JPH067190A - 抗モルヒネ抗体の抗イディオタイプ抗体、その製法及びモルヒネの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】抗モルヒネ抗体の抗イディオタイプ抗体、その
製法、及び抗モルヒネ抗体とその抗イディオタイプ抗体
とを用いたモルヒネの免疫学的測定法を提供する。 【構成】抗モルヒネ抗体を動物に免疫し，その動物から
得られたリンパ球とミエローマ細胞とを細胞融合してハ
イブリドーマ株を作製し，そのハイブリドーマ株を一般
的なリンパ球培養培地を用いて培養してモルヒネに対し
て免疫学的反応性を有する抗体の可変部位と反応性を有
する抗体を得る。抗モルヒネ抗体の抗イディオタイプ抗
体に対して酵素標識抗モルヒネ抗体もしくはモルヒネを
競争的に反応させるか、又は抗モルヒネ抗体に対して酵
素標識抗モルヒネ抗体の抗イディオタイプ抗体もしくは
モルヒネを競争的に反応させることによって、モルヒネ
を簡単、迅速に測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、鎮痛薬の一種であるモ
ルヒネに免疫学的反応性を有する抗体（以下、『抗モル
ヒネ抗体』と称す。）の可変部位に対して免疫学的反応
性を有する抗体（以下、『抗イディオタイプ抗体』と称
す。）の製法及びそれらの抗体を用いたモルヒネの測定
法に関するものである。

【０００２】

【従来技術の説明】近年、末期癌患者の加療法の一つと
して、モルヒネを投与することによって痛みを軽減する
方法が採用されている。このような方法では、モルヒネ
の投与量が少ないと鎮痛効果がなく、その量が多すぎる
と副作用が大きくなりすぎる。従って、常にその濃度を
適切に維持できるための投与量を決定する際には、その
血中濃度を簡単、かつ迅速にモニタリングできる方法が
必要である。

【０００３】そのような試みとしては、従来、クロマ
トグラフィーを用いる方法〔ジャーナル・オブ・クロマ
トグラフィー（Ｊｏｕｒａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ），２３０巻，４２７〜４３２頁，１９８
２年〕、モルヒネに対して免疫学的反応性を有するポ
リクローナル抗体を用いた免疫化学測定法〔ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジイ（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ
ｇｙ），３８巻，１４９〜１５６頁，１９７６年〕、
モルヒネに対して免疫学的反応性を有するモノクローナ
ル抗体を用いた免疫化学測定法〔モレキュラー・イムノ
ロジィ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ），２５巻，９３７〜９４３頁，１９８８年〕などが
知られている。

【０００４】しかし、〜には、以下のような問題点
がある。では、血清中からモルヒネを分離する操作が
煩雑であり、さらに、分離したモルヒネを液体クロマト
グラフィーによって測定する必要があるので、長時間を
必要とする。及びでは、抗体の特異性が低いこと
（コデイン等との反応性が認められること）、さらに、
ラジオアイソトープを取扱うことができる条件が整って
いる必要があることなどの問題があった。

【０００５】

【発明が解決すべき課題】本発明の目的は、『抗イディ
オタイプ抗体』、その製法、及び『抗モルヒネ抗体』と
『抗イディオタイプ抗体』とを用いたモルヒネの免疫学
的測定法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の課
題を解決するために鋭意研究した結果、『抗モルヒネ抗
体』を免疫して得られたリンパ球とミエローマ細胞とを
細胞融合して得られたハイブリドーマ株を培養すること
によって『抗イディオタイプ抗体』を得ることができ、
『抗モルヒネ抗体』と『抗イディオタイプ抗体』とを用
いた競争的免疫学的測定法でモルヒネを測定することが
できることを見出し、本発明を完成するに至った。即
ち、本発明は、以下の通りである。

【０００７】第１の発明は、『抗モルヒネ抗体』の『抗
イディオタイブ抗体』に関するものである。第２の発明
は、『抗モルヒネ抗体』を免疫して得られたリンパ球と
ミエローマ細胞とを細胞融合することによって得られた
ハイブリドーマ株を培養することを特徴とする前記の
『抗イディオタイプ抗体』の製法に関するものである。
第３の発明は、前記に記載のハイブリドーマ株に関する
ものである。第４の発明は、固相支持体に固定化した
『抗モルヒネ抗体』を、モルヒネ、又は標識物質で標識
した『抗イディオタイプ抗体』と競争的に反応させるこ
とを特徴とするモルヒネの測定法に関するものである。
第５の発明は、固相支持体に固定化した『抗イディオタ
イプ抗体』を、モルヒネ、又は標識物質で標識した『抗
モルヒネ抗体』と競争的に反応させることを特徴とする
モルヒネの測定法に関するものである。

【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の『抗イディオタイプ抗体』は、『抗モルヒネ抗
体』の可変部位と免疫学的反応によって『抗イディオタ
イプ抗体』と『抗モルヒネ抗体』との複合体を形成する
ことができ（前者を免疫学的反応における抗体、後者を
抗原という言葉に置き換えていえば、両者はいわゆる抗
原抗体反応による複合体を形成することができる。）、
かつ『抗モルヒネ抗体』とモルヒネとの免疫学的反応を
阻止できる特性を有する抗体である。即ち、本発明の
『抗イディオタイプ抗体』は、『抗モルヒネ抗体』の可
変部位（モルヒネと特異的な免疫学的反応性を有する部
位）と免疫学的反応によって複合体を形成することによ
って、『抗モルヒネ抗体』とモルヒネとの複合体の形成
を阻止することができる特性を有するものである。

【０００９】そのような特性を有する『抗イディオタイ
プ抗体』としては、『抗モルヒネ抗体』を動物に免疫す
ることによって得られた血清、その動物のリンパ球とミ
エローマ細胞との細胞融合によって得られたハイブリド
ーマ株が産生するモノクローナル抗体などを挙げること
ができるが；好ましくはモノクローナル抗体がよい。

【００１０】本発明の免疫に用いる動物としては、実験
小動物（マウス，ラット，モルモット，ウサギ，イヌな
ど），家畜（ヤギ，ウシ，ウマなど）などを挙げること
ができ；モノクローナル抗体を生産するためには、好ま
しくは実験小動物を用いるのがよく、さらに好ましくは
マウスを用いるのがよい。

【００１１】本発明で動物への免疫原として用いる抗原
である『抗モルヒネ抗体』としては、競争的免疫学的測
定法において使用できる『抗イディオタイプ抗体』を作
製できる限り特に限定されず、例えば、モルヒネを前記
動物に免疫して得たモルヒネと特異的に免疫学的反応性
を有する血清、その動物のリンパ球とミエローマ細胞と
の細胞融合によって得られたハイブリドーマ株が産生す
るモノクローナル抗体などを挙げることができるが；好
ましくは、モノクローナル抗体がよく；さらに好ましく
は、コデイン（鎮咳剤）とは実質的に交差反応性を示さ
ないモノクローナル抗体がよい。

【００１２】コデインとは実質的に交差反応性を示さな
いモノクローナル抗体は、例えば、ノルモルヒネを生体
高分子である免疫グロブリンに結合させたものを免疫原
に用いた免疫マウスから得たリンパ球とマウスのミエロ
ーマ細胞とを融合して得たハイブリドーマ株であるＭＯ
−２株（微工研条寄第１９１０号），ＭＯ−３株（微工
研条寄第１９１１号），ＭＯ−４株，ＭＯ−５株（微工
研条寄第１９１２号），ＭＯ−６株などを一般的なリン
パ球培養培地を用いてフラスコで静置培養するか又はマ
ウス腹腔内で培養することによって得ることができる
が、コデイン及びＭ−６−Ｇ（モルヒネ−６−グルクロ
ナイド）と実質的に反応性が認められないモノクローナ
ル抗体を必要とする場合には、ＭＯ−３株，ＭＯ−４
株，ＭＯ−５株又はＭＯ−６株を培養することによって
さらに高い特異性を有するモノクローナル抗体を得るこ
とができる。

【００１３】そして、免疫原としては、このようなモノ
クローナル抗体の可変部位を有するものであれば特に限
定されず、例えば、モノクローナル抗体をそのまま用い
てもよく、そのモノクローナル抗体のＦａｂ，Ｆａｂ’
もしくはＦ（ａｂ’）_２を用いてもよく、又は／及びそ
れらを分子量１万以上の高分子担体に結合させたものな
どを挙げることができるが；好ましくは、前記のモノク
ローナル抗体を分子量１万以上の高分子担体に結合させ
たものがよい。

【００１４】そのような分子量１万以上の高分子担体と
しては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミ
ン（ＯＶＡ）、陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グ
ロブリンなどのような生体高分子やポリＬ−リジン（Ｐ
ＬＬ）などのようなポリアミノ酸を挙げることができ
る。

【００１５】本発明の好ましい『抗イディオタイプ抗
体』は、例えば、モルヒネに対して特異的な反応性を有
する『抗モルヒネ抗体』を生体高分子であるＫＬＨに結
合させたものを免疫原に用いた免疫マウスから得たリン
パ球とマウスのミエローマ細胞とを融合して得たハイブ
リドーマ株であるｉＭＯ−３−Ｘ１株（微工研菌寄第１
１９３３号），ｉＭＯ−３−Ｐ１株，ｉＭＯ−３−Ｐ２
株などを一般的なリンパ球培養培地を用いたフラスコで
静置培養するか又はマウス腹腔内で培養することによっ
て得ることができる。このようなハイブリドーマ株の好
ましい作製方法及び抗体の製造方法についての概略を説
明する。

【００１６】〔Ａ〕モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ株の作製 （１）免疫原及び標識抗体の作製 マウスに用いる免疫原は、例えば、『抗モルヒネ抗体』
をグルタルアルデヒドを用いて、分子量１万以上の高分
子担体（例えば、ＢＳＡ，ＯＶＡ，ＫＬＨ，免疫グロブ
リンなどのような生体高分子、及びＰＬＬなどのような
ポリアミノ酸などを好ましい例として挙げることができ
る。）と結合することによって作製することができる。

【００１７】標識物質で標識した抗体における標識物質
としては、ラジオアイソトープ、蛍光物質、酵素〔例え
ば、酸化還元酵素（ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコール
オキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼなど）、リン酸加水分解酵素（アルカリ性フォ
スファターゼなど）〕などを挙げることができるが、取
扱いが容易な酵素を用いるのが好ましい。酵素標識抗体
としては、例えば、『抗モルヒネ抗体』を過沃素酸酸化
法〔Ｎａｋａｎｅ，Ｐ．Ｋ．ａｎｄ Ｋａｗａｏｉ，
Ａ．：Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２
２巻，１０８４頁（１９７４年）〕によって西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合することによって作
製することができる。

【００１８】（２）免疫マウスリンパ球の調製 マウスの免疫方法は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
に溶解した前記（１）の免疫原（１０〜４００μｇ）を
マウスに１回または数週間隔で数回投与することで行う
ことができる。１回目の免疫は、アジュバント（ミョウ
バン，結核死菌体，核酸などを含む免疫促進物質）を投
与せずに行うこともできるが、アジュバントを用いて調
製したエマルジョンを投与することが好ましい。リンパ
球は、その免疫マウスの充分な抗体価を確認後、最終免
疫から数日後の血液，リンパ節，脾臓などから得ること
ができるが、脾臓から得た方が好ましい。

【００１９】（３）ミエローマ細胞の準備 細胞融合には、マウス由来のＭＰＣ−１１，Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８・６５３（６５３），Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１），Ｐ３−ＮＳ−１（ＮＳ−１），Ｓ
Ｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）など、及びラット由
来の２１０．ＲＣ Ｙ３．Ａｇ１．２．３（Ｙ３）など
のミエローマ細胞を用いることができるが；６５３，Ｐ
３Ｕ１，ＮＳ−１，ＳＰ２／０などの細胞外に抗体を産
生分泌しないミエローマ細胞を用いた方が好ましい。

【００２０】（４）細胞融合 細胞融合は、前記のようにして免疫されたマウスのリン
パ球と前記ミエローマ細胞との細胞数を（５〜２０）：
１の割合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶
液、例えば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分
（ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，ＭｃＣｏｙ，ＲＰＭＩ１６４０な
どの培地成分）溶液、等張緩衝液などを用いて良く混合
し、遠心分離した後のペレット（細胞塊）に、ＨＶＪ
（センダイウイルス）またはＰＥＧ（ポリエチレングリ
コール）溶液を添加することによって行うことができる
が、好ましくはＰＥＧ溶液を用いるのがよく、さらに好
ましくは平均分子量が１０００〜８０００で３０〜６０
重量％のＰＥＧ溶液を用いるのがよい。この時、細胞融
合を促進するために、コルヒチン、ジメチルスルホキシ
ド、ポリ−Ｌ−アルギニンなどを適当量添加することも
できる。細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、免
疫されたマウスと異種の動物由来のものを使用すること
もできるが、得られるモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマ株の抗体産生量および安定性の面を考えると、免
疫されたマウスとは同種のミエローマ細胞を用いた方が
よく、さらに好ましくは同系のものを用いた方がよい。

【００２１】（５）ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＨ
ＡＴ培地〔ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジ
ン，ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有した培地。この培地
成分としては一般に用いられるリンパ球培養用培地成分
を用いることができる〕で培養して行うことができる。
ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル（培
養ウェル）に抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数を
入れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物質ま
たはそれを産生する細胞（例えば、胸腺，脾臓，リンパ
節由来のリンパ球など）をフィーダー細胞として必要に
応じて使用することができる。ＨＡＴ培地で増殖するこ
とによって選択されたハイブリドーマは、抗体産生ウェ
ルの検索に適した細胞個数に達するまで、ＨＴ培地（ヒ
ポキサンチン、チミジン、ＦＣＳを含有した培地、この
培地成分としては一般に用いられるリンパ球培養用培地
成分を用いることができる）で数日間培養し、さらに、
一般的に用いられるＦＣＳを含有するリンパ球培養用培
地で培養する。

【００２２】（６）抗体産生ハイブリドーマの選択 前記（５）で得られたハイブリドーマが、目的とする抗
体を産生しているか否かの検定は、例えば、マウス抗体
に対する酵素標識二次抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（酵素
免疫測定法），サンドイッチＥＬＩＳＡ法，プラーク形
成法，凝集反応法，ＲＩＡ法（ラジオアイソトープを用
いた免疫測定方法），間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）などで
行うことができるが、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で行う
ことが好ましい。

【００２３】このサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、以下の
ようにして行う。『抗モルヒネ抗体』を固定化したＥＬ
ＩＳＡプレートの各ウェル（測定ウェル）に、ハイブリ
ドーマ培養上清を加えて一定時間静置する。そして、こ
れらの洗浄した各測定ウェルに（１）で調製した酵素標
識抗体（標識に用いる酵素は、例えば、ペルオキシダー
ゼ，アルカリフォスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ
などを挙げることができる。）をこれらの測定ウェルに
加えて一定時間静置する。次に、これらの測定ウェルを
洗浄し、用いた酵素に対応した基質溶液を加えて酵素活
性を測定する。そして、酵素活性が認められれば、その
培養上清をとった培養ウェル中に目的とする抗体を産生
するハイブリドーマが存在していたことがわかる。この
ようにして、細胞増殖が認められ、かつ抗体を産生して
いるハイブリドーマを得ることができる。

【００２４】（７）ハイブリドーマの株化（クローニン
グ） 抗体産生が認められた培養ウェル中のハイブリドーマ
は、限界希釈法，シングル・セル・マニプレーション法
（倒立顕微鏡下、１ウェルに１個のハイブリドーマを入
れる方法），軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方
法、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ）を用いた方法などでク
ローニングすることができる。この時、前記のいずれか
のクローニング方法によって（６）で見出した抗体産生
ハイブリドーマを培養し、その増殖が認められた培養ウ
ェルの上清を用い、（６）の抗体産生ハイブリドーマの
選択で行ったＥＬＩＳＡ法と同様の方法で、抗体産生ウ
ェルを検索し、その抗体産生ウェルについては、さら
に、モルヒネを用いた阻害試験で『抗モルヒネ抗体』と
の反応性を阻害される抗体産生ウェルを検索する。この
ようにして、『抗モルヒネ抗体』の可変部位に対して特
異性が高く、かつ抗体価が高い『抗イディオタイプ抗
体』であるモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ株を選択して得ることができる。

【００２５】〔Ｂ〕モノクローナル抗体の製法 前記のモノクローナル抗体の生産は、前記で得たハイ
ブリドーマ株をフラスコ内で培養したり、または動物の
腹腔内で培養することによって行うことができる。前記
（７）で得たハイブリドーマ株のフラスコ内培養での該
モノクローナル抗体の生産は、例えば、０〜２０％ウシ
胎児血清を含む一般的に用いられるリンパ球培養用培地
（例えば、ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，ＭｃＣｏｙ，ＲＰＭＩ１
６４０などの培地成分を含む培地）で細胞濃度が上限に
達するまで培養することによって行うことができる。こ
の時、該モノクローナル抗体は、遠心操作で得た培養上
清中に含まれている。

【００２６】一方、前記（７）で得たハイブリドーマ株
の動物腹腔内培養での該モノクローナル抗体の生産は、
細胞融合に用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を
用いて行うこともできるが、同種の動物を用いて行った
方が好ましく、さらに好ましくは同系の動物を用いて行
った方がよい。

【００２７】このような方法による『抗モルヒネ抗体』
の可変部位に対して特異性が高く、かつ抗体価が高い
『抗イディオタイプ抗体』であるモノクローナル抗体の
生産は、マウス，ラット，ハムスターなどの適当な動物
の腹腔内にこの動物の免疫能を低下させる物質、例え
ば、プリスタンなどの鉱物油を投与し、数週間後に１０
^６〜１０^７個の前記（７）で得たハイブリドーマ株細胞
を投与し、その腹腔内にこの株細胞を数週間で高密度に
増殖させることによって行うことができる。この時、該
モノクローナル抗体は、遠心操作で得た腹水上清中に含
まれている。そして、その抗体濃度は、フラスコ内培養
で得た時の培養上清の抗体濃度の１０〜１０００倍であ
る。

【００２８】ハイブリドーマ株のフラスコ内または動物
腹腔内での培養で得られた該モノクローナル抗体は、蛋
白質の一般的な精製法に適用されている塩析，透析，イ
オン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマト
グラフィーなどを行うことによって精製され、高純度の
モノクローナル抗体となる。前記のようにして得た該モ
ノクローナル抗体は、『抗モルヒネ抗体』の可変部位に
対して対して非常に高い特異的な反応性を有するもので
ある。

【００２９】〔Ｃ〕『抗モルヒネ抗体』と『抗イディオ
タイプ抗体』とを用いた競争的免疫学的測定法によるモ
ルヒネの測定 （１）『抗モルヒネ抗体』又は『抗イディオタイプ抗
体』の標識物質による標識 『抗モルヒネ抗体』又は『抗イディオタイプ抗体』の標
識物質としては、ラジオアイソトープ、蛍光物質、酵素
〔例えば、酸化還元酵素（ペルオキシダーゼ、カタラー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アル
コールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼなど）、リン酸加水分解酵素（アルカリ
性フォスファターゼなど）〕などを挙げることができる
が、取扱いが容易な酵素を用いるのが好ましい。酵素標
識抗体は、例えば、『抗モルヒネ抗体』又は『抗イディ
オタイプ抗体』と酵素とを、グルタルアルデヒドを用い
た１段階法〔イムノケミストリィ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｏｒｙ），６巻，４３頁，１９６９年〕又は２
段階法〔イムノケミストリィ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｏｒｙ），８巻，１１７５頁，１９７１年〕、過沃
素酸酸化法〔メソッド・イン・エンジモロジィ（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｒｏｇｙ），３７巻，１
３３頁，１９７５年〕、マレイミド法〔ジャーナル・オ
ブ・ザ・バイオケミストィ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），７８巻，２３５頁，１９７５
年〕などによって作製することができるが、好ましくは
過沃素酸酸化法及びマレイミド法がよい。

【００３０】これをそのままモルヒネの測定に用いるこ
とができるが、モルヒネの測定感度をさらに高めるため
には、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｈｅｐｈａｃｒｙｌなどを
用いたゲル濾過を行うか又は標識に用いる酵素がペルオ
キシダーゼなどのような糖蛋白質である場合にはコンカ
ナバリンＡセファロースを用いてアフィニティクロマト
を行ったものを用いることができる。このようにして精
製された酵素標識画分は、そのままモルヒネの測定に使
用できるが、中性付近の緩衝液（例えば、リン酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液など）などで透析し、凍結乾燥
又は滅菌フィルターで濾過して保存し、必要に応じて酵
素標識『抗モルヒネ抗体』又は酵素標識『抗イディオタ
イプ抗体』として、中性付近の緩衝液で蛋白質濃度を
０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０
μｇ／ｍｌに調製して使用するのがよい。

【００３１】（２）『抗モルヒネ抗体』、モルヒネ、及
び標識物質で標識した『抗イディオタイプ抗体』を用い
た競争的免疫学的反応によるモルヒネの測定 固相支持体に『抗モルヒネ抗体』を固定化し、モルヒ
ネ、又は標識物質で標識した『抗イディオタイプ抗体』
を固定化された『抗モルヒネ抗体』と競争的に反応させ
ることによって、モルヒネを測定することができる。固
相支持体は、その形状としては、例えば、プレート、チ
ューブ、ビーズ、膜などのイムノアッセイ用に使用でき
るものを挙げることができ；その材質としては、例え
ば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ニ
トロセルロース、ナイロン、スチレン−ブタジエン共重
合体、ポリメチルメタクリレート、ガラスなどを挙げる
ことができる。モルヒネの測定は、次に示すような主要
な段階を経ることによって、行うことができる。

【００３２】固相支持体に一定量の『抗モルヒネ抗
体』を固定化する段階 固相支持体に、本発明の測定を可能とする範囲で、一定
量の『抗モルヒネ抗体』溶液を一定時間接触させる。接
触時の温度は、特に限定されないが、好ましくは２〜４
０℃がよい。 固相支持体に固定化されなかった『抗モルヒネ抗体』
を除去する段階 『抗モルヒネ抗体』溶液を除去した後、洗浄液で数回洗
浄して固相支持体に固定化されなかった『抗モルヒネ抗
体』を除去する。洗浄液としては、例えば、水、固定化
時に用いた緩衝液に界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｗ
ｅｅｎ６０など）を０〜３容量％含む溶液などを挙げる
ことができるが、好ましくは０．００５〜０．８％の界
面活性剤を含む反応時のｐＨに調整した緩衝液を用いる
のがよい。

【００３３】標識物質で標識した『抗イディオタイプ
抗体』が固相支持体表面に非特異的に結合することを防
ぐ段階 前記の『抗モルヒネ抗体』を固定化した支持体に、本発
明の測定を可能とする範囲で、一定量のブロッキング液
を一定時間接触させる。接触時の温度は、特に限定され
ないが、好ましくは２〜４０℃がよい。ブロッキング液
としては、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、ＯＶＡ（卵白
アルブミン）、ＫＬＨ（陣笠貝ヘモシアニン）、γ−グ
ロブリンなどの高分子蛋白質又は各種動物の血清を、サ
ッカロース、塩化マグネシウムなどを含んだ前記の洗浄
液に溶解することによって調製することができる。これ
らの高分子蛋白質の濃度は、０．５〜５、好ましくは
０．５〜２ｗｔ／ｖｏｌ％がよく、各種動物の血清の場
合には１〜５０ｗｔ／ｖｏｌ％がよい。また、必要に応
じて、このようなブロッキング液には、ケーソンＣＧ、
アジ化ナトリウム、エチル水銀チオサリチル酸ナトリウ
ムなどのような蛋白質の防腐剤を必要量添加することも
できる。

【００３４】モルヒネ、又は標識物質で標識した『抗
イディオタイプ抗体』と固相支持体に固定化された『抗
モルヒネ抗体』とを競争的に反応させる段階 測定試料（モルヒネを含む）と前記標識『抗イディオタ
イプ抗体』溶液とを等容量づつとり、前記固相支持体に
固定化された『抗モルヒネ抗体』と接触反応させる。接
触時の温度は、特に限定されないが、好ましくは２〜４
０℃がよい。測定試料と標識『抗イディオタイプ抗体』
溶液とは、混合した後に直ちに接触反応させてもよい
し、又は固相支持体に固定化された『抗モルヒネ抗体』
に、それぞれを順次添加し、直ちに攪拌して接触反応さ
せてもよい。測定試料としては、ヒトの尿、血液、血清
などのヒトの体液を用いることができる。

【００３５】『抗モルヒネ抗体』を介して固相支持体
に固定化されなかったフリーの標識『抗イディオタイプ
抗体』を除去する段階 前記の反応液を除去し、『抗モルヒネ抗体』を介して固
相支持体に固定化されなかったフリーの標識『抗イディ
オタイプ抗体』とモルヒネとを洗浄液で数回洗浄するこ
とによって除去する。

【００３６】『抗モルヒネ抗体』を介して固相支持体
に固定化された標識『抗イディオタイプ抗体』と酵素の
基質溶液（以下、『基質溶液』と称す）とを反応させる
段階 本発明の測定を可能とする範囲で、標識に用いた物質が
酵素の場合には、一定量の『基質溶液』を一定時間接触
させ（好ましくはＨ_２ＳＯ_４などの酸、ＮａＯＨなどの
アルカリ、酵素活性阻害剤などで酵素反応を停止した方
がよい。）、反応によって呈色した吸光度を測定する。
接触時の温度は、特に限定されないが、用いる酵素の至
適温度範囲内であれば特に問題ないが、好ましくは２〜
４０℃がよい。

【００３７】『基質溶液』としては、標識に用いた酵素
が反応するＨ_２Ｏ_２の基質、その酵素反応によって生じ
た物質によって発色する呈色物質〔ｏ−フェニレンジア
ミン、２，２’−アミノビス（３エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）など〕を含む至適ｐＨ範囲の緩衝
液を用いることができる。そして、前記の酵素反応終了
後の反応液の呈色が最大吸光度を示す波長でその反応液
の吸光度を測定する。標識に用いた物質がラジオアイソ
トープの場合にはシンチレーションカウンターで、蛍光
物質の場合には蛍光光度計で『抗モルヒネ抗体』を介し
て固相支持体に固定化された標識『抗イディオタイプ抗
体』を測定する。以上のようにして、測定試料の代わり
に既知量のモルヒネ溶液（０〜４０ｎｇ／ｍｌのモルヒ
ネ溶液。以下、『標準モルヒネ溶液』と称する。）を用
いた測定結果から、検量線を作成し、測定試料中のモル
ヒネの量を知ることができる。このモルヒネ測定段階の
うちのの段階で、固相支持体に固定化された『抗モル
ヒネ抗体』に対して、モルヒネと標識『抗イディオタイ
プ抗体』との競争的反応が起きることによって、その測
定試料中のモルヒネの量を迅速かつ高感度で測定するこ
とができる。

【００３８】（３）『抗イディオタイプ抗体』、モルヒ
ネ、及び標識物質で標識した『抗モルヒネ抗体』を用い
た競争的酵素免疫反応によるモルヒネの測定 固相支持体に『抗イディオタイプ抗体』を固定化し、モ
ルヒネ、又は標識物質で標識した『抗モルヒネ抗体』と
競争的に反応させることによって、モルヒネを測定する
ことができる。前記（２）において、『抗モルヒネ抗
体』の代わりに『抗イディオタイプ抗体』を用い、標識
物質で標識した『抗イディオタイプ抗体』の代わりに標
識物質で標識した『抗モルヒネ抗体』を用いて、同様に
することによって、測定試料中のモルヒネの量を迅速か
つ高感度で測定することができる。

【００３９】

【実施例】以下、本発明を参考例及び実施例によって具
体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明の範
囲を限定するものではない。 参考例１〔『抗モルヒネ抗体』の生産と精製〕 ＭＥＭに浮遊させた２×１０^６個の細胞のハイブリドー
マ株〔ＭＯ−３株（微工研条寄１９１１号）〕をＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（♀、８週齢、１〜２週間前にプリスタン
を０．５ｍｌ腹腔内投与）の腹腔内に投与して行った。
マウス体重の顕著な増加は、１週間目頃から認められ、
１〜３週間目に適宜腹水を取り出した。このようにして
得られた腹水の抗体価は、１０^６〜１０^８であった。得
られた腹水からのモノクローナル抗体である『抗モルヒ
ネ抗体』の精製は、次のようにして行った。前記の腹水
を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７．４）に対して
透析し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカ
ラムに流した。素通り画分を５０％飽和硫安で塩析し、
得られた沈澱をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解
し、ＰＢＳに対して透析した。このようにして得られた
『抗モルヒネ抗体』は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
を用いたスラブゲル電気泳動で高純度であることがわか
った。

【００４０】実施例１〔免疫原の調製〕 参考例１のモノクローナル抗体（以下、『ＭＯ−３』と
称す。）とＫＬＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ ＃３７４８
１）とを、それぞれＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈した
後、それらの等量を混合し、１０％グルタルアルデヒド
（和光純薬製。電子顕微鏡用。）を１４μｌ／ｍｌ添加
し、室温で１時間攪拌した。このようにして得た免疫原
をＰＢＳに対して透析した後、４℃で保存した。

【００４１】実施例２〔酵素標識抗体の調製〕 ７．３２ｍｇの西洋ワサビペーオキシダーゼ（ＨＲＰ）
を１ｍｌの蒸留水に溶解し、０．１Ｍ過沃素酸ナトリウ
ムを２００μｌ加えて室温で３０分間反応した。この酵
素溶液を１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して４℃
で一晩透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．５）を１００μｌ添加してｐＨ９．５に調整した。
一方、ＰＢＳに溶解していた８ｍｇのモノクローナル抗
体（ＭＯ−３）を１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．５）に対して４℃で一晩透析した。このようにして
得られたＨＲＰ溶液とモノクローナル抗体溶液とを混合
し、室温で２時間半攪拌した後、この反応液にテトラヒ
ドリドホウ酸ナトリウムを加え、４℃で２時間攪拌し
た。このようにして得られたＨＲＰ標識モノクローナル
抗体は、ＰＢＳに対して透析した後、４℃で保存した。

【００４２】実施例３〔『抗イディオタイプ抗体』産生
ハイブリドーマ株の作製〕 （１）マウスの免疫及び脾臓リンパ球の調製 実施例１で調製した免疫原溶液０．４ｍｌと０．４ｍｌ
のフロイントの完全アジュバントとを充分に混合して得
られたエマルジョンの０．２ｍｌを、ＢＡＬＢ／ｃマウ
ス（♀、８週齢）の腹部皮下に投与した。この初回免疫
から２週間後、前記と同様にして調製したエマルジョン
の０．２ｍｌを前記マウスの腹部皮下に投与した。さら
に、７週間後に、前記の免疫原溶液０．４ｍｌと０．４
ｍｌのフロイントの不完全アジュバントとを充分に混合
して得られたエマルジョンの０．２ｍｌを、前記マウス
の腹腔内に投与した。

【００４３】さらに、２週間後及び４週間後に、前記と
同様にして調製したエマルジョンの０．２ｍｌを前記マ
ウスの腹部皮下に投与した。さらに、２週間後に、最終
免疫として、前記の免疫原溶液をＰＢＳで２倍に希釈し
たもの０．２ｍｌを前記マウスの尾静脈に投与した。こ
のようにして免疫されたマウスから、最終免疫から３日
目に摘出した脾臓を、ＭＥＭ（リンパ球培養用培地粉末
を蒸溜水に溶解したもの、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含
む）を入れたシャーレ中で洗い、１０ｍｌのＭＥＭを入
れた別のシャーレ中に移して、滅菌したスライドグラス
のフロスト部分を用いてほぐした。このようにして得た
浮遊リンパ球を、ＭＥＭ（３７℃）に懸濁して、遠心分
離（３５０Ｇ、６分間）して洗浄した。この操作をさら
に２回反復した後、ＭＥＭ（３７℃）に再懸濁し、細胞
融合に供するマウス脾臓リンパ球とした。

【００４４】（２）細胞融合 対数増殖期にある８−アザグアニン耐性のマウスミエロ
ーマ細胞〔Ｘ６３−Ａｇ８・６５３（６５３）又はＰ３
−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）〕を培養フラスコ
から回収し、遠心分離（３５０Ｇ、６分間）してＭＥＭ
（３７℃）で２回洗浄した。これをＭＥＭ（３７℃）に
再懸濁し、細胞融合に供するマウスミエローマ細胞とし
た。１．８×１０^８個の前記のマウスの脾臓リンパ球と
３．６×１０^７個の６５３のマウスミエローマ細胞又は
１．８×１０^７個の前記のマウスの脾臓リンパ球と９×
１０^７個のＰ３Ｕ１のマウスミエローマ細胞とを、５０
ｍｌ容プラスチック製コニカル遠心管に入れ、混合し、
次いで、上清を遠心分離（３５０Ｇ、６分間）した後
に、同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐした。

【００４５】同遠心管を回転させつつ、１ｍｌの４０％
ＰＥＧ１５００溶液（３７℃）を１分間かけて加え、回
転させながらさらに１分間反応させた。次に、回転させ
ながらＭＥＭ（３７℃）を徐々に加え、最終的には１０
ｍｌとし、遠心分離（１２０Ｇ、６分間）して上清を吸
引除去した。同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐ
し、８０ｍｌのＨＡＴ培地（１×１０^−４Ｍヒポキサン
チン，４×１０^−７Ｍアミノプテリン，１．６×１０
^−５Ｍチミジン、ウシインシュリン０．２Ｕ／ｍｌ及び
２０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地、
３７℃に保温）に再懸濁して、９６ウェルの培養プレー
ト８枚の各培養ウェルに１００μｌづつ分注して、ＣＯ
_２インキュベーターを用いて培養した（５％ＣＯ_２、９
５％空気、３７℃、湿度１００％）。

【００４６】（３）ハイブリドーマの選択 前述（２）の培養開始から２〜４週間かけて、細胞増殖
が認められた培養プレートの各ウェルの培養上清中に、
『抗モルヒネ抗体』に対する抗体が含まれているか否か
を、次に示すＥＬＩＳＡ法で検討した。まず、９６ウェ
ルＵ底ＥＬＩＳＡプレート（以下、ＥＬＩＳＡプレート
と略す。）の各分析ウェルに、参考例１で精製したＭＯ
−３（『抗モルヒネ抗体』）溶液（１０μｇ／ｍｌ、ｐ
Ｈ９．８の０．０５Ｍ炭酸緩衝液に溶解）を５０μｌづ
つ分注し、４℃で１晩静置した（このような処理によっ
て、ＭＯ−３が各分析ウェルの表面に吸着する。）。

【００４７】次いで、その各分析ウェルを洗浄液（０．
０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ。以下、ＰＢＳ−
Ｔと略記する。）で洗浄した後、０．５％のＯＶＡ溶液
（ＰＢＳに溶解）を各分析ウェルに１００μｌづつ分注
して室温で３０分間静置した。これらの各分析ウェルを
ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、前記培養プレートの各培養ウェル
の培養上清を、これらの各分析ウェルに５０μｌづつ分
注して室温で２時間静置した（陰性対照には、ＨＡＴ培
地を用いた。一方、陽性対照には、本発明での細胞融合
に用いたマウスの血清をＰＢＳ−Ｔで１００倍に希釈し
たものを用いた。）。

【００４８】次に、前記の各分析ウェルをＰＢＳ−Ｔで
洗浄し、実施例２で調製した酵素標識抗体溶液をＰＢＳ
−Ｔで適当に希釈したものを５０μｌづつ、各分析ウェ
ルに分注し、室温で１時間静置した。そして、その各分
析ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、２，２’−アジノ−ビ
ス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
（１．２ｍｇ／ｍｌ）及び０．０２％の過酸化水素を含
む溶液を１００μｌづつ各分析ウェルに分注し、室温で
３０分間反応後、この分析プレート用の吸光度測定装置
を用いて各分析ウエルの４０５ｎｍにおける吸光度を測
定した。このような検討の結果、『抗モルヒネ抗体』と
免疫学的反応性を有する抗体の産生が認められたのは、
６５３を用いた場合には，培養プレート中の２６９個の
培養ウェルの中の１個であり、Ｐ３Ｕ１を用いた場合に
は，培養プレート中の５５３個の培養ウェルの中の２個
であった。

【００４９】次に、これらの抗体が『抗モルヒネ抗体』
の可変部位と免疫学的反応性を有するか否かを検討し
た。即ち、これらの抗体を産生した３個の培養ウェルに
ついて、モルヒネを用いた阻害試験（前記のサンドイッ
チＥＬＩＳＡで培養ウェルの上清５０μｌのかわりに、
その培養ウェルの上清２５μｌとモルヒネ２５０ｎｇを
溶解したＰＢＳ−Ｔの２５μｌとを同時に分析ウェルに
入れる以外は同様の操作を行う）を行なうことによって
検討した。その結果、モルヒネで阻害される抗体を含有
している培養ウェルは、３個の全てに認められた。即
ち、この３個の培養ウェル（Ａ，Ｂ，Ｃと称する。）に
は、『抗モルヒネ抗体』の可変部位と反応性を有する抗
体（『抗イディオタイプ抗体』）を産生するハイブリド
ーマが存在することが確認された。

【００５０】（４）ハイブリドーマの株化（クローニン
グ） ２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、前
述の（３）工程において示した抗体産生が確認された３
個の培養ウェル中のハイブリドーマについて限界希釈法
でクローニングした。培養には、９６ウェル培養プレー
トを用い、支持細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細
胞懸濁液（１０^７個／ｍｌ）を使用して、（ハイブリド
ーマ１〜５個）／（胸腺細胞懸濁液１００μｌ）／ウェ
ルで培養し、培養開始から５日目に２０％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地を各培養ウェルに１００μｌづつ
追加してさらに培養を続けた。前記Ａ、Ｂ、Ｃの３個の
培養ウェル中のハイブリドーマのクローニングにおい
て、１０〜１４日目に単一コロニーとして観察される培
養ウェルの上清を採取して、サンドイッチＥＬＩＳＡ法
〔前述の（３）工程と同様の方法〕で抗体産生ウェルの
スクリーニングを行なった。このようにして、Ａ、Ｂ、
Ｃの各培養ウェルからハイブリドーマ株をそれぞれ少な
くとも１株づつ以上得た。そして、それらのうちで細胞
増殖と抗体産生量を考慮して、Ａ，Ｂ，Ｃ培養ウェルを
代表するハイブリドーマ株を、１株づつ選んで再クロー
ニングした。

【００５１】このようにして得られた株をｉＭＯ−３−
Ｘ１株（微工研菌寄第 １１９３３号），ｉＭＯ−３−
Ｐ１株，ｉＭＯ−３−Ｐ２株と称し、これらの株が産生
したモノクローナル抗体を、それぞれｉＭＯ−３−Ｘ
１，ｉＭＯ−３−Ｐ１，ｉＭＯ−３−Ｐ２と称す。これ
ら３株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体のク
ラス・サブクラス、Ｌ鎖の型を次の測定試験で決定し
た。

【００５２】〔測定試験〕『抗イディオタイプ抗体』の
クラス・サブクラスは、次のようにして決定した。マウ
スモノクローナル抗体アイソタイピング・キット（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ社製）を用いたイムノ・ブロット法によっ
て、ｉＭＯ３−Ｘ１株，ｉＭＯ３−Ｐ１株及びｉＭＯ−
３−Ｐ２株が産生した免疫グロブリンのクラス・サブク
ラスを検討した結果、ｉＭＯ−３−Ｘ１株，ｉＭＯ−３
−Ｐ１株及びｉＭＯ−３−Ｐ２株が産生したモノクロー
ナル抗体（ｉＭＯ−３−Ｘ１，ｉＭＯ−３−Ｐ１及びｉ
ＭＯ−３−Ｐ２）は、いずれもκ型Ｌ鎖を有するＩｇＧ
_１に属する抗体であることがわかった。

【００５３】実施例４〔フラスコ培養による『抗イディ
オタイプ抗体』の生産〕 １５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養して得
たｉＭＯ−３−Ｘ１株の培養細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ
１６４０培地（ＦＣＳを含まない）に移しかえて、殆ど
全ての細胞が死滅する直前まで培養した。『抗モルヒネ
抗体』に対する『抗イディオタイプ抗体』（ｉＭＯ−３
−Ｘ１）は、培養液を遠心分離（１，５００Ｇ、５分
間）して得られた上清中に５０μｇ／ｍｌ（一次元平板
免疫拡散法により測定）含有されていた。

【００５４】実施例５〔マウス腹腔内における『抗イデ
ィオタイプ抗体』の生産〕 『抗モルヒネ抗体』に対する大量の『抗イディオタイプ
抗体』を得るために、マウス腹腔内でｉＭＯ−３−Ｘ１
株の細胞を培養した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、８周
齢、２週間前にプリスタン０．５ｍｌを腹腔内に投与し
ておく）の腹腔内に、ｉＭＯ−３−Ｘ１株の細胞を２×
１０^６個浮遊させた０．５ｍｌのＰＢＳを投与した。こ
のマウスの体重は、１週間目頃から顕著な増加を示し、
細胞投与から７、９および１１日目に１９Ｇの注射針を
用いて腹水を採取した（全採取量；６ｍｌ／匹）。そし
て、この腹水を遠心分離（１，５００Ｇ、５分間）し
て、腹水上清を得た。

【００５５】『抗モルヒネ抗体』に対する『抗イディオ
タイプ抗体』（ｉＭＯ−３−Ｘ１）は、この腹水上清中
に１０ｍｇ／ｍｌ（一次元平板免疫拡散法により測定）
含有されていた。参考例１の『抗モルヒネ抗体』の精製
と同様にして、『抗イディオタイプ抗体』を精製するこ
とによって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いたス
ラブゲル電気泳動で高純度であることがわかった。

【００５６】実施例６〔モルヒネの測定〕 （１）標識物質で標識した『抗モルヒネ抗体』及び『抗
イディオタイプ抗体』の作製 酵素標識『抗モルヒネ抗体』はＭＯ−５株（微工研条寄
１９１２号）が産生した精製抗体ＭＯ−５を用いて、ま
た、酵素標識『抗イディオタイプ抗体』は、ｉＭＯ−３
−Ｘ１株（微工研条寄１１９３３号）が産生した精製抗
体ｉＭＯ−３−Ｘ１を用いて、次に示すようなマレイミ
ド法によって作製した。まず、この抗体（４ｍｇ）を
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）（１ｍｌ）に溶
解した。この溶液に同緩衝液で３回洗浄した固定化ペプ
シン〔ステロジーン社製。１００μｌ（０．３〜０．４
ｍｇのペプシンを固定）〕を加え、３７℃で６時間振と
うして反応させた。その後、１Ｎ水酸化ナトリウムを少
量加えてｐＨを６〜７に調製して反応を停止させた。

【００５７】この反応液を遠心分離（２，０００Ｇ、１
分間）によって固定化ペプシンを除去し、得られた上澄
みをモルカット３００００（ミリポア社製）で限外濾過
し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で５００μｌ
とした。次に、この溶液の４７０μｌに０．１Ｍメルカ
プトエチルアミン溶液〔５ｍＭのエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）〕（５０μｌ）を加え、３７℃で９０分
間静置して反応させた。その後、ＰＤ−１０カラム（フ
ァルマシア社製）を用いてメルカプトエチルアミンを除
去し、得られた目的画分をモルカット１００００（ミリ
ポア社製）で限外濾過し、０．１Ｍリン酸緩衝液（５ｍ
ＭのＥＤＴＡを含む。ｐＨ６．０）で９００μｌとし
た。このようにして、ここで使用した抗体のＦｃ部分を
除去したＦａｂ’溶液を得た（このＦａｂ’はチオール
基を有す）。そして、この溶液の２８０ｎｍにおける吸
光度からＦａｂ’の濃度を算出した（０．１％溶液の２
８０ｎｍにおける吸光度を１．４８とした）。

【００５８】一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ（４ｍ
ｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（１ｍｌ）
に溶解し、これに５０ｍＭスルホサクシンイミジル−４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート（以下、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣと略記す
る）溶液〔０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶
解〕（６０μｌ）を加えて３０℃で１時間静置して反応
させた。反応後直ちに、モルカット１００００で限外濾
過し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で６００μ
ｌとした。このようにして、ペルオキシダーゼ−（ｓｕ
ｌｆｏ−ＳＭＣＣ）溶液を得た。そして、この４０３ｎ
ｍにおける吸光度からペルオキシダーゼ−（ｓｕｌｆｏ
−ＳＭＣＣ）濃度を算出した（０．１％溶液の４０３ｎ
ｍにおける吸光度を２．２８とした）。以上のようにし
て得られた抗体のＦａｂ’溶液とペルオキシダーゼ−
（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）溶液とを両者のモル比が１対
１になるように混合し（ＥＤＴＡの終濃度は２．５ｍ
Ｍ）、４℃で１６時間反応させた後に、５０ｍＭのＮ−
エチルマレイミド溶液〔５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）〕（１０μｌ）を加えて
反応を停止した。この反応液をコンカナバリンＡセファ
ロース（ファルマシア社製）を充填したカラムに通して
未反応のＦａｂ’を除去した。この溶液をリン酸緩衝生
理食塩水（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で塩化
ナトリウムを０．１４Ｍとした溶液。以下、ＰＢＳと略
記する。）を用いて４℃で一晩透析し、目的とする酵素
標識『抗モルヒネ抗体』又は酵素標識『抗イディオタイ
プ抗体』を得た。モルヒネを測定する際には、これらの
原液を『希釈液』〔１％ＢＳＡを含んだ０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）〕で適当に希釈して用いた。

【００５９】（２）酵素標識『抗イディオタイプ抗体』
を用いたモルヒネの検量線の作製 参考例１の『抗モルヒネ抗体』をプロテインＧカラム
（ファルマシア社製）〔流出液には５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ６．８）、溶出液には０．２Ｍ塩酸−グ
リシン緩衝液（ｐＨ２．５）を使用。〕を用いて精製す
ることによってさらに高純度の『抗モルヒネ抗体』を得
た。この『抗モルヒネ抗体』溶液（１０μｇ／ｍｌ、Ｐ
ＢＳ溶液）を固相支持体（Ｎｕｎｃ社製のポリスチレン
製のマイクロタイタープレート）の各分析ウェルに１０
０μｌづつ分注し、４℃下一晩静置して『抗モルヒネ抗
体』を固定化した。次に、このプレートを洗浄液（０．
０１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、プレ
ートへの酵素標識『抗イディオタイプ抗体』の非特異的
な吸着を防ぐためにブロッキング液（０．５％ＢＳＡ、
５％サッカロース、１ｍＭ塩化マグネシウム及び０．０
１％のケーソンＣＧを含むＰＢＳ）を各分析ウェルに１
００μｌづつ分注し、室温下１時間静置した。次に、洗
浄液で洗浄後、『標準モルヒネ溶液』（『希釈液』を用
いて調製した０〜３２ｎｇ／ｍｌのモルヒネ溶液。）
（５０μｌ）を加えた後、前記（１）の酵素標識『抗イ
ディオタイプ抗体』溶液（５０μｌ）を加えて攪拌し、
室温下で１時間静置した。

【００６０】次に、洗浄液で同ウェルを洗浄後、『基質
溶液』（２０ｍｇのｏ−フェニレンジアミンと１０μｌ
の３５％Ｈ_２Ｏ_２をｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸緩衝
液２５ｍｌに溶解した溶液）を同ウェルに１００μｌづ
つ分注し、遮光して室温下で１５分間静置した後に２Ｎ
硫酸を５０μｌづつ分注して酵素反応を停止させ、マイ
クロプレート光度計を用いて、その反応液の４９２ｎｍ
における吸光度を測定した。そのようにして得られたモ
ルヒネの検量線を図１に示す。

【００６１】（３）酵素標識『抗モルヒネ抗体』を用い
たモルヒネの検量線の作製 前記（２）において、酵素標識『抗イディオタイプ抗
体』の代わりに酵素標識『抗モルヒネ抗体』を用い、
『抗モルヒネ抗体』の代わりに実施例５の『抗イディオ
タイプ抗体』を用い、『標準モルヒネ溶液』としては
『希釈液』を用いて調製した０〜１，０００ｎｇ／ｍｌ
のモルヒネ溶液を用いて、前記（２）と同様の操作によ
ってモルヒネの検量線を作成した。その結果を図２に示
す。

【００６２】（４）モルヒネの添加回収試験 前記（２）において、『標準モルヒネ溶液』の代わりに
健常人血清（化血研社製）にモルヒネを添加した溶液
（１０、２０、５０、又は１００ｎｇ／ｍｌ）を『希釈
液』で１０倍希釈した溶液を用いて、モルヒネの量を測
定した結果、添加したモルヒネ量（計算値）と実際に測
定の結果得られたモルヒネ量（実測値）とは、非常に近
似した値であった。その結果を表１に示す。

【００６３】

【表１】

【００６４】

【発明の効果】本発明の抗モルヒネ抗体の抗イディオタ
イプ抗体を利用したモルヒネの免疫学的測定法によれ
ば、モルヒネを簡単、かつ迅速に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例６の（２）において、『抗モルヒネ抗
体』に対して、酵素標識『抗イディオタイプ抗体』とモ
ルヒネとを競争的に反応させて得られたモルヒネの検量
線である。

【図２】実施例６の（３）において、『抗イディオタイ
プ抗体』に対して、酵素標識『抗モルヒネ抗体』とモル
ヒネとを競争的に反応させて得られたモルヒネの検量線
である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 8310−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 宇佐川 崇 山口県宇部市大字小串1978番地の５ 宇部 興産株式会社宇部研究所内 (72)発明者 瀬戸口 宏行 山口県宇部市大字小串1978番地の５ 宇部 興産株式会社宇部研究所内 (72)発明者 宇関 典子 山口県宇部市大字小串1978番地の５ 宇部 興産株式会社宇部研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗モルヒネ抗体の抗イディオタイプ抗
   体。
2. 【請求項２】 抗モルヒネ抗体を免疫して得られたリン
   パ球とミエローマ細胞とを細胞融合することによって得
   られたハイブリドーマ株を培養することを特徴とする請
   求項１に記載の抗イディオタイプ抗体の製法。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のハイブリドーマ株。
4. 【請求項４】 固相支持体に固定化した請求項１に記載
   の抗モルヒネ抗体を、モルヒネ、又は標識物質で標識し
   た請求項１に記載の抗イディオタイプ抗体と競争的に反
   応させることを特徴とするモルヒネの測定法。
5. 【請求項５】 固相支持体に固定化した請求項１に記載
   の抗イディオタイプ抗体を、モルヒネ、又は標識物質で
   標識した請求項１に記載の抗モルヒネ抗体と競争的に反
   応させることを特徴とするモルヒネの測定法。