JPH0670787A

JPH0670787A - 多糖類の改質方法

Info

Publication number: JPH0670787A
Application number: JP5163913A
Authority: JP
Inventors: Arie Kamperman; アリー・カンパーマン; Nicolaas Charles M Laane; ニコラス・チャールズ・エム・ラーネ; Diederik Johannes M Schmedding; ディーデリク・ヨハネス・マリア・スチメディング
Original assignee: Quest International BV
Current assignee: Givaudan Nederland Services BV
Priority date: 1992-06-09
Filing date: 1993-06-08
Publication date: 1994-03-15

Abstract

(57)【要約】【目的】酵素を使用する多糖類の改質方法において、
使用された酵素を簡便に回収する方法を提供する。【構成】本発明は、水性媒体中に導入された多糖類に
改質酵素の作用を施すことによって、多糖類を改質する
方法に関する。酵素反応の終りにおいて、改質された多
糖類は、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコール、Ｃ₃〜Ｃ₄ケトン、Ｃ
₁〜Ｃ₄アルキルアセテート、及びＣ₂〜Ｃ₄エーテル
から成る群から選択される有機溶媒、又は無機水溶性塩
の添加によって沈殿させられる。その後、得られた液体
中に残留した改質酵素が再使用の目的のために回収され
る。また、所望により、得られた液体中に存在する反応
生成物を回収することことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、（水性媒体中に導入さ
れた）多糖類に改質酵素の作用を施すことによって、多
糖類を改質する方法に関する。より詳細に述べると、本
発明は、酵素を使用する多糖類の改質方法であって、か
なりの量の酵素を回収することができる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、（多）糖類の改質を行うことの
できる種々の酵素的改質方法が存在する。幾つかのグア
ー(guar)の改質方法を以下に記載する。ガラクトマンナ
ンに酵素的改質を施す場合、α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル側鎖の減少、即ち、ガラクトマンナンのガラクトース
含有率の減少が達成され、これは改良されたゲル形成特
性のような変化した特性を有する生成物をもたらす。さ
らに、特に、ガラクトマンナン「グアー」が約40％の高
いガラクトース含有率を有することが指摘される。この
高いガラクトース含有率のために、グアーのゲル形成特
性が不十分であると考えらる。このような特性を改良す
るために、グアーにα−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵素の作
用を施して、ガラクトース含有率を約10乃至30重量％ま
で減少させることが知られている。これに関して、エイ
チ・エス・デュガル(H. S. Dugal)とジェー・ダブリュ
ー・スワンソン(J. W. Swanson) のＩＰＰＴＡ、第11
巻、第１号、29〜35頁、1974年、を参照すると、これに
は、酵素又は酵素の混合物によるグアーの処理が側鎖と
マンナン主鎖との間の結合を切断することの原理が示さ
れている。この反応は80℃で５分間加熱することによっ
て停止されると記載されている。含まれている酵素のそ
のような不活性化は、残留するα−Ｄ−ガラクトピラノ
シル側鎖を全くか又はほとんど有していない無価値な生
成物が生成するのを防ぐために必要である。しかしなが
ら、酵素はかなり高価であるが、酵素の回収方法につい
ては全く示されていない。

【０００３】欧州特許公開公報第 0,121,960号（EP-A-
0,121,960）には、グアーのゲル化特性を改良する方法
が記載されているが、それによれば、ガラクトース側鎖
単位の一部がマンナン主鎖から特異的α−Ｄ−ガラクト
シダーゼ酵素の助けによって除去される。この酵素が検
知可能な程度のβ−マンナーゼ活性を有していないのは
明らかである。なぜなら、β−マンナーゼ酵素はガラク
トマンナンの主要なマンナン主鎖を切断するからであ
る。マンナン主鎖の切断は溶液の粘度を特定のしかし重
要な産業的用途にとって許容できない水準まで低下させ
る。適する酵素は植物性の源（例えば、アルファルファ
(lucerne) 、コロハ(fenugreek) 、コーヒー豆、又はグ
アーの種子）或いはバクテリア又は菌類の源から得るこ
とができるが、これらはβ−マンナーゼからの粗酵素配
合物を精製する必要があるためかなり高価であり、プロ
セスの終りに酵素が、例えば、80乃至100 ℃で処理され
ることによって、単純に失活させられることが問題にな
る。

【０００４】また、欧州特許公開公報第 0,192,401号
（EP-A-0,192,401）には、グアーのゲル化特性の改良方
法が開示されているが、この方法は、グアー中のガラク
トース含有量の少なくとも約10％が分離されるまで、水
性溶液中のグアーをα−ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼ酵素、即ち、α−Ｄ−ガラクトシダーゼにさらすこ
とによって特徴付けられる。このα−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼは、ペニシリウム（Penicillium)種の特定の群から
誘導される。しかしながら、ガラクトマンナンの改質方
法の最後には、問題の酵素は反応混合物の加熱によって
失活される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】残念なことに、これら
の方法のいずれにおいても、酵素を簡便に回収すること
はできない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】驚くべきことに、本発明
者らは、上述したように多糖類の転化を行う方法であっ
て、ポリマーの最終生成物からかなりの改質酵素を回収
できる特殊な方法を見出だしたが、それによってその酵
素をさらなる多糖類改質プロセスにおいて再使用でき
る。より詳細には、本発明の方法は、(a) 改質された多
糖類が、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコール、Ｃ₃〜Ｃ₄ケトン、Ｃ
₁〜Ｃ₄アルキルアセテート、及びＣ₂〜Ｃ₄エーテル
から成る群から選択される有機溶媒、又は無機水溶性塩
の添加によって沈殿させられること、(b) 得られた液
（上澄液または濾液）中に残留した改質酵素が再使用の
目的のために回収されること、及び(c) 適当な場合に
は、転化物、特に分解された側鎖（モノマー形態が有
利）、が得られた液体から回収できること、によって特
徴付けられる。

【０００７】本発明の上述の説明に関連して、本発明の
唯一性は、本発明による特定の沈殿剤の群の特殊な性
質、即ち、これらの沈殿剤が改質された多糖類のみを水
性反応液から沈殿させ、改質酵素は沈殿させず、改質酵
素は前記液体中に溶解したままであるという点に存在す
る。

【０００８】本発明の上述の説明に関連して、酵素が粗
酵素（蛋白質）源から、硫酸アンモニウム塩による塩析
か、又は酵素の沈殿をもたらす有機溶媒のイソプロパノ
ールの添加によって、回収できることを示している、本
技術分野の多数の文献が参照される。しかしながら、こ
のような従来技術の方法は、例えば、側鎖分解酵素のα
−Ｄ−ガラクトシダーゼは上澄液中に溶解したままであ
り、処理された多糖類、即ち、転化されたガラクトマン
ナン基質のみが析出する本発明の方法とは全く異なるも
のである。上述の意味の文献には以下のものが含まれ
る。

【０００９】日本特許第 1291795号（JP 1291795）宝酒
造株式会社：この引例は、粗生産系、即ち、バシジオミ
コラ(Basidiomycola) の子実体(fruit body)又は菌糸体
を含む培養混合物からプロリンペプチダーゼを、培養混
合物の均質化トップ部分を硫酸アンモニウムを使用する
塩析によって回収する方法に関する；日本特許第 12385
10号（JP 1238510）宝酒造株式会社：この引例は、硫酸
アンモニウムを使用する塩析によって、粗生産系、即
ち、果実から回収された安定な蛋白質分解酵素を含む化
粧品材料を開示している；ソビエト特許第 1110801号
（SU 1110801) VOKON TECH. INST. ：この引例は、水性
抽出と硫酸アンモニウムによる酵素の沈殿による、粗生
産系、即ち、リゾープス・ピグマエス(Rhizopus pygmau
es) Pl-8からのミルク凝固性プロテイナーゼの回収を記
載している；ソビエト特許第 908796 号（SU 908796) M
OSC FOOD IND. TECH. ：この引例は、硫酸アンモニウム
を使用する塩析によって、粗生産系、即ち、微生物培地
から製造されたグルコアミラーゼを回収することに関す
る。

【００１０】上記のものに加えて、イソプロピルアルコ
ール（イソプロパノール）及びアセトンのような有機溶
媒を使用して酵素が分離できることを示している従来技
術が参照される。例えば、米国特許第 4,083,960号の第
２欄１乃至15行には、微生物の細胞のトルエン抽出物中
に存在するβ−ガラクトシダーゼ酵素を有機溶媒のアセ
トン及びイソプロピルアルコールによって沈殿させるこ
とが開示されている。

【００１１】本発明の方法の工程(c) について言及する
と、転化物、特に多糖類の切断された側鎖、からの改質
酵素の分離（これらはいずれも工程(a) の後得られる液
体中に存在する）は、ガラクトースが側鎖又は側鎖成分
である場合特に関心が持たれる。このようにして、ユダ
ヤ教の法にかなったガラクトースを製造することがで
き、これは次にユダヤ教の法にかなった食品を製造する
のに使用できる。このような分離は当業者に公知の方法
によって行うことができ、例えば、限外濾過によって行
うことができる。

【００１２】本発明の方法に関連して、有機溶媒には、
Ｃ₁〜Ｃ₄アルコールとしてメタノール、エタノール、
プロパノール、イソプロパノール、ブタン-1- オール、
及びブタン-2- オール、Ｃ₃〜Ｃ₄ケトンとしてアセト
ン、Ｃ₁〜Ｃ₄アルキルアセテートとして酢酸メチル、
酢酸エチル、酢酸プロピル、及び酢酸ブチル、及びＣ₂
〜Ｃ₄エーテルとしてジエチルエーテルが包含される。
エタノール、メタノールが好ましい溶媒であり、イソプ
ロパノールが最も好ましい。得られた多糖類生成物の沈
殿によって酵素反応を停止させるのに必要な有機溶媒の
量は約30〜60％w/w である。側鎖分解酵素のα−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼの安定性に関連して、イソプロパノール
がガラクトマンナン用の沈殿剤として使用された場合、
得られたα−Ｄ−ガラクトシダーゼ含有媒体は０〜10℃
の範囲の温度に保つのが好ましい。

【００１３】上述したように、得られた多糖類生成物を
沈殿させるのに使用される有機溶媒は無機水溶性塩で置
き換えることができる。より詳細に述べると、そのよう
な塩は、硫酸アンモニウム（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、硫酸マ
グネシウム（ＭｇＳＯ₄）、塩化ナトリウム（ＮａＣ
ｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、硫酸ナトリウム
（Ｎａ₂ＳＯ₄）、及び硼酸ナトリウム（Ｎａ₃Ｂ
Ｏ₃）から成る群から選択される。得られた多糖類生成
物用の塩析方法において使用される塩としては、硫酸ア
ンモニウムを使用するのが好ましい。使用量は使用され
る塩にもよるが、15〜30％w/w の範囲が好ましい。

【００１４】本発明の方法に適用できる多糖類の代表的
例は、マンナン主鎖とα−Ｄ−ガラクトピラノシル側鎖
を有するガラクトマンナンである。その他の例は、ペク
チン、アミロペクチン、アラビナン、微生物の多糖類
（例えば、キサンタン）、カッパ−カラジーナン（3,6
アンヒドロ形成酵素；λカラジーナンに転化）、その他
である。

【００１５】上述のガラクトマンナンの例は、グアー
（シアナポシス・テトラゴノリブス(Cyanaposis tetrag
onolibus) から得られる）、アルファルファ（メディカ
ゴ・サチバ(Medicago sativa) ）、コロハ（トリゴネラ
ホエヌム・グアエクム(Trigonellafoenum graecum)）、
及びロカストビーンガム(locust bean gum) （セラトニ
ア・シリグア(Ceratonia siligua) ）である。ガラクト
マンナンのさらに別の例は、Adv. Carbohydr. Chem. Bi
ochem. 35 (1978) 、341 頁以降に報告されている。こ
れらのガラクトマンナンは、約20乃至50％w/w のガラク
トースを含む。この異なるガラクトース含有率のため
に、上述のガラクトマンナンは異なる特性を有する。例
えば、約21％w/w のガラクトース含有率を有するロカス
トビーンガムは、キサンタン又はカッパ−カラジーナン
のようなその他の多糖類と、ゲルとして観察される錯体
を形成することができるが、約40％w/w のガラクトース
含有率を有するグアーはできない。品質は劣るかも知れ
ないがグアーのかなり低い価格と大きな入手の容易さを
考慮すると、（可溶性）生成物を汚染物から容易に精製
できるので、本発明の方法はグアーに特に適している。
処理されるグアーが多量であることを考慮すると、使用
されたα−Ｄ−ガラクトシダーゼの回収は経済的に重要
であると考えられる。

【００１６】上述したように、α−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ酵素は植物及び微生物の源から抽出できる。しかしな
がら、比較的高い価格は別として（欧州特許公開公報第
0,192,401号の第１頁25〜27行を参照されたい）、得ら
れたα−Ｄ−ガラクトシダーゼ抽出物は一般にいくらか
のβ−マンナナーゼ活性も示す。この理由のために、遺
伝的に改質された微生物によって製造された欧州特許公
開公報第 0,255,153号によるα−Ｄ−ガラクトシダーゼ
生成物が使用できる。さらに、酵素の添加量は広い範囲
で変化できるが、ガラクトマンナン１ｇ当たり10〜60単
位(Units) の範囲が好ましい（パラ−ニトロフェノール
−ガラクトースを発色基質として使用する標準的酵素ア
ッセイに従って決定；欧州特許公開公報第 0,255,153号
の実施例4.1を参照されたい。

【００１７】本発明に従って処理されたガラクトマンナ
ン中のガラクトース含有率の減少度は最終生成物の用途
に依存する。一般に、10〜30％w/w の範囲、好ましくは
15〜20％w/w の低下されたガラクトース含有率が許容可
能であると考えられる。

【００１８】本発明によるガラクトマンナンの処理は、
0.1 〜３％w/w のガラクトマンナン、好ましくはグアー
を含む水性媒体中で行うのが好ましい。反応温度は広い
範囲内で変化できるが、15〜40℃の範囲が好ましい。反
応時間は主に出発材料に必要な転化率に依存するが、一
般に１〜10時間の範囲である。

【００１９】完全性のために、本発明に従って処理され
たガラクトマンナンでゲル化される生成物の例は食品及
び飼料生成物であり、例えば、清涼飲料、ベーカリーゼ
リー、及びインスタントプディングである（Food Techn
ol. 27(1973)、26頁以下の頁を参照のこと）。

【００２０】得られた酵素溶液が直ぐには再使用されな
い場合、酵素活性を十分に高い水準で維持するために、
低温で最も良好に保つことができる。このことは、グア
ーの改質に関する図１及び図２によって示されている。

【００２１】図１は実施例１で得られた40％イソプロパ
ノール／水抽出物中のα−Ｄ−ガラクトシダーゼの安定
性のデータを示すグラフである。白丸はＴ＝４℃、黒丸
はＴ＝20℃。

【００２２】図２は実施例２で得られた18％硫酸アンモ
ニウム／水抽出物中のα−Ｄ−ガラクトシダーゼの安定
性のデータを示すグラフである。白丸はＴ＝４℃、黒丸
はＴ＝20℃。

【００２３】本発明を以下の実施例によって説明する
が、これらの実施例は本発明を限定するためのものでは
ない。

【００２４】

【実施例】実施例１及び２は本発明の基本的な方法を説
明する。ここでは、グアーが基質として使用され、α−
Ｄ−ガラクトシダーゼが改質酵素として使用される。し
かしながら、この方法は、以下に示す基質と酵素の組み
合わせを使用して行っても同等の結果を得ることができ
る。

【００２５】基質酵素ガラクトマンナングアーガラクトース−オキシダーゼペクチン（メトキシル化ペクチンメチル−エステラーゼポリガラクツロン酸）アミロペクチンプルラナーゼ分枝鎖アラビナンアラビノフラノシダーゼ澱粉グルコシルトランスフェラーゼアルギネート（ガラクツロン酸とマンヌロナン−Ｃ₅エピメラーゼマンヌロン酸のブロックコポリマー）

【００２６】実施例１ 10ｇのグアー粉末（フィルゲル(Filgel) P9155；オラン
ダ、ナーデンのクエスト・インターナショナルによって
市販されている）を15 ml のイソプロパノールと混合し
て水中のグアーの均質溶液を製造した。この懸濁液を10
mM 酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）緩衝液（ｐＨ＝4.5 ）
の１リットルに添加し、得られた混合物を連続的に攪拌
した。十分な粘度に達したグアー溶液を得るために、溶
液を80℃で15分間加熱した。

【００２７】このグアー溶液を40℃まで冷却した後、体
積を蒸発に対して調節し（１リットルまで）、その後、
グアー１ｇ当たり30単位のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ
（欧州特許公開公報第 0,255,153号に記載されているよ
うにサッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerev
isiae)から誘導したもの）を添加した（即ち、合計で30
0 単位の酵素）。３時間のインキュベーション時間の
後、40％w/w までイソプロパノールを溶液に添加するこ
とによって、酵素反応を停止させた。得られた沈殿物を
200 メッシュのナイロンスクリーン（75μm ）上で濾過
し、オーブン乾燥器中で乾燥した。得られた繊維状の物
質を（改質された）グアーの粉末仕様に適合するように
微粉砕した。

【００２８】遊離したガラクトースの90％以上も含む得
られた濾液中のα−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性は、Ｐ
ＮＰＧ（パラ−ニトロフェノール−ガラクトース）を発
色基質として使用する標準的酵素アッセイによって測定
した（欧州特許公開公報第 0,255,153号の実施例 4.1を
参照されたい）。測定された値は、初めに添加された活
性に基づいて、約70％（＝±200 Ｕ）であった。これに
関連して、グアー溶液、即ち、インキュベーション溶液
そのもの中の酵素活性は、３時間のインキュベーション
時間の後、初期酵素活性の80％未満まで低下していたこ
とが指摘される。即ち、極少量の酵素しか改質グアーと
共沈しなかったことが指摘される。

【００２９】上述の回収されたα−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ活性は別のグアーの酵素処理に使用できる。しかしな
がら、高温では酵素活性が減少することが予想される。
このため、40％w/w イソプロパノール／水抽出物中の酵
素安定性試験を行って、酵素の安定性は例えば４℃のよ
うな低温では十分であるが、20℃のような高い温度では
長時間の貯蔵（５時間以上）に対しては不十分であると
考えられることを示した。これらの試験は、３％w/w の
α−Ｄ−ガラクトシダーゼ含有率を有する40％w/w イソ
プロパノール／水抽出物を使用して行った。特定の間隔
で（即ち、０、１、２、３、４、５、及び24時間後にお
いて）、酵素の活性を上述のＰＮＰＧを使用する標準的
酵素アッセイによって測定した。安定性試験の結果を図
１に示す。

【００３０】実施例２実施例１に記載した方法を行ったが、ただし、１時間の
インキュベーション時間の後、18％w/w の量まで硫酸ア
ンモニウムを溶液に添加することによって酵素反応を停
止させた。

【００３１】得られた濾液中のα−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ活性を実施例１に記載した標準的アッセイによって測
定した。酵素活性の測定値は、初めに添加された活性に
基づいて、約70％であった。これに関連して、インキュ
ベーション段階中にすでにグアー溶液の初期酵素活性は
80％未満まで低下したいたという事実が着目される。

【００３２】別のグアーの酵素処理に使用できる上述の
回収されたα−Ｄ−ガラクトシダーゼの安定性を実施例
１に定義したようにして調べた。サンプルは３％w/w の
α−Ｄ−ガラクトシダーゼ含有率を有する18％w/w 硫酸
アンモニウム／水抽出物であった。安定性試験の結果を
図２に示すが、これは４℃と20℃の両方における良好な
貯蔵特性を示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた40％イソプロパノール／水
抽出物中のα−Ｄ−ガラクトシダーゼの安定性のデータ
を示すグラフである。

【図２】実施例２で得られた18％硫酸アンモニウム／水
抽出物中のα−Ｄ−ガラクトシダーゼの安定性のデータ
を示すグラフである。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年９月７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ニコラス・チャールズ・エム・ラーネオランダ国、1412・ジーエス・ナーデン、ジュリアナラーン 28 (72)発明者ディーデリク・ヨハネス・マリア・スチメディングオランダ国、1412・エヌシー・ナーデン、スクート 83

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】水性媒体中に導入された多糖類に改質酵
素の作用を施すことによって多糖類を改質する方法であ
って、 (a) 改質された多糖類を、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコール、Ｃ₃〜Ｃ₄ケトン、Ｃ₁〜Ｃ₄
アルキルアセテート、及びＣ₂〜Ｃ₄エーテルから成る
群から選択される有機溶媒、又は無機水溶性塩の添加に
よって沈殿させること、 (b) 得られた液体中に残留した改質酵素を再使用の目的
のために回収すること、及び (c) 所望により、得られた液体中に存在する反応生成物
を回収すること、によって特徴付けられる、方法。
【請求項２】有機溶媒が、イソプロパノール、メタノ
ール、エタノール、及びアセトンから成る群から選択さ
れる、請求項１の方法。
【請求項３】有機溶媒がイソプロパノールである、請
求項２の方法。
【請求項４】有機溶媒を30〜60％w/w の量で使用す
る、請求項１乃至３のいずれか１請求項の方法。
【請求項５】無機水溶性塩が、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、
ＭｇＳＯ₄、ＮａＣｌ、ＮａＡｃ、Ｎａ₂ＳＯ₄、及び
Ｎａ₃ＢＯ₃から成る群から選択される、請求項１の方
法。
【請求項６】（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を無機水溶性塩とし
て使用する、請求項５の方法。
【請求項７】塩を15〜30％w/w の量で使用する、請求
項５又は６の方法。
【請求項８】多糖類が、ガラクトマンナン、ペクチ
ン、アミロペクチン、アラビナン、澱粉、アルギネー
ト、及びカッパ−カラジーナンである、請求項１乃至７
のいずれか１請求項の方法。
【請求項９】ガラクトマンナンがグアーである、請求
項８の方法。
【請求項１０】水性媒体中のグアー含有率が0.1 〜３
重量％である、請求項９の方法。
【請求項１１】 α−Ｄ−ガラクトシダーゼを改質酵素
として使用する場合、この酵素を含む得られた媒体を０
〜10℃の範囲の温度で貯蔵する、請求項９又は10の方
法。