JPH067198A - レーザー誘導された蛍光によるｄｎａ断片のサイジングおよびソーティング - Google Patents
レーザー誘導された蛍光によるｄｎａ断片のサイジングおよびソーティングInfo
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- JPH067198A JPH067198A JP5037039A JP3703993A JPH067198A JP H067198 A JPH067198 A JP H067198A JP 5037039 A JP5037039 A JP 5037039A JP 3703993 A JP3703993 A JP 3703993A JP H067198 A JPH067198 A JP H067198A
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、複数のヌクレオチドを含有するＤ
ＮＡ断片を誘導された蛍光によってサイジングする方法
であって、ＤＮＡ小片を該ＤＮＡ小片内の予め選別され
た部位で断片化することにより複数のＤＮＡ断片を生じ
させる工程、該ＤＮＡ小片または該ＤＮＡ断片を該ヌク
レオチドを化学量論的に染色するのに有効な第１の色素
で染色する工程および該第１の色素から各々の該ＤＮＡ
断片中のヌクレオチド数に相関的に関連する蛍光強度シ
グナルを発生させるために染色を行なったのちに、該Ｄ
ＮＡ断片を蛍光的に検査する工程からなるＤＮＡ断片の
サイジング方法を提供する。 【効果】 本発明により、ＤＮＡ小片から作製されるＤ
ＮＡ断片が、従来より長い断片のままで短時間でサイジ
ングされ、ソーティングシステムを用いることにより、
該サイジングとともにＤＮＡ断片のソーティングも可能
となる。
ＮＡ断片を誘導された蛍光によってサイジングする方法
であって、ＤＮＡ小片を該ＤＮＡ小片内の予め選別され
た部位で断片化することにより複数のＤＮＡ断片を生じ
させる工程、該ＤＮＡ小片または該ＤＮＡ断片を該ヌク
レオチドを化学量論的に染色するのに有効な第１の色素
で染色する工程および該第１の色素から各々の該ＤＮＡ
断片中のヌクレオチド数に相関的に関連する蛍光強度シ
グナルを発生させるために染色を行なったのちに、該Ｄ
ＮＡ断片を蛍光的に検査する工程からなるＤＮＡ断片の
サイジング方法を提供する。 【効果】 本発明により、ＤＮＡ小片から作製されるＤ
ＮＡ断片が、従来より長い断片のままで短時間でサイジ
ングされ、ソーティングシステムを用いることにより、
該サイジングとともにＤＮＡ断片のソーティングも可能
となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ分析に関する。さ
らにはＤＮＡ断片のサイズ分布分析およびソーティング
に関する。
らにはＤＮＡ断片のサイズ分布分析およびソーティング
に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒト
ゲノムは22対の染色体に加えて２本の常染色体を形成す
る約30億のヌクレオチドからなり、各々は５千万から５
億のヌクレオチドの連続したＤＮＡ小片からなる。ヒト
ゲノムを形成するＤＮＡの構成および配列はＤＮＡを供
給するソースについて唯一の情報を含有する。この情報
を入手するための１つの方法は、既知の特徴を有する部
位でＤＮＡを断片化し、ついで断片のサイズの分布を分
析する、すなわち、各部位間の各断片におけるヌクレオ
チド数を分析することである。ゲノム構造の多型性は、
ＤＮＡ小片の断片化からえられる断片のサイズにかなり
の変化をもたらし、他人と区別させたり、ヒトの遺伝病
への感染のしやすさを評価する基礎を作る。これらの多
型性の分析はしばしばＤＮＡフィンガープリントとして
言及される。
ゲノムは22対の染色体に加えて２本の常染色体を形成す
る約30億のヌクレオチドからなり、各々は５千万から５
億のヌクレオチドの連続したＤＮＡ小片からなる。ヒト
ゲノムを形成するＤＮＡの構成および配列はＤＮＡを供
給するソースについて唯一の情報を含有する。この情報
を入手するための１つの方法は、既知の特徴を有する部
位でＤＮＡを断片化し、ついで断片のサイズの分布を分
析する、すなわち、各部位間の各断片におけるヌクレオ
チド数を分析することである。ゲノム構造の多型性は、
ＤＮＡ小片の断片化からえられる断片のサイズにかなり
の変化をもたらし、他人と区別させたり、ヒトの遺伝病
への感染のしやすさを評価する基礎を作る。これらの多
型性の分析はしばしばＤＮＡフィンガープリントとして
言及される。
【０００３】ＤＮＡフィンガープリントは、法医学の同
定、医学的な遺伝学、環境変異原の効果のモニターおよ
び基礎的な分子生物学研究にさらに適用される重要な医
学的診断の道具である。ＤＮＡフィンガープリントの１
つの形態は、制限酵素が特定のソースからＤＮＡ小片を
ＤＮＡのより短い小片または断片に切るために用いられ
る「制限酵素で切断される断片の長さの多型性(restric
tion fragment lengthpolymorphism)」（ＲＦＬＰ）を
含む。ＤＮＡ試料が制限酵素によって分解されるばあい
には、ＲＦＬＰは断片のサイズによって並べられた特有
なＤＮＡ配列（ＤＮＡフィンガープリント）を含む、Ｄ
ＮＡ断片の特有のパターンを提供する。多数の既知の制
限酵素があり、各々４から12塩基対の特定のＤＮＡ配列
を認識し、そこでＤＮＡを切断し、その結果、より小さ
なＤＮＡ断片がえられる。
定、医学的な遺伝学、環境変異原の効果のモニターおよ
び基礎的な分子生物学研究にさらに適用される重要な医
学的診断の道具である。ＤＮＡフィンガープリントの１
つの形態は、制限酵素が特定のソースからＤＮＡ小片を
ＤＮＡのより短い小片または断片に切るために用いられ
る「制限酵素で切断される断片の長さの多型性(restric
tion fragment lengthpolymorphism)」（ＲＦＬＰ）を
含む。ＤＮＡ試料が制限酵素によって分解されるばあい
には、ＲＦＬＰは断片のサイズによって並べられた特有
なＤＮＡ配列（ＤＮＡフィンガープリント）を含む、Ｄ
ＮＡ断片の特有のパターンを提供する。多数の既知の制
限酵素があり、各々４から12塩基対の特定のＤＮＡ配列
を認識し、そこでＤＮＡを切断し、その結果、より小さ
なＤＮＡ断片がえられる。
【０００４】いったんＤＮＡ小片を多数の断片に切断す
ると、通常はその断片をサイズによって分離するために
電気泳動を用いる。電界は断片を含むゲルを横切って配
置され、より大きな断片よりもより小さな断片がより速
く動くようになる。ゲル電気泳動はよく知られた技法で
あり、分析においてＤＮＡ小片の個々のソースを同定す
るためのフィンガープリントを形成する、ＤＮＡ断片の
バンドパターンをえるために用いられている。通常、特
異的なＤＮＡ配列のバンドパターンは分離されたＤＮＡ
断片に放射性ＤＮＡプローブを結合し、好ましいフィル
ムを、放射能で標識された断片にさらすことによって視
覚化される。たとえば、ジェー アイトーントン(J.I.
Thornton) 、「デーエヌエー プロフィーリング(DNA P
rofiling) 」、シー アンド イーエヌ(C & EN)、18〜
30頁（1989年11月20日）およびケー ヘイン(K. Hein
e)、「デーエヌエー オン トライアル(DNA on Tria
l)」、アウトルック(Outlook)26 巻：４、８〜14頁（19
89年）を参照されたい。１つの変形として、電気泳動用
ゲルにおける既知の軌道の長さ(path length) に沿った
断片の移動時間をオートメーション化された蛍光検出に
よって測定するために、断片の末端が蛍光色素を用いて
標識される。たとえば、エー ヴィ カラノ(A.V. Carr
ano)、「ア ハイ−リゾリューション、フルオレッセン
ス−ベースド、セミオートメーティッド メソッド フ
ォー デーエヌエー フィンガープリンティング(A Hig
h-Resolution, Fluorescence-Based, Semiautomated Me
thod forDNA Fingerprinting)」、４ ゲノミックス(Ge
nomics)、129 〜136 頁（1989年）を参照されたい。
ると、通常はその断片をサイズによって分離するために
電気泳動を用いる。電界は断片を含むゲルを横切って配
置され、より大きな断片よりもより小さな断片がより速
く動くようになる。ゲル電気泳動はよく知られた技法で
あり、分析においてＤＮＡ小片の個々のソースを同定す
るためのフィンガープリントを形成する、ＤＮＡ断片の
バンドパターンをえるために用いられている。通常、特
異的なＤＮＡ配列のバンドパターンは分離されたＤＮＡ
断片に放射性ＤＮＡプローブを結合し、好ましいフィル
ムを、放射能で標識された断片にさらすことによって視
覚化される。たとえば、ジェー アイトーントン(J.I.
Thornton) 、「デーエヌエー プロフィーリング(DNA P
rofiling) 」、シー アンド イーエヌ(C & EN)、18〜
30頁（1989年11月20日）およびケー ヘイン(K. Hein
e)、「デーエヌエー オン トライアル(DNA on Tria
l)」、アウトルック(Outlook)26 巻：４、８〜14頁（19
89年）を参照されたい。１つの変形として、電気泳動用
ゲルにおける既知の軌道の長さ(path length) に沿った
断片の移動時間をオートメーション化された蛍光検出に
よって測定するために、断片の末端が蛍光色素を用いて
標識される。たとえば、エー ヴィ カラノ(A.V. Carr
ano)、「ア ハイ−リゾリューション、フルオレッセン
ス−ベースド、セミオートメーティッド メソッド フ
ォー デーエヌエー フィンガープリンティング(A Hig
h-Resolution, Fluorescence-Based, Semiautomated Me
thod forDNA Fingerprinting)」、４ ゲノミックス(Ge
nomics)、129 〜136 頁（1989年）を参照されたい。
【０００５】しかしながら、ゲル電気泳動を使用するに
あたり、とくに大きな断片サイズおよび放射性標識が含
まれるばあいはいくつかの限定がある。この両者のばあ
い、電気泳動によって分離する方法では大きなサイズの
断片を分解するためにかなりの時間がかかる。放射性プ
ローブから像を現像することは追加の時間を消費する工
程となり、放射性物質と関連づけて考えられる健康に対
する危険性および環境問題が生じる。加えて、断片サイ
ズの分布は対数的であるので、大きな断片間の分離、す
なわち分解は小さな断片より少ない。また、電気泳動は
認識できるパターンをえるために比較的大量のＤＮＡを
必要とする。
あたり、とくに大きな断片サイズおよび放射性標識が含
まれるばあいはいくつかの限定がある。この両者のばあ
い、電気泳動によって分離する方法では大きなサイズの
断片を分解するためにかなりの時間がかかる。放射性プ
ローブから像を現像することは追加の時間を消費する工
程となり、放射性物質と関連づけて考えられる健康に対
する危険性および環境問題が生じる。加えて、断片サイ
ズの分布は対数的であるので、大きな断片間の分離、す
なわち分解は小さな断片より少ない。また、電気泳動は
認識できるパターンをえるために比較的大量のＤＮＡを
必要とする。
【０００６】少量のＤＮＡのみ（おそらく一本鎖のみ）
を用い、短時間でサイズ情報を提供し、さらに断片サイ
ズ間で高い分解能をもつ、ＤＮＡ断片のサイズ分布技法
を提供することが望ましい。従来の技術のこれらのおよ
び他の問題を改善すべく、ＤＮＡ小片からＤＮＡ断片サ
イズの分布をうるためにフローサイトメトリーをもとに
した技法を用いて本発明を完成するにいたった。
を用い、短時間でサイズ情報を提供し、さらに断片サイ
ズ間で高い分解能をもつ、ＤＮＡ断片のサイズ分布技法
を提供することが望ましい。従来の技術のこれらのおよ
び他の問題を改善すべく、ＤＮＡ小片からＤＮＡ断片サ
イズの分布をうるためにフローサイトメトリーをもとに
した技法を用いて本発明を完成するにいたった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は複数
のヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片を誘導された蛍光
によってサイジングする方法であって、ＤＮＡ小片を該
ＤＮＡ小片内の予め選別された部位で断片化することに
より複数のＤＮＡ断片を生じさせる工程、該ＤＮＡ小片
または該ＤＮＡ断片を該ヌクレオチドを化学量論的に染
色するのに有効な第１の色素で染色する工程および該第
１の色素から各々の該ＤＮＡ断片中のヌクレオチド数に
相関的に関連する蛍光強度シグナルを発生させるために
染色を行なったのちに、該ＤＮＡ断片を蛍光的に検査す
る工程からなるＤＮＡ断片のサイジング方法を提供す
る。
のヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片を誘導された蛍光
によってサイジングする方法であって、ＤＮＡ小片を該
ＤＮＡ小片内の予め選別された部位で断片化することに
より複数のＤＮＡ断片を生じさせる工程、該ＤＮＡ小片
または該ＤＮＡ断片を該ヌクレオチドを化学量論的に染
色するのに有効な第１の色素で染色する工程および該第
１の色素から各々の該ＤＮＡ断片中のヌクレオチド数に
相関的に関連する蛍光強度シグナルを発生させるために
染色を行なったのちに、該ＤＮＡ断片を蛍光的に検査す
る工程からなるＤＮＡ断片のサイジング方法を提供す
る。
【０００８】
【実施例】前記およびそのほかの課題を達成するため
に、本発明の目的にしたがって、実施例が示され、かつ
以下に概略的に説明されるように、本発明の方法はＤＮ
Ａ断片の長さを定量するために誘導された蛍光を使用す
ることからなる。ＤＮＡ小片は複数のＤＮＡ断片を産生
するために予め選択された部位で断片化される。すべて
のＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片に沿って化学量論的にヌク
レオチドを染色するのに効果的な色素で処理する。その
のち、染色されたＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片のひとつひ
とつについてヌクレオチド数に機能的に関連する出力の
発生を蛍光的に調べられる。１つの出力において、各断
片からの蛍光発光の強度が断片の長さに直接的に比例す
る。
に、本発明の目的にしたがって、実施例が示され、かつ
以下に概略的に説明されるように、本発明の方法はＤＮ
Ａ断片の長さを定量するために誘導された蛍光を使用す
ることからなる。ＤＮＡ小片は複数のＤＮＡ断片を産生
するために予め選択された部位で断片化される。すべて
のＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片に沿って化学量論的にヌク
レオチドを染色するのに効果的な色素で処理する。その
のち、染色されたＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片のひとつひ
とつについてヌクレオチド数に機能的に関連する出力の
発生を蛍光的に調べられる。１つの出力において、各断
片からの蛍光発光の強度が断片の長さに直接的に比例す
る。
【０００９】本発明によりＤＮＡ多型性が特徴づけられ
る。すなわち、既知の配列部位でＤＮＡを切断するよう
に選ばれた１つまたはそれより多くの酵素を用いて、選
択されたＤＮＡ小片を断片化することによってえられる
ＤＮＡ断片のサイズを、迅速に分析することを提供する
フローサイトメトリーにもとづく技法を用いて「フィン
ガープリントされる(fingerprinted) 」のである。サイ
ジングの手順の一例は以下のようである。
る。すなわち、既知の配列部位でＤＮＡを切断するよう
に選ばれた１つまたはそれより多くの酵素を用いて、選
択されたＤＮＡ小片を断片化することによってえられる
ＤＮＡ断片のサイズを、迅速に分析することを提供する
フローサイトメトリーにもとづく技法を用いて「フィン
ガープリントされる(fingerprinted) 」のである。サイ
ジングの手順の一例は以下のようである。
【００１０】１． 選択されたソースからえたＤＮＡ小
片を酵素分解によって断片化し、ＤＮＡ断片の溶液をえ
る。ＤＮＡ小片からなるヌクレオチドは染色されてもよ
い。すなわち、ＤＮＡ小片が断片化される前または後の
いずれかに適当な蛍光色素で標識される。
片を酵素分解によって断片化し、ＤＮＡ断片の溶液をえ
る。ＤＮＡ小片からなるヌクレオチドは染色されてもよ
い。すなわち、ＤＮＡ小片が断片化される前または後の
いずれかに適当な蛍光色素で標識される。
【００１１】２． いつでも蛍光励起体積(fluorescenc
e excitation volume)中に１断片のみがえられるよう
に、染色されたＤＮＡ断片を効果的な濃度および速度で
検出装置に通す。
e excitation volume)中に１断片のみがえられるよう
に、染色されたＤＮＡ断片を効果的な濃度および速度で
検出装置に通す。
【００１２】３． 各染色されたＤＮＡ断片を、励起体
積で、たとえばレーザー照射によって励起させ、その結
果として生じる蛍光強度を測定する。誘導された蛍光の
強度は断片における染色の量の測量であると同時に断片
の長さの測量である。
積で、たとえばレーザー照射によって励起させ、その結
果として生じる蛍光強度を測定する。誘導された蛍光の
強度は断片における染色の量の測量であると同時に断片
の長さの測量である。
【００１３】４． それぞれ異なる強度での断片数は、
選択された１つまたはそれより多くの酵素によってＤＮ
Ａ小片から産生される各長さの断片数の分析をもたら
す。
選択された１つまたはそれより多くの酵素によってＤＮ
Ａ小片から産生される各長さの断片数の分析をもたら
す。
【００１４】ＤＮＡ小片はまず、いくつかの適するソー
ス、たとえば血液、組織試料、精液、研究室での研究標
品などから選択されてもよい。ＤＮＡ小片はそののち、
分析の特定な適用のために選ばれた酵素を用いて断片化
される。ある特定に有効な型の酵素は特定の部位、すな
わち特定のヌクレオチド配列を認識する制限エンドヌク
レアーゼであり、同定された配列の内部でＤＮＡ小片を
切断する。たとえば、ＥcoＲＩ酵素は２本鎖の小片の認
識部位 ・・・ＧＡＡＴＴＣ・・・ ・・・ＣＴＴＡＡＧ・・・ で切断する。数百の異なる制限酵素とそれらのそれぞれ
の切断部位が知られている。単一のソースからえられる
同一のＤＮＡ小片を異なる酵素で分解し、一群のフィン
ガープリントをえられうることは価値のあることであろ
う。また、ＤＮＡ小片を多数の酵素で分解し、さらに断
片サイズの分布分析を特徴づけてもよい。
ス、たとえば血液、組織試料、精液、研究室での研究標
品などから選択されてもよい。ＤＮＡ小片はそののち、
分析の特定な適用のために選ばれた酵素を用いて断片化
される。ある特定に有効な型の酵素は特定の部位、すな
わち特定のヌクレオチド配列を認識する制限エンドヌク
レアーゼであり、同定された配列の内部でＤＮＡ小片を
切断する。たとえば、ＥcoＲＩ酵素は２本鎖の小片の認
識部位 ・・・ＧＡＡＴＴＣ・・・ ・・・ＣＴＴＡＡＧ・・・ で切断する。数百の異なる制限酵素とそれらのそれぞれ
の切断部位が知られている。単一のソースからえられる
同一のＤＮＡ小片を異なる酵素で分解し、一群のフィン
ガープリントをえられうることは価値のあることであろ
う。また、ＤＮＡ小片を多数の酵素で分解し、さらに断
片サイズの分布分析を特徴づけてもよい。
【００１５】ＤＮＡ小片の選択された酵素による断片
化、すなわち、分解はよく知られた方法であり、至適な
分解条件は酵素の製造業者によって特定されている。0.
2 〜１μｇのＤＮＡを用いる一般的な制限酵素法は、ジ
ェイ サムブロック(J. Sambrook) ら、モレキュラー
クローニング(Molecular Cloning) 、5.28〜5.33頁（19
89年）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ー プレス(Cold SpringHarbor Laboratory Press) に
以下のように記載されている。
化、すなわち、分解はよく知られた方法であり、至適な
分解条件は酵素の製造業者によって特定されている。0.
2 〜１μｇのＤＮＡを用いる一般的な制限酵素法は、ジ
ェイ サムブロック(J. Sambrook) ら、モレキュラー
クローニング(Molecular Cloning) 、5.28〜5.33頁（19
89年）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ー プレス(Cold SpringHarbor Laboratory Press) に
以下のように記載されている。
【００１６】１． 滅菌したミクロフュージ チューブ
(microfuge tube)にＤＮＡ溶液を入れ、必要量の水と混
合して18μｌの体積にする。
(microfuge tube)にＤＮＡ溶液を入れ、必要量の水と混
合して18μｌの体積にする。
【００１７】２． ２μｌの適当な制限酵素分解用緩衝
液を加え、チューブを軽くたたくこと(tapping) により
混合する。一例として、緩衝液は以下のように作成され
る。
液を加え、チューブを軽くたたくこと(tapping) により
混合する。一例として、緩衝液は以下のように作成され
る。
【００１８】 200ｍＭ グルタミン酸カリウム 50ｍＭ トリス−酢酸塩（ｐＨ7.5 ） 20ｍＭ 酢酸マグネシウム 100μｇ／ml ウシ血清アルブミン（分画Ｖ、シグマ
社製） １ｍＭ β−メルカプトエタノール ３． １〜２単位の制限酵素を加え、チューブを軽くた
たくことによって混合する。ここで、１単位の酵素と
は、推奨される緩衝液中、推奨される温度で20μｌの反
応において１時間で１μｇのＤＮＡの分解を完了するた
めに必要とされる量として定義される。
社製） １ｍＭ β−メルカプトエタノール ３． １〜２単位の制限酵素を加え、チューブを軽くた
たくことによって混合する。ここで、１単位の酵素と
は、推奨される緩衝液中、推奨される温度で20μｌの反
応において１時間で１μｇのＤＮＡの分解を完了するた
めに必要とされる量として定義される。
【００１９】４． 混合物を適当な温度で必要な時間イ
ンキュベートする。
ンキュベートする。
【００２０】５． 最終濃度が10ｍＭとなるように0.5
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0 ）を加えることにより、反応を
停止する。
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0 ）を加えることにより、反応を
停止する。
【００２１】ＤＮＡは、さらなる制限酵素分解を加えた
ほかの種々の技法によって断片化することもできる。
ほかの種々の技法によって断片化することもできる。
【００２２】１． ＤＮアーゼ過敏性(hypersensitivit
y)部位（ＤＮアーゼフットプリント） ＤＮアーゼによるクロマチン分解は、ＤＮＡに結合し、
その結合した部位でのＤＮアーゼによるＤＮＡの切断が
妨げられるようなタンパク質の違いによって種々の長さ
の断片を産生するであろう（デー ジェイ ガラス(D.
J.Galas) ら、ヌクレイック アシッド リサーチ(Nucl
eic Acids Res.)、５巻、3157頁（1987年）参照）。
y)部位（ＤＮアーゼフットプリント） ＤＮアーゼによるクロマチン分解は、ＤＮＡに結合し、
その結合した部位でのＤＮアーゼによるＤＮＡの切断が
妨げられるようなタンパク質の違いによって種々の長さ
の断片を産生するであろう（デー ジェイ ガラス(D.
J.Galas) ら、ヌクレイック アシッド リサーチ(Nucl
eic Acids Res.)、５巻、3157頁（1987年）参照）。
【００２３】２． １対の塩基対の誤った組み合わせに
おけるＲＮアーゼの切断 蛍光で標識したＲＮＡプローブを対象のＤＮＡ配列の正
常な型または野生型に対して相補的に合成する。そのの
ちに、この相補的なプローブを分析される目標のＤＮＡ
にアニーリングする。蛍光標識したプローブ鎖と目標の
ＤＮＡ鎖の間に１対のヌクレオチドの誤りの組み合わせ
があるかどうかを測定するために、ＲＮＡとＤＮＡのハ
イブリッドをＲＮアーゼＡで処理する。ＲＮアーゼＡは
ＲＮＡの１本鎖領域を特異的に切断する。こうしてＲＮ
ＡとＤＮＡのハイブリッドの蛍光標識したＲＮＡ鎖にお
ける１対の塩基対の誤った組み合わせが切断される（ア
ール エム マイヤーズ(R.M. Myers)ら、サイエンス(S
cience)230巻、1242頁（1985年）およびイー エフ ウ
ィンター(E.F. Winter) ら、プロシーディング オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ
ユナイテッド ステイト オブ アメリカを用いた(P
roc. Natl. Acad. Sci.)82巻、7525頁（1985年）参
照）。
おけるＲＮアーゼの切断 蛍光で標識したＲＮＡプローブを対象のＤＮＡ配列の正
常な型または野生型に対して相補的に合成する。そのの
ちに、この相補的なプローブを分析される目標のＤＮＡ
にアニーリングする。蛍光標識したプローブ鎖と目標の
ＤＮＡ鎖の間に１対のヌクレオチドの誤りの組み合わせ
があるかどうかを測定するために、ＲＮＡとＤＮＡのハ
イブリッドをＲＮアーゼＡで処理する。ＲＮアーゼＡは
ＲＮＡの１本鎖領域を特異的に切断する。こうしてＲＮ
ＡとＤＮＡのハイブリッドの蛍光標識したＲＮＡ鎖にお
ける１対の塩基対の誤った組み合わせが切断される（ア
ール エム マイヤーズ(R.M. Myers)ら、サイエンス(S
cience)230巻、1242頁（1985年）およびイー エフ ウ
ィンター(E.F. Winter) ら、プロシーディング オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ
ユナイテッド ステイト オブ アメリカを用いた(P
roc. Natl. Acad. Sci.)82巻、7525頁（1985年）参
照）。
【００２４】３． ＲecＡを用いた制限エンドヌクレア
ーゼ切断 ＲecＡタンパク質で覆われた短いオリゴヌクレオチドを
相補的な目標のＤＮＡ配列にアニーリングする。ＤＮＡ
とオリゴヌクレオチドのハイブリッドをＥcoＲＩメチラ
ーゼ酵素で処理する。オリゴヌクレオチドで保護されて
いないＥcoＲＩ部位はメチル化され、一方、オリゴヌク
レオチドで保護されたＥcoＲＩ部位は影響を受けないま
ま残る。ＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼは保護された
（すなわち、メチル化されていない）部位でのみ切断す
る。この方法は500,000 塩基対より大きい断片を産生す
るために用いられる（エル ジェイ フェリン(L.J. Fe
rrin) 、サイエンス、254 巻、1494頁（1991年）参
照）。
ーゼ切断 ＲecＡタンパク質で覆われた短いオリゴヌクレオチドを
相補的な目標のＤＮＡ配列にアニーリングする。ＤＮＡ
とオリゴヌクレオチドのハイブリッドをＥcoＲＩメチラ
ーゼ酵素で処理する。オリゴヌクレオチドで保護されて
いないＥcoＲＩ部位はメチル化され、一方、オリゴヌク
レオチドで保護されたＥcoＲＩ部位は影響を受けないま
ま残る。ＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼは保護された
（すなわち、メチル化されていない）部位でのみ切断す
る。この方法は500,000 塩基対より大きい断片を産生す
るために用いられる（エル ジェイ フェリン(L.J. Fe
rrin) 、サイエンス、254 巻、1494頁（1991年）参
照）。
【００２５】４． ＤＮＡ断片化は酵素分解以外の技法
により行われることもできる。たとえば、異なる振動数
における超音波励起は１群のサイズの分布を産生するの
に用いられてもよい。種々の化学薬品もまたヌクレオチ
ドと反応し、ＤＮＡ小片の断片化に用いられてもよい。
により行われることもできる。たとえば、異なる振動数
における超音波励起は１群のサイズの分布を産生するの
に用いられてもよい。種々の化学薬品もまたヌクレオチ
ドと反応し、ＤＮＡ小片の断片化に用いられてもよい。
【００２６】フローサイトメトリー分析のためには、Ｄ
ＮＡ断片は蛍光色素で染色されなければならない。蛍光
色素はＤＮＡ断片に化学量論的に結合するように選ばれ
る。複合体は異なる方法、すなわち１本鎖ＤＮＡ、２本
鎖ＤＮＡ、特定の塩基対などで形成されてもよい。よく
知られた色素としては、エチジウムブロミド、アクリジ
ンオレンジ、プロピジウムイオダイド、ＤＡＰＩ、ヘキ
スト、クロモマイシン、ミトラマイシン(mithramycin)
、9 アミノアクリジン(9 amino acridine)、エチジウ
ムブロミドヘテロジン(ethidium bromide heterodyne)
、非対称シアニン色素(asymmetric cyanine dyes) 、
またはエネルギー移送用のこれらの色素の組み合わせが
あげられる。選択された１種のまたは複数の色素はＤＮ
Ａ配列に沿って化学量論的にオリゴヌクレオチドと結合
する。すなわち、断片に沿った結合部位は、ＤＮＡの長
さに沿った色素分子の総数がＤＮＡを形成する塩基対の
（bpの）数に比例する、ということである。たとえば、
以下に述べる染色プロトコール下では、ＤＮＡ断片に結
合するエチジウムブロミドの分子数は化学量論的であ
り、塩基対の数の1.5 倍でありうる。たとえば、シー
アール カンター(C.R. Cantor) ら、バイオフィジカル
ケミストリー(Biophysical Chemistry) 、第３章、ザ
ビヘイビアー オブ バイオロジカル マクロモレキ
ュルズ(The Behavior of Biological Macromolecules)
、1251頁（1980年）、ダブリュー エイチフリーマン
アンド カンパニー(W.H. Freeman and Company)中の
「バインディング オブ スモーラー モレキュルズ
トゥー ヌクレイック アシッズ(Binding of Smaller
Molecules to Nucleic Acids) 」が参照される。
ＮＡ断片は蛍光色素で染色されなければならない。蛍光
色素はＤＮＡ断片に化学量論的に結合するように選ばれ
る。複合体は異なる方法、すなわち１本鎖ＤＮＡ、２本
鎖ＤＮＡ、特定の塩基対などで形成されてもよい。よく
知られた色素としては、エチジウムブロミド、アクリジ
ンオレンジ、プロピジウムイオダイド、ＤＡＰＩ、ヘキ
スト、クロモマイシン、ミトラマイシン(mithramycin)
、9 アミノアクリジン(9 amino acridine)、エチジウ
ムブロミドヘテロジン(ethidium bromide heterodyne)
、非対称シアニン色素(asymmetric cyanine dyes) 、
またはエネルギー移送用のこれらの色素の組み合わせが
あげられる。選択された１種のまたは複数の色素はＤＮ
Ａ配列に沿って化学量論的にオリゴヌクレオチドと結合
する。すなわち、断片に沿った結合部位は、ＤＮＡの長
さに沿った色素分子の総数がＤＮＡを形成する塩基対の
（bpの）数に比例する、ということである。たとえば、
以下に述べる染色プロトコール下では、ＤＮＡ断片に結
合するエチジウムブロミドの分子数は化学量論的であ
り、塩基対の数の1.5 倍でありうる。たとえば、シー
アール カンター(C.R. Cantor) ら、バイオフィジカル
ケミストリー(Biophysical Chemistry) 、第３章、ザ
ビヘイビアー オブ バイオロジカル マクロモレキ
ュルズ(The Behavior of Biological Macromolecules)
、1251頁（1980年）、ダブリュー エイチフリーマン
アンド カンパニー(W.H. Freeman and Company)中の
「バインディング オブ スモーラー モレキュルズ
トゥー ヌクレイック アシッズ(Binding of Smaller
Molecules to Nucleic Acids) 」が参照される。
【００２７】エチジウムブロミドを用いて染色する手順
の一例を以下に示す。
の一例を以下に示す。
【００２８】ＤＮＡ試料を１〜５μｇ／ml溶液のエチジ
ウムブロミドおよびＴＥ8.0 緩衝液（ＴＥ8.0 buffer)
を含有する溶液に加える。適する緩衝液はギブコ(GIBC
O) 社から入手され、10ｍＭ トリス−塩酸および１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0 ）である。反応は室温で５〜10
分間で完了する。
ウムブロミドおよびＴＥ8.0 緩衝液（ＴＥ8.0 buffer)
を含有する溶液に加える。適する緩衝液はギブコ(GIBC
O) 社から入手され、10ｍＭ トリス−塩酸および１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0 ）である。反応は室温で５〜10
分間で完了する。
【００２９】染色されたＤＮＡ断片はつぎに、検出領域
を通過し、隣接した断片のサイズを区別するために充分
に分解された、各断片から蛍光強度を測定するために感
度の高い蛍光検出技法を用いて分析される。理論上で
は、所望の分布分析をえるためには、１本のＤＮＡ小片
のみが必要とされるのであるが、典型的な溶液は多くの
ＤＮＡ小片から形成され、相対的なＤＮＡ断片のサイズ
の分布がえられる。ＤＮＡ断片は典型的には、100bp か
ら500,000bp の範囲のサイズを有する。
を通過し、隣接した断片のサイズを区別するために充分
に分解された、各断片から蛍光強度を測定するために感
度の高い蛍光検出技法を用いて分析される。理論上で
は、所望の分布分析をえるためには、１本のＤＮＡ小片
のみが必要とされるのであるが、典型的な溶液は多くの
ＤＮＡ小片から形成され、相対的なＤＮＡ断片のサイズ
の分布がえられる。ＤＮＡ断片は典型的には、100bp か
ら500,000bp の範囲のサイズを有する。
【００３０】フローサイトメーターまたは類似の感度の
高い蛍光検出装置に用いる粒子の連続する流束(flow st
ream) を形成する方法はよく知られている。たとえば、
フルウィラー(Fulwyler)らの1973年１月16日に発行され
た米国特許第3,710,933 号明細書およびエム アール
メラムド(M.R. Melamed)ら、フローサイトメトリーアン
ド ソーティング(Flow Cytometry and Sorting)、第２
版、ウィレイ−リス(Wiley-Liss)、ニューヨーク（1990
年）が参照される。１つの断片のみが励起体積(excitat
ion volume) 中に存在するように、断片が流束中でひっ
つくことのないような効果的な低濃度にするために、Ｄ
ＮＡ断片の希釈溶液を作製する。そののちに、そのＤＮ
Ａ断片の溶液を、１つの断片のレーザーによる励起を一
度にするための検出チャンバーを通過するための薄層状
のシース(laminar sheath)の流束の内に注入する。試料
とシースの流速は、粒子間の分離を維持し、各粒子に励
起光源中で至適時間を提供するように調整される。至適
時間は、サイジングの速度、検出感度および色素標識の
光安定性を考慮して決定される。適する励起光源は、Ｄ
ＮＡ断片の染色に用いられる色素において蛍光が発する
ように選択される。たとえば、エチジウムブロミドに60
0nm 付近のバンドの蛍光を生じさせるためには、488nm
のアルゴンレーザーが効果的である。
高い蛍光検出装置に用いる粒子の連続する流束(flow st
ream) を形成する方法はよく知られている。たとえば、
フルウィラー(Fulwyler)らの1973年１月16日に発行され
た米国特許第3,710,933 号明細書およびエム アール
メラムド(M.R. Melamed)ら、フローサイトメトリーアン
ド ソーティング(Flow Cytometry and Sorting)、第２
版、ウィレイ−リス(Wiley-Liss)、ニューヨーク（1990
年）が参照される。１つの断片のみが励起体積(excitat
ion volume) 中に存在するように、断片が流束中でひっ
つくことのないような効果的な低濃度にするために、Ｄ
ＮＡ断片の希釈溶液を作製する。そののちに、そのＤＮ
Ａ断片の溶液を、１つの断片のレーザーによる励起を一
度にするための検出チャンバーを通過するための薄層状
のシース(laminar sheath)の流束の内に注入する。試料
とシースの流速は、粒子間の分離を維持し、各粒子に励
起光源中で至適時間を提供するように調整される。至適
時間は、サイジングの速度、検出感度および色素標識の
光安定性を考慮して決定される。適する励起光源は、Ｄ
ＮＡ断片の染色に用いられる色素において蛍光が発する
ように選択される。たとえば、エチジウムブロミドに60
0nm 付近のバンドの蛍光を生じさせるためには、488nm
のアルゴンレーザーが効果的である。
【００３１】通常のフローサイトメトリーシステムの感
度は、小さい励起体積、たとえば直径10〜20μｍおよび
長さ100 μｍ、に厳密に(tightly) 焦点を合わせられた
レーザービームを照射することにより向上する。たとえ
ば、11ｐＬのプローブ体積について記載されている、ジ
ェイ エイチ(J.H. Hahn) ら、「レーザー−インデュー
スド フルオレッセンス ディテクション オブ ロー
ダミン−６Ｇ アット６×10-5Ｍ(Laser-Induced Fluor
escence Detection of Rhodamine-6G at ６×10
-15 Ｍ）」、アプライド スペクトロスカピイ(Appl. S
pectrosc.)45巻、743 頁（1991年）が参照される。小さ
いプローブ体積により、出力シグナルにおける発光のバ
ックグラウンド量、すなわちノイズが大きく減少され
る。
度は、小さい励起体積、たとえば直径10〜20μｍおよび
長さ100 μｍ、に厳密に(tightly) 焦点を合わせられた
レーザービームを照射することにより向上する。たとえ
ば、11ｐＬのプローブ体積について記載されている、ジ
ェイ エイチ(J.H. Hahn) ら、「レーザー−インデュー
スド フルオレッセンス ディテクション オブ ロー
ダミン−６Ｇ アット６×10-5Ｍ(Laser-Induced Fluor
escence Detection of Rhodamine-6G at ６×10
-15 Ｍ）」、アプライド スペクトロスカピイ(Appl. S
pectrosc.)45巻、743 頁（1991年）が参照される。小さ
いプローブ体積により、出力シグナルにおける発光のバ
ックグラウンド量、すなわちノイズが大きく減少され
る。
【００３２】レーザーによる励起は、たとえば色素発光
光量子（遅発性の(delayed))とラマン拡散光量子（速効
性の(prompt)）の間に区別をつけるように導く時間であ
る、約70ps全幅（70ps full width)のパルスを用いるパ
ルスレーザーによってもよい。たとえば、イー ビー
シェラ(E.B. Shera)ら、「デテクション オブ シング
ル フルオレッセント モレキュルズ(Detection of Si
ngle Fluorescent Molecules) 」、ケミカル フィジッ
クス レターズ(Chem. Phys. Lett.)174巻、553 頁（19
90年11月）が参照される。遅発性用窓が蛍光光量子とラ
マン拡散光量子とを区別するのに効果的となるために、
色素発光が数ナノセコンドの寿命で退衰する間、速効性
の拡散光量子がレーザーパルス時間内に生ずる。
光量子（遅発性の(delayed))とラマン拡散光量子（速効
性の(prompt)）の間に区別をつけるように導く時間であ
る、約70ps全幅（70ps full width)のパルスを用いるパ
ルスレーザーによってもよい。たとえば、イー ビー
シェラ(E.B. Shera)ら、「デテクション オブ シング
ル フルオレッセント モレキュルズ(Detection of Si
ngle Fluorescent Molecules) 」、ケミカル フィジッ
クス レターズ(Chem. Phys. Lett.)174巻、553 頁（19
90年11月）が参照される。遅発性用窓が蛍光光量子とラ
マン拡散光量子とを区別するのに効果的となるために、
色素発光が数ナノセコンドの寿命で退衰する間、速効性
の拡散光量子がレーザーパルス時間内に生ずる。
【００３３】また、レーザーはｃｗレーザーでもよい。
たとえば、エス エイ ソーパー(S.A. Soper)、「シン
グル−モレキュル デテクション オブ ローダミン−
６Ｇイン エタノリック ソルーションズ ユージング
コンティニュアス ウェイブ レーザー エクサイテ
ィション(Single-Molecule Detection of Rhodamine-6G
in Ethanolic Solutions Using Continuous Wave Lase
r Excitation) 」、アナリティカル ケミストリー(Ana
l. Chem.) 63巻、432 頁（1991年）が参照される。発光
された光量子の数は、ＤＮＡ断片がレーザービームを通
過する時間を長くすることにより、そして色素および色
素のための高い光安定性を有する溶媒を選択することに
より増加しうる。検出された光量子（光電子）数はま
た、検出装置の感度を高めることにより増加する。さら
に、本発明は単一の分子よりもむしろＤＮＡ断片を含
み、そして断片の長さが長いほど強い出力の蛍光強度が
えられる。
たとえば、エス エイ ソーパー(S.A. Soper)、「シン
グル−モレキュル デテクション オブ ローダミン−
６Ｇイン エタノリック ソルーションズ ユージング
コンティニュアス ウェイブ レーザー エクサイテ
ィション(Single-Molecule Detection of Rhodamine-6G
in Ethanolic Solutions Using Continuous Wave Lase
r Excitation) 」、アナリティカル ケミストリー(Ana
l. Chem.) 63巻、432 頁（1991年）が参照される。発光
された光量子の数は、ＤＮＡ断片がレーザービームを通
過する時間を長くすることにより、そして色素および色
素のための高い光安定性を有する溶媒を選択することに
より増加しうる。検出された光量子（光電子）数はま
た、検出装置の感度を高めることにより増加する。さら
に、本発明は単一の分子よりもむしろＤＮＡ断片を含
み、そして断片の長さが長いほど強い出力の蛍光強度が
えられる。
【００３４】溶液は、ＤＮＡ断片に結合しなかったいく
らかの色素を含有してもよいことがわかるであろう。こ
の色素は結合した色素とともに励起されるであろうが、
システムは結合していない色素の蛍光と結合した色素の
蛍光とを区別しなければならない。１つの実施態様で
は、パルス化されたレーザーおよび誘導された検出技法
がこの区別を行なうのに用いられてもよい。たとえば、
結合していないエチジウムブロミドおよび結合している
エチジウムブロミドの励起された状態の寿命はそれぞれ
２nsおよび23nsである。したがって、検出システムは結
合しているエチジウムブロミドの蛍光のみを検出するこ
とができ、ＤＮＡ断片の長さに相関的(functionally)に
関連する出力シグナルを提供しうる。また、色素は結合
している状態および結合していない状態において異なる
蛍光または吸収波長を提供するように選択されてもよ
い。たとえば、一連の非対称シアニン色素がアイ デー
ジョンソン(I.D. Johnson)ら、「アシンメトリック
シアニン ダイズ フォー フルオレッセント ステイ
ニング アンド クウォンティフィケーション オブヌ
クレイック アシッズ(Asymmetric Cyanine Dyes for F
luorescent Stainingand Quantification of Nucleic A
cids)」、フルオレッセンス スペクトロスコーピィ(Fl
uorescence Spectroscopy) 、アブストラクト 1806、
エフエイエスイービー ジェイ(FASEB J.)６巻、Ａ314
頁、No.1（1992年１月）に報告されている。
らかの色素を含有してもよいことがわかるであろう。こ
の色素は結合した色素とともに励起されるであろうが、
システムは結合していない色素の蛍光と結合した色素の
蛍光とを区別しなければならない。１つの実施態様で
は、パルス化されたレーザーおよび誘導された検出技法
がこの区別を行なうのに用いられてもよい。たとえば、
結合していないエチジウムブロミドおよび結合している
エチジウムブロミドの励起された状態の寿命はそれぞれ
２nsおよび23nsである。したがって、検出システムは結
合しているエチジウムブロミドの蛍光のみを検出するこ
とができ、ＤＮＡ断片の長さに相関的(functionally)に
関連する出力シグナルを提供しうる。また、色素は結合
している状態および結合していない状態において異なる
蛍光または吸収波長を提供するように選択されてもよ
い。たとえば、一連の非対称シアニン色素がアイ デー
ジョンソン(I.D. Johnson)ら、「アシンメトリック
シアニン ダイズ フォー フルオレッセント ステイ
ニング アンド クウォンティフィケーション オブヌ
クレイック アシッズ(Asymmetric Cyanine Dyes for F
luorescent Stainingand Quantification of Nucleic A
cids)」、フルオレッセンス スペクトロスコーピィ(Fl
uorescence Spectroscopy) 、アブストラクト 1806、
エフエイエスイービー ジェイ(FASEB J.)６巻、Ａ314
頁、No.1（1992年１月）に報告されている。
【００３５】偏光された(polarized) 蛍光発光もまた、
結合していない色素分子から結合している色素分子を区
別する手段を提供する。結合していないＤＮＡ色素の蛍
光偏光は0.05以下であるのに対し、ＤＮＡに結合した蛍
光色素の蛍光偏光は0.20から0.30の間でありうる。たと
えば、エル エス クラム(L.S. Cram) ら、「フルオレ
ッセンス ポラリゼーション アンド パルス ワイス
アナリシス オブクロモゾームス バイ ア フロー
システム(Fluorescence Polarization andPulse Widt
h Analysis of Chromosomes by a Flow System)」、ジ
ャーナル オブ ヒストケミストリー アンド サイト
ケミストリー(J. Histochem. Cytochem.) 27巻、445
頁、No.1（1979年）、およびティー エム ジョビン
(T.M. Jovin)、「フルオレッセンス ポラリゼーション
アンド エナジー トランスファー：セオリー アン
ド アプリケーション(Fluorescence Polarization and
Energy Transfer：Theory and Application) 」、エム
アール メラムド(M.R. Melamed)ら編、フローサイト
メトリー アンド ソーティング(Flow Cytometry and
Sorting)、156 頁、ジョン ウィレイ アンド サンズ
(John Wiley & Sons)（1979年）が参照される。偏光し
た励起光源(polarized excitation source) を用いるこ
とおよび蛍光検出器の前に置かれた偏光フィルターを通
して発光を検出することによって区別がなされる。偏光
フィルターは励起光源の偏光方向に平行な偏光方向に並
べられる。
結合していない色素分子から結合している色素分子を区
別する手段を提供する。結合していないＤＮＡ色素の蛍
光偏光は0.05以下であるのに対し、ＤＮＡに結合した蛍
光色素の蛍光偏光は0.20から0.30の間でありうる。たと
えば、エル エス クラム(L.S. Cram) ら、「フルオレ
ッセンス ポラリゼーション アンド パルス ワイス
アナリシス オブクロモゾームス バイ ア フロー
システム(Fluorescence Polarization andPulse Widt
h Analysis of Chromosomes by a Flow System)」、ジ
ャーナル オブ ヒストケミストリー アンド サイト
ケミストリー(J. Histochem. Cytochem.) 27巻、445
頁、No.1（1979年）、およびティー エム ジョビン
(T.M. Jovin)、「フルオレッセンス ポラリゼーション
アンド エナジー トランスファー：セオリー アン
ド アプリケーション(Fluorescence Polarization and
Energy Transfer：Theory and Application) 」、エム
アール メラムド(M.R. Melamed)ら編、フローサイト
メトリー アンド ソーティング(Flow Cytometry and
Sorting)、156 頁、ジョン ウィレイ アンド サンズ
(John Wiley & Sons)（1979年）が参照される。偏光し
た励起光源(polarized excitation source) を用いるこ
とおよび蛍光検出器の前に置かれた偏光フィルターを通
して発光を検出することによって区別がなされる。偏光
フィルターは励起光源の偏光方向に平行な偏光方向に並
べられる。
【００３６】連続的なｃｗレーザー励起には、エネルギ
ー移送式型が、結合している色素分子と結合していない
色素分子を区別するために用いられてもよい。第２の色
素がＤＮＡに結合するばあいもまた、断片のサイジング
に用いられる結合している第１の色素分子は、第２の色
素分子の励起が第２の色素分子から第１の色素分子への
エネルギー移送という結果になるように、第２の色素分
子に近接するであろう。周囲の流体中の結合していない
第１および第２の色素分子は、エネルギー移送に効果的
に近くには存在しないであろう。したがって、第２の色
素分子が励起されたばあいには、結合している第１の色
素分子のみが断片の長さを測定するために蛍光を発する
であろう。
ー移送式型が、結合している色素分子と結合していない
色素分子を区別するために用いられてもよい。第２の色
素がＤＮＡに結合するばあいもまた、断片のサイジング
に用いられる結合している第１の色素分子は、第２の色
素分子の励起が第２の色素分子から第１の色素分子への
エネルギー移送という結果になるように、第２の色素分
子に近接するであろう。周囲の流体中の結合していない
第１および第２の色素分子は、エネルギー移送に効果的
に近くには存在しないであろう。したがって、第２の色
素分子が励起されたばあいには、結合している第１の色
素分子のみが断片の長さを測定するために蛍光を発する
であろう。
【００３７】例としては、ＤＮＡ特異的色素であるヘキ
ストとクロモマイシンがエネルギーを移送させうる。ヘ
キスト色素分子が励起されると、それらは数オングスト
ロームの移送半径内でクロモマイシン分子にエネルギー
を移送させうる。このエネルギー移送対(energy transf
er pair)はフローサイトメトリーによる染色体の蛍光分
析において用いられる。たとえば、アール ジー ラン
グロイス(R.G. Langlois) らによる「サイトケミカル
スタディーズ オブ メタフェーズ クロモソウムズ
バイ フローサイトメトリー(Cytochemical Studies of
Metaphase Chromosomes by Flow Cytometry) 」、クロ
モソウマ(Chromosoma)77巻、229 頁（1980年）を参照さ
れたい。エネルギー移送による励起はまた、ヌクレオチ
ドを 260nm付近で励起することによっても行なってもよ
く、そののち結合した色素分子にエネルギーが移送され
る。たとえば、ジェイ ビー レペック(J.B. LePecq)
らによる「ア フルオレッセント コンプレックス ビ
トゥィーン エチジウムブロミド アンド ヌクレイッ
ク アシッズ（A fluorescent Complex between Ethidi
um Bromide and Nucleic Acids）」、ジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー（J.Mol. Biol.) 27巻、
87頁（1967年）を参照されたい。
ストとクロモマイシンがエネルギーを移送させうる。ヘ
キスト色素分子が励起されると、それらは数オングスト
ロームの移送半径内でクロモマイシン分子にエネルギー
を移送させうる。このエネルギー移送対(energy transf
er pair)はフローサイトメトリーによる染色体の蛍光分
析において用いられる。たとえば、アール ジー ラン
グロイス(R.G. Langlois) らによる「サイトケミカル
スタディーズ オブ メタフェーズ クロモソウムズ
バイ フローサイトメトリー(Cytochemical Studies of
Metaphase Chromosomes by Flow Cytometry) 」、クロ
モソウマ(Chromosoma)77巻、229 頁（1980年）を参照さ
れたい。エネルギー移送による励起はまた、ヌクレオチ
ドを 260nm付近で励起することによっても行なってもよ
く、そののち結合した色素分子にエネルギーが移送され
る。たとえば、ジェイ ビー レペック(J.B. LePecq)
らによる「ア フルオレッセント コンプレックス ビ
トゥィーン エチジウムブロミド アンド ヌクレイッ
ク アシッズ（A fluorescent Complex between Ethidi
um Bromide and Nucleic Acids）」、ジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー（J.Mol. Biol.) 27巻、
87頁（1967年）を参照されたい。
【００３８】フローサイトメトリー型装置もまた、隣接
する断片の長さを区別するのに高い分解能を与える。実
際、分解能は一般的に蛍光発光から生じる光量子におけ
るショットノイズ(shot noise)によって限定され、ＤＮ
Ａ断片を形成する塩基対の（bp′s ）数が増えると分解
能（％）は増加する。
する断片の長さを区別するのに高い分解能を与える。実
際、分解能は一般的に蛍光発光から生じる光量子におけ
るショットノイズ(shot noise)によって限定され、ＤＮ
Ａ断片を形成する塩基対の（bp′s ）数が増えると分解
能（％）は増加する。
【００３９】分解能（％）（Ｒ）は断片の長さ（Ｌ）、
標識された断片の分画（ｆ）、１つの標識あたりに集め
られた光電子の数（ｂ）（ｂは典型的には約30）および
断片がサイズされた回数（Ｎ）によって決定される。平
均強度はμで示される。３σの標識偏差における分解能
Ｒは Ｒ（％）＝３×100 ×Ｎ1/2 ×（Ｌ×ｆ×ｂ）1/2 ／（Ｌ×ｆ×ｂ） （ただしμ＝Ｌ×ｆ×ｂ、σ＝μ1/2 ） で表わされる。
標識された断片の分画（ｆ）、１つの標識あたりに集め
られた光電子の数（ｂ）（ｂは典型的には約30）および
断片がサイズされた回数（Ｎ）によって決定される。平
均強度はμで示される。３σの標識偏差における分解能
Ｒは Ｒ（％）＝３×100 ×Ｎ1/2 ×（Ｌ×ｆ×ｂ）1/2 ／（Ｌ×ｆ×ｂ） （ただしμ＝Ｌ×ｆ×ｂ、σ＝μ1/2 ） で表わされる。
【００４０】たとえば、1000の塩基長さの断片のばあい
を考えると、Ｌ＝1000、ｆ＝0.5 （たとえばエチジウム
ブロミド）、ｂ＝30である。Ｎ＝１で、μ＝15000 、σ
＝122.474 およびＲ＝2.45％である。分解能はＮ1/2 で
向上する。Ｎ＝1000で、σ＝3.87およびＲ＝0.0775％で
ある。10、100 または10000 個の同一の断片のサイジン
グであっても問題はない。典型的な１本の電気泳動バン
ドにおいては10000 よりももっと多い断片が存在する。
したがって、100,000bp の断片については分解能は１％
よりずっと良くなりうるが、一方、ゲル電気泳動による
100,000bp の範囲の断片の分離においては、10〜20％の
分解能しか期待できず、断片の長さが大きくなると分解
能はさらに低下する。
を考えると、Ｌ＝1000、ｆ＝0.5 （たとえばエチジウム
ブロミド）、ｂ＝30である。Ｎ＝１で、μ＝15000 、σ
＝122.474 およびＲ＝2.45％である。分解能はＮ1/2 で
向上する。Ｎ＝1000で、σ＝3.87およびＲ＝0.0775％で
ある。10、100 または10000 個の同一の断片のサイジン
グであっても問題はない。典型的な１本の電気泳動バン
ドにおいては10000 よりももっと多い断片が存在する。
したがって、100,000bp の断片については分解能は１％
よりずっと良くなりうるが、一方、ゲル電気泳動による
100,000bp の範囲の断片の分離においては、10〜20％の
分解能しか期待できず、断片の長さが大きくなると分解
能はさらに低下する。
【００４１】本発明によるＤＮＡフィンガープリントも
また、きわめて迅速に行なうことが可能である。電気泳
動による典型的なＤＮＡフィンガープリントは約50バン
ドを有する。100 断片／秒の速さの断片分析でフィンガ
ープリントを行なうためには、1000断片では50バンドに
約8.3 分が必要とされるのみである。１本のバンドのみ
が所望の分解に要求されるばあいには、分析時間はたっ
た約１秒である。したがって、所望の分解が１本のバン
ドあたり100 断片要求されるばあいには、50バンドの分
析はたった約50秒で行なわれるであろう。
また、きわめて迅速に行なうことが可能である。電気泳
動による典型的なＤＮＡフィンガープリントは約50バン
ドを有する。100 断片／秒の速さの断片分析でフィンガ
ープリントを行なうためには、1000断片では50バンドに
約8.3 分が必要とされるのみである。１本のバンドのみ
が所望の分解に要求されるばあいには、分析時間はたっ
た約１秒である。したがって、所望の分解が１本のバン
ドあたり100 断片要求されるばあいには、50バンドの分
析はたった約50秒で行なわれるであろう。
【００４２】本発明の適用において、ハイブリダイゼー
ション プローブはＤＮＡ制限断片(DNA restriction f
ragments) に結合することができ、断片長さのサイズ(f
ragment length sizes) と結びつけて考えられうる。通
常、ハイブリダイゼーションプローブはプローブ色素(p
robe dye) を含んで形成され、調べられるＤＮＡ小片か
ら形成されるＤＮＡ断片と塩基対のマッチングによって
ハイブリダイズする。そののち、ハイブリダイズしたＤ
ＮＡ断片の励起は、サイズ測定色素(size-measuring dy
e)とプローブ色素の両者の蛍光出力の相関関係がプロー
ブと種々の断片長さを関連づけるであろうように、サイ
ズ測定色素とプローブ色素を励起することができた。Ｄ
ＮＡへのin situプローブ ハイブリダイゼーションは
メソッズ イン セル バイオロジー（Methods in Cel
l Biology ）、33巻、ゼットダージンキエウック(Z. Da
rzynkiewicz)ら著、アカデミック プレス インク(Aca
demic Press, Inc.)（ニューヨーク 1990年）、37章、
「フルオレッセンスイン サイチュー ハイブリダイゼ
ーション ウィズ デーエヌエー プローブス(Fluores
cence In Situ Hybridization with DNA Probes) 」、
383 頁に論ぜられている。
ション プローブはＤＮＡ制限断片(DNA restriction f
ragments) に結合することができ、断片長さのサイズ(f
ragment length sizes) と結びつけて考えられうる。通
常、ハイブリダイゼーションプローブはプローブ色素(p
robe dye) を含んで形成され、調べられるＤＮＡ小片か
ら形成されるＤＮＡ断片と塩基対のマッチングによって
ハイブリダイズする。そののち、ハイブリダイズしたＤ
ＮＡ断片の励起は、サイズ測定色素(size-measuring dy
e)とプローブ色素の両者の蛍光出力の相関関係がプロー
ブと種々の断片長さを関連づけるであろうように、サイ
ズ測定色素とプローブ色素を励起することができた。Ｄ
ＮＡへのin situプローブ ハイブリダイゼーションは
メソッズ イン セル バイオロジー（Methods in Cel
l Biology ）、33巻、ゼットダージンキエウック(Z. Da
rzynkiewicz)ら著、アカデミック プレス インク(Aca
demic Press, Inc.)（ニューヨーク 1990年）、37章、
「フルオレッセンスイン サイチュー ハイブリダイゼ
ーション ウィズ デーエヌエー プローブス(Fluores
cence In Situ Hybridization with DNA Probes) 」、
383 頁に論ぜられている。
【００４３】長さ測定に加えて、ＤＮＡ鎖からおおまか
な塩基組成情報を引き出すことが可能である。たとえ
ば、ＤＮＡ特異的色素ヘキストはＤＮＡにおけるＡＴの
豊富な領域に優先的に結合し、またクロモマイシンはＧ
Ｃの豊富な領域に優先的に結合する。これら２種の色素
の蛍光を励起することによって、二変量の染色体分析
（前記のラングロイス参照）においてなされるように、
断片のＡＴ：ＧＣの割合が測定されうる。この割合は断
片の長さに加えさらなるフィンガープリント情報を供与
するであろう。異なる配列特異性(specificities) をと
もなった他の結合色素が断片の塩基特性を描写するため
に用いられうる。さらに、蛍光標識されたヌクレオチド
前駆体の存在下にＤＮＡの小片を合成することにより、
その塩基組成にしたがったＤＮＡの小片に標識がなさ
れ、この情報はひき続いて断片長さの蛍光分析に関連づ
けることができる。たとえば、３つの正常なヌクレオチ
ドおよび１つの蛍光標識されたＣヌクレオチドを用いて
ＤＮＡの小片を複製すれば、標識されたＣヌクレオチド
はＧヌクレオチドにのみ結合するであろうために、もと
の小片におけるＧヌクレオチドの数についての情報がえ
られるであろう。
な塩基組成情報を引き出すことが可能である。たとえ
ば、ＤＮＡ特異的色素ヘキストはＤＮＡにおけるＡＴの
豊富な領域に優先的に結合し、またクロモマイシンはＧ
Ｃの豊富な領域に優先的に結合する。これら２種の色素
の蛍光を励起することによって、二変量の染色体分析
（前記のラングロイス参照）においてなされるように、
断片のＡＴ：ＧＣの割合が測定されうる。この割合は断
片の長さに加えさらなるフィンガープリント情報を供与
するであろう。異なる配列特異性(specificities) をと
もなった他の結合色素が断片の塩基特性を描写するため
に用いられうる。さらに、蛍光標識されたヌクレオチド
前駆体の存在下にＤＮＡの小片を合成することにより、
その塩基組成にしたがったＤＮＡの小片に標識がなさ
れ、この情報はひき続いて断片長さの蛍光分析に関連づ
けることができる。たとえば、３つの正常なヌクレオチ
ドおよび１つの蛍光標識されたＣヌクレオチドを用いて
ＤＮＡの小片を複製すれば、標識されたＣヌクレオチド
はＧヌクレオチドにのみ結合するであろうために、もと
の小片におけるＧヌクレオチドの数についての情報がえ
られるであろう。
【００４４】前記システムのさらなる能力は、フローサ
イトメーターと統合された種々のソーティングシステム
を用いることによってもたらされうる。たとえば、前記
の米国特許第3,710,933 号明細書および前記のフロー
サイトメトリー アンド ソーティングを参照された
い。ソーティングの能力は追加の処理または研究のため
に流束から１つまたはそれより多くの断片のサイズを選
り分けることを可能にするであろう。ハイブリダイゼー
ション プローブを用いるばあい、ソーティングにより
流束からハイブリダイズされた断片を分離することが可
能になる。
イトメーターと統合された種々のソーティングシステム
を用いることによってもたらされうる。たとえば、前記
の米国特許第3,710,933 号明細書および前記のフロー
サイトメトリー アンド ソーティングを参照された
い。ソーティングの能力は追加の処理または研究のため
に流束から１つまたはそれより多くの断片のサイズを選
り分けることを可能にするであろう。ハイブリダイゼー
ション プローブを用いるばあい、ソーティングにより
流束からハイブリダイズされた断片を分離することが可
能になる。
【００４５】通常のソーティング装置は、米国特許第3,
710,933 号明細書およびティー リンドモ(T. Lindmo)
、「フロー ソーターズ フォー バイオロジカル
セルズ(Flow Sorters for Biological Cells) 」、フロ
ー サイトメトリー アンドソーティング（Flow Cytom
etry and Sorting）、第２版、エム メラメド(M.Melam
ed) ら著、145 〜169 頁、ジョン ウィレイ アンド
サンズ(John Wiley &Sons) （1990年）に記載されたよ
うに、前述の蛍光出力シグナルを用いる。断片が出力を
生じるように励起体積を通過したのち、流体力学的な流
束(hydrodynamic flow stream)が、たとえば、超音波振
とう処理によって小滴にされ、各々の液滴は１より多く
ない断片を含む。ＤＮＡ断片を含有する液滴は励起に対
して選択された蛍光反応性をもち、液滴と交差する高電
圧パルスの適用により荷電され、そののち荷電された液
滴を選択的に偏向するように静電界を発生する帯電板を
通過する。選択された液滴に適用された電荷(charge)は
フローサイトメーター内の励起体積からの蛍光発光に対
応する電気回路の構成部分によってコントロールされ、
そこで荷電するパルスは活性化され、選択された波長お
よび強さで蛍光を発する材料を含有する液滴の偏向を生
じる。
710,933 号明細書およびティー リンドモ(T. Lindmo)
、「フロー ソーターズ フォー バイオロジカル
セルズ(Flow Sorters for Biological Cells) 」、フロ
ー サイトメトリー アンドソーティング（Flow Cytom
etry and Sorting）、第２版、エム メラメド(M.Melam
ed) ら著、145 〜169 頁、ジョン ウィレイ アンド
サンズ(John Wiley &Sons) （1990年）に記載されたよ
うに、前述の蛍光出力シグナルを用いる。断片が出力を
生じるように励起体積を通過したのち、流体力学的な流
束(hydrodynamic flow stream)が、たとえば、超音波振
とう処理によって小滴にされ、各々の液滴は１より多く
ない断片を含む。ＤＮＡ断片を含有する液滴は励起に対
して選択された蛍光反応性をもち、液滴と交差する高電
圧パルスの適用により荷電され、そののち荷電された液
滴を選択的に偏向するように静電界を発生する帯電板を
通過する。選択された液滴に適用された電荷(charge)は
フローサイトメーター内の励起体積からの蛍光発光に対
応する電気回路の構成部分によってコントロールされ、
そこで荷電するパルスは活性化され、選択された波長お
よび強さで蛍光を発する材料を含有する液滴の偏向を生
じる。
【００４６】前述の記載はＤＮＡ小片に関するものであ
るが、前記の方法はＲＮＡ鎖にも同等に適用しうる。本
明細書におけるＤＮＡについてのいかなる言及もＲＮＡ
を含むと解釈されるべきである。加えて、検出されるシ
グナルの形態は蛍光であると教示されている。しかしな
がら、「蛍光」という用語は燐光およびルミネッセンス
を含むと解釈されるべきであり、特異的な色素に依存し
て、いかなる形態の光の発光も利用しうる。さらに、全
ての生物が特異的な特性を決定するゲノムをもっている
ので、フィンガープリントに供されるＤＮＡまたはＲＮ
Ａは必ずしもヒト由来でなくてもよい。
るが、前記の方法はＲＮＡ鎖にも同等に適用しうる。本
明細書におけるＤＮＡについてのいかなる言及もＲＮＡ
を含むと解釈されるべきである。加えて、検出されるシ
グナルの形態は蛍光であると教示されている。しかしな
がら、「蛍光」という用語は燐光およびルミネッセンス
を含むと解釈されるべきであり、特異的な色素に依存し
て、いかなる形態の光の発光も利用しうる。さらに、全
ての生物が特異的な特性を決定するゲノムをもっている
ので、フィンガープリントに供されるＤＮＡまたはＲＮ
Ａは必ずしもヒト由来でなくてもよい。
【００４７】本発明の好ましい実施態様についての前述
の記載は解説および記述する目的で示されている。これ
は本発明を包括するものでも開示された厳密な形式に限
定するものでもなく、明らかに多くの修飾および変形が
前述の教示を考慮して可能である。実施態様は本発明の
原理、および意図された特定の使用に合うように当業者
が種々の実施態様に種々の修飾をともなって本発明を的
確に利用することを可能にするために実際の適用を選択
し記載している。ここに添付されたクレームによって定
義された発明の範囲が意図される。
の記載は解説および記述する目的で示されている。これ
は本発明を包括するものでも開示された厳密な形式に限
定するものでもなく、明らかに多くの修飾および変形が
前述の教示を考慮して可能である。実施態様は本発明の
原理、および意図された特定の使用に合うように当業者
が種々の実施態様に種々の修飾をともなって本発明を的
確に利用することを可能にするために実際の適用を選択
し記載している。ここに添付されたクレームによって定
義された発明の範囲が意図される。
【００４８】
【発明の効果】本発明により、ＤＮＡ小片、とくに少量
のＤＮＡ小片から作製されるＤＮＡ断片を短時間でサイ
ジングすることが可能である。さらに、前記断片は従来
よりも長い断片を用いることが可能である。
のＤＮＡ小片から作製されるＤＮＡ断片を短時間でサイ
ジングすることが可能である。さらに、前記断片は従来
よりも長い断片を用いることが可能である。
【００４９】また、本発明では種々のソーティングシス
テムを併用することにより、前記サイジングとともにＤ
ＮＡ断片のソーティングも可能とする。
テムを併用することにより、前記サイジングとともにＤ
ＮＡ断片のソーティングも可能とする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーク エル ハモンド アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、アイリタ ドライブ 64 (72)発明者 リチャード エイ ケラー アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、ラ ローザ コート ４ (72)発明者 バベッタ エル マロン アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、トウタビ ストリー ト 690 (72)発明者 ジョーン シー マーチン アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、トリニティー ドラ イブ 4987
Claims (24)
- 【請求項１】 複数のヌクレオチドを含有するＤＮＡ断
片を誘導された蛍光によってサイジングする方法であっ
て、ＤＮＡ小片を該ＤＮＡ小片内の予め選別された部位
で断片化することにより複数のＤＮＡ断片を生じさせる
工程、該ＤＮＡ小片または該ＤＮＡ断片を該ヌクレオチ
ドを化学量論的に染色するのに有効な第１の色素で染色
する工程および該第１の色素から各々の該ＤＮＡ断片中
のヌクレオチド数に相関的に関連する蛍光強度シグナル
を発生させるために染色を行なったのちに、該ＤＮＡ断
片を蛍光的に検査する工程からなるＤＮＡ断片のサイジ
ング方法。 - 【請求項２】 前記ＤＮＡ小片の断片化の工程が、既知
の塩基対の組み合わせにおいて該小片を切断するために
選択された制限酵素にさらすことからなる請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 前記ＤＮＡ小片の断片化の工程が、該小
片に沿って選択された部位を同定するために、選択され
たＤＮＡ配列を該ＤＮＡ小片に結合させる工程および前
記複数のＤＮＡ断片を形成するために、該選択された部
位で該ＤＮＡ小片を切断する工程を含んでなる請求項１
記載の方法。 - 【請求項４】 前記ＤＮＡ小片または前記ＤＮＡ断片を
第１の色素で染色する工程が、該ＤＮＡ小片または該Ｄ
ＮＡ断片を、エチジウムブロミド、アクリジンオレン
ジ、プロピジウムイオダイド、ＤＡＰＩ、ヘキスト、ク
ロモマイシン、ミトラマイシン、9 アミノアクリジンお
よびエチジウムアクリジンヘテロジンからなる群より選
ばれた色素を含有する溶液に加える工程を含む請求項１
記載の方法。 - 【請求項５】 前記ＤＮＡ小片または前記ＤＮＡ断片を
前記第１の色素で染色する工程が、該ＤＮＡ小片または
該ＤＮＡ断片をエチジウムブロミド、アクリジンオレン
ジ、プロピジウムイオダイド、ＤＡＰＩ、ヘキスト、ク
ロモマイシン、ミトラマイシン、9 アミノアクリジンお
よびエチジウムアクリジンヘテロジンからなる群より選
ばれた色素を含有する溶液に加える工程を含む請求項２
記載の方法。 - 【請求項６】 前記ＤＮＡ小片または前記ＤＮＡ断片を
前記第１の色素で染色する工程が、該ＤＮＡ小片または
該ＤＮＡ断片をエチジウムブロミド、アクリジンオレン
ジ、プロピジウムイオダイド、ＤＡＰＩ、ヘキスト、ク
ロモマイシン、ミトラマイシン、9 アミノアクリジンお
よびエチジウムアクリジンヘテロジンからなる群より選
ばれた色素を含有する溶液に加える工程を含む請求項３
記載の方法。 - 【請求項７】 前記ＤＮＡ断片を蛍光的に検査する工程
が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流束
を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせるた
めに効果的なレーザーを該流束に照射する工程および該
流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定する
工程を含んでなる請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 前記全蛍光強度を測定する工程が、さら
に前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していない
色素分子とを区別する工程を含む請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記ＤＮＡ断片を蛍光的に検査する工程
が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流束
を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせるた
めに効果的なレーザーを該流束に照射する工程および該
流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定する
工程を含んでなる請求項２記載の方法。 - 【請求項１０】 前記全蛍光強度を測定する工程が、さ
らに前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していな
い色素分子とを区別する工程を含む請求項９記載の方
法。 - 【請求項１１】 前記ＤＮＡ断片を蛍光的に検査する工
程が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流
束を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせる
ために効果的なレーザーを該流束に照射する工程および
該流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定す
る工程を含んでなる請求項３記載の方法。 - 【請求項１２】 前記全蛍光強度を測定する工程が、さ
らに前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していな
い色素分子とを区別する工程を含む請求項11記載の方
法。 - 【請求項１３】 前記ＤＮＡ断片を蛍光的に検査する工
程が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流
束を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせる
ために効果的なレーザーを該流束に照射する工程および
該流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定す
る工程を含んでなる請求項４記載の方法。 - 【請求項１４】 前記全蛍光強度を測定する工程が、さ
らに前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していな
い色素分子とを区別する工程を含む請求項13記載の方
法。 - 【請求項１５】 前記ＤＮＡ断片を蛍光的に検査する工
程が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流
束を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせる
ために効果的なレーザーを該流束に照射する工程および
該流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定す
る工程を含んでなる請求項５記載の方法。 - 【請求項１６】 前記全蛍光強度を測定する工程が、さ
らに前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していな
い色素分子とを区別する工程を含む請求項15記載の方
法。 - 【請求項１７】 前記ＤＮＡ断片を蛍光的に検査する工
程が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流
束を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせる
ために効果的なレーザーを該流束に照射する工程および
該流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定す
る工程を含んでなる請求項６記載の方法。 - 【請求項１８】 前記全蛍光の検出工程が、さらに前記
ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していない色素分
子を区別する工程を含む請求項17記載の方法。 - 【請求項１９】 前記色素分子を区別する工程が、前記
第１の色素にエネルギー移送するのに効果的な第２の色
素で前記ヌクレオチドを染色する工程、該第１の色素に
エネルギー移送するための該第２の色素を励起する工程
および前記ＤＮＡ断片のサイズに機能的に関連するシグ
ナルを出力するために該第１の色素から蛍光強度を測定
する工程を含んでなる請求項８記載の方法。 - 【請求項２０】 前記色素分子を区別する工程が、前記
第１の色素を偏光させた光源で励起させる工程および該
偏光させた光源の偏光に対して平行な偏光方向に向けら
れた偏光フィルターを通して前記第１の色素から蛍光を
検出する工程を含んでなる請求項８記載の方法。 - 【請求項２１】 前記色素分子を区別する工程が、前記
ＤＮＡ断片に結合していない色素分子の蛍光の寿命に関
連する第１の検出窓を配置する工程、前記第１の検出窓
の後ろにあり、前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子の蛍
光の寿命に関連する第２の検出窓を配置する工程および
該第２の窓内で検出された全蛍光強度を測定する工程を
含んでなる請求項８記載の方法。 - 【請求項２２】 予め決定されたヌクレオチド配列を有
するハイブリダイゼーションプローブを蛍光色素標識を
用いて形成する工程、該ハイブリダイゼーションプロー
ブと前記ＤＮＡ断片をハイブリダイズ化する工程および
該プローブと断片サイズの関係を測定するために該蛍光
色素標識を蛍光的に検査する工程を含有する請求項１記
載の方法。 - 【請求項２３】 さらに、前記染色されたＤＮＡ断片を
前記蛍光強度シグナルの相関的要素としてソーティング
する工程を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項２４】 さらに、前記ＤＮＡ鎖またはＤＮＡ断
片を選択されたオレゴヌクレオチドに結合する第３の色
素で染色する工程および該選択されたオリゴヌクレオチ
ド含量を断片サイズと関連づけるために該第３の色素か
ら発光する該ＤＮＡ断片を蛍光的に検査する工程を含ん
でなる請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84111492A | 1992-02-25 | 1992-02-25 | |
| US841,114 | 1992-02-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH067198A true JPH067198A (ja) | 1994-01-18 |
Family
ID=25284049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5037039A Pending JPH067198A (ja) | 1992-02-25 | 1993-02-25 | レーザー誘導された蛍光によるｄｎａ断片のサイジングおよびソーティング |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH067198A (ja) |
| CA (1) | CA2089423A1 (ja) |
| FR (1) | FR2687687B1 (ja) |
| GB (1) | GB2264496B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021519432A (ja) * | 2018-03-30 | 2021-08-10 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． | フローサイトメータ、そのレーザ光学アセンブリ、およびレーザ光学アセンブリの組立方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221654B1 (en) | 1996-09-25 | 2001-04-24 | California Institute Of Technology | Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size |
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| US6540895B1 (en) | 1997-09-23 | 2003-04-01 | California Institute Of Technology | Microfabricated cell sorter for chemical and biological materials |
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| WO2003021272A2 (en) * | 2001-08-22 | 2003-03-13 | Union Biometrica, Inc. | Improved axial pattern analysis utilizing organisms having defined marker patterns |
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| WO2003048295A1 (en) | 2001-11-30 | 2003-06-12 | Fluidigm Corporation | Microfluidic device and methods of using same |
| US7312085B2 (en) | 2002-04-01 | 2007-12-25 | Fluidigm Corporation | Microfluidic particle-analysis systems |
| AU2003224817B2 (en) | 2002-04-01 | 2008-11-06 | Fluidigm Corporation | Microfluidic particle-analysis systems |
| JP2006501056A (ja) | 2002-09-25 | 2006-01-12 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | ミクロ流体大規模集積 |
| WO2004040001A2 (en) | 2002-10-02 | 2004-05-13 | California Institute Of Technology | Microfluidic nucleic acid analysis |
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