JPH0666798A - 検体中の抗原又は抗体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 免疫測定法において、反応容器の汚染を防止
しながら、非特異反応によるブランク値の上昇を防止
し、かつ免疫反応を促進させる。 【構成】 固相担体を用いる免疫測定法において、免疫
反応系にＨＬＢ値が１２〜１９の非イオン界面活性剤を
１．５〜６ w/w％添加することを特徴とする検体中の抗
原又は抗体の測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫反応を原理として、
生体中に微量存在する免疫反応の成分を高感度で測定す
る方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】例えば、血液や髄液などの各種体液、便
や尿などの排泄物、各種組織の抽出液などの生体試料中
に含まれている微量物質の測定には、放射免疫測定法
（ＲＩＡ）や酵素免疫測定法（ＥＩＡ）などの免疫測定
法が採用されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】免疫測定法は、特異性
が高く非常に高感度であることから微量成分の測定法と
しての重要性が増している。しかしながら、不均一相で
の免疫測定法には、抗原と抗体の特異的な反応の検出を
妨害する種々の干渉のあることが知られている。これら
は、“マトリックス効果”、“バックグラウンド”又は
“非特異吸着”と呼ばれている。この非特異的な妨害
は、測定試料中に含まれている成分に起因し、この成分
は、通常、免疫測定における“干渉物質”と呼ばれてい
る。

【０００４】これまで、干渉物質による非特異的な妨害
を減少させるため、ゼラチンやケラチンの水解物を添加
する方法（特開昭５６−４２１４２）、及び界面活性剤
を添加する方法（特開昭５８−１８７８６２、特開昭６
０−５３８４６及び、特開昭６１−２６０１６３）等が
既に知られており、これらの手法の活用により測定精度
の部分的な改良は期待できるが、いまだ不満足な状況に
あった。

【０００５】更に、他の問題点として、免疫反応を行な
う容器の汚染がある。全自動免疫測定装置を用いる場
合、免疫反応から発色・蛍光・発光などの検出反応まで
の全ての反応を同一反応容器で行なったり、免疫反応の
容器を簡単な洗浄工程を経て、繰り返し使用することが
しばしば行なわれている。この場合、免疫反応の際の容
器の汚染は、著しいブランク値の上昇や測定精度の低下
を起こす。

【０００６】また、免疫反応の促進のため、界面活性剤
等を添加し、免疫測定法の精度の向上を計る試みも行な
われている。たとえば、ポリエチレングリコールを用い
る方法（P. TIJSSEN著、石川栄治監訳、生化学実験法１
１（「エンザイムイムノアッセイ」東京化学同人）、及
び界面活性剤を用いる方法（特開昭６２−７１８６１）
等の報告があるが、上記の干渉物質による非特異反応
（非特異的な妨害）の減少や免疫反応を行なう容器の汚
染を低下させることを同時に満足できるものではなかっ
た。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決すべく種々の研究を重ねた結果、免疫反応の成
分の１つが固相に存在する免疫測定系に非イオン界面活
性剤から選ばれる特定の界面活性剤を特定の量添加する
ことにより、上記課題を同時に解決できることを見出し
て本発明を完成した。

【０００８】即ち、本発明は、水不溶性の支持体に結合
した抗体又は抗原を用いて検体中の抗原又は抗体を測定
する際に、１２〜１９のＨＬＢ（Hydrophile Lipophile
Balance）値を有する非イオン界面活性剤を抗原−抗体
反応系に１．５〜６ w/w％の濃度となるように存在させ
て抗原−抗体反応を行なうことを特徴とする検体中の抗
原又は抗体の測定法、に関する。

【０００９】本発明によれば、不均一相における免疫測
定法において、反応容器の免疫反応の際の汚染を防止で
き、又、干渉物質による非特異的な妨害を減少させるこ
とにより、バックグラウンドを下げ、特に低値における
測定結果の再現性を向上させることができ、更に、免疫
反応が促進され、これにより、低値における測定精度が
向上し、分析時間が短縮する。

【００１０】以下、本発明について詳細に説明する。

【００１１】本発明において、水不溶性の支持体に結合
した抗体又は抗原即ち固相化した抗体又は抗原を用いる
が、水不溶性の支持体即ち固相化担体としては、例え
ば、ビーズ、磁性粒子、マイクロタイタープレート、チ
ューブ、膜など種々のものが使用でき、特に限定されな
い。

【００１２】固相化担体に結合させる抗体又は抗原とし
ては、各種のものが使用でき、特に限定されないが、検
体中の測定すべき物質に応じて選択されることは言うま
でもない。固相化担体に対する抗体又は抗原の結合は、
化学的結合であっても物理的結合（吸着）であってもよ
い。

【００１３】検体としては種々のものが使用でき、特に
限定されない。例えば、血清、血漿、血液、髄液等の各
種体液や尿等の排泄物、便等の希釈物から固形分を除去
したもの、各種組織の抽出液等が挙げられ、特に限定さ
れない。

【００１４】本発明において、抗原−抗体反応、即ち免
疫反応による検体中の抗原又は抗体の測定は公知の方法
によって行なうことができる。例えば、酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定
法（ＦＩＡ）等の免疫測定法により行なうことができ
る。又、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等種々の方
法で行なうことができ、固相化した抗体又は抗原を使用
する方法ならいずれの方法であってもよい。なお、これ
らは、例えば石川栄治ら共編、「酵素免疫測定法」、第
２版、医学書院、１９８２年；山村雄一監修、医化学実
験法講座、第４巻「免疫化学」中山書店、１９７２年；
入江實編、「続ラジオイムノアッセイ」、講談社、１９
７９年等に記載されている。

【００１５】なお、免疫反応は通常４〜４５℃及びｐＨ
＝４〜９において行なうのが好ましく、又、免疫反応の
後、常法によりＢ／Ｆ分離及び検出を行なう。

【００１６】本発明において、免疫反応を行なう容器と
しては種々のものが使用でき、特に限定されない。

【００１７】固相化担体としてマイクロタイタープレー
トやチューブを用いる場合は、固相化担体自体を反応容
器とすることができるが、固相化担体とは別途に各種の
反応容器を用いることもできる。これら別途に用いる各
種の反応器としては、ガラス又はプラスチック製のチュ
ーブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、
マイクロタイタープレート、凍結乾燥した磁性ビーズを
１回測定分づつシールし保存容器をかねるプラスチック
製の容器（たとえば、東ソー社製ＡＩＡシリーズ用の試
薬の容器）、専用に設計され、洗浄しながら繰り返し使
用する全自動ＥＩＡ測定装置用の反応管（オリンパス社
製ＰＫシーズ用の反応管）などが挙げられる。

【００１８】これらの反応容器は、節約のために、交換
することなく全工程（例えばＥＩＡの場合、１次（２
次）免疫反応、ＢＦ分離、検出反応となる）を通して同
一の反応容器を使用したり、さらには、一度使用した反
応容器を、簡単な洗浄後、何度も繰り返し使用すること
もできる。

【００１９】本発明の特徴は、上記免疫反応を行なう際
に、１２〜１９のＨＬＢ値を有する非イオン界面活性剤
を１．５〜６ w/w％の濃度となるように抗原−抗体反応
系に存在させる点にある。

【００２０】非イオン界面活性剤としては、ＨＬＢ値が
１２〜１９であれば特に限定されないが、好ましくは、
ポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤及び多価アル
コール系非イオン界面活性剤からなる群から選ばれる化
合物が挙げられる。

【００２１】たとえば、ポリオキシエチレンノニルフェ
ニルエーテル（具体的には、ノニオンＮＳ−２０８．
５、ノニオンＮＳ−２２０、及びノニオンＮＳ−２７０
（日本油脂製）など）、ポリオキシエチレンオレイルエ
ーテル（具体的には、ノニオンＥ−２１５（日本油脂
製）など）、ポリオキシエチレンモノステアレート（具
体的には、ノニオンＳ−１５．４、及びノニオンＳ−４
０（日本油脂製）など）、並びにポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート（具体的には、ツウィーン２０
など）、等である。

【００２２】本発明で使用する非イオン界面活性剤の免
疫反応系への添加量は、１．５〜６w/w％であるが、好
ましくは、２〜５ w/w％である。

【００２３】添加量が１．５ w/w％未満においては、免
疫反応容器の汚染を防止し、かつ免疫反応を促進させる
効果が得られない。また、６ w/w％を越えると、かえっ
て非特異反応によるブランク値の上昇をきたすことにな
る。

【００２４】本発明において非イオン界面活性剤を免疫
反応系に添加する場合、免疫反応系がいくつかのステッ
プに分かれている時は、特定のステップのみに加える場
合と、全ての免疫反応系のステップに加える場合がある
が、このいずれであっても良く、特に限定されるもので
はない。

【００２５】非イオン界面活性剤の添加時期は、少なく
とも免疫反応の際にその系内に非イオン界面活性剤が存
在すれば特に制限されない。たとえば、免疫反応媒体、
標識成分、特異的免疫成分（抗体又は抗原）、又は検体
等に添加しておいてもよく、また免疫反応時に、検体、
標識成分、必要により特異的免疫成分を加えた免疫反応
媒体（即ち免疫反応系）中に別に添加してもよい。

【００２６】非イオン界面活性剤は、そのまま添加して
も、水溶液または分散液として添加してもよい。

【００２７】

【実施例】次に、実施例によって、本発明を具体的に説
明するが、これらによって本発明が限定されるものでは
ない。

【００２８】実施例１ 各種界面活性剤の効果を下記のサンドイッチ法によるＮ
ＣＣ−ＳＴ−４３９抗原の酵素免疫測定法により調べ
た。

【００２９】免疫反応用緩衝液（１％牛血清アルブミン
含有リン酸生理食塩水）およびペルオキシダーゼ標識Ｎ
ＣＣ−ＳＴ−４３９抗体を免疫反応用緩衝液で希釈した
酵素標識抗体液に、各種界面活性剤を３ w/w％になるよ
うに添加した。

【００３０】測定操作は以下のように行った。

【００３１】サンドイッチ法によるＮＣＣ−ＳＴ−４３
９抗原の酵素免疫測定法 反応用トレイにＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗体が結合した直
径６．２５mmのポリスチレンビーズを入れ、これに０ｕ
／ml，２．５ｕ／mlおよび１００ｕ／mlの標準抗原溶液
を５０μｌ採取し、免疫反応用緩衝液を２００μｌ加
え、３７℃で２時間の免疫反応を行った。１mlの生理食
塩水で３回ビーズを洗浄し、次いで免疫反応用緩衝液と
同一の界面活性剤を含有する酵素標識抗体液２５０μｌ
を加えて室温で１時間反応した。さらに、ビーズを１ml
の生理食塩水で３回洗浄したのち別の試験管に移し、
２．８７ｍＭ ２，２’−アジノビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン−６−スルホン酸）および０．０１４％過
酸化水素を含む発色液３００μｌを加えて室温で１時間
反応した。その後、０．１４mMアジ化ナトリウムを含む
反応停止液を２ml加えて精製水を対照に４２０nmの吸光
度を測定した。

【００３２】測定は５回の多重測定で行い、吸光度の平
均値、変動係数（ＣＶ）および０ｕ／mlの場合の吸光度
に対する２．５ｕ／mlの場合の吸光度の比（ＳＮ比）を
求め比較した。

【００３３】対照として界面活性剤無添加および免疫反
応促進効果の知られるポリオキシエチレングリコール
（ＰＥＧ）を添加した系でも同様の測定を行った。

【００３４】結果を表１に示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】表１から明らかなごとく、１２から１９の
ＨＬＢ値を有する非イオン界面活性剤を添加することに
よって、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原濃度が０ｕ／mlの場
合の発色は低くなり、２．５および１００ｕ／mlの場合
の発色は高くなっており、変動係数も小さくなった。ま
たＳＮ比も対照に比べ大きくなった。

【００３７】このことは免疫反応を促進しながらバック
グラウンドは下がり、低値における免疫反応の測定感度
及び測定精度は向上したことを示している。

【００３８】実施例２ 界面活性剤濃度の影響をサンドイッチ法によるＮＣＣ−
ＳＴ−４３９抗原の酵素免疫測定法により調べた。

【００３９】界面活性剤としてポリオキシエチレンノニ
ルフェニルエーテル（ＨＬＢ値１８．７）およびポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート（ＨＬＢ値１
６．７）を用い、実施例１と同一の免疫反応用緩衝液お
よび酵素標識抗体液に０．１から８．０ w/w％になるよ
うに添加して実施例１と同様の測定操作で測定した。

【００４０】測定は５回の多重測定で行い、吸光度の平
均値、変動係数（ＣＶ）を求め比較した。

【００４１】対照として界面活性剤無添加及びポリオキ
シエチレングリコール２００００を添加した系でも同様
の測定を行った。

【００４２】結果を表２に示す。

【００４３】低濃度の界面活性剤添加ではバックグラウ
ンドを下げる効果も免疫反応の促進効果も十分でなく、
高濃度では逆にバックグラウンドが高くなることが判っ
た。１．５から６．０ w/w％の添加で良好な効果が得ら
れた。

【００４４】

【表２】

【００４５】実施例３ 反応容器の汚染防止効果をサンドイッチ法によるＮＣＣ
−ＳＴ−４３９抗原の酵素免疫測定法により調べた。

【００４６】２ w/w％のポリオキシエチレンソルビタン
モノラウレート（ＨＬＢ値１６．７）を実施例１と同一
の免疫反応用緩衝液および酵素標識抗体液に添加して検
討した。

【００４７】オリンパス社製自動酵素免疫分析装置ＰＫ
３１０用反応Ｕ字管にＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗体が結合
した直径６．２５mmのポリスチレンビーズを入れ、これ
に０ｕ／mlの標準抗原溶液５０μｌを採取し、免疫反応
用緩衝液を２００μｌ加え、３７℃で２時間免疫反応を
行った。１mlの生理食塩水で３回ビーズを洗浄し、酵素
標識抗体液２５０μｌを加えて室温で１時間反応した。
さらに、ビーズを１mlの生理食塩水で３回洗浄したのち
別の試験管に移した。ビーズおよび免疫反応に使用した
反応Ｕ字管にそれぞれ２．８７ｍＭ ２，２’−アジノ
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
および０．０１４％過酸化水素を含む発色液３００μｌ
加えて室温で１時間反応した。その後、０．１４mMアジ
化ナトリウムを含む反応停止液を２ml加えて精製水を対
照に４２０nmの吸光度を測定した。

【００４８】対照として界面活性剤無添加の系でも同様
の測定を行った。

【００４９】結果を表３に示す。

【００５０】

【表３】

【００５１】ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ
ート（ＨＬＢ値１６．７）を免疫反応系に添加すること
により、反応Ｕ字管の汚染が防止された。

【００５２】実施例４ 同一反応容器の連続使用による再現性をサンドイッチ法
によるＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原の酵素免疫測定法によ
り調べた。

【００５３】界面活性剤としてポリオキシエチレンノニ
ルフェニルエーテル（ＨＬＢ値１８．７）およびポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート（ＨＬＢ値１
６．７）を用い、実施例１と同一の免疫反応用緩衝液お
よび酵素標識抗体液に２．０ w/w％になるように添加し
て検討した。

【００５４】測定操作はオリンパス社製自動酵素免疫分
析装置ＰＫ３１０を使用し、０ｕ／mlの標準抗原溶液又
は血清検体５０μｌと免疫反応用緩衝液２１０μｌを、
ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗体が結合した直径６．２５mmの
ポリスチレンビーズを入れた反応Ｕ字管に採取し第１反
応を３７℃で１５．７５分間行った。Ｂ／Ｆ分離用緩衝
液で洗浄した後、酵素標識抗体液３００μｌを分注し、
第２反応を３７℃で１６．７５分間行った。再びＢ／Ｆ
分離用緩衝液で洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン−
過酸化水素系の発色剤３００μｌを分注し、３７℃で１
６分間反応させた。希釈液を７００μｌ分注して４９２
nmと８００nmの吸光度差を測定した。同一反応管により
連続３回測定し変動係数を求めた。

【００５５】対照として界面活性剤無添加の系でも同様
の測定を行った。

【００５６】結果を表４に示す。

【００５７】

【表４】

【００５８】界面活性剤を添加した系はバックグラウン
ドが低く連続使用による吸光度の上昇傾向も見られなか
った。また、変動係数も小さく、明らかに添加効果が見
られた。

【００５９】実施例５ ＨＢｓ抗原測定キットの酵素標識抗体液へのポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート（ＨＬＢ値１６．
７）の添加効果を調べた。

【００６０】ダイナボット社製ＨＢｓ抗原測定キットの
酵素標識抗体液に２．０ w/w％のポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート（ＨＬＢ値１６．７）を添加し
て所定の操作法に従って陰性および陽性検体をサンドイ
ッチ法により測定した。

【００６１】対照として界面活性剤無添加の系でも同様
の測定を行った。

【００６２】結果を表５に示す。

【００６３】

【表５】

【００６４】陰性検体の吸光度は下がり、陽性検体の吸
光度は高くなり、明らかに陰性と陽性の差が大きくなっ
ていた。

【００６５】実施例６ ＣＥＡ測定キットの酵素標識抗体液へのポリオキシエチ
レンノニルフェニルエーテル（ＨＬＢ値１８．７）の添
加効果を調べた。

【００６６】ロシュ社製ＣＥＡ測定キットの酵素標識抗
体液に３．０ w/w％のポリオキシエチレンノニルフェニ
ルエーテル（ＨＬＢ値１８．７）を添加して所定の操作
法に従って０および２０ng／mlの標準抗原をサンドイッ
チ法により測定した。

【００６７】対照として界面活性剤無添加の系でも同様
の測定を行った。

【００６８】結果を表６に示す。

【００６９】

【表６】

【００７０】０ng／ml標準抗原の吸光度は下がり、２０
ng／ml標準抗原の吸光度は高くなった。バックグラウン
ドの低下は低濃度の測定感度及び測定精度の向上を示
し、かつ免疫反応が促進されているのも明らかである。

【００７１】

【発明の効果】本発明によれば、反応容器の汚染が防止
され、バックグラウンドを下げ、免疫反応が促進され、
特に低値における測定精度及び測定精度並びに再現性を
向上させることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田辺 敏雄 群馬県高崎市岩鼻町16−３ (72)発明者 高木 久子 群馬県高崎市竜見町13−５ (72)発明者 岩本 政之 群馬県高崎市岩鼻町239 Ｆ−32

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水不溶性の支持体に結合した抗体又は抗
   原を用いて検体中の抗原又は抗体を測定する際に、１２
   〜１９のＨＬＢ値を有する非イオン界面活性剤を抗原−
   抗体反応系に１．５〜６ w/w％の濃度となるように存在
   させて抗原−抗体反応を行なうことを特徴とする検体中
   の抗原又は抗体の測定法。
2. 【請求項２】 前記非イオン界面活性剤を抗原−抗体反
   応系に２〜５ w/w％の濃度となるように存在させること
   を特徴とする請求項１記載の測定法。