関するデータからは、どの増殖段階で寄生体
特異抗原が免疫原性を有するのか、あるいは検出された
抗原が防御免疫に関与しているか否かについては、はつ
きりした結論は下せない（Schmidt-Ullrichらの「宿主
−寄生体相互作用」((“The Host-Invader Interpla
y”))、１９８０、H. Van den Bossche ed.，Elserier
／North Holland，Amsterdam，１１７−１２０）。
Ｐ．フアルシパラム（Ｐ．falciparum）の分裂前体抗原
についても述べられている（Kilejian，Proc．Nat．Aca
d．Sci．１９８０，７７，３６９５−３６９９；Ｊ．ex
p．Med.，１９８０，１５１，１５３４−１５３８；Per
rian et．al．Trans．Roy．Soc．Trop．Med．Hyg．１９
８１，７５，１６３−１６５）。しかしこれらの抗原の
うちどれも精製されていないし、あるいは防御抗原であ
ることが示されていない。
分裂前体膜由来の分子量が２００，０００以下の抗原に
ついても文献（Freeman et．al the Host−Invader Int
erplay，H.Van den Bossche，Ed.，Elsevier／North Ho
lland Biochemical Press １９８０，１２１−１２
４）中に記載されているが、ここで述べられた唯一の抗
体である、これらの抗原に特異的な単一クローン性抗体
が受動免疫を示すということが記載されていない。
驚くべきことに本発明者は現在、上記の分裂前体膜由来
の抗体により認識される抗原が、マラリアに対する保護
作用を生み出すことが可能であることを見出し、また分
裂前体型のプラズモジウム（Plasmodium）寄生体に結合
したそのような抗原を単離し、定義した。
かくの如く同定された抗原は、プラズモジウム（Plasmo
dium）属寄生体の保護作用を引き起こすたん白質性抗原
であり、次のような特徴を有する。
(i) 分子量は１．８×１０5から２．５×１０5の範囲
にある。
(ii) 該寄生体の赤血球性分裂前体および分裂小体の膜
に結合している。
(iii) 赤血球内で処理されて、同じ抗原性を有する別
々のフラグメントにわかれる。
ここで該抗原あるいはその別々のフラグメントは、寄性
体の分裂小体の表面膜およびその官能誘導体に結合して
いる。
これらの抗原性たん白質は、プラズモジウムヨエリイ
（Plasmodium yoelii），Ｐ．ベルゲイ（Ｐ．berghe
i），およびＰ．ビンケイ（Ｐ．vinckei）などのいくつ
かのネズミ料マラリア原生動物や、特にＰ．フアルシパ
ラム（Ｐ．falciparum）の霊長類マラリア寄生体に存在
することが知られている。
「分子量」というのは、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動や他の標準的な分子量の指標により求められた見かけ
の分子量を意味する。本発明の抗原生たん白質の分子量
は、Ｕ．Ｋ．Laemmli（Nature，１９７０，２２７，６
８０−６８５）の方法により求めることができる。適切
な標準分子量指標としてはたとえば、スペクトリンヘテ
ロダイマー（分子量２．２×１０5および分子量２．４
×１０5）がある。
ここで用られている「結合している」というのは、マラ
リア寄生体の分裂前体あるいは分裂小体由来のたん白質
性抗原物質だけでなく、別のところから得られるよく似
たあるいは同じアミノ酸配列を有する、抗原性の同じ物
質も含んでいる。
本発明の抗原は、該寄生体の細胞内増殖の後期にのみ合
成される。したがつてＰ．フアルシパラム（Ｐ．falcip
arum）については、この抗原の合成開始は増員生殖の開
始と一致し、該細胞内段階の最後まで続く。
親抗原の特徴は、どんな寄生体から得られても赤血球内
で処理されて、同じ抗原性を有する別々の低分子量のフ
ラグメントにわかれることであることがわかつた。これ
らのフラグメントの分子量は特定の親抗原の分子量によ
つてかわるが、主なフラグメントは親抗原よりそれぞれ
０．３−０．４×１０5，０．７−０．８×１０5，１−
１．４×１０4だけ小さい分子量を有することがわかつ
た。
Ｐ．フアルシパラム（Ｐ．falciparum）の同調培養にお
いて、該変化は翻訳時期が同じではないが、分裂小体の
成熟あるいは放出は赤血球内の増殖サイクルの最後に起
きることで一致しているようである。該抗原自身よりも
別々のフラグメントが分裂小体の表面に存在している可
能性が高い。
上記の如く定義した抗原の免疫学的性質の利点は該親抗
原だけでなく、赤血球内で作られたフラグメントや親抗
原あるいはそのフラグメントを含む物質などの免疫学的
フラグメントによつても得られることは当業者に容易に
理解される。ここではそのような物質はすべて「官能誘
導体」と呼ぶ。
抗原性たん白質は、このような抗原の調整のどのような
公知の方法によつても調製され得る。そのような方法は
すべて、該寄生体からの抗原たん白質の単離、あるいは
該抗原たん白質を化学的または生物学的に再生産させる
ことより成る。
したがつてここに定義された抗原たん白質のひとつの調
製法が規定され、それは (i) プラズモジウム（Plasmodium）寄生体の分裂前体
を含む赤血球を可溶化する段階と、 (ii) 所期の抗原たん白質に特異的で抗原−抗体複合体
を与える単一クローン性抗体に、該可溶化物質を接触さ
せる段階と、 (iii) 該抗原−抗体複合体より該抗原たん白質を回収
する段階とより成る。
上記の如く規定した方法により調製したとき、ここに定
義した抗原性たん白質が供される。該分裂前体は、その
公知のいかなる可溶化方法によつても可溶化される。た
だし大きなたん白質の分解や失活を起こさない、寄生体
物質の適切な可溶化方法を用いる。特に海面活性剤に接
触させることにより可溶化される。該界面活性剤はイオ
ン性でも非イオン性でもよいが、非イオン性界面活性剤
が好ましい。そのような界面活性剤の例としては、ノニ
デツトＰ４０（NonidetＰ４０）、トリトンＸ，Brij９
９（それぞれシエル，ロームアンドハース、およびＩＣ
Ｉにより作られている界面活性剤の登録商標である）お
よびレネツクス３０（Renex３０）として知られている
ポリオキシエチレン（１２）トリデシルエーテル界面活
性剤がある。レネツクス３０はハネウエルアトラス社の
作つている界面活性剤の登録商標である。界面活性剤は
最終濃度が０．０１％から５％Ｕ／Ｖの間になるように
加える。
本方法に用いる単一クローン性抗体は公知のいかなる方
法によつても調製される（たとえばMilstein，Scientif
ic American１９８０，２４３(4)，５６−６４を参
照）。そのような方法の中では、マウスを関係する寄生
体（この場合はたとえばマラリア寄生体）に対し、齧歯
目のマラリア寄生体に感染させることにより免疫する。
それぞれ異なつた抗原決定基を認識する抗体産生能力を
持つリンパ球を単離し、ネズミの骨髄腫細胞に融合させ
て「ハイブリドーマ」を得る。各々のハイブリドーマは
その親リンパ球の抗体を表現しクローン化することが可
能である。個々のハイブリドーマのスクリーニングによ
り、問題としている抗原決定基に特異的な単一クローン
性抗体を表現する、ひとつあるいはそれ以上の細胞株が
得られる。次にこの細胞株を使つて大量の単一クローン
性抗体を作り、この抗体は次に問題としている抗原決定
基を分離精製するのに用いられる。ここに定義した抗原
に特異的な抗体は、簡単な公知の検査方法で容易に同定
できる。
該単一クローン性抗体は、たとえばセフアロース（商
標）などの不活性の支持物質に適切に結合せしめ、次に
抗体を含む該支持体に該可溶化物質を通す。この操作は
カラムを用いるとうまくできる。
抗原−抗体複合体の破壊により、ここから抗原たん白質
が回収できる。この操作条件は当業者には公知である。
該たん白質の抗原性を保持する適切な条件としては、高
いpH（たとえば適当な界面活性剤の存在下でpH１１．
５）において、ジエチルアミンで洗う方法などがある。
プラズモジウム（Plasmodium）属寄生体に感染する危険
はあるが、前記した抗原は、感染を受けやすい脊椎動物
宿主でマラリアに対する免疫を誘導するために、ワクチ
ンの中に含有させてもよい。この目的のために、該抗原
たん白質は薬物学的に許容される担体といつしよに使用
されることもある。該抗原たん白質は単独で、あるいは
該たん白質の他の機能生たん白質といつしよに、あるい
はマラリアに対し防御作用を有する他のたん白質といつ
しよに使用されることもある。
さらに薬物学的に許容される担体とともに、前に定義し
た抗原、あるいはその機能生誘導体を含有する、マラリ
アに対する免疫を誘導するワクチンが規定される。
この場合薬物学的に許容される担体とは、該抗原体を患
者へ導入するための手段として適当な液体のことをい
う。そのような担体の例としては食塩水がある。該抗原
は該担体の溶液でもよいし、あるいは固体として浮遊さ
せてもよい。あるいは薬物学的に許容される界面活性剤
の添加により可溶化させてもよい。
免疫応答を刺激し、ワクチンの効果を高めるために、該
ワクチンにアジュバントを含有させてもよい。本発明に
使用するのに適切なアジュバントとしてはフロイント
（Freund）完全アジュバントがあり、さらに詳しくは、
サポニン、コリネバクテリウムパリヴアム（Corynebact
erium parvum）（コパルヴアツクス((coparvax))）およ
び、水酸化アルミニウムあるいはこれらの混合物、ある
いは別の公知のアジュバントなどがある。
抗原たん白質を最終濃度が０．２から５mg／mlの範囲
に、好ましくは０．５から２mg／mlの範囲に、最も好ま
しくは１mg／mlになるように、ワクチンを製剤化すると
使いやすい。製剤化のあとでワクチンは無菌容器に入れ
る。そして容器を密封し、低温、たとえば４℃で保存す
るか、あるいは凍結乾燥してもよい。
脊椎動物宿主でマラリアに対する免疫を誘導するため
に、適切に製剤化したワクチンを１回あるいはそれ以上
投与する。１回の投与量は、ワクチンを０．１から２m
l、好ましくは０．２から１ml、最も好ましくは０．５m
lとするのがよい。
さらに、前に定義したワクチンの有効量を宿主に投与す
ることから成る、感染を受けやすい脊椎動物宿主にマラ
リアに対する免疫を誘導する方法が規定される。
該ワクチンは、経口投与および非経口（たとえば皮下あ
るいは筋肉内）注射などの通常のワクチン投与方法のい
かなる方法によつて投与してもよい。治療に際してはワ
クチンを１回のみ投与してもよいし、ある期間に何回も
投与してもよい。
以下の例により本発明を説明するが、これは決して本発
明を限定するものではない。
例１ Ｐ．イエリー（Ｐ．yoelii）抗原のハイブリドー
マ細胞株の誘導 ポリエチレングリコール存在下で、２匹のＰ．イエリー
（Ｐ．yoelii）免疫−ＢＡＬＢ／Ｃマウスから得た脾臓
細胞を、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ag４−１骨髄腫細胞と融合
させた（Galfre，et al.，Nature，１９７７，２６６，
５５０−５５２の一般的方法による）。該細胞を１４４
個の組織培養穴の、１０％子牛血清をベースとして増強
したＲＰＭＩ１６４０倍地を用いたＨＡＴ選択倍地（Li
ttlefield，Science，１９６４．１４５．７０９−７１
０）２mlの中に加えた。１０日後培養上層液を間接蛍光
抗体法（ＩＩＦ）により、Ｐ．イエリー（Ｐ．yoelii）
特異抗体の有無について検査した。検査した１４３培養
のうち３８は陽性であつた。培養番号１番は、分裂前体
には結合しているがリング状や栄養体型には存在しない
抗原に特異的な抗体を含んでいた。倍地でおおつた半固
体寒天中の単細胞より得られたコロニーを増殖させるこ
とにより、この培養よりクローン化したハイブリドーマ
細胞株を作つた。該クローン化ハイブリドーマ株はその
特異な抗体の分泌を続けた。該ハイブリドーマ株をＷＩ
Ｃ２５．１．と呼び、１９８１年７月１６日にＩ−１６
０番としてパスツール研究所（the Institute Pasteu
r）に寄託した。該ハウブリドーマ株をさらに、ＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウス中の腹水癌として増殖させたところ、これ
らマウスの腹水および血清には約１０mg／mlの単一特異
抗体が含まれていた。第２番目のハイブリドーマ株（Ｗ
ＩＣ４５．１）は、抗体２５．１と同じ抗原に対して特
異的な抗体を分泌するが、これは分子量が０．９×１０
5より大きい抗原およびフラグメントのみを認識すると
ころが異なる点であるようである。
例２ Ｐ．イエリー（Ｐ．yoelii）からの抗原の調製 血液性プラズモジウムイエリー（Plasmodium yoelii）
をＣＤ−１マウス中で、８０−９０％寄生体血症となる
まで増殖させ、赤血球を集め可溶化した。５０ｍＫトリ
ス、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、１
ｍＭ弗化フエニルメチルスルフオニル（ＰＭＳＦ）を含
む１％ノニデツト（Nonidet）ｐ４０．０．１ｍＭトシ
ル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、５ｍ
Ｍエチレングリコール−ビス−（アミノエチルエーテ
ル）Ｎ，Ｎ′−四酢酸塩（ＥＧＴＡ）、そして（たん白
質分解活性を阻害させるための）５ｍＭヨードアセトア
ミドから成る緩衝液中で、赤血球を溶解させた。溶解さ
せた細胞を １００，００００ｇで遠心分離し、赤血球の可溶性たん
白質、いくつかの膜たん白質、および約７０％の該寄生
体たん白質（35Ｓ−メチオニン標識化合物のこの画分へ
のin vitro 取込み量の比率より求められた）を含有す
る上層を集めた。
ハイブリドーマ株ＷＩＣ２５．１を含有するマウスの腹
水より、免疫グロブリンを、たん白質Ａ−セフアロース
に結合させた後、pH３．０において１段階溶出法により
精製した。膨潤ゲル１mlにつき免疫グロブリン１０mgの
割合で、該免疫グロブリンをブロムシアン活性化セフア
ロースに結合させた。該免疫吸着剤を充分洗浄し、カラ
ムに詰めて、１０ｍＫトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ、１％ＮＰ４０pH８．０で平衡化させた。
上述の如く得た上層を、１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ＮＰ４０pH８．０で平衡
化させた該免疫吸着剤に通し、この緩衝液で洗つた。非
特異的に結合した物質は、０．５Ｍ NaClを含有するこ
との緩衝液（カラムの５倍量）で洗浄し除去した。次に
カラムを、１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、０．１％ＮＰ ４０pH８．０を含有する緩
衝液で洗つた。５０ｍＭジエチルアミン、０．１％ＮＰ
４０pH１１．５で特異的溶出を行なつた。
該溶出物質の第２回目の免疫吸着剤クロマトグラフイー
を行なつた。特異的溶出液を１０ｍＭトリス、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ＮＰ ４０pH
８．０を含有する緩衝液に対し透析した。この試料を、
この緩衝液で再平衡化させたカラムに添加し、１０ｍＭ
トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５
％デオキシコール酸ナトリウムpH８．２を通して洗つ
た。保持された物質は、５０ｍＭジエチルアミン、０．
５％デオキシコール酸ナトリウムpH１１．５で溶出させ
た。溶出液を濃縮し、透析して該抗原を得た。
例３ Ｐ．イエリー（Ｐ．yoelii）からの得られる該抗
原とそのたん白分解フラグメントの生化学的特性 比活性の高い35Ｓ−メチオニンを含む培地中で、寄生体
結合細胞を２−３時間培養し、35Ｓ−メチオニンをたん
白質中にとりこませ、抗原を標識した。標識した抗原た
ん白質は、単一クローン性抗体２５．１との免疫沈降法
と、免疫複合体を沈でんさせるためのたん白質Ａを有す
る黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）細胞を用
いて得た。これをＳＤＳゲル電気泳動にかけた。該抗原
は見かけの分子量が２．３０×１０5の物質として泳動
した。さらに同じ抗原決定基を有する一連の分解産物が
検出された。主なフラグメントの見かけの分子量は、
１．９７，１．６０，１．５１，１．２６，０．９０，
０．５６，０．２８×１０5であつた。量的にそれほど
多くないが、見かけの分子量が２．２０，２．１３，
１．９０，１．８０，１．７４，１．４８，１．１８，
１．１２，１．０４×１０5の分解産物も存在してい
た。例２に示した免疫吸着剤カラムクロマトグラフイー
により精製した抗原は、免疫沈降させた35Ｓ−メチオニ
ン標識物質と同一の分解産物のパターンを示した。
これらのポリペプチドの関係は、主要なポリペプチドの
ペプチドマツプ法とＰ．イエリー（ｐ．yoelii）分裂前
体のパルスラベルにより明らかになつた。抗体２５．１
により免疫沈降させた35Ｓ−メチオニン−標識ポリペプ
チドの二次元キモトリプシンペプチドマツプ法と、125
Ｉ−ヨードを用いてヨード化した精製物質のＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル中の限定たん白分解ペプチドマツプ
法により、主要なポリプペチドのアミノ酸配列の間に類
似性があることが明らかとなつた。Ｐ．イエリー（Ｐ．
yoelii）分裂前体を比活性の高い35Ｓ−メチオニンの存
在下で１０分間孵置したのち、非放射性メチオニンで追
跡した。標識後異なつた時間間隔で試料を可溶化し、抗
体２５．１で免疫沈降させた。放射活性は最初分子量が
２．３０×１０5のポリペプチドに取込まれたが、さら
に孵置すると放射活性は順次分子量の小さい方のポリペ
プドにあらわれ、それと同時に分子量が２３０，０００
の成分中の放射活性は減少した。したがつて抗体２５．
１によつて認識されるもともとの抗原は分子量が２．３
×１０5のたん白質であり、分子量の小さいポリペプチ
ドはそのたん白分解フラグメントであり、各フラグメン
トが該単一クローン性抗体により認識される抗原決定基
を有していた。in vitro（試験管内）の実験では、もと
もとのたん白質の分解は合成直後に始まり、７時間後に
はほとんど分解していた。この結果は、該分解が細胞溶
解や可溶化のあとというより、正常な分裂前体の孵置中
に起きたことを示している。
該抗原とそのいくつかのフラグメントの等電点をＯ′Fa
rrell（J.Biol.Chem.２５０：４００７−４０２１，１
９７５）の方法に基づく２次元ゲル電気泳動法により測
定した。ただし第１次元にはポリアクリルアミドかある
いはアガロース／ポリアクリルアミド混合ゲルを用い
た。pH−３−１０のアンフオラインを用いてpH勾配を作
り、該抗原とそのフラグメントについて次のおよその等
電点が得られた。分子量２．３×１０5のものはpH５．
３−５．７、分子量１．６×１０5は５．２−５．５、
分子量１．５×１０5は５．２−５．５、分子量０．９
×１０5は６．０−６．７、分子量０．５６×１０5は
５．２−５．４、分子量０．３０×１０5は５．０−
５．３であつた。フラグメントを等電点にしたがつて並
べるといつも、分子量０．２８，０．５６未満，１．５
未満，１．６，２．３未満，０．９×１０5未満であつ
た。
過ヨウ素酸−シツフ染色と、ポリアクリルアミドゲル中
で125Ｉ−ヨード化コンカナバリンＡレクチンの該たん
白質への結合を用いる標準試験法の結果は、該たん白質
には糖が結合していないことを示唆している。
グリコシル化の欠如は、扁豆レクチン−セフアロースお
よび大麦胚芽アグルチニン−セフアロース由来のたん白
質溶出液を特異的に結合できないこと、およびたん白質
Ｎ−配糖体形成の特異的阻害剤であるタニカマイシン
（tunicamycin）の存在下で、該寄生体により合成した
場合該たん白質の大きさにまつたく影響を与えなかつた
ことからも、確認された。
例４ Ｐ．イエリー（P.yoelii）に結合した抗原の局在
化 アセトン固定した細胞を用いる間接蛍光抗体法では、該
抗原たん白質は分裂前体および分裂小体の膜に局在して
いた。抗体２５．１および該精製抗原に対して作つた多
価抗体共に、浮遊液中の固定していない正常な分裂前体
の表面とは反応しなかつた。該たん白質は、ラクトペル
オキシダーゼに触媒される正常分裂前体のヨード化では
標識されなかつたが、該細胞をはじめに０．０１％（Ｖ
／Ｖ）ノニデツトＰ４０を添加して可溶化した場合は標
識された。さらに培地にトリプシン（５μｇ／ml）を添
加した場合、実施例３で述べた寄生体細胞のin vitro孵
置の間に観察された該たん白質の処理に変化はなかつ
た。したがつて該たん白質は宿主細胞膜の外表面に露出
しているのでもなく、また内表面に局在しているのでも
ないと考えられる。抗体２５．１を用いた間接蛍光抗体
法のパターンは、実施例２の分子量が２．３０×１０5
のたん白質は、宿主赤血球の膜に結合しているのではな
く、増殖している細胞内寄生体の原形質膜に特異的に結
合していることを示唆している。アセトン固定した分裂
前体を、抗体２５．１（マウス免疫グロブリン）とウサ
ギ抗マウス赤血球抗血清の混合物と反応させた二重免疫
蛍光抗体法により得られた結果も、この解釈が正しいこ
とを支持している。スライドを洗浄して次に、ローダミ
ン結合ヤギ抗ウサギIgG抗血清とＦＩＴＣ結合ウサギ抗
マウスIgG抗血清を順次反応させた。鏡検すると、Ｐ．
イエリー（Ｐ．yoelii）分裂前体抗原（ＦＩＴＣにより
染色される）は、宿主赤血球膜（ローダミンにより染色
される）とは明らかに異なり、しかもその内側にある膜
に局在していることがわかつた。
初期の分裂前体は、残りの細胞体の形成に先立ち、該抗
原は該寄生体を取り巻く球形の膜に局在しているようで
あるが、分裂と残りの細胞体の形成の後は、この膜が個
々の分裂小体を取り巻くようである。したがつて分子量
２．３０×１０5のたん白質（および／あるいはそのた
ん白質分解誘導体）は、分裂前体に結合していると共
に、遊離の分裂小体に均一に分布している。
浮遊液中に遊離の分裂小体を用いた間接蛍光抗体法で、
抗体２５．１により陽性の蛍光が得られたが、これは該
抗原が分裂小体の膜の上にあることを示している。
例５ 単一クローン性抗体２５．１を用いて精製した、
プラズモジウムイエリー（Plasmodium yoelii）の抗原
によるマウスの免疫と抗体応答下記のスケジュールにし
たがつて、５匹のＢＡＬＢＩＣマウスの群を例２で得た
抗原たん白質か、あるいは対照物質により免疫した。
第１群 ５０μｇの抗原２５．１をフロイント完全アジ
ュバント（ＦＣＡ）に浮化させ、第０日目に０．２ml腹
腔内投与 ２０μｇの抗原２５．１を０．２mlの正常マウス血清
（ＮＭＳ）に浮遊させ、第２６日目に静脈注射 ２５μｇの抗原２５．１を食塩水に浮遊させ、第３９日
目に静脈注射 第２群 ＦＣＡのみ、第０日目に静脈注射 ＭＭＳのみ、第１８日目に静脈注射 食塩水のみ、第４２日目に静脈注射 第４９日目に血清試料をとり、間接蛍光抗体法により抗
体価測定と鏡検を行ない、下記の結果を得た。
抗原２５．１で免疫したマウスからとつた血清を用いた
蛍光染色パターンと、単一クローン性抗体２５．１を用
いて得たパターンは、区別できなかつた。染色は、Ｐ．
イエリー（Ｐ．yoelii）の分裂前体と分裂小体に限定さ
れていた。この結果は、例２の方法で調製した抗原２
５．１の純度と免疫学的性質を確証している。
例６ 単一クローン性抗体２５．１を用いて精製した、
プラズモジウムイエリー（Plasmodium yoelii）の抗原
によるマウスの免疫と、強制感染に対する防御反応 下記のスケジュールにしたがつて、５匹のＢＡＬＢＩＣ
マウスの群を例２で得た抗原たん白質か、あるいは対照
物質により免疫した。
第１群 １２μｇの抗原２５．１をＦＣＡに乳化し、第
０日目に0.2ml腹腔内投与 １２μｇの抗原２５．１をＦＣＡに乳化し、第３５日目
に腹腔内投与 ０．１ml食塩水中の２０μｇの抗原を、第５０日目に静
脈注射 第２群 ＦＣＡ中の２μｇの抗原２５．１を、第０日目
に腹腔内投与 ＦＣＡ中の２μｇの抗原２５．１を、第３５日目に腹腔
内投与 ０．１ml食塩水中の２０μｇの抗原を２５．１を、第５
０日目に静脈注射 第３群 ＦＣＡ中の食塩水を、第０日目に腹腔内投与 ＦＣＡ中の食塩水を第３５日目に腹腔内投与 ０．１mlの食塩水を第５０日目に静脈注射第６０日目に
血清試料をとり、間接蛍光抗体法により抗体価の測定と
免疫沈降反応による分析を行なつた。第６１日目に、１
０4Ｐ．イエリー（Ｐ．yoelii）ＹＭ−寄生体を持つた
赤血球を、すべてのマウスに投与した。免疫したマウス
の抗体応答を表１に示す。この結果は、使用した条件下
では、１２μｇの抗原２５．１による免疫の方が２μｇ
の抗原２５．１の免疫よりも、抗原の応答を引き出すの
により効果的であることを示している。
表１ 抗原25.1で免疫したマウスの抗体応答群 抗体価 抗体の特異性 １ ＞１：１０２４０ 分裂前体と分裂小体 ２ ＞１：５１２０ 分裂前体と分裂小体 ３ ＜１：４０ 非特異的 各群のＰ．イエリー（Ｐ．yoelii）に対して行なつた強
制感染に対する防御反応を図１に示す。この結果は、抗
体価の高い群の方が強制感染に対し、より効果的に防御
されたことを示している。対照群のマウスはすべて、強
制感染後８日以内に死んでいる。抗原２５．１で免疫し
たマウスはすべて生き残つた。
免疫したマウスから得た血清の抗原特異性を免疫沈降反
応で調べた結果、抗体の反応は、免疫に使用した分子量
２３０，０００の分裂前体抗原（およびその分解フラグ
メント）に向けられていた。
例７ Ｐ．フアルシパラム（Ｐ．falciparum）からの抗
原の同定 遠心分離によりパーコル（Percoll）層から調製した
Ｐ．フアルシパラム（Ｐ．falciparum）を寄生させた赤
血球の、分裂前体に富む画分を２時間にわたり、35−メ
チオニンで標識した。遠心分離後上層をとり免疫沈降反
応を行なつた。抗体はＰ．フアルシパラム（Ｐ．falcip
arum）に特異的で、実施例１の方法のハイブリドーマよ
り得たものを使用した。その特異的沈降物をＳＤＳゲル
電気泳動にかけると、該抗原は見かけの分子量が１．９
５×１０5の物質として泳動した。さらに別々の分解産
物がいくつか観察された。主要なフラグメントの分子量
は１．５３，１．５０，０．８３×１０5であり、さら
に分子量が1.12，1.10，1.08×１０5のフラグメントも
存在していた。
分子量1.95×１０5の成分がもともとのたん白質で、そ
こから特異的なフラグメントが得られたという事実は、
該細胞を２０分間の短い時間標識することにより確認さ
れた。P.フアルシパラム（Ｐ．falciparum）抗体を用い
た。この物質の抽出物の免疫沈降物は、分子量が１．９
×１０5の抗原に存在していた35−メチオニンの放射活
性をすべて持つていた。
この抗原（およびその特異的フラグメント）は、免疫沈
降反応やＳＤＳゲル電気泳動で測定すると、Ｐ．フアル
シパラム（Ｐ．falciparum）に対するヒトの免疫血清で
認識される物質の中に、はつきりあらわれてくる。
主フラグメントと１．９×１０5分子量種のアミノ酸順
列の関連性は、３５５−メチオニン含有ペプチドのペプ
チドマツピングにより確認した。抗原とそのフラグメン
トの等電点は大体５．８（１．９５×１０5）、５．２
（１．５３および１．５０×１０5）、６．０（１．１
０×１０5）および６．２−６．５（０．８３×１０5）
と測定された。
例８ Ｐ．フアルシパラム（Ｐ．falciparum）からの抗
原の調製 ヒト赤血球中に培養したＰ．フアルシパラム（Ｐ．falc
iparum）寄生体を、例２の方法のように集め、可溶化し
た。ハイブリドーマ株ＷＩＣ８９．１を含むマウスの腹
水から得た免疫グロブリンを結合させたセフアロースカ
ラムに、該可溶化物質を通した。実施例２の如く、カラ
ムを洗い、５０ｍＭジエチルアミン、０．１％ＮＰ４
０，pH１１．５で溶出すると、溶出液に含まれていたの
は分子量が１．９５×１０5の抗原と分子量が０．８３
×１０5のフラグメントがほとんどであつた。
例９ Ｐ．フアルシパラム（Ｐ．falciparum）から得ら
れる抗原の精製と変化 ３３時間おきに２回ソルビトールで処理し同調させてお
いたＰ．フアルシパラム（Ｐ．falciparum）を、４８時
間in vitro培養して、該寄生体の細胞内増殖時の、該た
ん白質の合成と変化について調べた。第２回目のソルビ
トール処理の後３時間おきに、ギムザ染色した寄生体の
形態学的観察を行ない、増殖段階を追跡した。最初の１
２時間はリング状のものだけが見られたが、その後栄養
体が現われ始め、２４時間で最適に達した。分裂前体は
２７時間目に初めて観察され、３９時間目には分裂前体
が最も多くなつた。３９時間目にいくつかの新しいリン
グ状のものが見えて、分裂小体の放出が起きたことを示
していたが、リング状のものはほとんど４５−４８時間
目まで現われなかつた。35 Ｓ−メチオニンの３０分間のパラスラベルの間に合成
したポリペプチドを、６時間間隔で調べた。３６時間目
の増員分裂のときにたん白合成が最高になつた。多くの
たん白質の合成時期は、増殖サイクル中に限定されたと
きにあつた。増員生殖のときにのみ合成された量の多い
たん白質のひとつは、分子量が１．９５×１０5のたん
白質であつた。
おのおのの時期に合成されたたん白質をプールしたヒト
の免疫血清で免疫沈降をさせると、はつきりしたパター
ンが観察された。リング状および栄養体の段階では、分
子量が１．６×１０5と０．７１×１０5の２つのポリペ
プチドのみが、ヒト免疫血清により認識され沈降した。
増員生殖の時期には、いくつかのポリペプチドがヒト免
疫血清に認識された。（分子量が０．３×１０5より大
きくて）量の多いものの分子量は、０．３７，０．４
０，０．４６，０．６２，０．７２，０．８０，０．８
４，０．８９，１．０４，１．２０，１．３４，１．４
６（二量体）、１．７８，１．９５，２．０８，２．２
０．２．３５×１０5であつた。これらのたん白質のう
ちのいくつかの合成は増員生殖の特定の時期に起きた。
分子量が１．９５×１０5の抗原は、該免疫血清により
認識され、増員生殖の間中合成され続けた。
単一クローン性抗体８９．１も増員生殖の間中、分子量
１．９５×１０5たん白質を沈降させた。可溶化しパル
スラベウした物質と、パルスラベルのあとで非標識メチ
オニンで６０から１２０分間追跡した細胞から得た可溶
化物質に、免疫沈降反応を実施し、該たん白質の合成後
の変化を調べた。寄生体増殖サイクル（不完全な分裂前
体）の３０時間目に、１２０分の追跡を行つたが放射活
性の低分子量への移行はみられなかつた。４２時間目
に、パルス期間にほとんどの放射活性は、分子量１９
５，０００のバンドに取り込まれたが、６０分間の追跡
で分子量が１．５３×１０5と１．５０×１０5のバンド
が顕著になり、分子量が０．８３×１０5のバンドも現
われた。１２０分の追跡の後分子量０．８３×１０5の
バンドの強さが増し、放射活性のいくらかは分子量０．
６×１０5のポリペプチドに結合していた。４５時間の
寄生体の増殖の後、追跡期間の間に分子量１９５，００
０のたん白質の別々のフラグメントへの変化ははるかに
大きくなつた。（４８時間の免疫沈降物は、３０分間の
パルス期間の間でさえ、分子量が１９５，０００のたん
白質から分子量が６０，０００のフラグメントへの変化
が起きていたことを示している。）この変化の開始時期
は、培養中の新しいリング状の発現と同時であり、した
がつて分裂前体の成熟と感染性分裂小体の放出と同時で
あつた。
例１０ Ｐ．フアルシパラム（Ｐ．falciparum）に結合
した抗原の局在化とＰ．イエリー（Ｐ．yoelii）抗原に
対する多価抗血清との交差反応性 アセトン固定細胞を用いた間接免疫蛍光抗体法より、該
抗原たん白質は分裂前体と分裂小体の膜に局在化してお
り、その分布は実施例４で述べた抗原と同じであつた。
実施例２で述べた如く、ｐ．イエリー（Ｐ．yoelii）抗
原に対するマウスの高抗体価の抗血清を作成し、p.イエ
リー（Ｐ．yoelii）抗原とＰ．フアルシパラム（Ｐ．fa
lciparum)抗原との、免疫学的交差反応性を証明した。
ｐ．イエリー（Ｐ．yoelii）に感染したマウスの細胞に
ついて、蛍光抗体法でこの抗血清を検査すると、蛍光染
色パターンは、単一クローン性抗体２５．１で得たもの
と区別が不可能であり、該抗体の抗体価は１：２０，０
００であつた。この抗血清をＰ．フアルシパラム（Ｐ．
falciparum）に感染したヒト赤血球に対し検査すると、
染色パターンは抗体８９．１のものと同じで、抗体価は
１：１，６００であつた。これはおそらく構造の類似性
に関係した２つの抗原の免疫学的交差反応性を示してい
る。
例１１ ワクチン 免疫化に用いるワクチンは通常法により調製され、次の
成分を持つている。
製剤Ａ 抗原 抗原 ２mg 生理食塩水 １ml 製剤Ｂ 抗原 １mg アルヒドロゲル １mg 生理食塩水 １ml
【図面の簡単な説明】
図面はＰ．イエリーによる強制感染に対する防御作用を
示す。 縦軸は寄生虫血症％を示し、横軸は強制感染後の日数を
示す。 ●第１群 ▲第２群 ○第３群

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Plasmodium yoeliiまたはPlasmodium falc
    iparum種寄生体の保護誘導性たん白質抗原であって、 (i) 見かけの分子量が1.8×105から2.5×105の範囲内
    であり、 (ii) Plasmodium yoelii種寄生体の保護誘導性たん白
    質抗原の等電点は約5.3−約5.7であり、Plasmodium fal
    ciparum種寄生体の保護誘導性たん白質抗原の等電点は
    約5.8であり、 (iii) 該寄生体の赤血球性の分裂前体型の膜に結合し
    ており、 そして(iv)赤血球内で処理されて、該保護誘導性たん白
    質抗原と同じ抗原性を有する別々のフラグメントにわか
    れ、そしてこれらのフラグメントは該寄生体の分裂小体
    の膜に結合している、 ことを特徴とする上記保護誘導性たん白質抗原、および
    その保護誘導性フラグメント。
  2. 【請求項２】上記抗原の見かけの分子量が1.90×105か
    ら2.30×105である、特許請求の範囲第1項に記載の抗
    原。
  3. 【請求項３】見かけの分子量が約1.95×105である、特
    許請求の範囲第2項に記載の抗原。
  4. 【請求項４】上記抗原が赤血球内で処理されて、見かけ
    の分子量がそれぞれ1.53×105,1.50×105および0.83×1
    05であって等電点がそれぞれ5.2,5.2及び6.2−6.5であ
    る別々のフラグメントにわかれるものである、特許請求
    の範囲第3項に記載の抗原。
  5. 【請求項５】上記保護誘導性フラグメントが、Plasmodi
    um falciparum種寄生体由来のものであって見かけの分
    子量が1.53×105で等電点が5.2である、特許請求の範囲
    第1項に記載の保護誘導性フラグメント。
  6. 【請求項６】上記保護誘導性フラグメントが、Plasmodi
    um falciparum種寄生体由来のものであって見かけの分
    子量が1.50×105で等電点が5.2である、特許請求の範囲
    第1項に記載の保護誘導性フラグメント。
  7. 【請求項７】上記保護誘導性フラグメントが、Plasmodi
    um falciparum種寄生体由来のものであって見かけの分
    子量が0.83×105で等電点が6.2−6.5である、特許請求
    の範囲第1項に記載の保護誘導性フラグメント。
  8. 【請求項８】Plasmodium yoeliiまたはPlasmodium falc
    iparum種寄生体の保護誘導性たん白質抗原であって、 (i) 見かけの分子量が1.8×105から2.5×105の範囲内
    であり、 (ii) Plasmodium yoelii種寄生体の保護誘導性たん白
    質抗原の等電点は約5.3−約5.7であり、Plasmodium fal
    ciparum種寄生体の保護誘導性たん白質抗原の等電点は
    約5.8であり、 (iii) 該寄生体の赤血球性の分裂前体型の膜に結合し
    ており、 そして(iv)赤血球内で処理されて、該保護誘導性たん白
    質抗原と同じ抗原性を有する別々のフラグメントにわか
    れ、そしてこれらのフラグメントは該寄生体の分裂小体
    の膜に結合している、 ことを特徴とする上記保護誘導性たん白質抗原の製造法
    であり、 (A) 分裂前体型の上記寄生体を含有する赤血球を可溶
    化する段階と、 (B) 得られる可溶化物質を、上記(i)、(ii)、(iii)及び
    (iv)の特性を有する抗原に対して特異的な単一クローン
    性抗体と接触せしめて、抗原−抗体複合体を得る段階
    と、 (C) 得られる抗原−抗体複合体より抗原を回収する段
    階、 からなる上記の保護誘導性たん白質抗原の製造法。
  9. 【請求項９】Plasmodium yoeliiまたはPlasmodium falc
    iparum種に対する免疫を誘導するのに適したワクチンで
    あり、 Plasmodium yoeliiまたはPlasmodium falciparum種寄生
    体の保護誘導性たん白質抗原であって、 (i) 見かけの分子量が1.8×105から2.5×105の範囲内
    であり、 (ii) Plasmodium yoelii種寄生体の保護誘導性たん白
    質抗原の等電点は約5.3−約5.7であり、Plasmodium fal
    ciparum種寄生体の保護誘導性たん白質抗原の等電点は
    約5.8であり、 (iii) 該寄生体の赤血球性の分裂前体型の膜に結合し
    ており、 そして(iv)赤血球内で処理されて、該保護誘導性たん白
    質抗原と同じ抗原性を有する別々のフラグメントにわか
    れ、そしてこれらのフラグメントは該寄生体の分裂小体
    の膜に結合している、 ことを特徴とする上記保護誘導性たん白質抗原あるいは
    その保護誘導性フラグメントを含有する上記ワクチン。
  10. 【請求項１０】上記保護誘導性たん白質抗原の見かけの
    分子量が1.90×105から2.30×105の範囲内である、特許
    請求の範囲第９項に記載のワクチン。
  11. 【請求項１１】見かけの分子量が約1.95×105である、
    特許請求の範囲第10項に記載のワクチン。
  12. 【請求項１２】上記保護誘導性たん白質抗原が赤血球内
    で処理されて、見かけの分子量がそれぞれ1.53×105，
    1.50×105および0.83×105であって等電点がそれぞれ5.
    2,5.2及び6.2−6.5である別々のフラグメントにわかれ
    るものである抗原を含有する、特許請求の範囲第11項に
    記載のワクチン。
  13. 【請求項１３】上記保護誘導性フラグメントが、見かけ
    の分子量が1.53×105で等電点が5.2であるフラグメント
    を含有する、特許請求の範囲第9項に記載のワクチン。
  14. 【請求項１４】上記保護誘導性フラグメントが、見かけ
    の分子量が1.50×105で等電点が5.2であるフラグメント
    を含有する、特許請求の範囲第9項に記載のワクチン。
  15. 【請求項１５】上記保護誘導性フラグメントが、見かけ
    の分子量が0.83×105で等電点が6.2−6.5であるフラグ
    メントを含有する、特許請求の範囲第9項に記載のワク
    チン。
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