JPH067172A - デアセチルセファロスポリンｃシンターゼ活性をコードしている組換ｄｎａ発現ベクターおよびｄｎａ化合物 - Google Patents
デアセチルセファロスポリンｃシンターゼ活性をコードしている組換ｄｎａ発現ベクターおよびｄｎａ化合物Info
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- JPH067172A JPH067172A JP3166001A JP16600191A JPH067172A JP H067172 A JPH067172 A JP H067172A JP 3166001 A JP3166001 A JP 3166001A JP 16600191 A JP16600191 A JP 16600191A JP H067172 A JPH067172 A JP H067172A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 β−ラクタム抗生物質生合成における重要な
ステップである、デアセトキシセファロスポリンＣをデ
アセチルセファロスポリンＣに変換する反応を触媒する
活性を大量に製造する。 【構成】 本発明は、Ｓtreptomyces clavuligerusのヒ
ドロキシラーゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物を提
供する。この化合物は、Ｅ.coli、Ｐenicillium、Ｓtre
ptomyces、ＡspergillusおよびＣephalosporiumを包含
する広範な宿主細胞のための組換ＤＮＡ発現ベクターを
構築するために使用することができる。
ステップである、デアセトキシセファロスポリンＣをデ
アセチルセファロスポリンＣに変換する反応を触媒する
活性を大量に製造する。 【構成】 本発明は、Ｓtreptomyces clavuligerusのヒ
ドロキシラーゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物を提
供する。この化合物は、Ｅ.coli、Ｐenicillium、Ｓtre
ptomyces、ＡspergillusおよびＣephalosporiumを包含
する広範な宿主細胞のための組換ＤＮＡ発現ベクターを
構築するために使用することができる。
Description
【０００１】天然のイオウ含有β−ラクタム抗生物質は
臨床的に最も重要であり、新規なβ−ラクタム化合物の
単離は、フレミング(Ｆleming)によるペニシリンの発見
後６０年間続けられている。ペニシリン類およびセファ
ロスポリン類(セファマイシン類を包含する)に共通する
構造上の特性は、β−ラクタム環である。
臨床的に最も重要であり、新規なβ−ラクタム化合物の
単離は、フレミング(Ｆleming)によるペニシリンの発見
後６０年間続けられている。ペニシリン類およびセファ
ロスポリン類(セファマイシン類を包含する)に共通する
構造上の特性は、β−ラクタム環である。
【０００２】これらの抗生物質は、種々の原核生物およ
び下等真核生物によって産生される。ペニシリンＧまた
はペニシリンＶ化合物によって例示されるペニシリン類
は、線維状真菌、とりわけＰenicillium chrysogenumに
よって産生される。最初、下等真核生物であるＣephalo
sporium acremonium(別称、Ａcremonium chrysogenum)
からの産物として単離されたセファロスポリン類は、多
数の原核生物、とりわけＳtreptomyces clavuligerus、
Ｓ.lipmaniiおよびＳ.cattleyaの代謝物質でもあり、こ
れらはセファマイシン類、およびオキシペナム類(クラ
ブラン酸(clavulanic acid))およびカルバペネム類(チ
エナマイシン(thienamycin))のようなその他のβ−ラク
タム類をも産生する。
び下等真核生物によって産生される。ペニシリンＧまた
はペニシリンＶ化合物によって例示されるペニシリン類
は、線維状真菌、とりわけＰenicillium chrysogenumに
よって産生される。最初、下等真核生物であるＣephalo
sporium acremonium(別称、Ａcremonium chrysogenum)
からの産物として単離されたセファロスポリン類は、多
数の原核生物、とりわけＳtreptomyces clavuligerus、
Ｓ.lipmaniiおよびＳ.cattleyaの代謝物質でもあり、こ
れらはセファマイシン類、およびオキシペナム類(クラ
ブラン酸(clavulanic acid))およびカルバペネム類(チ
エナマイシン(thienamycin))のようなその他のβ−ラク
タム類をも産生する。
【０００３】β−ラクタム産生微生物から無細胞系を開
発することによって、イオウ含有β−ラクタム類(ペニ
シリン類、およびセファマイシン類を包含するセファロ
スポリン類)の経路における生合成ステップが確立され
た。
発することによって、イオウ含有β−ラクタム類(ペニ
シリン類、およびセファマイシン類を包含するセファロ
スポリン類)の経路における生合成ステップが確立され
た。
【０００４】線維状真菌(例えばＰ.chrysogenum)でのペ
ニシリン類、および原核生物(例えばＣ.acremonium)お
よび下等真核生物の両者によって産生されるセファロス
ポリン類(例えばＳ.clavuligerus)の合成における最初
のステップは、同一である。ＡＣＶシンテターゼは、ア
ミノ酸前駆体であるＬ−α−アミノアジピン酸、Ｌ−シ
ステイン、およびＬ−バリンの、トリペプチドＬＬＤ−
ＡＣＶへの縮合を触媒する。次のステップは、トリペプ
チドの環化によって、この経路における最初のβ−ラク
タムを合成し、全てのペニシリン類、セファロスポリン
類およびセファマイシン類への前駆体であるイソペニシ
リンＮ(ＩＰＮ)とする。
ニシリン類、および原核生物(例えばＣ.acremonium)お
よび下等真核生物の両者によって産生されるセファロス
ポリン類(例えばＳ.clavuligerus)の合成における最初
のステップは、同一である。ＡＣＶシンテターゼは、ア
ミノ酸前駆体であるＬ−α−アミノアジピン酸、Ｌ−シ
ステイン、およびＬ−バリンの、トリペプチドＬＬＤ−
ＡＣＶへの縮合を触媒する。次のステップは、トリペプ
チドの環化によって、この経路における最初のβ−ラク
タムを合成し、全てのペニシリン類、セファロスポリン
類およびセファマイシン類への前駆体であるイソペニシ
リンＮ(ＩＰＮ)とする。
【０００５】ＩＰＮの合成後、セファロスポリン類およ
びペニシリン類への経路が分岐する。Ｐenicillium chr
ysogenumでは、例えば、ＩＰＮのα−アミノアジピル側
鎖を、対応するアシルＣoＡ由来の多数の(ほぼ１００)
疎水性側鎖の１つと交換することができる。最もよく知
られている例の１つは、フェニルアセチルＣoＡとＩＰ
ＮからのペニシリンＧの形成である。しかしながら、真
菌、Ｃ.acremoniumでは、α−アミノアジピル側鎖は異
性化され、ペニシリンＮが製造される。次に、ペニシリ
ンの５員チアゾリジン環は、セファロスポリン類に特有
の６員ジヒドロチアジン環に“拡張"される。この反応
はデアセトキシセファロスポリンＣシンテターゼ(ＤＡ
ＯＣＳ)によって触媒され、この経路における最初のセ
ファロスポリンであるデアセトキシセファロスポリンＣ
(ＤＡＯＣ)が合成される。この経路における化学構造に
ついては、図１を参照されたい。
びペニシリン類への経路が分岐する。Ｐenicillium chr
ysogenumでは、例えば、ＩＰＮのα−アミノアジピル側
鎖を、対応するアシルＣoＡ由来の多数の(ほぼ１００)
疎水性側鎖の１つと交換することができる。最もよく知
られている例の１つは、フェニルアセチルＣoＡとＩＰ
ＮからのペニシリンＧの形成である。しかしながら、真
菌、Ｃ.acremoniumでは、α−アミノアジピル側鎖は異
性化され、ペニシリンＮが製造される。次に、ペニシリ
ンの５員チアゾリジン環は、セファロスポリン類に特有
の６員ジヒドロチアジン環に“拡張"される。この反応
はデアセトキシセファロスポリンＣシンテターゼ(ＤＡ
ＯＣＳ)によって触媒され、この経路における最初のセ
ファロスポリンであるデアセトキシセファロスポリンＣ
(ＤＡＯＣ)が合成される。この経路における化学構造に
ついては、図１を参照されたい。
【０００６】本発明は、セファロスポリン類の製造に関
与する活性、即ちデアセチルセファロスポリンＣシンタ
ーゼ(ヒドロキシラーゼ)をコードしている単離されたＤ
ＮＡ配列を含有するＤＮＡ化合物を提供するものであ
る。本発明は、過剰に産生されることがあるベータ−ラ
クタム生合成酵素のレパートリーを拡大する。この活性
は、基質同族体を新規なベータ−ラクタム類に生体内変
換すること、および遺伝子量の増大による株の改善を促
進する。
与する活性、即ちデアセチルセファロスポリンＣシンタ
ーゼ(ヒドロキシラーゼ)をコードしている単離されたＤ
ＮＡ配列を含有するＤＮＡ化合物を提供するものであ
る。本発明は、過剰に産生されることがあるベータ−ラ
クタム生合成酵素のレパートリーを拡大する。この活性
は、基質同族体を新規なベータ−ラクタム類に生体内変
換すること、および遺伝子量の増大による株の改善を促
進する。
【０００７】本発明は、Ｓtreptomyces clavuligerus由
来のヒドロキシラーゼ活性をコードしている単離された
ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ化合物を提供する。ヒドロ
キシラーゼは、ＤＡＯＣの３−メチル基がヒドロキシル
化され、デアセチルセファロスポリンＣ(ＤＡＣ)が製造
される反応を触媒する。触媒される反応は、Ｃephalosp
orium acremonium由来のセファロスポリン類、およびＳ
treptomyces clavuligerusおよびＳ.lipmanii由来の７
α−メトキシセファロスポリン類またはセファマイシン
類のような重要な抗生物質の生合成における重要なステ
ップである。従って、この活性を大量に製造し得ること
は、非常に重要である。
来のヒドロキシラーゼ活性をコードしている単離された
ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ化合物を提供する。ヒドロ
キシラーゼは、ＤＡＯＣの３−メチル基がヒドロキシル
化され、デアセチルセファロスポリンＣ(ＤＡＣ)が製造
される反応を触媒する。触媒される反応は、Ｃephalosp
orium acremonium由来のセファロスポリン類、およびＳ
treptomyces clavuligerusおよびＳ.lipmanii由来の７
α−メトキシセファロスポリン類またはセファマイシン
類のような重要な抗生物質の生合成における重要なステ
ップである。従って、この活性を大量に製造し得ること
は、非常に重要である。
【０００８】本発明のＤＮＡ化合物は、単一の転写解読
枠においてヒドロキシラーゼ活性をコードしている。こ
の転写解読枠の転写、次に得られたｍＲＮＡの翻訳によ
って、ヒドロキシラーゼ活性を有する１本のポリペプチ
ド鎖が製造される。ヒドロキシラーゼ活性をコードして
いる本発明の好ましいＤＮＡ化合物は、Ｓtreptomyces
clavuligerusのゲノムＤＮＡから単離され、ｐＯＷ３９
９と呼ばれる組換ＤＮＡ発現ベクターを構築するために
使用された。プラスミドｐＯＷ３９９は、本発明の一部
を構成する。クローンされたヒドロキシラーゼ遺伝子
は、とりわけ、ヒドロキシラーゼによって触媒される反
応が律速段階である場合、真菌および細菌におけるセフ
ァロスポリン類の収量を増大するのに有用である。
枠においてヒドロキシラーゼ活性をコードしている。こ
の転写解読枠の転写、次に得られたｍＲＮＡの翻訳によ
って、ヒドロキシラーゼ活性を有する１本のポリペプチ
ド鎖が製造される。ヒドロキシラーゼ活性をコードして
いる本発明の好ましいＤＮＡ化合物は、Ｓtreptomyces
clavuligerusのゲノムＤＮＡから単離され、ｐＯＷ３９
９と呼ばれる組換ＤＮＡ発現ベクターを構築するために
使用された。プラスミドｐＯＷ３９９は、本発明の一部
を構成する。クローンされたヒドロキシラーゼ遺伝子
は、とりわけ、ヒドロキシラーゼによって触媒される反
応が律速段階である場合、真菌および細菌におけるセフ
ァロスポリン類の収量を増大するのに有用である。
【０００９】Ｅ.coliによって産生されるヒドロキシラ
ーゼ活性も、ＤＡＯＣからのＤＡＣの製造を触媒する。
本発明のＥ.coli形質転換体の粗細胞抽出物は、ヒドロ
キシラーゼ活性を示す。これらのＥ.coli発現ベクター
および形質転換体は、大量の活性なヒドロキシラーゼを
得るのに効率的な方法を提供する。このヒドロキシラー
ゼは、ＤＡＣの製造のためだけでなく、ベータ−ラクタ
ム抗生物質経路のその他の化合物の製造において収量を
増大するためにも有用である。
ーゼ活性も、ＤＡＯＣからのＤＡＣの製造を触媒する。
本発明のＥ.coli形質転換体の粗細胞抽出物は、ヒドロ
キシラーゼ活性を示す。これらのＥ.coli発現ベクター
および形質転換体は、大量の活性なヒドロキシラーゼを
得るのに効率的な方法を提供する。このヒドロキシラー
ゼは、ＤＡＣの製造のためだけでなく、ベータ−ラクタ
ム抗生物質経路のその他の化合物の製造において収量を
増大するためにも有用である。
【００１０】このヒドロキシラーゼ活性をコードしてい
るＤＮＡ化合物は、例えば、Ｅscherichia、Ｐenicilli
um、Ｃephalosporium、ＰaecilomycesおよびＳtreptomy
ces、とりわけＳ.clavuligerusを包含するその他の種々
の微生物においてヒドロキシラーゼの収量を増大する発
現ベクターを構築するために、容易に修飾される。本発
明のＥ.coliベクターのために利用された構築プロトコ
ールは、必要に応じ、当業者に周知の方法を使用して適
当な調節エレメントを置換するだけで、その他の微生物
のための同様のベクターを構築するためにも使用するこ
とができる。
るＤＮＡ化合物は、例えば、Ｅscherichia、Ｐenicilli
um、Ｃephalosporium、ＰaecilomycesおよびＳtreptomy
ces、とりわけＳ.clavuligerusを包含するその他の種々
の微生物においてヒドロキシラーゼの収量を増大する発
現ベクターを構築するために、容易に修飾される。本発
明のＥ.coliベクターのために利用された構築プロトコ
ールは、必要に応じ、当業者に周知の方法を使用して適
当な調節エレメントを置換するだけで、その他の微生物
のための同様のベクターを構築するためにも使用するこ
とができる。
【００１１】本発明はまた、Ｓtreptomyces clavuliger
usのヒドロキシラーゼ活性を発現し得る組換宿主細胞を
作成するための方法であって、Ｓtreptomyces clavulig
erusのヒドロキシラーゼ活性をコードしている単離され
たＤＮＡ配列を含有する組換ＤＮＡベクターで宿主細胞
を形質転換することからなる方法を提供するものであ
る。好ましい宿主細胞には、Ｅ.coli、Ｃephalosporiu
m、Ｓtreptomyces、ＡspergillusおよびＰenicilliumが
ある。この様な形質転換宿主細胞は、ヒドロキシラーゼ
遺伝子が発現され、それによって組換宿主細胞中でヒド
ロキシラーゼ活性が産生されるような、当業者に周知の
条件下で培養することができる。
usのヒドロキシラーゼ活性を発現し得る組換宿主細胞を
作成するための方法であって、Ｓtreptomyces clavulig
erusのヒドロキシラーゼ活性をコードしている単離され
たＤＮＡ配列を含有する組換ＤＮＡベクターで宿主細胞
を形質転換することからなる方法を提供するものであ
る。好ましい宿主細胞には、Ｅ.coli、Ｃephalosporiu
m、Ｓtreptomyces、ＡspergillusおよびＰenicilliumが
ある。この様な形質転換宿主細胞は、ヒドロキシラーゼ
遺伝子が発現され、それによって組換宿主細胞中でヒド
ロキシラーゼ活性が産生されるような、当業者に周知の
条件下で培養することができる。
【００１２】従って、本発明は更に、組換宿主細胞にお
いてＳtreptomyces clavuligerusのヒドロキシラーゼ活
性を発現させるための方法であって、該形質転換宿主細
胞を遺伝子発現に好適な条件下で培養することからなる
方法を提供する。
いてＳtreptomyces clavuligerusのヒドロキシラーゼ活
性を発現させるための方法であって、該形質転換宿主細
胞を遺伝子発現に好適な条件下で培養することからなる
方法を提供する。
【００１３】以下の章は、本発明のより詳細な説明を提
供する。本発明を明瞭にし、本発明の理解を助けるため
に、本明細書に記載および特許請求される時、以下の語
句は下記の通り定義される。 ＡｍｄＳ−アセトアミダーゼ遺伝子。 ｃＩ８５７−λｐＬプロモーターの温度感受性リプレッ
サーをコードしている遺伝子。 ＤＡＣ−デアセチルセファロスポリンＣ、構造式を以下
に示す。
供する。本発明を明瞭にし、本発明の理解を助けるため
に、本明細書に記載および特許請求される時、以下の語
句は下記の通り定義される。 ＡｍｄＳ−アセトアミダーゼ遺伝子。 ｃＩ８５７−λｐＬプロモーターの温度感受性リプレッ
サーをコードしている遺伝子。 ＤＡＣ−デアセチルセファロスポリンＣ、構造式を以下
に示す。
【化３】 ＤＡＣＳまたはＤＡＣＳ活性−デアセチルセファロスポ
リンＣシンターゼ、ヒドロキシラーゼとも呼ばれる、Ｄ
ＡＯＣのＤＡＣへの変換を触媒する酵素活性。 ＤＡＯＣ−デアセトキシセファロスポリンＣ、構造式を
以下に示す。
リンＣシンターゼ、ヒドロキシラーゼとも呼ばれる、Ｄ
ＡＯＣのＤＡＣへの変換を触媒する酵素活性。 ＤＡＯＣ−デアセトキシセファロスポリンＣ、構造式を
以下に示す。
【化４】 ヒドロキシラーゼまたはヒドロキシラーゼ活性−ＤＡＯ
ＣのＤＡＣへの変換を触媒する酵素活性；ＤＡＣＳとも
呼ばれる。 ＯＲＩ−プラスミドまたはベクターの複製起点、ＤＮＡ
ポリメラーゼのための結合または開始部位として働くＤ
ＮＡ配列。 ｐＬ−バクテリオファージラムダ由来の左方プロモータ
ー。 単離されたＤＮＡ配列−ゲノムＤＮＡ中のその天然の位
置から位置的に区別される、構築または合成されたＤＮ
Ａ配列。この定義は、天然の状態以外の全てのその形態
の、単離されたＤＮＡ配列を包含する。例えば、遺伝子
量を増大するために、プラスミドまたはファージベクタ
ーに挿入するか、それが由来する生物またはその他の生
物のゲノムにこのＤＮＡを挿入することができる。 ＴｃＲ−テトラサイクリン耐性付与遺伝子。
ＣのＤＡＣへの変換を触媒する酵素活性；ＤＡＣＳとも
呼ばれる。 ＯＲＩ−プラスミドまたはベクターの複製起点、ＤＮＡ
ポリメラーゼのための結合または開始部位として働くＤ
ＮＡ配列。 ｐＬ−バクテリオファージラムダ由来の左方プロモータ
ー。 単離されたＤＮＡ配列−ゲノムＤＮＡ中のその天然の位
置から位置的に区別される、構築または合成されたＤＮ
Ａ配列。この定義は、天然の状態以外の全てのその形態
の、単離されたＤＮＡ配列を包含する。例えば、遺伝子
量を増大するために、プラスミドまたはファージベクタ
ーに挿入するか、それが由来する生物またはその他の生
物のゲノムにこのＤＮＡを挿入することができる。 ＴｃＲ−テトラサイクリン耐性付与遺伝子。
【００１４】添付の図面に示された制限部位および機能
地図は、本明細書で論じられる組換ＤＮＡベクターのお
およその描写である。制限部位の情報は完全ではなく、
従って、地図に実際に示された以外に、ベクターにより
多くの、ある種の制限部位があるかもしれない。図１
は、ベータ−ラクタム生合成経路を示す図である。図２
は、プラスミドｐＯＷ３９９の制限部位および機能地図
である。
地図は、本明細書で論じられる組換ＤＮＡベクターのお
およその描写である。制限部位の情報は完全ではなく、
従って、地図に実際に示された以外に、ベクターにより
多くの、ある種の制限部位があるかもしれない。図１
は、ベータ−ラクタム生合成経路を示す図である。図２
は、プラスミドｐＯＷ３９９の制限部位および機能地図
である。
【００１５】本発明は、Ｓtreptomyces clavuligerusの
ヒドロキシラーゼ活性をコードしている単離されたＤＮ
Ａ配列を含有するＤＮＡ化合物および組換ＤＮＡクロー
ニングおよび発現ベクターを提供する。Ｓ.clavuligeru
sヒドロキシラーゼをコードしているＤＮＡの配列を下
記に示す。この表記では、２本鎖ＤＮＡ分子の“セン
ス"またはコード鎖のみが示され、ＤＮＡは左から右へ
５'→３'方向で描かれる。ヌクレオチド配列には番号が
付され、数はＤＮＡ配列の左に記載される。ＤＮＡ配列
の次に、ＤＮＡによってコードされたヒドロキシラーゼ
のアミノ酸残基配列を左から右へ、アミノ末端→カルボ
キシル末端方向で挙げる。
ヒドロキシラーゼ活性をコードしている単離されたＤＮ
Ａ配列を含有するＤＮＡ化合物および組換ＤＮＡクロー
ニングおよび発現ベクターを提供する。Ｓ.clavuligeru
sヒドロキシラーゼをコードしているＤＮＡの配列を下
記に示す。この表記では、２本鎖ＤＮＡ分子の“セン
ス"またはコード鎖のみが示され、ＤＮＡは左から右へ
５'→３'方向で描かれる。ヌクレオチド配列には番号が
付され、数はＤＮＡ配列の左に記載される。ＤＮＡ配列
の次に、ＤＮＡによってコードされたヒドロキシラーゼ
のアミノ酸残基配列を左から右へ、アミノ末端→カルボ
キシル末端方向で挙げる。
【００１６】
【化５】 ［式中、Ａはデオキシアデニル残基、Ｇはデオキシグア
ニル残基、Ｃはデオキシシチジル残基、Ｔはチミジル残
基である］。
ニル残基、Ｃはデオキシシチジル残基、Ｔはチミジル残
基である］。
【００１７】以下は、上記ＤＮＡ配列によってコードさ
れたアミノ酸配列である：
れたアミノ酸配列である：
【化６】 ［式中、Ａlaはアラニン残基、Ａrgはアルギニン残基、
Ａsnはアスパラギン残基、Ａspはアスパラギン酸残基、
Ｃysはシステイン残基、Ｇlnはグルタミン残基、Ｇluは
グルタミン酸残基、Ｇlyはグリシン残基、Ｈisはヒスチ
ジン残基、Ｉleはイソロイシン残基、Ｌeuはロイシン残
基、Ｌysはリシン残基、Ｍetはメチオニン残基、Ｐheは
フェニルアラニン残基、Ｐroはプロリン残基、Ｓerはセ
リン残基、Ｔhrはトレオニン残基、Ｔrpはトリプトファ
ン残基、Ｔyrはチロシン残基、Ｖalはバリン残基であ
る］。
Ａsnはアスパラギン残基、Ａspはアスパラギン酸残基、
Ｃysはシステイン残基、Ｇlnはグルタミン残基、Ｇluは
グルタミン酸残基、Ｇlyはグリシン残基、Ｈisはヒスチ
ジン残基、Ｉleはイソロイシン残基、Ｌeuはロイシン残
基、Ｌysはリシン残基、Ｍetはメチオニン残基、Ｐheは
フェニルアラニン残基、Ｐroはプロリン残基、Ｓerはセ
リン残基、Ｔhrはトレオニン残基、Ｔrpはトリプトファ
ン残基、Ｔyrはチロシン残基、Ｖalはバリン残基であ
る］。
【００１８】当業者には、上記ＤＮＡ配列が本発明の重
要な部分であることが理解されよう。上の配列は、完全
に保護されたデオキシリボヌクレオチド・ビルディング
ブロックを使用し、改良ホスホトリエステル法によって
好都合に合成することができる。この様な合成法は当該
技術分野で周知であり、実質上、イタクラ等(Itakuraet
al., 1977, Science 198:1056)およびクレア等(Crea e
t al., 1978, Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 75:5765)の方
法に従って行なうことができる。また、とりわけ好まし
い方法は、ヒシウング等(Hsiung et al., 1983, Nuc.Ac
id Res.11:3227)およびナラング等(Narang et al., 198
0, Methods in Enzymology 68:90)に記載されている。
これらの手動的方法以外に、ＡＢＳ(Applied Biosystem
s, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 9440
4)３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーのような自動ＤＮＡ
シンセサイザーを使用して、ＤＮＡ配列を合成すること
ができる。
要な部分であることが理解されよう。上の配列は、完全
に保護されたデオキシリボヌクレオチド・ビルディング
ブロックを使用し、改良ホスホトリエステル法によって
好都合に合成することができる。この様な合成法は当該
技術分野で周知であり、実質上、イタクラ等(Itakuraet
al., 1977, Science 198:1056)およびクレア等(Crea e
t al., 1978, Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 75:5765)の方
法に従って行なうことができる。また、とりわけ好まし
い方法は、ヒシウング等(Hsiung et al., 1983, Nuc.Ac
id Res.11:3227)およびナラング等(Narang et al., 198
0, Methods in Enzymology 68:90)に記載されている。
これらの手動的方法以外に、ＡＢＳ(Applied Biosystem
s, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 9440
4)３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーのような自動ＤＮＡ
シンセサイザーを使用して、ＤＮＡ配列を合成すること
ができる。
【００１９】大部分のアミノ酸残基および翻訳終止シグ
ナルに１以上のコドンがあることに起因する遺伝子コー
ドの縮重性のために、上記ヒドロキシラーゼ酵素のアミ
ノ酸残基配列は、多数の異なったＤＮＡ配列によってコ
ードされ得る。これらの種々のＤＮＡ配列が本発明の同
じアミノ酸残基配列をコードするかもしれないので、本
発明は更にこれらの種々の配列を包含する。
ナルに１以上のコドンがあることに起因する遺伝子コー
ドの縮重性のために、上記ヒドロキシラーゼ酵素のアミ
ノ酸残基配列は、多数の異なったＤＮＡ配列によってコ
ードされ得る。これらの種々のＤＮＡ配列が本発明の同
じアミノ酸残基配列をコードするかもしれないので、本
発明は更にこれらの種々の配列を包含する。
【００２０】好ましい、ヒドロキシラーゼ活性をコード
しているＤＮＡ化合物は、Ｓtreptomyces clavuligerus
の菌株から単離された。Ｓ.clavuligerus株の全ゲノム
ＤＮＡのゲノムライブラリーを構築し、デオキシリボオ
リゴヌクレオチドプローブにホモローガスな配列の存在
について調べた。このプローブは、Ｓ.clavuligerusヒ
ドロキシラーゼのアミノ末端アミノ酸配列について得ら
れた情報、遺伝子コードの認識、およびＳtreptomyces
のコドン使用優先性の認識に従って構築された。ＤＮＡ
配列決定から、どのクローンがＳ.clavuligerusヒドロ
キシラーゼをコードしているかが判明した。
しているＤＮＡ化合物は、Ｓtreptomyces clavuligerus
の菌株から単離された。Ｓ.clavuligerus株の全ゲノム
ＤＮＡのゲノムライブラリーを構築し、デオキシリボオ
リゴヌクレオチドプローブにホモローガスな配列の存在
について調べた。このプローブは、Ｓ.clavuligerusヒ
ドロキシラーゼのアミノ末端アミノ酸配列について得ら
れた情報、遺伝子コードの認識、およびＳtreptomyces
のコドン使用優先性の認識に従って構築された。ＤＮＡ
配列決定から、どのクローンがＳ.clavuligerusヒドロ
キシラーゼをコードしているかが判明した。
【００２１】λｐＬプロモーターのコントロール下にヒ
ドロキシラーゼ遺伝子を有するプラスミドを含有してい
るＥ.coli K12 JM109/pOW399は、ノーザン・リージョナ
ル・リサーチ・ラボラトリーズ(ＮＲＲＬ)、ペオリア、
イリノイ６１６０４に１９９０年６月４日、ＮＲＲＬ
Ｂ−１８６５８の受託番号で寄託され、ストック・カル
チャー・コレクションの一部を構成している。プラスミ
ドｐＯＷ３９９は、当業者に周知の方法によってＥ.col
i K12 JM109から単離することができる。プラスミドｐ
ＯＷ３９９は無傷のＳtreptomyces clavuligerusヒドロ
キシラーゼ遺伝子を含有しており、例えばプラスミドの
〜２.５kb ＥcoＲＩ／ＢamＨＩ制限フラグメントからこ
れを単離することができる。プラスミドｐＯＷ３９９の
制限部位および機能地図を、添付の図面の図２に示す。
ドロキシラーゼ遺伝子を有するプラスミドを含有してい
るＥ.coli K12 JM109/pOW399は、ノーザン・リージョナ
ル・リサーチ・ラボラトリーズ(ＮＲＲＬ)、ペオリア、
イリノイ６１６０４に１９９０年６月４日、ＮＲＲＬ
Ｂ−１８６５８の受託番号で寄託され、ストック・カル
チャー・コレクションの一部を構成している。プラスミ
ドｐＯＷ３９９は、当業者に周知の方法によってＥ.col
i K12 JM109から単離することができる。プラスミドｐ
ＯＷ３９９は無傷のＳtreptomyces clavuligerusヒドロ
キシラーゼ遺伝子を含有しており、例えばプラスミドの
〜２.５kb ＥcoＲＩ／ＢamＨＩ制限フラグメントからこ
れを単離することができる。プラスミドｐＯＷ３９９の
制限部位および機能地図を、添付の図面の図２に示す。
【００２２】約３０℃の低い温度で、プラスミドｐＯＷ
３９９またはその誘導体上にコードされているｃＩ８５
７蛋白は活性であり、λｐＬプロモーターの活性を抑制
することができるが、温度が約４２℃に高められると、
ｃＩ８５７蛋白は不活化され、λｐＬプロモーターは所
望の遺伝子産物をコードしているｍＲＮＡを大量に転写
させる。約４２℃の温度で、Ｅ.coli K12 JM109/pOW399
は、ヒドロキシラーゼ活性を全細胞蛋白の〜５％近い高
レベルで発現する。これらのＥ.coli K12 JM109/pOW399
形質転換体からの粗細胞抽出物は、ＤＡＯＣのＤＡＣへ
の変換を触媒することができ、一方、非形質転換Ｅ.col
i K12 JM109細胞からの細胞抽出物はこの変換を触媒す
ることができない。変換反応についての分析方法および
分析結果は、実施例１に示される。
３９９またはその誘導体上にコードされているｃＩ８５
７蛋白は活性であり、λｐＬプロモーターの活性を抑制
することができるが、温度が約４２℃に高められると、
ｃＩ８５７蛋白は不活化され、λｐＬプロモーターは所
望の遺伝子産物をコードしているｍＲＮＡを大量に転写
させる。約４２℃の温度で、Ｅ.coli K12 JM109/pOW399
は、ヒドロキシラーゼ活性を全細胞蛋白の〜５％近い高
レベルで発現する。これらのＥ.coli K12 JM109/pOW399
形質転換体からの粗細胞抽出物は、ＤＡＯＣのＤＡＣへ
の変換を触媒することができ、一方、非形質転換Ｅ.col
i K12 JM109細胞からの細胞抽出物はこの変換を触媒す
ることができない。変換反応についての分析方法および
分析結果は、実施例１に示される。
【００２３】プラスミドｐＯＷ３９９を使用すると、高
い発現レベルが達成されるだけでなく、このプラスミド
には選択可能なマーカーが存在するので、Ｅ.coli中で
ヒドロキシラーゼ活性を発現させるために、このプラス
ミドはとりわけ好ましい。多数の組換ＤＮＡベクターは
β−ラクタマーゼをコードしているので、このベクター
を含有している細胞は、アンピシリンのようなある種の
β−ラクタム抗生物質の存在下で増殖することができ
る。しかしながら、β−ラクタム類を構築する目的でヒ
ドロキシラーゼ活性を含有している細胞不含の抽出物を
使用するのが所望の場合、抽出物がβ−ラクタマーゼ活
性を含有していることを望まない。従って、プラスミド
ｐＯＷ３９９は選択可能なマーカーとしてβ−ラクタマ
ーゼをコードせず、β−ラクタムと反応しない蛋白をコ
ードしているテトラサイクリン耐性付与遺伝子を使用す
る。
い発現レベルが達成されるだけでなく、このプラスミド
には選択可能なマーカーが存在するので、Ｅ.coli中で
ヒドロキシラーゼ活性を発現させるために、このプラス
ミドはとりわけ好ましい。多数の組換ＤＮＡベクターは
β−ラクタマーゼをコードしているので、このベクター
を含有している細胞は、アンピシリンのようなある種の
β−ラクタム抗生物質の存在下で増殖することができ
る。しかしながら、β−ラクタム類を構築する目的でヒ
ドロキシラーゼ活性を含有している細胞不含の抽出物を
使用するのが所望の場合、抽出物がβ−ラクタマーゼ活
性を含有していることを望まない。従って、プラスミド
ｐＯＷ３９９は選択可能なマーカーとしてβ−ラクタマ
ーゼをコードせず、β−ラクタムと反応しない蛋白をコ
ードしているテトラサイクリン耐性付与遺伝子を使用す
る。
【００２４】Ｅ.coliは、大量のヒドロキシラーゼ活性
を産生させるために効率のよい微生物である。Ｅ.coli
を培養することは、天然にヒドロキシラーゼを産生する
生物を培養するより複雑でないので、非組換または“天
然の"ヒドロキシラーゼ産生株よりも効率的および経済
的に組換ヒドロキシラーゼを製造するために、Ｅ.coli
K12 JM109/pOW399を使用することができる。ＤＡＯＣを
修飾して新規な抗生物質または抗生物質コア構造を製造
するイン・ビトロ試験のために、このヒドロキシラーゼ
活性を使用することができる。
を産生させるために効率のよい微生物である。Ｅ.coli
を培養することは、天然にヒドロキシラーゼを産生する
生物を培養するより複雑でないので、非組換または“天
然の"ヒドロキシラーゼ産生株よりも効率的および経済
的に組換ヒドロキシラーゼを製造するために、Ｅ.coli
K12 JM109/pOW399を使用することができる。ＤＡＯＣを
修飾して新規な抗生物質または抗生物質コア構造を製造
するイン・ビトロ試験のために、このヒドロキシラーゼ
活性を使用することができる。
【００２５】しかしながら、本発明は、本明細書に例示
した特定のベクターに限定されない。それ以外に、本発
明は、Ｓtreptomyces clavuligerusのヒドロキシラーゼ
活性をコードしているＤＮＡ化合物を包含する。本発明
のＤＮＡ化合物は、発現ベクターが複製または組み込み
を行ない、プロモーターおよび翻訳活性化配列が機能的
である全ての宿主細胞においてヒドロキシラーゼ活性を
発現させる発現ベクターを構築するために使用すること
ができる。
した特定のベクターに限定されない。それ以外に、本発
明は、Ｓtreptomyces clavuligerusのヒドロキシラーゼ
活性をコードしているＤＮＡ化合物を包含する。本発明
のＤＮＡ化合物は、発現ベクターが複製または組み込み
を行ない、プロモーターおよび翻訳活性化配列が機能的
である全ての宿主細胞においてヒドロキシラーゼ活性を
発現させる発現ベクターを構築するために使用すること
ができる。
【００２６】従って、本発明は、ヒドロキシラーゼ酵素
をコードしている遺伝子の数を増大することによって、
細胞中のヒドロキシラーゼ活性の生来の量を増大するた
めに、使用することができる。その結果、より多くのＤ
ＡＯＣをＤＡＣに変換することができる。ＤＡＣが増加
すると、最終的に細胞中のセファロスポリンＣおよびセ
ファマイシンＣの収量が増大する。セファロスポリンＣ
およびセファマイシンは両者とも、既知の用途を有する
抗生物質である。本発明は更に、ヒドロキシラーゼ酵素
またはその誘導体が機能して生合成における中間ステッ
プを触媒するその他の抗生物質の産生を促進することが
できた。
をコードしている遺伝子の数を増大することによって、
細胞中のヒドロキシラーゼ活性の生来の量を増大するた
めに、使用することができる。その結果、より多くのＤ
ＡＯＣをＤＡＣに変換することができる。ＤＡＣが増加
すると、最終的に細胞中のセファロスポリンＣおよびセ
ファマイシンＣの収量が増大する。セファロスポリンＣ
およびセファマイシンは両者とも、既知の用途を有する
抗生物質である。本発明は更に、ヒドロキシラーゼ酵素
またはその誘導体が機能して生合成における中間ステッ
プを触媒するその他の抗生物質の産生を促進することが
できた。
【００２７】本発明の別の用途は、新規かつ有用なセフ
ァロスポリン類を製造するためにＤＡＯＣを使用するこ
とができるように、生合成をＤＡＯＣで停止させること
である。機能的ヒドロキシラーゼ遺伝子を破壊または移
動させることによって、生合成経路を停止させることが
できる。変異したヒドロキシラーゼ遺伝子を含有してい
る不安定なベクターを細胞に導入すると、ヒドロキシラ
ーゼ遺伝子のゲノムコピーとの間で一重または二重のり
かえが起こり得る。ヒドロキシラーゼをコードしている
配列に選択可能なマーカーが組み込まれる場合、選択的
条件下で増殖する能力を保持している幾つかの細胞はヒ
ドロキシラーゼ遺伝子が破壊されているであろう。
ァロスポリン類を製造するためにＤＡＯＣを使用するこ
とができるように、生合成をＤＡＯＣで停止させること
である。機能的ヒドロキシラーゼ遺伝子を破壊または移
動させることによって、生合成経路を停止させることが
できる。変異したヒドロキシラーゼ遺伝子を含有してい
る不安定なベクターを細胞に導入すると、ヒドロキシラ
ーゼ遺伝子のゲノムコピーとの間で一重または二重のり
かえが起こり得る。ヒドロキシラーゼをコードしている
配列に選択可能なマーカーが組み込まれる場合、選択的
条件下で増殖する能力を保持している幾つかの細胞はヒ
ドロキシラーゼ遺伝子が破壊されているであろう。
【００２８】本発明のＤＮＡ化合物は、他の微生物にお
いてヒドロキシラーゼ、エクスパンダーゼ(ヨーロッパ
特許公開第０３４１８９２号、１９８９年１１月１５日
公開)またはエクスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ(ヨー
ロッパ特許公開第０２８１３９１号、１９８８年９月７
日公開)遺伝子を見い出すためのプローブとして使用す
ることもできる。
いてヒドロキシラーゼ、エクスパンダーゼ(ヨーロッパ
特許公開第０３４１８９２号、１９８９年１１月１５日
公開)またはエクスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ(ヨー
ロッパ特許公開第０２８１３９１号、１９８８年９月７
日公開)遺伝子を見い出すためのプローブとして使用す
ることもできる。
【００２９】本発明のヒドロキシラーゼ発現ベクター
は、選択可能なマーカーとしてテトラサイクリン耐性遺
伝子に限定されない。当業者は、多数の選択可能なマー
カーがヒドロキシラーゼ発現ベクターでの使用に好適で
あることを認識している。この様な選択可能なマーカー
には、例えば、カナマイシンまたはクロラムフェニコー
ル耐性を付与する遺伝子、またはその他の抗生物質耐性
付与遺伝子がある。
は、選択可能なマーカーとしてテトラサイクリン耐性遺
伝子に限定されない。当業者は、多数の選択可能なマー
カーがヒドロキシラーゼ発現ベクターでの使用に好適で
あることを認識している。この様な選択可能なマーカー
には、例えば、カナマイシンまたはクロラムフェニコー
ル耐性を付与する遺伝子、またはその他の抗生物質耐性
付与遺伝子がある。
【００３０】本発明は、Ｅ.coli中でヒドロキシラーゼ
活性を発現させるＥ.coli発現プラスミドまたはベクタ
ーを包含する。即ち、本発明は、例えばｐＢＲ３２２ま
たはｐＵＣ系プラスミドの様なプラスミド由来のレプリ
コンのような、ヒドロキシラーゼ活性を発現させ、Ｅ.c
oli中で機能的なレプリコンを利用する発現ベクターを
包含する。本発明は更に、ヒドロキシラーゼ活性を発現
し、宿主細胞中での複製および維持を提供する組み込み
またはウイルスの複製を利用する発現ベクターを包含す
るので、本発明はプラスミドベクターに限定されるもの
でもない。
活性を発現させるＥ.coli発現プラスミドまたはベクタ
ーを包含する。即ち、本発明は、例えばｐＢＲ３２２ま
たはｐＵＣ系プラスミドの様なプラスミド由来のレプリ
コンのような、ヒドロキシラーゼ活性を発現させ、Ｅ.c
oli中で機能的なレプリコンを利用する発現ベクターを
包含する。本発明は更に、ヒドロキシラーゼ活性を発現
し、宿主細胞中での複製および維持を提供する組み込み
またはウイルスの複製を利用する発現ベクターを包含す
るので、本発明はプラスミドベクターに限定されるもの
でもない。
【００３１】本発明は、ヒドロキシラーゼ活性をコード
しているＤＮＡを発現させるための特定のプロモーター
および翻訳活性化配列に限定されない。本発明は、Ｅ.c
oli中で機能し、Ｅ.coli中でヒドロキシラーゼ活性を発
現させるために使用される全てのプロモーターおよび翻
訳活性化配列の使用を包含する。Ｅ.coli中で機能的な
多数のプロモーターおよび翻訳活性化配列が知られてお
り、Ｅ.coli中でヒドロキシラーゼ活性を発現させるた
めに好適である。この様な転写および翻訳活性化配列
は、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、λｐＬ、λｐＲ
プロモーターおよび翻訳活性化配列を包含するが、これ
に限定されない。同様に、その他の生物において機能的
な、好適なプロモーター配列の例は、Ｐenicillium chr
ysogenum由来のＩＰＮＳ遺伝子のプロモーター、および
Ａspergillus nidulansにおけるａｍｄＳ遺伝子由来の
プロモーターであり、その両者は米国特許第４,８９２,
８１９号に記載されている。米国特許第４,８８５,２５
１号に記載されているＣephalosporium aeremoniumにお
けるＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターも有用である。
しているＤＮＡを発現させるための特定のプロモーター
および翻訳活性化配列に限定されない。本発明は、Ｅ.c
oli中で機能し、Ｅ.coli中でヒドロキシラーゼ活性を発
現させるために使用される全てのプロモーターおよび翻
訳活性化配列の使用を包含する。Ｅ.coli中で機能的な
多数のプロモーターおよび翻訳活性化配列が知られてお
り、Ｅ.coli中でヒドロキシラーゼ活性を発現させるた
めに好適である。この様な転写および翻訳活性化配列
は、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、λｐＬ、λｐＲ
プロモーターおよび翻訳活性化配列を包含するが、これ
に限定されない。同様に、その他の生物において機能的
な、好適なプロモーター配列の例は、Ｐenicillium chr
ysogenum由来のＩＰＮＳ遺伝子のプロモーター、および
Ａspergillus nidulansにおけるａｍｄＳ遺伝子由来の
プロモーターであり、その両者は米国特許第４,８９２,
８１９号に記載されている。米国特許第４,８８５,２５
１号に記載されているＣephalosporium aeremoniumにお
けるＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターも有用である。
【００３２】また、他の生物由来の転写および翻訳活性
化配列を、本発明のヒドロキシラーゼ活性をコードして
いるＤＮＡ化合物にライゲートし、活性化配列が機能す
る宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を発現させる発現
ベクターを製造することもできる。Ｅ.coliはヒドロキ
シラーゼ産生および次のイン・ビトロ用途のための精製
に最も好適な宿主であるが、とりわけ、与えられた生物
の抗生物質産生能および効率を増大する目的では、Ｅ.c
oli以外の宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を発現さ
せるベクターも有用である。
化配列を、本発明のヒドロキシラーゼ活性をコードして
いるＤＮＡ化合物にライゲートし、活性化配列が機能す
る宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を発現させる発現
ベクターを製造することもできる。Ｅ.coliはヒドロキ
シラーゼ産生および次のイン・ビトロ用途のための精製
に最も好適な宿主であるが、とりわけ、与えられた生物
の抗生物質産生能および効率を増大する目的では、Ｅ.c
oli以外の宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を発現さ
せるベクターも有用である。
【００３３】種々の生物が、β−ラクタム抗生物質を産
生する。以下の表は、β−ラクタム抗生物質産生生物の
リストの一部を提供する。
生する。以下の表は、β−ラクタム抗生物質産生生物の
リストの一部を提供する。
【００３４】
【表１】 β−ラクタム抗生物質産生生物生物 抗生物質 Agrobacterium 種々のβ−ラクタム類 Arachnomyces minimus ペニシリン類およびセファロスポリン類 Anixiopsis peruviana ペニシリン類およびセファロスポリン類 Cephalosporium acremonium ペニシリン類およびセファロスポリン類 purpurascens polyaleurum chrysogenum curtipes Chromobacterium 種々のβ−ラクタム類 Emericellopsis terricola ペニシリン類およびセファロスポリン類 minima synnematicola glabra mirabilis salmosynnemata Flavobacterium 種々のβ−ラクタム類 Gluconobacter 種々のβ−ラクタム類 Nocardia lactamadurans セファマイシンＣ uniformis ノカルジシン Paecilomyces carneus ペニシリン類および persicinus セファロスポリン類 Penicillium chrysogenum 種々のペニシリン類および その他のβ−ラクタム類 Serratia 種々のβ−ラクタム類 Spiroidium fuscum ペニシリン類およびセファロスポリン類 Streptomyces antibioticus クラブラン酸 argenteolus アスパレノマイシンＡ、 ＭＭ４５５０およびＭＭ１３９０２ cattleya チエナマイシン chartreusis ＳＦ１６２３および セファマイシンＡおよびＢ cinnamonensis セファマイシンＡおよびＢ clavuligerus ＰＡ−３２４１３−Ｉ、セファマイシンＣ、 Ａ１６８８６Ａ、ペニシリン類、 セファロスポリン類、クラブラン酸、および その他のクラバム類 fimbriatus セファマイシンＡおよびＢ flavovirens ＭＭ４５５０およびＭＭ１３９０２ flavus ＭＭ４５５０およびＭＭ１３９０２ fulvoviridis ＭＭ４５５０およびＭＭ１３９０２ griseus セファマイシンＡおよびＢ、および カルペチマイシンＡおよびＢ halstedi セファマイシンＡおよびＢ heteromorphus Ｃ２０８１Ｘおよび セファマイシンＡおよびＢ hygroscopicus デアセトキシセファロスポリンＣ lipmanii セファマイシン、ペニシリンＮ、 ７−メトキシセファロスポリンＣ、 Ａ１６８８４、ＭＭ４５５０、ＭＭ１３９０２ olivaceus エピチエナマイシンＦ、ＭＭ４５５０、 およびＭＭ１３９０２ panayensis Ｃ２０８１Ｘ、および セファマイシンＡおよびＢ pluracidomyceticus プルラシドマイシンＡ rochei セファマイシンＡおよびＢ sioyaensis ＭＭ４５５０およびＭＭ１３９０２ sp.OA-6129 ＯＡ−６１２９Ａ sp.KC-6643 カルペチマイシンＡ tokunomensis アスパレノマイシンＡ viridochromogenes セファマイシンＡおよびＢ wadayamensis ＷＳ−３４４２−Ｄ
【００３５】上記β−ラクタム抗生物質産生生物の多く
は、抗生物質製造のために製薬工業で使用される。これ
らの生物の抗生物質産生能は、発酵の間、抗生物質生合
成酵素の細胞内濃度を高めることによって、増大および
より効率的にされ得る。本発明のヒドロキシラーゼ活性
をコードしているＤＮＡ化合物を使用し、適当な宿主細
胞にトランスフォームされると、トランスフォームされ
た宿主細胞のヒドロキシラーゼ活性の細胞内濃度を増大
し、それによってその細胞の抗生物質産生能および効率
を高めるための発現ベクターを構築することができる。
は、抗生物質製造のために製薬工業で使用される。これ
らの生物の抗生物質産生能は、発酵の間、抗生物質生合
成酵素の細胞内濃度を高めることによって、増大および
より効率的にされ得る。本発明のヒドロキシラーゼ活性
をコードしているＤＮＡ化合物を使用し、適当な宿主細
胞にトランスフォームされると、トランスフォームされ
た宿主細胞のヒドロキシラーゼ活性の細胞内濃度を増大
し、それによってその細胞の抗生物質産生能および効率
を高めるための発現ベクターを構築することができる。
【００３６】ベクターがトランスフォームされる、与え
られた宿主細胞のヒドロキシラーゼ活性の細胞内濃度を
高めるであろうベクターは、以下のエレメントを必要と
する：１）本発明のヒドロキシラーゼ活性をコードして
いるＤＮＡ化合物、２）トランスフォームされる宿主細
胞中で機能するだけでなく、ヒドロキシラーゼ活性をコ
ードしているＤＮＡを発現させるために正しい方向およ
び位置に位置しているプロモーターおよび翻訳活性化配
列。もちろん、安定な形質転換体は、ベクターが、宿主
細胞中、染色体外エレメントとしてまたはゲノムＤＮＡ
に組み込まれた時に、複製する場合にのみ得ることがで
きる。従って、好ましいベクターは、宿主細胞中でベク
ターの複製または組み込みを特異的に誘導する配列を含
有するであろう。しかしながら、この様な特異的な複製
または組み込み配列の存在は必ずしも必要とされない。
なぜなら、非特異的組み込みは、ＤＮＡが宿主細胞に導
入される時に起こり得るからである。ヒドロキシラーゼ
発現ベクターは更に、ベクターを含有する宿主細胞の選
択手段を提供する抗生物質耐性付与遺伝子または幾つか
のその他のエレメントを含有することができるが、この
様な選択可能なエレメントは、ベクターが宿主細胞の染
色体ＤＮＡに組み込まれる時、必要ではないし望ましく
もない。
られた宿主細胞のヒドロキシラーゼ活性の細胞内濃度を
高めるであろうベクターは、以下のエレメントを必要と
する：１）本発明のヒドロキシラーゼ活性をコードして
いるＤＮＡ化合物、２）トランスフォームされる宿主細
胞中で機能するだけでなく、ヒドロキシラーゼ活性をコ
ードしているＤＮＡを発現させるために正しい方向およ
び位置に位置しているプロモーターおよび翻訳活性化配
列。もちろん、安定な形質転換体は、ベクターが、宿主
細胞中、染色体外エレメントとしてまたはゲノムＤＮＡ
に組み込まれた時に、複製する場合にのみ得ることがで
きる。従って、好ましいベクターは、宿主細胞中でベク
ターの複製または組み込みを特異的に誘導する配列を含
有するであろう。しかしながら、この様な特異的な複製
または組み込み配列の存在は必ずしも必要とされない。
なぜなら、非特異的組み込みは、ＤＮＡが宿主細胞に導
入される時に起こり得るからである。ヒドロキシラーゼ
発現ベクターは更に、ベクターを含有する宿主細胞の選
択手段を提供する抗生物質耐性付与遺伝子または幾つか
のその他のエレメントを含有することができるが、この
様な選択可能なエレメントは、ベクターが宿主細胞の染
色体ＤＮＡに組み込まれる時、必要ではないし望ましく
もない。
【００３７】多数のＥ.coli K12株は、たぶんａｍｐＣ
遺伝子座によってコードされている内生のβ−ラクタマ
ーゼ活性を含有している。この理由から、最適ヒドロキ
シラーゼ活性が観察されるように、ヒドロキシラーゼポ
リペプチドを部分精製することが望ましい。所望のヒド
ロキシラーゼ活性から内生のＥ.coli β−ラクタマーゼ
活性を分離するために、酵素の精製を使用することがで
きる。β−ラクタマーゼの有害な効果を克服するため
の、部分精製の使用以外の方法は、この活性を産生しな
い株を使用することである。
遺伝子座によってコードされている内生のβ−ラクタマ
ーゼ活性を含有している。この理由から、最適ヒドロキ
シラーゼ活性が観察されるように、ヒドロキシラーゼポ
リペプチドを部分精製することが望ましい。所望のヒド
ロキシラーゼ活性から内生のＥ.coli β−ラクタマーゼ
活性を分離するために、酵素の精製を使用することがで
きる。β−ラクタマーゼの有害な効果を克服するため
の、部分精製の使用以外の方法は、この活性を産生しな
い株を使用することである。
【００３８】本発明は、Ｓtreptomyces clavuligerusの
ヒドロキシラーゼ遺伝子のコード配列を提供することに
よって、形質転換を受け易い全ての生物のためのヒドロ
キシラーゼ発現ベクターを提供する。前記Ｅ.coliヒド
ロキシラーゼ発現ベクターは、本発明の広範な発現ベク
ターの例示である。しかしながら、本発明の好ましいベ
クターの多くは、β−ラクタム抗生物質(ペニシリン類
およびセファロスポリン類を包含する)産生細胞におい
てヒドロキシラーゼを発現させるようにデザインされて
いる。
ヒドロキシラーゼ遺伝子のコード配列を提供することに
よって、形質転換を受け易い全ての生物のためのヒドロ
キシラーゼ発現ベクターを提供する。前記Ｅ.coliヒド
ロキシラーゼ発現ベクターは、本発明の広範な発現ベク
ターの例示である。しかしながら、本発明の好ましいベ
クターの多くは、β−ラクタム抗生物質(ペニシリン類
およびセファロスポリン類を包含する)産生細胞におい
てヒドロキシラーゼを発現させるようにデザインされて
いる。
【００３９】前記および実施例１に記載のベクターは、
本発明によって提供された広範なヒドロキシラーゼ発現
ベクターの例示にすぎない。米国特許第４,８８５,２５
１号は、Ｃephalosporium acremonium ＩＰＮＳ遺伝子
の５'および３'調節シグナルを記載している。このシグ
ナルを、本発明のヒドロキシラーゼをコードしている配
列と結合させて、Ｃephalosporiumでの使用にとりわけ
好適な本発明のヒドロキシラーゼ発現ベクターを製造す
ることができる。
本発明によって提供された広範なヒドロキシラーゼ発現
ベクターの例示にすぎない。米国特許第４,８８５,２５
１号は、Ｃephalosporium acremonium ＩＰＮＳ遺伝子
の５'および３'調節シグナルを記載している。このシグ
ナルを、本発明のヒドロキシラーゼをコードしている配
列と結合させて、Ｃephalosporiumでの使用にとりわけ
好適な本発明のヒドロキシラーゼ発現ベクターを製造す
ることができる。
【００４０】本発明のヒドロキシラーゼ発現ベクター
は、全ての細胞、とりわけβ−ラクタム抗生物質産生細
胞においてヒドロキシラーゼ活性の細胞内濃度を高める
のに有用である。プラスミドｐＯＷ３９９は、Ｓtrepto
myces clavuligerusのヒドロキシラーゼ遺伝子のコード
配列を含有しており、従って、プラスミドｐＯＷ３９９
を、ヒドロキシラーゼ遺伝子のコピー数を増大し、それ
によって酵素の細胞内濃度を高めるベクターを構築する
ために使用することができる。本発明のヒドロキシラー
ゼをコードしている配列はＳtreptomyces宿主細胞から
単離されたので、このヒドロキシラーゼコード配列は、
Ｓtreptomyces宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を高
レベルで発現させるようにデザインされた発現ベクター
で使用するのにとりわけよく適合している。文献は、Ｓ
treptomyces発現ベクターの構築およびＳtreptomyces宿
主細胞の形質転換のための方法を多数記載している。例
えば、ガルシア・ドミンゲッツ等(Garcia-Dominguez et
al., 1987, Applied andEnvironmental Microbiology
53(6):1376-1381)参照。本発明のヒドロキシラーゼをコ
ードしている配列は、Ｓtreptomycesのプロモーターお
よびレプリコンを含有している発現ベクターに容易に組
み込むことができる。種々の既知のＳtreptomycesプロ
モーターおよびレプリコンを、この様な用途のために利
用することができる。表２は、Ｓtreptomycesレプリコ
ンを入手し得るＳtreptomycesプラスミドのリストを例
示するが、これに限定されない。当業者には、レプリコ
ン機能が破壊されない限り、本発明のヒドロキシラーゼ
遺伝子を含有しているベクターを構築するために、この
表に挙げられた全てまたは一部分のプラスミドを使用し
得ることが理解されよう。プラスミド含有宿主および受
託番号も表２に挙げる。
は、全ての細胞、とりわけβ−ラクタム抗生物質産生細
胞においてヒドロキシラーゼ活性の細胞内濃度を高める
のに有用である。プラスミドｐＯＷ３９９は、Ｓtrepto
myces clavuligerusのヒドロキシラーゼ遺伝子のコード
配列を含有しており、従って、プラスミドｐＯＷ３９９
を、ヒドロキシラーゼ遺伝子のコピー数を増大し、それ
によって酵素の細胞内濃度を高めるベクターを構築する
ために使用することができる。本発明のヒドロキシラー
ゼをコードしている配列はＳtreptomyces宿主細胞から
単離されたので、このヒドロキシラーゼコード配列は、
Ｓtreptomyces宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を高
レベルで発現させるようにデザインされた発現ベクター
で使用するのにとりわけよく適合している。文献は、Ｓ
treptomyces発現ベクターの構築およびＳtreptomyces宿
主細胞の形質転換のための方法を多数記載している。例
えば、ガルシア・ドミンゲッツ等(Garcia-Dominguez et
al., 1987, Applied andEnvironmental Microbiology
53(6):1376-1381)参照。本発明のヒドロキシラーゼをコ
ードしている配列は、Ｓtreptomycesのプロモーターお
よびレプリコンを含有している発現ベクターに容易に組
み込むことができる。種々の既知のＳtreptomycesプロ
モーターおよびレプリコンを、この様な用途のために利
用することができる。表２は、Ｓtreptomycesレプリコ
ンを入手し得るＳtreptomycesプラスミドのリストを例
示するが、これに限定されない。当業者には、レプリコ
ン機能が破壊されない限り、本発明のヒドロキシラーゼ
遺伝子を含有しているベクターを構築するために、この
表に挙げられた全てまたは一部分のプラスミドを使用し
得ることが理解されよう。プラスミド含有宿主および受
託番号も表２に挙げる。
【００４１】
【表２】
【００４２】本発明の、Ｓtreptomyces clavuligerus
ヒドロキシラーゼをコードしている配列は、与えられた
生物で使用するための組換ヒドロキシラーゼ遺伝子を構
築するために、Ｓtreptomycesのその他の株、およびＰe
nicillium、Ｃephalosporium、またはその他の全ての宿
主細胞由来の転写および翻訳活性化配列の制御下に置く
こともできる。
ヒドロキシラーゼをコードしている配列は、与えられた
生物で使用するための組換ヒドロキシラーゼ遺伝子を構
築するために、Ｓtreptomycesのその他の株、およびＰe
nicillium、Ｃephalosporium、またはその他の全ての宿
主細胞由来の転写および翻訳活性化配列の制御下に置く
こともできる。
【００４３】以下の実施例は、本発明を更に詳細に説明
し、例示するために提供するものである。
し、例示するために提供するものである。
【００４４】実施例１ Ｅ.coli K12 JM109/pOW399の凍結乾燥品は、ノーザン・
リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ(ＮＲＲＬ)、
ペオリア、イリノイ６１６０４から、ＮＲＲＬＢ−１８
６５８(受託日：１９９０年６月４日)の受託番号で入手
することができ、下記の方法で“培養物"として直接使
用することができる。
リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ(ＮＲＲＬ)、
ペオリア、イリノイ６１６０４から、ＮＲＲＬＢ−１８
６５８(受託日：１９９０年６月４日)の受託番号で入手
することができ、下記の方法で“培養物"として直接使
用することができる。
【００４５】Ｅ.coli K12 JM109/pOW399におけるＳ.cla
vuligerusヒドロキシラーゼの産生 Ａ．Ｅ.coliにおけるヒドロキシラーゼの発現 Ｅ.coli K12 JM109/pOW399を、細胞が中対数期に到達す
るまで、ＴＹブロス３リットルおよび５μg／mlのテト
ラサイクリン中、３０℃で増殖させた。混合物の温度を
４２℃に上昇させ、更に約４時間インキュベートを続け
た。プラスミドｐＯＷ３９９においてヒドロキシラーゼ
を発現させるために配置されたラムダｐＬプロモーター
のｃＩ８５７温度感受性リプレッサーを４２℃で不活化
し、ヒドロキシラーゼを発現させる。
vuligerusヒドロキシラーゼの産生 Ａ．Ｅ.coliにおけるヒドロキシラーゼの発現 Ｅ.coli K12 JM109/pOW399を、細胞が中対数期に到達す
るまで、ＴＹブロス３リットルおよび５μg／mlのテト
ラサイクリン中、３０℃で増殖させた。混合物の温度を
４２℃に上昇させ、更に約４時間インキュベートを続け
た。プラスミドｐＯＷ３９９においてヒドロキシラーゼ
を発現させるために配置されたラムダｐＬプロモーター
のｃＩ８５７温度感受性リプレッサーを４２℃で不活化
し、ヒドロキシラーゼを発現させる。
【００４６】Ｂ．ヒドロキシラーゼを含有している顆粒の単離 ヒドロキシラーゼを含有している顆粒を単離する。先
ず、全細胞を遠心し、次いで、１０℃の水に再懸濁す
る。細胞のスラリーを、ガウリン(Gaulin)ホモジナイザ
ーにて８０００psigでホモジナイズする。次に、ホモジ
ナイズされたスラリーを水に希釈して１０分間撹拌し、
１０％水酸化ナトリウムでｐＨを８.４−８.６に調節す
る。次いで、混合物を遠心する。固形物はヒドロキシラ
ーゼを含有する顆粒であり、使用時まで−７０℃で凍結
する。
ず、全細胞を遠心し、次いで、１０℃の水に再懸濁す
る。細胞のスラリーを、ガウリン(Gaulin)ホモジナイザ
ーにて８０００psigでホモジナイズする。次に、ホモジ
ナイズされたスラリーを水に希釈して１０分間撹拌し、
１０％水酸化ナトリウムでｐＨを８.４−８.６に調節す
る。次いで、混合物を遠心する。固形物はヒドロキシラ
ーゼを含有する顆粒であり、使用時まで−７０℃で凍結
する。
【００４７】Ｃ．顆粒からの活性なヒドロキシラーゼの製造 ０.５Ｍ尿素、０.５mlジチオスレイトール(ＤＴＴ)およ
び５mＭトリス塩基(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメ
タン)を含有しているフォールディング・バッファー８m
lに顆粒を再懸濁することによって、洗浄した顆粒０.５
gから活性なヒドロキシラーゼを調製した。ｐＨは調節
しなかった。顆粒を再懸濁した時、水酸化ナトリウムで
ｐＨを１１.７に上昇させ、この溶液を５分間撹拌し
た。撹拌後、塩酸でｐＨを９.５に下げた。次に、この
混合物を４８,０００×ｇで１０分間遠心した。ヒドロ
キシラーゼ検定で使用するために、上清を貯蔵した。
び５mＭトリス塩基(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメ
タン)を含有しているフォールディング・バッファー８m
lに顆粒を再懸濁することによって、洗浄した顆粒０.５
gから活性なヒドロキシラーゼを調製した。ｐＨは調節
しなかった。顆粒を再懸濁した時、水酸化ナトリウムで
ｐＨを１１.７に上昇させ、この溶液を５分間撹拌し
た。撹拌後、塩酸でｐＨを９.５に下げた。次に、この
混合物を４８,０００×ｇで１０分間遠心した。ヒドロ
キシラーゼ検定で使用するために、上清を貯蔵した。
【００４８】ドツラフおよびイエー（Dotzlaf,J.E., an
d Yeh,W.-K. (1987) J.Bacteriol.,169, 1611-1618)に
よる記載に従い、ＨＰＬＣを用い、ＤＡＯＣからのＤＡ
Ｃの生成を２６０ｎｍでモニターすることによって、ヒ
ドロキシラーゼ活性を調べた。検定混合物の容量は１ml
であり、１５mＭ ＭＯＰＳ(３−[Ｎ−モルホリノ]プロ
パンスルホン酸)バッファー(ｐＨ７.３)中、蛋白質試料
(８.４マイクログラム)、ＤＡＯＣ(０.３マイクロモ
ル)、α−ケトグルタル酸(０.３マイクロモル)、硫酸第
１鉄(０.１マイクロモル)、アスコルビン酸(０.２５マ
イクロモル)、ＤＴＴ(１マイクロモル)、アデノシン三
リン酸(ＡＴＰ)(０.０５マイクロモル)を含有した。Ｄ
ＡＯＣを加えることによって酵素反応を開始させ、２９
℃で２０分間反応を行なった。ＤＡＣの生成は、４０分
まで、反応時間について直線状であった。酵素活性１単
位は、上記検定条件下でＤＡＯＣから１分当たり１マイ
クロモルのＤＡＣを生成させるのに必要なヒドロキシラ
ーゼの量として定義される。ヒドロキシラーゼの比活性
は、蛋白質１ミリグラム当たりの単位数として定義され
る。蛋白質含有量は、標準物質としてウシ血清アルブミ
ンを使用し、ブラッドフォードの方法(Ｂradford,M.M.,
1979, Anal.Biochem., 72, 248-254)によって決定され
た。
d Yeh,W.-K. (1987) J.Bacteriol.,169, 1611-1618)に
よる記載に従い、ＨＰＬＣを用い、ＤＡＯＣからのＤＡ
Ｃの生成を２６０ｎｍでモニターすることによって、ヒ
ドロキシラーゼ活性を調べた。検定混合物の容量は１ml
であり、１５mＭ ＭＯＰＳ(３−[Ｎ−モルホリノ]プロ
パンスルホン酸)バッファー(ｐＨ７.３)中、蛋白質試料
(８.４マイクログラム)、ＤＡＯＣ(０.３マイクロモ
ル)、α−ケトグルタル酸(０.３マイクロモル)、硫酸第
１鉄(０.１マイクロモル)、アスコルビン酸(０.２５マ
イクロモル)、ＤＴＴ(１マイクロモル)、アデノシン三
リン酸(ＡＴＰ)(０.０５マイクロモル)を含有した。Ｄ
ＡＯＣを加えることによって酵素反応を開始させ、２９
℃で２０分間反応を行なった。ＤＡＣの生成は、４０分
まで、反応時間について直線状であった。酵素活性１単
位は、上記検定条件下でＤＡＯＣから１分当たり１マイ
クロモルのＤＡＣを生成させるのに必要なヒドロキシラ
ーゼの量として定義される。ヒドロキシラーゼの比活性
は、蛋白質１ミリグラム当たりの単位数として定義され
る。蛋白質含有量は、標準物質としてウシ血清アルブミ
ンを使用し、ブラッドフォードの方法(Ｂradford,M.M.,
1979, Anal.Biochem., 72, 248-254)によって決定され
た。
【００４９】Ｅ.coli K12 JM109/pOW399から製造された
ヒドロキシラーゼは、６０−８０ミリ単位／mg蛋白の比
活性を有した。
ヒドロキシラーゼは、６０−８０ミリ単位／mg蛋白の比
活性を有した。
【図１】 ベータ−ラクタム生合成経路を示す図であ
る。
る。
【図２】 プラスミドｐＯＷ３９９の制限部位および機
能地図である。
能地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジェイムズ・ロバート・ミラー アメリカ合衆国46250インディアナ州サウ ス・インディアナポリス、グレンビュー・ ドライブ4228番
Claims (10)
- 【請求項１】 Ｓtreptomyces clavuligerusのヒドロキ
シラーゼ活性をコードしている単離されたＤＮＡ配列を
含有するＤＮＡ化合物。 - 【請求項２】 式： 【化１】 ［式中、Ａlaはアラニン残基、Ａrgはアルギニン残基、
Ａsnはアスパラギン残基、Ａspはアスパラギン酸残基、
Ｃysはシステイン残基、Ｇlnはグルタミン残基、Ｇluは
グルタミン酸残基、Ｇlyはグリシン残基、Ｈisはヒスチ
ジン残基、Ｉleはイソロイシン残基、Ｌeuはロイシン残
基、Ｌysはリシン残基、Ｍetはメチオニン残基、Ｐheは
フェニルアラニン残基、Ｐroはプロリン残基、Ｓerはセ
リン残基、Ｔhrはトレオニン残基、Ｔrpはトリプトファ
ン残基、Ｔyrはチロシン残基、Ｖａｌはバリン残基であ
る］をコードしている単離されたＤＮＡ配列を含有する
請求項１に記載のＤＮＡ化合物。 - 【請求項３】 式： 【化２】 ［式中、Ａはデオキシアデニル残基、Ｇはデオキシグア
ニル残基、Ｃはデオキシシチジル残基、Ｔはチミジル残
基である］で示される単離されたＤＮＡ配列を含有する
請求項２に記載のＤＮＡ化合物。 - 【請求項４】 プラスミドｐＯＷ３９９の〜２．５kb
ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ制限フラグメント。 - 【請求項５】 請求項１に記載の単離されたＤＮＡ配列
を含有する組換ＤＮＡベクター。 - 【請求項６】 プラスミドｐＯＷ３９９である請求項５
に記載の組換ＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項７】 Ｓtreptomyces clavuligerusのヒドロキ
シラーゼ活性を発現し得る組換宿主細胞を作成するため
の方法であって、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ配
列を含有している組換ＤＮＡベクターで宿主細胞を形質
転換することからなる方法。 - 【請求項８】 該組換宿主細胞がＥscherichia、Ｃepha
losporium、Ｓtreptomyces、ＡspergillusまたはＰenic
illiumからなる群から選択される請求項７に記載の方
法。 - 【請求項９】 組換宿主細胞中でＳtreptomyces clavul
igerusのヒドロキシラーゼ活性を発現させるための方法
であって、遺伝子発現に好適な条件下で請求項７に記載
の該形質転換宿主細胞を培養することからなる方法。 - 【請求項１０】 該組換宿主細胞がＥscherichia、Ｃep
halosporium、Ｓtreptomyces、ＡspergillusまたはＰen
icilliumからなる群から選択される請求項９に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54950290A | 1990-07-06 | 1990-07-06 | |
| US549,502 | 1990-07-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH067172A true JPH067172A (ja) | 1994-01-18 |
Family
ID=24193271
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3166001A Pending JPH067172A (ja) | 1990-07-06 | 1991-07-06 | デアセチルセファロスポリンｃシンターゼ活性をコードしている組換ｄｎａ発現ベクターおよびｄｎａ化合物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0465189A3 (ja) |
| JP (1) | JPH067172A (ja) |
| CA (1) | CA2045951A1 (ja) |
| IL (1) | IL98701A0 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100227711B1 (ko) * | 1991-10-15 | 1999-12-01 | 한스 발터 라벤 | 7-아미노세팔로스포란산 및 7-아미노데아세틸세팔로스포란산 제조를 위한 신규한 생물학적 공정 |
| AU9264598A (en) * | 1997-08-22 | 1999-03-16 | Gist-Brocades B.V. | Statin production by fermentation |
| EP2802661B1 (en) | 2012-01-10 | 2017-07-19 | Orchid Chemicals and Pharmaceuticals Ltd | Mutated cephalosporin hydroxylase and its application in deacetylcephalosporanic acid synthesis |
| CN107557348B (zh) | 2016-07-01 | 2022-07-08 | 百瑞全球有限公司 | 头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的dna、使用该突变体的方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL85535A (en) * | 1987-03-04 | 1994-02-27 | Lilly Co Eli | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase and deacetylcephalosporin c synthetase |
| US5070020A (en) * | 1988-05-09 | 1991-12-03 | Eli Lilly And Company | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase |
-
1991
- 1991-06-28 CA CA002045951A patent/CA2045951A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-01 EP EP19910305939 patent/EP0465189A3/en not_active Withdrawn
- 1991-07-01 IL IL98701A patent/IL98701A0/xx unknown
- 1991-07-06 JP JP3166001A patent/JPH067172A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0465189A3 (en) | 1992-03-04 |
| CA2045951A1 (en) | 1992-01-07 |
| EP0465189A2 (en) | 1992-01-08 |
| IL98701A0 (en) | 1992-07-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20001128 |