JPH0662433B2 - ヘモフイルス・パラガリナ−ラムの粉状ワクチン製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヘモフイルス・パラガリナーラム(Haemophilus
paragallinarum)の粉状ワクチン製造法に関する。

ここで粉状ワクチンとは、ヘモフイルス・パラガリナー
ラムの感染性を不活化し、脱水して乾燥粉状とした抗原
をいう。

ヘモフイルス・パラガリナーラムは、ニワトリ伝染性コ
リーザの病原菌でグラム陰性菌の一つとして公知であ
り、前記菌に感染発病したニワトリは、臨床症状として
顔面腫張、鼻汁、流涙を呈し、また産卵率の低下を招く
ことが知られている。

また本病に対するワクチンとしては、液状、凍結乾燥の
２つの形態で市販されているものがあり、その感染防禦
効果は認められている。ここで一般的方法に従つて製造
されるワクチンには、病原微生物をホルマリン等の化学
的手段を用いて死菌化するか、あるいは紫外線照射等の
物理的手段を用いて死菌化する不活化ワクチンと、病原
微生物を生物学的手段を用いて弱毒化する弱毒生ワクチ
ンとがあり、前記ヘモフイルス・パラガリナーラム菌に
ついての前記市販ワクチンもこれら前記に属する。

しかしこれらのワクチンは、微生物由来のタンパク、
糖、脂質などを含んでいる等の理由から、抗原性を長期
に渡つて維持することが難かしい。そこで長期保存のた
めには、凍結乾燥、凍結、冷蔵保存等の条件が採用され
るが、このうち最も保存効果の優れたものとされる凍結
乾燥法では、これを実施するために多大な設備投資が必
要になりまた電力消費も大きいという問題がある。

このような現状から、抗原性の寿命が長期に渡るワクチ
ンの簡便な製造法の提供が望まれる。

また前記病原菌に対するワクチンの製造に際して望まれ
る他の課題は、製造されたワクチンの運搬、取扱い性の
容易化を実現することである。従来の液状または凍結乾
燥ワクチンでは、大量運搬に難があつたり特殊な運搬手
段が必要になるし、またヘモフイルス・パラガリナーラ
ム菌の３種の血清型（１９６２年、米国のPageが平板凝
集反応で型別）のものの流行状況に応じて行なうべき接
種ワクチンの使用態様の選択が、従来ワクチンでは制約
されているからである。

本発明は、前述した従来のワクチンとはことなり、ヘモ
フィルス・パラガリナーラム菌の培養菌液、あるいはこ
れより沈澱分離した前記菌をNaCl添加緩衝液又は生理食
塩水に懸濁させた菌液に、該菌液の２〜６倍量のアルコ
ール又はアセトンを加え、生成する沈澱を回収する工程
と、この回収した沈澱を再度アルコール又はアセトンに
懸濁させた後、沈澱を回収して減圧下で乾燥させる工程
とを有する方法により、ヘモフィルス・パラガリナーラ
ムの粉状ワクチンを製造することを特徴とするものであ
る。

本発明によつて製造される粉状ワクチンは、常温下でも
保存できる特徴をもち、またこれだけでなくその使用態
様についても、生理食塩水等に溶解させてニワトリに接
種する他、粉状であるため錠剤としたりカプセルに充填
して使用することも可能である。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明においては、ヘモフイルス・パラガリナーラム菌
を含む液を製造材料として、下記操作を順次に行なうこ
とにより、感染性の不活化された抗原が脱水乾燥された
粉状のものとして好適に製造される。

(a) 極性溶媒を用いた菌の回収 (b) アルコール又はアセトンを用いた菌の脱水乾燥 製造材料 本発明において使用される製造材料には、ヘモフイルス
・パラガリナーラムの培養菌液が用いられる。

ワクチンに混入する培地成分等を積極的に分離除去する
場合には、遠心法を用いて培養菌液中の培地成分を除去
し、得られた菌分画をNaClを含む緩衝液（リン酸塩緩衝
液、トリス塩酸緩衝液等）又は生理食塩水に懸濁させた
菌液を用いてもよい。

菌の培養は一般的方法に従つて行なわれるが、使用され
る培地の一例は次の通りである。

培地：１０００ml中 ニワトリ肉汁 ２００ml カザミノ酸(Difco) ５ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ イースト抽出液^＊ ３０ml ニワトリ血清^＊ １５ml 精製水 残 量 pH：７．０〜７．４ （＊：ロ過滅菌したもの） 培地中のニワトリ肉汁は、通常ブロイラー（産卵鶏も
可）の胸筋を使用し、次のように作製される。

を１夜４℃で抽出。

２） ３０分間煮沸 ３） メツシユロ過 ４） No.２ロ紙ロ過 ５） トリス（ヒドロキシル）アミノメタンでpH７．２
に修正 ６） 使用迄−２０℃に保存。

ニワトリ血清は、種類は問わないがコリーザに対する抗
体を保有しないものが使用される。

イースト抽出液は、例えばパン製造に使用される乾燥酵
母を使用し、次のように作製される。

２） ミキサーで混合 ３） ４℃で２夜抽出 ４） 冷却遠心機で遠心、上清をとる。

５） １０％NaOHでpHを７．６〜７．８に修正。

６） ザイツロ過、ミリポアロ過滅菌 ７） 使用迄−２０℃保存。

菌の回収および感染性の不活化 菌の回収においては、前記製造材料としての菌液に、極
性溶媒を加えて撹拌した後所定時間静置し、沈澱が生じ
て沈澱と上清が明確に区分できる時点で上清を除去し、
沈澱を回収する。

前記極性溶媒としては、メタノール、エタノール、アセ
トンが挙げられるが、このうちメタノールが最も代表的
に使用される。そして前記極性溶媒に菌が接触すること
により、菌回収の操作の過程において、ヘモフイルス・
パラガリナーラムの感染性の不活化が同時に達成され
る。

前記菌液に加えるべき極性溶媒は、冷却して用いること
が望ましい。また菌液に対して加えるべき量は通常は２
〜６倍量、好ましくは２〜３倍量とされる。

極性溶媒を加えることにより、菌液中の懸濁物は誘電率
の低下に伴なつて凝集沈澱を生ずるが、極性溶媒の加え
る量が少ないと沈澱の生成が充分でなく、反対に多すぎ
る場合には、得られる沈澱が塊状のものとなつて次段の
脱水乾燥の操作の際に、充分な脱水が達成されないこと
になる。

また極性溶媒を加えることで生成される沈澱分画は、一
般的には遠心分離により回収されるが、その他ロ紙、ホ
ローフアイバー、メンブレンフイルター等を用いたロ過
によつてもよい。

また沈澱と上澄みの明確な区分を得るには、極性溶媒を
加えた溶液を少なくとも１時間以上、好ましくは２〜３
時間程度静置することが望ましい。

菌の脱水乾燥 菌の脱水乾燥においては、前記により回収された菌の沈
澱分画を特定の有機溶媒に懸濁させた後、沈澱を回収し
て減圧下で乾燥する。

前記溶媒としては、菌の回収操作において使用される極
性溶媒（メタノール、エタノール、アセトン）が使用さ
れるが、菌の回収で用いたものと同一であることは要し
ない。

前記の要媒は、冷却して用いることが望ましい。菌の沈
澱を懸濁させる前記溶媒の量は特に制限されないが、製
造に用いた菌液の約半量程度とされることが望ましい場
合が多い。

また沈澱の回収は、一般的には遠心分離又はロ過によつ
て行なわれる。なお沈澱の回収に先立つて懸濁液は１時
間程度以上、好ましくは２〜３時間静置することがよ
い。

減圧乾燥は、回収した沈澱より溶媒を蒸散させるもので
あり、減圧（真空）容器内に前記回収した沈澱を収容さ
せて行なわれる。

以上の菌の脱水乾燥の操作は、前段における菌の回収の
操作による緩かな脱水作用に相まつて、製造されるワク
チンの好適な乾燥を実現するが、必要ならば脱水乾燥の
操作を２回以上繰り返して行なうようにしてもよい。

前述した菌の回収および脱水乾燥によつて製造された粉
状ワクチンは、これをニワトリに接種することで行なつ
た臨床試験において、好適な感染防禦効果を示すことが
確認された。

また粉状ワクチンは、２２℃を越えない条件の下で抗原
性の安定な保存が可能であり、４℃以下の最適条件下で
は、１年以上に渡り長期保存もできる。

本発明の一実施例のフローシートを示すと次の通りであ
る。

＊１ 全行程は０〜４℃で行なわれる。

＊２ 菌以外の培地成分が略除去される。

＊３ リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ） NaCl ８．０ｇ KCl ０．２ｇ Na₂HPO₄ １．１５ｇ KH₂PO₄ ０．２ｇ 上記試薬を蒸留水に溶解して１０００mlとし、その５０
０mlに菌を懸濁させる。

＊４ 菌を略１００％回収した含水状態の沈澱物。

＊５ 菌を略１００％回収し、菌以外の培地成分もい
くらか含む含水状態の沈澱物。

＊６ 本操作以降は、沈澱^*4、沈澱^*5について共通。

＊７ 真空デシケータ内に１夜収容。

＊８ 乾燥した粉状のワクチンのまま。

次に本発明の実施例とその感染防禦効果の試験例を示
す。

（培養菌液） Ａ型およびＣ型の血清型のヘモフイルス・パラガリナー
ラム菌について、それぞれ前記一例として示した液体培
地により、３７℃、通気、静置の条件で１７時間培養し
て培養菌液を作製した。

Ａ型は、動物医薬品検査所より分与されたNo.２２１株
を用い、またＣ型は、日本生物科学研究所が群馬県下の
養鶏場において発症病鶏から分離したＧ−１株を用い
た。

（乾燥粉状ワクチンの製造） 前記した培養菌液を製造材料として、前述のフローシー
トの手順に従い粉状ワクチンを製造した。

その結果を表１、表２に示す。表１は菌の回収および脱
水乾燥のためにいずれもアセトンを使用した場合であ
り、表２はいずれもメタノールを使用した場合である。

ただし製造は、３^＊、１３^＊を除き培養菌液を直接用い
た。また３^＊、１３^＊は培養菌液から回収した沈澱をリ
ン酸塩緩衝液で懸濁した菌液を用いた。

粉状ワクチンの感染防禦効果試験 （試験法） 製造された粉状ワクチンの０．２mgおよび０．８mgを、
２．５mgの水酸化アルミニウムゲル^*1を含むリン酸塩緩
衝液^*2（pH７．２〜７．４）０．５mlに溶解し、これを
ニワトリ^*3の大腿部に筋肉注射する。注射後３週めに１
〜２×１０^８CFUのヘモフイルス・パラガリナーラム菌
^*4をニワトリの鼻腔より感染させ、その後１週間臨床症
状を観察することで行なつた。

＊１ 水酸化アルミニウムゲル 硫酸アルミニウム １４９．４ｇ アンモニア水 ８５．３ml 上記試薬を蒸留水に溶解して１０００mlとする。

＊２ リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ） NaCl ８．０ｇ KCl ０．２ｇ Na₂HPO₄ １．１５ｇ KH₂PO₄ ０．２ｇ 上記試薬を蒸留水に溶解して１０００mlとする。

＊３ SPF（Specific pathogen fiee）のLine M系統の
ニワトリ。

＊４ 感染に用いる菌株は粉状ワクチンの製造に用いた
ものと同一のもの。

（効果の判定） 臨床症状の結果を、ワクチン非接種群について同様の菌
感染を行なつたものを対照として、その臨床症状を対比
することで行なつた。

また粉状ワクチンの抗原性の長期間安定性を判定するた
めに、一定期間保存後の粉状ワクチンについて前記試験
を同様に行なつた。

なお、血清型Ａ型のNo.２２１株は、ニワトリの赤血球
を凝集する赤血球凝集素(Haemagglutinin:HAと略す）を
もつので、この菌株より製造した粉状ワクチンについて
は前記臨床症状と共にHA阻止抗体（HIと略す）の産生を
HI反応により測定した。

これらの結果は下記表３−１、３−２および４−１、４
−２の通りであり、血清型Ａ型のNo.221株由来の粉状ワ
クチンについては、対照との比較において、臨床症状お
よびHI価のいずれにおいても抗原性が確認され、また長
期保存後においても抗原性は維持されていた。

また血清型Ｃ型のＧ−１株由来の粉状ワクチンについて
も、対照との比較において、臨床症状において抗原性が
確認され、長期保存においても抗原性は維持されてい
た。

本発明によれば、臨床症状として顔面腫張、鼻汁、流涙
を呈し、産卵率低下を招くヘモフィルス・パラガリナー
ラム菌を病原菌とした伝染性コリーザのワクチンを、長
期に渡ってその抗原性を維持することができ、しかも取
扱性、運搬性に優れたものとして提供できるという効果
がある。

また本発明方法によれば、凍結乾燥法に比べて、設備の
負担は極めて少なく、電力消費も少なくてよいという効
果も得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭49−6118（ＪＰ，Ａ) 特公 昭40−8152（ＪＰ，Ｂ１) 動物のワクチン社団法人北里研究所編 （株）養賢堂Ｐ．220〜230（昭和53年発 行）Ｐ．11，12

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヘモフィルス・パラガリナーラム菌の培養
   菌液に、あるいはこれより沈澱分離した前記菌を NaCl
   添加緩衝液又は生理食塩水に懸濁させた菌液に、該菌液
   の２〜６倍量のアルコール又はアセトンを加え、生成す
   る沈澱を回収する工程と、この回収した沈澱を再度アル
   コール又はアセトンに懸濁させた後、沈澱を回収して減
   圧下で乾燥させる工程とを有することを特徴とするヘモ
   フィルス・パラガリナーラムの粉状ワクチン製造法。