JPH0662846A - 分析試薬用酵素の安定化法、および溶液状の分析試薬用酵素 - Google Patents
分析試薬用酵素の安定化法、および溶液状の分析試薬用酵素Info
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- JPH0662846A JPH0662846A JP23650092A JP23650092A JPH0662846A JP H0662846 A JPH0662846 A JP H0662846A JP 23650092 A JP23650092 A JP 23650092A JP 23650092 A JP23650092 A JP 23650092A JP H0662846 A JPH0662846 A JP H0662846A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】本発明の目的は、溶液状態において十分な安定
性を持つ５種の分析試薬用酵素：ペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）、ウリカーゼ、およびコレステロールオキシダー
ゼ（ＣＯＤ）、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡｓＯ
Ｄ）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）を提供するこ
とにある。 【構成】ＰＯＤ、ウリカーゼ、ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、ＬＰ
Ｌから選択される酵素に対し、ウシ血清アルブミン、デ
キストラン、ポリエチレングリコールから選択される水
溶性担体を化学的に結合させることによって、これらの
酵素の溶液状態での安定性を改善する。 【効果】分析試薬用酵素の溶液状態における安定性の改
善により、分析試薬の溶液状態での供給に貢献する。
性を持つ５種の分析試薬用酵素：ペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）、ウリカーゼ、およびコレステロールオキシダー
ゼ（ＣＯＤ）、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡｓＯ
Ｄ）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）を提供するこ
とにある。 【構成】ＰＯＤ、ウリカーゼ、ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、ＬＰ
Ｌから選択される酵素に対し、ウシ血清アルブミン、デ
キストラン、ポリエチレングリコールから選択される水
溶性担体を化学的に結合させることによって、これらの
酵素の溶液状態での安定性を改善する。 【効果】分析試薬用酵素の溶液状態における安定性の改
善により、分析試薬の溶液状態での供給に貢献する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は分析試薬用酵素の安定化
技術に関するものである。健康管理や疾病の診断におい
ては、血液成分の分析をはじめとする様々な試験が実施
される。血液成分の分析には酵素を利用した方法が多い
が、酵素の中には不安定なものもあり分析の信頼性を高
めるために酵素の安定化は重要な課題である。また凍結
乾燥された形で流通することの多い分析試薬を溶液状態
で供給するためにも、酵素の安定化は避けて通ることの
できない課題である。
技術に関するものである。健康管理や疾病の診断におい
ては、血液成分の分析をはじめとする様々な試験が実施
される。血液成分の分析には酵素を利用した方法が多い
が、酵素の中には不安定なものもあり分析の信頼性を高
めるために酵素の安定化は重要な課題である。また凍結
乾燥された形で流通することの多い分析試薬を溶液状態
で供給するためにも、酵素の安定化は避けて通ることの
できない課題である。
【０００２】
【従来技術の問題点】酵素のような活性蛋白の保存に
は、凍結乾燥が最も一般的な方法である。分析試薬用酵
素においても例外ではなく、酵素、補酵素、緩衝成分、
発色成分等の分析に必要な成分を予め混合し凍結乾燥し
て供給されている。この凍結乾燥組成物は使用時に定め
られた量の水で溶解することにより、分析用の試薬溶液
とすることができる。分析用酵素試薬の凍結乾燥にあた
っては、ショ糖、マンニトール、ガラクトース、アルブ
ミン等の高分子化合物、あるいは酵素の基質や反応生成
物を共存させておくことによる安定化技術が知られてい
る。これらの物質の利用により、凍結乾燥状態での安定
化はある程度期待できる。
は、凍結乾燥が最も一般的な方法である。分析試薬用酵
素においても例外ではなく、酵素、補酵素、緩衝成分、
発色成分等の分析に必要な成分を予め混合し凍結乾燥し
て供給されている。この凍結乾燥組成物は使用時に定め
られた量の水で溶解することにより、分析用の試薬溶液
とすることができる。分析用酵素試薬の凍結乾燥にあた
っては、ショ糖、マンニトール、ガラクトース、アルブ
ミン等の高分子化合物、あるいは酵素の基質や反応生成
物を共存させておくことによる安定化技術が知られてい
る。これらの物質の利用により、凍結乾燥状態での安定
化はある程度期待できる。
【０００３】しかし最近になって、溶液状態での酵素試
薬の供給が望まれるようになった。凍結乾燥された試薬
は利用時に水で溶解する手間が必要な上、溶解後の安定
性について不安が残ることがその理由である。水による
溶解にあたっては、固形化した成分を完全に溶解させな
ければ試薬の性能が確保されない。一方激しくかくはん
すれば酵素蛋白が起泡により失活したり、あるいは界面
活性剤によって生じた液面の泡が試薬の定量採取を妨害
することもある。また溶解後の安定性が保証されない場
合には、いったん溶解した試薬は短時間で使い切るよう
にしなければならず経済的に不利である。
薬の供給が望まれるようになった。凍結乾燥された試薬
は利用時に水で溶解する手間が必要な上、溶解後の安定
性について不安が残ることがその理由である。水による
溶解にあたっては、固形化した成分を完全に溶解させな
ければ試薬の性能が確保されない。一方激しくかくはん
すれば酵素蛋白が起泡により失活したり、あるいは界面
活性剤によって生じた液面の泡が試薬の定量採取を妨害
することもある。また溶解後の安定性が保証されない場
合には、いったん溶解した試薬は短時間で使い切るよう
にしなければならず経済的に不利である。
【０００４】このような事情から溶液状態での分析用酵
素試薬の供給が望まれているが、多くの酵素については
十分な安定化技術が確立されていない。中でも、多くの
分析試薬で発色系として採用されている過酸化水素発色
系を構成するペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと省略す
る）、尿酸の測定に必要なウリカーゼ、コレステロール
の測定に用いるコレステロールオキシダーゼ（以下ＣＯ
Ｄと省略する）、アスコルビン酸の測定や消去に用いる
アスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡｓＯＤと省略す
る）、トリグリセライドの測定に用いるリポプロテイン
リパーゼ（以下ＬＰＬと省略する）は使用量が比較的多
い。したがって特に経済的な面で安定化による効果が大
きいが、溶液状態での安定性については未だに改善の余
地が残されているのが現状である。
素試薬の供給が望まれているが、多くの酵素については
十分な安定化技術が確立されていない。中でも、多くの
分析試薬で発色系として採用されている過酸化水素発色
系を構成するペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと省略す
る）、尿酸の測定に必要なウリカーゼ、コレステロール
の測定に用いるコレステロールオキシダーゼ（以下ＣＯ
Ｄと省略する）、アスコルビン酸の測定や消去に用いる
アスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡｓＯＤと省略す
る）、トリグリセライドの測定に用いるリポプロテイン
リパーゼ（以下ＬＰＬと省略する）は使用量が比較的多
い。したがって特に経済的な面で安定化による効果が大
きいが、溶液状態での安定性については未だに改善の余
地が残されているのが現状である。
【０００５】水溶性担体との結合による酵素の安定化に
ついては、ポリウレタンをグルコシダーゼに結合させて
安定化した例（特公平３−３６５１１号公報）等が知ら
れているが、その他の分析試薬用酵素についての報告は
無い。また一般にポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ
と省略する）のような水溶性担体は、酵素製剤の生体内
における抗原性の低減や半減期の延長に利用できること
が知られているが、分析試薬用酵素の溶液状態での保存
安定化に対する有効性については報告が無い。
ついては、ポリウレタンをグルコシダーゼに結合させて
安定化した例（特公平３−３６５１１号公報）等が知ら
れているが、その他の分析試薬用酵素についての報告は
無い。また一般にポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ
と省略する）のような水溶性担体は、酵素製剤の生体内
における抗原性の低減や半減期の延長に利用できること
が知られているが、分析試薬用酵素の溶液状態での保存
安定化に対する有効性については報告が無い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、分析試薬用
酵素の中でも比較的使用頻度の高い５種の酵素につい
て、溶液状態での十分な安定性を付与する技術の提供を
課題とするものである。本発明において安定化の対象と
なる５種の酵素とは、ＰＯＤ、ウリカーゼ、ＣＯＤ、Ａ
ｓＯＤ、そしてＬＰＬである。これらの分析試薬用酵素
を、溶液状態で流通可能とする安定化技術の提供が本発
明の課題である。
酵素の中でも比較的使用頻度の高い５種の酵素につい
て、溶液状態での十分な安定性を付与する技術の提供を
課題とするものである。本発明において安定化の対象と
なる５種の酵素とは、ＰＯＤ、ウリカーゼ、ＣＯＤ、Ａ
ｓＯＤ、そしてＬＰＬである。これらの分析試薬用酵素
を、溶液状態で流通可能とする安定化技術の提供が本発
明の課題である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＰＯＤ、ウリ
カーゼ、ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、そしてＬＰＬから選択され
る酵素を、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略す
る）、デキストラン、ＰＥＧから選択される水溶性担体
と化学結合させることを特徴とする溶液状態における分
析試薬用酵素の安定化法、ならびにこの方法によって安
定化された溶液状の分析試薬用酵素である。
カーゼ、ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、そしてＬＰＬから選択され
る酵素を、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略す
る）、デキストラン、ＰＥＧから選択される水溶性担体
と化学結合させることを特徴とする溶液状態における分
析試薬用酵素の安定化法、ならびにこの方法によって安
定化された溶液状の分析試薬用酵素である。
【０００８】本発明において安定化の対象となるＰＯ
Ｄ、ウリカーゼ、ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、そしてＬＰＬとし
ては、現在凍結乾燥品として流通している一般の分析試
薬に利用されているものをそのまま利用することができ
る。ＰＯＤとしては西洋ワサビ由来のもの、ウリカーゼ
としてはキャンディダ（Candida）等の微生物由来のも
の、ＣＯＤとしてはノカルディア（Nocardia）等の微生
物由来のもの、ＡｓＯＤとしてカボチャやキュウリ等の
植物由来のもの、そしてＬＰＬとしてはクロモバクテリ
ウム（Chromobacterium）等の微生物由来のものがよく
知られている。これらの酵素に対してＢＳＡ、デキスト
ラン、ＰＥＧから選択される水溶性担体を化学的に結合
させることにより本発明の安定化作用を得ることができ
る。
Ｄ、ウリカーゼ、ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、そしてＬＰＬとし
ては、現在凍結乾燥品として流通している一般の分析試
薬に利用されているものをそのまま利用することができ
る。ＰＯＤとしては西洋ワサビ由来のもの、ウリカーゼ
としてはキャンディダ（Candida）等の微生物由来のも
の、ＣＯＤとしてはノカルディア（Nocardia）等の微生
物由来のもの、ＡｓＯＤとしてカボチャやキュウリ等の
植物由来のもの、そしてＬＰＬとしてはクロモバクテリ
ウム（Chromobacterium）等の微生物由来のものがよく
知られている。これらの酵素に対してＢＳＡ、デキスト
ラン、ＰＥＧから選択される水溶性担体を化学的に結合
させることにより本発明の安定化作用を得ることができ
る。
【０００９】このとき水溶性担体との結合によって酵素
の活性が妨害されないように注意する必要が有る。好ま
しい結合方法としては、例えばグルタルアルデヒドで酵
素を活性化したのちに水溶性担体と反応させる方法、あ
るいは過ヨウ素酸等で水溶性担体を活性化して酵素を結
合させる方法等を挙げることができる。このような結合
方法を利用すれば、酵素の活性が失われることなく安定
化を図ることが可能である。またグルタルアルデヒドに
よって酵素の失活が心配されるときには、水溶性担体を
グルタルアルデヒドで活性化する方法を採用してもよ
い。
の活性が妨害されないように注意する必要が有る。好ま
しい結合方法としては、例えばグルタルアルデヒドで酵
素を活性化したのちに水溶性担体と反応させる方法、あ
るいは過ヨウ素酸等で水溶性担体を活性化して酵素を結
合させる方法等を挙げることができる。このような結合
方法を利用すれば、酵素の活性が失われることなく安定
化を図ることが可能である。またグルタルアルデヒドに
よって酵素の失活が心配されるときには、水溶性担体を
グルタルアルデヒドで活性化する方法を採用してもよ
い。
【００１０】水溶性担体との結合によって安定化された
分析試薬用酵素は、他の酵素、補酵素、発色剤等のその
他の試薬成分とともに適当な緩衝液に溶解して分析試薬
とすることができる。本発明の安定化分析試薬用酵素の
応用例を次に示す。 安定化ＰＯＤ：全ての過酸化水素発色系 安定化ウリカーゼ：尿酸の測定系 安定化ＣＯＤ：コレステロールの測定系 安定化ＡｓＯＤ：アスコルビン酸の測定や消去 安定化ＬＰＬ：トリグリセライドの測定 本発明の安定化分析試薬用酵素には、更にその他の公知
の安定化剤を添加しておくこともできる。このような公
知の安定化剤としては界面活性剤、有機溶媒、キレート
剤等が知られている。
分析試薬用酵素は、他の酵素、補酵素、発色剤等のその
他の試薬成分とともに適当な緩衝液に溶解して分析試薬
とすることができる。本発明の安定化分析試薬用酵素の
応用例を次に示す。 安定化ＰＯＤ：全ての過酸化水素発色系 安定化ウリカーゼ：尿酸の測定系 安定化ＣＯＤ：コレステロールの測定系 安定化ＡｓＯＤ：アスコルビン酸の測定や消去 安定化ＬＰＬ：トリグリセライドの測定 本発明の安定化分析試薬用酵素には、更にその他の公知
の安定化剤を添加しておくこともできる。このような公
知の安定化剤としては界面活性剤、有機溶媒、キレート
剤等が知られている。
【００１１】
【作用】本発明におけるＢＳＡ、デキストラン、および
ＰＥＧは、ＰＯＤ、ウリカーゼ、ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、Ｌ
ＰＬとの結合によってこれらの酵素を溶液状態で安定化
する作用を持つ。安定化の原理は不明であるが、水溶性
担体との結合が酵素蛋白の水素および疎水結合を保護し
て構造変化を防止し、安定化作用が増強されることによ
るものと推測される。
ＰＥＧは、ＰＯＤ、ウリカーゼ、ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、Ｌ
ＰＬとの結合によってこれらの酵素を溶液状態で安定化
する作用を持つ。安定化の原理は不明であるが、水溶性
担体との結合が酵素蛋白の水素および疎水結合を保護し
て構造変化を防止し、安定化作用が増強されることによ
るものと推測される。
【００１２】これらの水溶性担体は、単に蛋白と共存さ
せるだけでも蛋白の立体構造の保護作用により安定化剤
として機能する。しかし単に共存させただけでは水溶液
としたときに両者が効果的に接近する機会が非常に制限
され、結果として充分な安定化作用は得られない。一
方、本発明では、水溶性担体を酵素と化学的に結合させ
ることによって単なる共存では実現できない大きな安定
化効果を生んでいる。もちろん本発明における水溶性担
体が、単に共存させた場合と同様の作用を示しているで
あろうことは否定できない。しかし酵素−水溶性担体間
の化学的な結合による安定化という新しい作用を利用し
た本発明は、酵素と水溶性担体との単なる配合による安
定化技術とは明瞭に区別される。つづいて実施例に基づ
き本発明を更に詳細に説明する。
せるだけでも蛋白の立体構造の保護作用により安定化剤
として機能する。しかし単に共存させただけでは水溶液
としたときに両者が効果的に接近する機会が非常に制限
され、結果として充分な安定化作用は得られない。一
方、本発明では、水溶性担体を酵素と化学的に結合させ
ることによって単なる共存では実現できない大きな安定
化効果を生んでいる。もちろん本発明における水溶性担
体が、単に共存させた場合と同様の作用を示しているで
あろうことは否定できない。しかし酵素−水溶性担体間
の化学的な結合による安定化という新しい作用を利用し
た本発明は、酵素と水溶性担体との単なる配合による安
定化技術とは明瞭に区別される。つづいて実施例に基づ
き本発明を更に詳細に説明する。
【００１３】
１−１．安定化ＰＯＤの製造 ＢＳＡと結合させることによって安定化したＰＯＤを製
造した。ＰＯＤ（西洋ワサビ由来、東洋紡績社製）１０
mgを１．２５%のグルタルアルデヒドを含む０．１Mリン
酸緩衝液（ｐＨ６．８、以下ＰＢＳと省略する）０．２
mlに溶解し、室温で１８時間反応させた。反応後、０．
１５MのＮａＣｌで平衡化したセファデックスＧ−１０
０カラムに吸着させ、同じＮａＣｌ溶液で溶出して蛋白
各分を分取して活性化ＰＯＤを得た。１mlの０．１５M
ＮａＣｌに５mgのＢＳＡを溶解したものに活性化ＰＯＤ
１mlを混合し、１M炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．１ml
を加えて４℃で２４時間混合を続けた。更に０．２Mリ
ジン０．１mlを加えて４℃で２時間混合し、最終的に得
られた反応液を４℃で生理食塩水に対して透析し、安定
化ＰＯＤ溶液約２．５mlを得た。
造した。ＰＯＤ（西洋ワサビ由来、東洋紡績社製）１０
mgを１．２５%のグルタルアルデヒドを含む０．１Mリン
酸緩衝液（ｐＨ６．８、以下ＰＢＳと省略する）０．２
mlに溶解し、室温で１８時間反応させた。反応後、０．
１５MのＮａＣｌで平衡化したセファデックスＧ−１０
０カラムに吸着させ、同じＮａＣｌ溶液で溶出して蛋白
各分を分取して活性化ＰＯＤを得た。１mlの０．１５M
ＮａＣｌに５mgのＢＳＡを溶解したものに活性化ＰＯＤ
１mlを混合し、１M炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．１ml
を加えて４℃で２４時間混合を続けた。更に０．２Mリ
ジン０．１mlを加えて４℃で２時間混合し、最終的に得
られた反応液を４℃で生理食塩水に対して透析し、安定
化ＰＯＤ溶液約２．５mlを得た。
【００１４】１−２．安定化作用の確認 １で得た安定化ＰＯＤと処理前のＰＯＤの安定性を比較
した。次の組成を持つ過酸化水素測定用試薬を調製し、
２〜１０℃で保存してＰＯＤ活性の経時的な変化を観察
した。活性は、１２mMの過酸化水素０．０５mlと３．０
mlの過酸化水素測定用試薬を３７℃、１０分間反応さ
せ、反応終了後に５０５nmにおける吸光度を測定して決
定した。結果は図１に示すとおりである。本発明により
安定化されたＰＯＤは、２〜１０℃で保存した場合６カ
月以上にわたって十分な活性を維持することが確認され
た。一方、処理前のＰＯＤでは、翌月には既に調製時の
活性の半分以下となり、３カ月後にはほとんどの活性を
失っていた。 過酸化水素測定用試薬： 安定化ＰＯＤ １ml （または処理前のＰＯＤ ４mg） ４−アミノアンチピリン １０mg フェノール ４０mg ０．１MのＰＢＳで溶解し全量を１００mlとする
した。次の組成を持つ過酸化水素測定用試薬を調製し、
２〜１０℃で保存してＰＯＤ活性の経時的な変化を観察
した。活性は、１２mMの過酸化水素０．０５mlと３．０
mlの過酸化水素測定用試薬を３７℃、１０分間反応さ
せ、反応終了後に５０５nmにおける吸光度を測定して決
定した。結果は図１に示すとおりである。本発明により
安定化されたＰＯＤは、２〜１０℃で保存した場合６カ
月以上にわたって十分な活性を維持することが確認され
た。一方、処理前のＰＯＤでは、翌月には既に調製時の
活性の半分以下となり、３カ月後にはほとんどの活性を
失っていた。 過酸化水素測定用試薬： 安定化ＰＯＤ １ml （または処理前のＰＯＤ ４mg） ４−アミノアンチピリン １０mg フェノール ４０mg ０．１MのＰＢＳで溶解し全量を１００mlとする
【００１５】２−１．安定化ウリカーゼの製造 デキストランと結合させることによって安定化したウリ
カーゼを製造した。デキストラン５０mgを０．０６Mの
ＮａＩＯ4溶液１．０mlと室温で３０分間反応させた。
その後０．１６Mエチレングリコール１．０mlを添加し
室温で１時間放置して反応を停止し、０．０１M炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に対して４℃で１夜透析
した。透析後の反応液に５mgのウリカーゼ（Candida由
来、東洋紡績社製）を添加して室温で２時間反応させ、
更に５mgの水素化ホウ素ナトリウムを加えて４℃で１２
時間反応させた後、生理食塩水に対して４℃で１４時間
透析して安定化ウリカーゼ約２．４mlを得た。
カーゼを製造した。デキストラン５０mgを０．０６Mの
ＮａＩＯ4溶液１．０mlと室温で３０分間反応させた。
その後０．１６Mエチレングリコール１．０mlを添加し
室温で１時間放置して反応を停止し、０．０１M炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に対して４℃で１夜透析
した。透析後の反応液に５mgのウリカーゼ（Candida由
来、東洋紡績社製）を添加して室温で２時間反応させ、
更に５mgの水素化ホウ素ナトリウムを加えて４℃で１２
時間反応させた後、生理食塩水に対して４℃で１４時間
透析して安定化ウリカーゼ約２．４mlを得た。
【００１６】２−２．安定化作用の確認 ２−１で得た安定化ウリカーゼと処理前のウリカーゼの
安定性を比較した。次の組成を持つ尿酸測定用試薬を調
製し、２〜１０℃で保存してウリカーゼ活性の経時的な
変化を観察した。活性は、２mMの尿酸０．０５mlと３．
０mlの尿酸測定用試薬を３７℃、１０分間反応させ、５
５５nmにおける吸光度を測定して決定した。本発明によ
り安定化されたウリカーゼは、２〜１０℃で保存した場
合６カ月以上にわたって十分な活性を維持することが確
認された。 尿酸測定用試薬： 安定化ウリカーゼ １ml （または処理前のウリカーゼ ２mg） 安定化ＰＯＤ（実施例１） １ml ４−アミノアンチピリン １０mg ＥＭＳＴ １４０mg ０．１MのＰＢＳ（ｐＨ６．５）で溶解し全量を１００m
lとする ＥＭＳＴはＮ−エチル−Ｎ−（β−メチルスルホンアミ
ドエチル）ｍ−トルイジンナトリウムの略
安定性を比較した。次の組成を持つ尿酸測定用試薬を調
製し、２〜１０℃で保存してウリカーゼ活性の経時的な
変化を観察した。活性は、２mMの尿酸０．０５mlと３．
０mlの尿酸測定用試薬を３７℃、１０分間反応させ、５
５５nmにおける吸光度を測定して決定した。本発明によ
り安定化されたウリカーゼは、２〜１０℃で保存した場
合６カ月以上にわたって十分な活性を維持することが確
認された。 尿酸測定用試薬： 安定化ウリカーゼ １ml （または処理前のウリカーゼ ２mg） 安定化ＰＯＤ（実施例１） １ml ４−アミノアンチピリン １０mg ＥＭＳＴ １４０mg ０．１MのＰＢＳ（ｐＨ６．５）で溶解し全量を１００m
lとする ＥＭＳＴはＮ−エチル−Ｎ−（β−メチルスルホンアミ
ドエチル）ｍ−トルイジンナトリウムの略
【００１７】３−１．安定化ＣＯＤの製造 ＰＥＧと結合させることによって安定化したＣＯＤを製
造した。ＰＥＧ６０００（和光純薬工業社製）２．０g
をジオキサン１０mlに溶解し、更に１，１’−カルボニ
ルジイミダゾール１gを加えて混合し、３７℃で９０分
間反応させた。反応後０．１５MＮａＣｌで１夜透析
し、これを凍結乾燥して約２gの活性化ＰＥＧを得た。
得られた活性化ＰＥＧの１５０mgとＣＯＤ（Nocardia由
来、ベーリンガー・マンハイム社製）２０mgを、０．１
MのＰＢＳ（ｐＨ７．０）２mlに溶解して４℃で２０時
間反応させた。反応後、０．１５MのＮａＣｌで平衡化
したセファデックスＧ−２００カラムに吸着させ、同じ
ＮａＣｌ溶液で溶出して蛋白各分を分取し安定化ＣＯＤ
約２．４mlを得た。
造した。ＰＥＧ６０００（和光純薬工業社製）２．０g
をジオキサン１０mlに溶解し、更に１，１’−カルボニ
ルジイミダゾール１gを加えて混合し、３７℃で９０分
間反応させた。反応後０．１５MＮａＣｌで１夜透析
し、これを凍結乾燥して約２gの活性化ＰＥＧを得た。
得られた活性化ＰＥＧの１５０mgとＣＯＤ（Nocardia由
来、ベーリンガー・マンハイム社製）２０mgを、０．１
MのＰＢＳ（ｐＨ７．０）２mlに溶解して４℃で２０時
間反応させた。反応後、０．１５MのＮａＣｌで平衡化
したセファデックスＧ−２００カラムに吸着させ、同じ
ＮａＣｌ溶液で溶出して蛋白各分を分取し安定化ＣＯＤ
約２．４mlを得た。
【００１８】３−２．安定化作用の確認 ３−１で得た安定化ＣＯＤと単にＣＯＤをＰＥＧと共存
させた場合の安定性を比較した。次の組成を持つコレス
テロール測定用試薬を調製し、３７℃で保存してＣＯＤ
活性の経時的な変化を観察した。活性はコレステロール
３００mg/dl（イソプロパノール溶液）０．０５mlにコ
レステロール測定用試薬３．０mlを加え、３７℃で反応
させてタイムコース（５５５nm）を取った。結果は図２
に示すとおりである。単にデキストランと共存させた場
合には調製後２週間で極端な活性の低下が観察される
が、本発明で安定化したＣＯＤでは同じ期間でほとんど
活性の変化が見られない。 コレステロール測定用試薬： 安定化ＣＯＤ １ml （または未処理のＣＯＤ８mg＋ＰＥＧ６０mg） 安定化ＰＯＤ（実施例１） １ml ４−アミノアンチピリン １０mg ＴＯＯＳ ４０mg ０．１MのＰＢＳ（ｐＨ６．０）で溶解し全量を１００m
lとする ＴＯＯＳはＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウムの略
させた場合の安定性を比較した。次の組成を持つコレス
テロール測定用試薬を調製し、３７℃で保存してＣＯＤ
活性の経時的な変化を観察した。活性はコレステロール
３００mg/dl（イソプロパノール溶液）０．０５mlにコ
レステロール測定用試薬３．０mlを加え、３７℃で反応
させてタイムコース（５５５nm）を取った。結果は図２
に示すとおりである。単にデキストランと共存させた場
合には調製後２週間で極端な活性の低下が観察される
が、本発明で安定化したＣＯＤでは同じ期間でほとんど
活性の変化が見られない。 コレステロール測定用試薬： 安定化ＣＯＤ １ml （または未処理のＣＯＤ８mg＋ＰＥＧ６０mg） 安定化ＰＯＤ（実施例１） １ml ４−アミノアンチピリン １０mg ＴＯＯＳ ４０mg ０．１MのＰＢＳ（ｐＨ６．０）で溶解し全量を１００m
lとする ＴＯＯＳはＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウムの略
【００１９】４−１．安定化ＡｓＯＤの製造 ＢＳＡと結合させることによって安定化したＡｓＯＤを
製造した。ＡｓＯＤ（カボチャ由来、ベーリンガー・マ
ンハイム社製）２０mgを１．０%のグルタルアルデヒド
を含む０．１MのＰＢＳ（ｐＨ７．０）０．５mlに溶解
し、室温で１８時間放置した。反応後、０．１５MのＮ
ａＣｌで平衡化したセファデックスＧ−２００カラムに
吸着させ、同じＮａＣｌ溶液で溶出して蛋白各分を分取
して活性化ＡｓＯＤを得た。１mlの０．１５MＮａＣｌ
に２０mgのＢＳＡを溶解したものに活性化ＡｓＯＤ１ml
を混合し、１M炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．１mlを加
えて４℃で２４時間反応させた。更に０．２Mのリジン
０．１mlを加えて４℃で２時間混合し、最終的に得られ
た反応液を４℃でＰＢＳ（ｐＨ６．５）に対して透析
し、安定化ＡｓＯＤ約２．５mlを得た。
製造した。ＡｓＯＤ（カボチャ由来、ベーリンガー・マ
ンハイム社製）２０mgを１．０%のグルタルアルデヒド
を含む０．１MのＰＢＳ（ｐＨ７．０）０．５mlに溶解
し、室温で１８時間放置した。反応後、０．１５MのＮ
ａＣｌで平衡化したセファデックスＧ−２００カラムに
吸着させ、同じＮａＣｌ溶液で溶出して蛋白各分を分取
して活性化ＡｓＯＤを得た。１mlの０．１５MＮａＣｌ
に２０mgのＢＳＡを溶解したものに活性化ＡｓＯＤ１ml
を混合し、１M炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．１mlを加
えて４℃で２４時間反応させた。更に０．２Mのリジン
０．１mlを加えて４℃で２時間混合し、最終的に得られ
た反応液を４℃でＰＢＳ（ｐＨ６．５）に対して透析
し、安定化ＡｓＯＤ約２．５mlを得た。
【００２０】４−２．安定化作用の確認 ４−１で調製した安定化ＡｓＯＤの安定性を、単にＢＳ
Ａと共存させた場合と比較した。次の組成を持つＡｓＯ
Ｄ含有溶液を調製し、４−１で得た安定化ＡｓＯＤとと
もに３７℃で保存してその安定性を比較した。活性は、
４−１で得た安定化ＡｓＯＤまたはＡｓＯＤ含有溶液
０．１mlに１００mg/dlのアスコルビン酸溶液０．１ml
を添加し、３７℃、５分間反応させ、２４０nmにおける
アスコルビン酸の吸収変化から決定した。結果は図３に
示すとおりである。安定化ＡｓＯＤでは１週間以上にわ
たってアスコルビン酸の消去能が維持されたのに対し
て、単にＢＳＡと混合した場合には溶解した翌日には活
性の大部分が失われていた。 ＡｓＯＤ含有溶液： ＡｓＯＤ ８mg ＢＳＡ ８mg ０．１MのＰＢＳ（ｐＨ６．５）で全量を１．０mlとす
る
Ａと共存させた場合と比較した。次の組成を持つＡｓＯ
Ｄ含有溶液を調製し、４−１で得た安定化ＡｓＯＤとと
もに３７℃で保存してその安定性を比較した。活性は、
４−１で得た安定化ＡｓＯＤまたはＡｓＯＤ含有溶液
０．１mlに１００mg/dlのアスコルビン酸溶液０．１ml
を添加し、３７℃、５分間反応させ、２４０nmにおける
アスコルビン酸の吸収変化から決定した。結果は図３に
示すとおりである。安定化ＡｓＯＤでは１週間以上にわ
たってアスコルビン酸の消去能が維持されたのに対し
て、単にＢＳＡと混合した場合には溶解した翌日には活
性の大部分が失われていた。 ＡｓＯＤ含有溶液： ＡｓＯＤ ８mg ＢＳＡ ８mg ０．１MのＰＢＳ（ｐＨ６．５）で全量を１．０mlとす
る
【００２１】５−１．安定化ＬＰＬの製造 デキストランと結合させることによって安定化したＬＰ
Ｌを製造した。２−１のウリカーゼに代えてＬＰＬ（Ch
romobacterium由来、旭化成社製）４５mgを用いて安定
化ＬＰＬ約２．６mlを得た。こうして得られた安定化Ｌ
ＰＬは、未処理のものや単にデキストランと共存させた
ＬＰＬと比べ、溶液状態での安定性が優れている。
Ｌを製造した。２−１のウリカーゼに代えてＬＰＬ（Ch
romobacterium由来、旭化成社製）４５mgを用いて安定
化ＬＰＬ約２．６mlを得た。こうして得られた安定化Ｌ
ＰＬは、未処理のものや単にデキストランと共存させた
ＬＰＬと比べ、溶液状態での安定性が優れている。
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば、ＰＯＤ、ウリカーゼ、
ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、ＬＰＬを、溶液状態において高度に
安定化することができる。本発明で安定化された分析試
薬用酵素は２〜１０℃という輸送に不便の無い温度にお
いても、６カ月以上にわたって実用的な活性を維持す
る。このように、本発明は分析試薬の溶液状態での供給
に大きく貢献するものである。また本発明で安定化の対
象とした酵素は、多くの酵素試薬の中でも比較的消費量
の大きいものである。したがって経済的な観点から見て
も本発明の効果は大きい。
ＣＯＤ、ＡｓＯＤ、ＬＰＬを、溶液状態において高度に
安定化することができる。本発明で安定化された分析試
薬用酵素は２〜１０℃という輸送に不便の無い温度にお
いても、６カ月以上にわたって実用的な活性を維持す
る。このように、本発明は分析試薬の溶液状態での供給
に大きく貢献するものである。また本発明で安定化の対
象とした酵素は、多くの酵素試薬の中でも比較的消費量
の大きいものである。したがって経済的な観点から見て
も本発明の効果は大きい。
【図１】図１は、本発明によって安定化されたＰＯＤ
と、処理前のＰＯＤの安定性を比較した結果を示すグラ
フである。図中、縦軸は試薬調製直後のＰＯＤ活性を１
００とした値を、横軸は時間（月）を示す。
と、処理前のＰＯＤの安定性を比較した結果を示すグラ
フである。図中、縦軸は試薬調製直後のＰＯＤ活性を１
００とした値を、横軸は時間（月）を示す。
【図２】図２は、本発明によって安定化されたＣＯＤ
と、未処理のＣＯＤを単にＰＥＧと共存させたときの安
定性を比較した結果を示すグラフである。図中、縦軸は
５５５nmにおける吸光度の変化量を、横軸は反応時間
（分）を示す。
と、未処理のＣＯＤを単にＰＥＧと共存させたときの安
定性を比較した結果を示すグラフである。図中、縦軸は
５５５nmにおける吸光度の変化量を、横軸は反応時間
（分）を示す。
【図３】図３は、本発明によって安定化されたＡｓＯＤ
と、未処理のＡｓＯＤを単にＢＳＡと共存させたときの
安定性を比較した結果を示すグラフである。図中、縦軸
は試薬調製直後のＡｓＯＤ活性（アスコルビン酸消去
能）を１００とした値を、横軸は保存期間（日）を示
す。
と、未処理のＡｓＯＤを単にＢＳＡと共存させたときの
安定性を比較した結果を示すグラフである。図中、縦軸
は試薬調製直後のＡｓＯＤ活性（アスコルビン酸消去
能）を１００とした値を、横軸は保存期間（日）を示
す。
Claims (2)
- 【請求項１】ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、リ
ポプロテインリパーゼから選択される酵素を、ウシ血清
アルブミン、デキストラン、ポリエチレングリコールか
ら選択される水溶性担体と化学結合させることを特徴と
する溶液状態における分析試薬用酵素の安定化法 - 【請求項２】ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、リ
ポプロテインリパーゼから選択される酵素を、ウシ血清
アルブミン、デキストラン、ポリエチレングリコールか
ら選択される水溶性担体と化学結合させたことを特徴と
する安定化された溶液状の分析試薬用酵素
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23650092A JPH0662846A (ja) | 1992-08-12 | 1992-08-12 | 分析試薬用酵素の安定化法、および溶液状の分析試薬用酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23650092A JPH0662846A (ja) | 1992-08-12 | 1992-08-12 | 分析試薬用酵素の安定化法、および溶液状の分析試薬用酵素 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662846A true JPH0662846A (ja) | 1994-03-08 |
Family
ID=17001655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23650092A Pending JPH0662846A (ja) | 1992-08-12 | 1992-08-12 | 分析試薬用酵素の安定化法、および溶液状の分析試薬用酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0662846A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000017299A (ja) * | 1998-07-01 | 2000-01-18 | San Contact Lens:Kk | 蛋白分解酵素含有洗浄液、および酵素洗浄液中の蛋白分解酵素を安定化する方法 |
| JP2010148526A (ja) * | 2010-04-05 | 2010-07-08 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
| WO2013161676A1 (ja) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | 協和メデックス株式会社 | コレステロールオキシダーゼの安定化方法 |
| WO2013176225A1 (ja) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | 協和メデックス株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| CN105412942A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-03-23 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂 |
-
1992
- 1992-08-12 JP JP23650092A patent/JPH0662846A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000017299A (ja) * | 1998-07-01 | 2000-01-18 | San Contact Lens:Kk | 蛋白分解酵素含有洗浄液、および酵素洗浄液中の蛋白分解酵素を安定化する方法 |
| JP2010148526A (ja) * | 2010-04-05 | 2010-07-08 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
| WO2013161676A1 (ja) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | 協和メデックス株式会社 | コレステロールオキシダーゼの安定化方法 |
| KR20150013452A (ko) | 2012-04-27 | 2015-02-05 | 교와 메덱스 가부시키가이샤 | 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법 |
| US9683228B2 (en) | 2012-04-27 | 2017-06-20 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for stabilizing cholesterol oxidase |
| WO2013176225A1 (ja) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | 協和メデックス株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| KR20150014927A (ko) | 2012-05-25 | 2015-02-09 | 교와 메덱스 가부시키가이샤 | 아스코르브산옥시다아제의 안정화 방법 |
| JPWO2013176225A1 (ja) * | 2012-05-25 | 2016-01-14 | 協和メデックス株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| US9546363B2 (en) | 2012-05-25 | 2017-01-17 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for stabilizing ascorbic acid oxidase |
| CN105412942A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-03-23 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂 |
| CN105412942B (zh) * | 2015-12-23 | 2019-02-26 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂 |
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