JPH0673396A - アルファ分解性プロテアーゼ洗浄性組成物 - Google Patents

アルファ分解性プロテアーゼ洗浄性組成物

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JPH0673396A
JPH0673396A JP10231592A JP10231592A JPH0673396A JP H0673396 A JPH0673396 A JP H0673396A JP 10231592 A JP10231592 A JP 10231592A JP 10231592 A JP10231592 A JP 10231592A JP H0673396 A JPH0673396 A JP H0673396A
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alanine
xaa
serine
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Susan A Anderson
スーザン・エイ・アンダーソン
Susanne Ottoboni
スーザン・オットボニ
Joseph A Tamm
ジョセフ・エム・タム
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Clorox Co
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 ライゾバクテール属からのアルカリ性セリン
・プロテアーゼを含む洗浄剤。 【効果】 この洗浄剤は、広いタンパク質分解活性と、
広いｐＨおよび温度範囲での安定性と、酸化剤に対する
安定性をもっている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ライゾバクテール（Ly
sobacter）属から誘導された新規のアルカリ性セリン・
プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）を含む洗浄性組成
物と、それを用いた洗浄方法とに関する。
【０００２】
【従来の技術】洗剤産業の主な傾向は、低い洗浄温度で
働き、洗濯用の添加剤と共に用いても安定であり、液体
または粒子の合成物のいずれにも調剤することができ、
なおかつ、充分な洗浄力が保持される洗濯用調剤を提供
することである。このような調剤が、以上の必要性を満
たすためには、通常、酵素、特にプロテアーゼを用いる
ことを必要とする。
【０００３】洗浄用の酵素として有用であるためには、
プロテアーゼが、広いｐＨ範囲と温度範囲において、タ
ンパク質に対してタンパク質分解活性を有すること、す
なわち、界面活性剤，洗浄研磨剤（ビルダー），酸化剤
およびその他の洗浄成分が存在しても触媒として安定で
あり、なおかつ貯蔵中もその活性を維持できる（充分な
貯蔵寿命）ことが望ましい。
【０００４】洗浄性組成物に最も広く用いられるプロテ
アーゼは、さまざまな種のバチルス（桿菌）から誘導さ
れたアルカリ性のプロテアーゼである。エスペラーゼ
（Esperase）R，アルカラーゼ（Alcalase）Rという商標
名で、デンマークのNovo/Nordisk Copenhagenにより販
売されているプロテアーゼや、バチルスlicheniformis
から誘導されたサブチリシンCarlsberg，サビナーゼ（S
avinase）Rは、望ましいアルカリ安定性とタンパク質分
解活性とを有している。これらの酵素は、洗剤メーカー
によりさまざまに特色がつけられ、また広く用いられて
いる。高温で有効な、バチルス酵素の適性温度は摂氏６
０度ないし７０度で、これは温水（摂氏３０度ないし４
０度）および低温（摂氏１５度ないし３０度）の洗濯に
用いられる通常温度より高い。さらに、バチルス・アル
カリ性プロテアーゼは、酸化剤に対する安定性が望まし
いレベルより低く、塩素系漂白剤では完全に不安定とな
って、そのために塩素系漂白剤や全自動食器洗い器用の
洗剤などと共に用いることができない。
【０００５】グラム陽性バクテリアから製造されるセリ
ン・プロテアーゼであるサブチリシンの変異体は、サブ
チリシン遺伝子の無作為の突然変異体と部位特異的突然
変異体の両方を用いて製造され、触媒効率（ｋcat／ＫM
値），基質特異性および三次構造における変化を起こ
す。酸化に対して安定性が向上し、タンパク質分解活性
が増大された、あるいは洗浄力が向上したと、特定のサ
ブチリシン変異体もすでに特徴づけられている（１９８
８年７月２６日、Estell他により出願された米国特許第
４，７６０，０２５号；１９８９年７月１３日Hastrup
他により出願されたＷＯ８９／０６２７９；および１９
８９年１０月１９日Bryan他により出願されたＷＯ８９
／０９８１９）。
【０００６】しかし、Estell他（１９８５年）（J Bil
chem 260:6518-6521）は、比較的よく特徴づけられたサ
ブチリシン・プロテアーゼ（ＢＰＮ’）についても、同
族のプロテアーゼに対するアミノ酸配列の同族関係に基
づく酸化感受性残基（たとえば２２２番目のメチオニ
ン）について最適なアミノ酸置換を選定することは予測
できないとしている。このような酸化感受性残基は、活
性部位の外側の位置にあっても、分子内のいまだに未知
の構造と機能の関係のために、触媒活性に重要なものと
なっている。
【０００７】たとえばライゾバクテール酵素遺伝子など
の、グラム陽性バクテリアにより生成されたセリン・プ
ロテアーゼである、アルファ分解性プロテアーゼ（ＡＬ
Ｐ）に関する従来の研究は、遺伝子の配列（Epsteinお
よびWensink(1988)J biol chem 263:16586-16590; Sile
nほか(1988) Gene 69:237-244; および図２参照）；酵
素の精製（Whitaker (1970) Methods in Enzymol 19:59
9-613）；およびタンパク質の結晶構造（Brayer他(197
9) J Mol Bil 131:743-775; Fujinaga他(1985) JMol bi
ol 183:479-502）の特定を行った。
【０００８】結晶学上のデータからは、基質の特異性を
示すために重要な結合ポケット（binding pocket）に、
１９２番目および２１３番目のメチオニン残基が含まれ
ている（キモトリプシンによるアライメントにより１５
−２４４からナンバリング）。
【０００９】１９２番目または２１３番目のメチオニン
にアラニンが置換したＡＬＰの変異体が生成された。Bo
ne他（(1989)Nature 339:191-195）は、アルファ分解性
プロテアーゼの、合成基質に関する基質の特異性パター
ンは、活性部位付近のこれらのメチオニン残基を変化さ
せることにより、広くすることができることを示した。
（便宜上、天然のアミノ酸は、１文字の省略コードで示
す。）たとえば、１９２番目のメチオニン（ＭＡ１９
２）のアラニン置換は、基質の特異性を広くする。ＭＡ
２１３位置で同じ置換を行うと、ＭＡ１９２変異体より
も基質の特異性が広くなり、また触媒効率（ｋcat／
Ｋm）もかなり低くなる。この結果は、産業上の利用に
おいてこれらの改良酵素の役割に焦点をあてることな
く、酵素と基質の相互作用の複雑さを示したものであ
る。
【００１０】
【発明の概要】本発明は、ある種のアルカリ性セリン・
プロテアーゼが、タンパク質の汚れに対して向上したタ
ンパク質分解性を有すること，広いｐＨ範囲と温度範囲
において安定であること，および酸化剤に対して改善さ
れた安定性を示すことの発見にある。これらの特性のた
めに、上記のプロテアーゼを洗濯用洗剤，自動食器洗い
器用洗剤，予浸剤，洗濯用添加剤およびその他の種類の
洗浄性組成物への調合に適したものにしている。
【００１１】また、本発明のアルファ分解性プロテアー
ゼが、カルシウムから独立していること、すなわち、カ
ルシウムが存在しなくても溶液内でのプロテアーゼの安
定性が維持されることも示される。サブチリシン系のア
ルカリ性プロテアーゼとは異なり、この特性によりアル
ファ分解性プロテアーゼを、鉱物硬度を制御するために
用いられる洗浄研磨剤（カルシウム金属イオン封鎖剤）
を含む洗剤への調合に適したものとしている。
【００１２】さらに詳しくは、本発明は、界面活性剤よ
り構成され、以下の配列を持つアルカリ性プロテアーゼ
を、タンパク質を含有する物質の除去を強化するために
有効な分量だけ含む洗浄性組成物を提供する（以下の化
学式では天然のＡＬＰ配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２に従
い番号がついている）： ［ＡＡ1-137］−Ｘａａ138−［ＡＡ139-157］−Ｘａａ
158−［ＡＡ159-162］−Ｘａａ163−［ＡＡ164-198］ ただし、ＡＡ1-137は、アミノ酸１ないし１３７の天然
のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘａａ138は、
メチオニン，セリン，アラニンからなる群から選択され
たものである；ＡＡ139-157は、アミノ酸１３９ないし
１５７の天然のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘ
ａａ158は、メチオニン，アラニン，スレオニン，グリ
シン，セリン，ロイシンからなる群から選択されたもの
である；ＡＡ159-162は、アミノ酸１５９ないし１６２
の天然のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘａａ
163は、バリン，アラニンからなる群から選択されたも
のである；およびＡＡ164-198は、アミノ酸１６４ない
し１９８の天然のアルファ分解性プロテアーゼである。
【００１３】上記に説明されたアルカリ性プロテアーゼ
の好適な実施例は、Ｘａａ138がアラニンであり、Ｘａ
ａ158がアラニンであり、Ｘａａ163がアラニンであるプ
ロテアーゼである。
【００１４】本発明の洗剤を調合する際に用いられるア
ルカリ性プロテアーゼは、ライゾバクテール属からもと
もと誘導されたものである。活性部位のある種の残基
が、通常は普通のアミノ酸置換により置き換えられてい
る野生のアルファ分解性プロテアーゼの変異体は、生来
の熱安定性が増加すると共に、繊維上のタンパク性の汚
れに対する汚れの除去性能が向上していることがわかっ
ている。本発明の実施例では、アルカリ性セリン・プロ
テアーゼが以下のような特性を有する洗浄性組成物が提
示される： ａ）ｐＨ約７ないし１２の範囲のｐＨにおいて最適な加
水分解活性がある； ｂ）ｐＨ約５ないし１０．５の範囲の水溶液中で活性が
安定している；および ｃ）ｐＨ５で摂氏約７５度よりも高い溶融温度（Ｔm）
と、ｐＨ８で摂氏約７３度より高い溶融温度をもつ。
【００１５】他の実施例においては、本発明はタンパク
質で汚された表面を、有効な量の上述の洗剤と接触させ
る段階より構成される洗浄方法に関する。
【００１６】さらに他の実施例においては、本発明は、
タンパク質で汚された物質の除去を強化するだけの有効
な量を含む本発明の洗浄性組成物に、表面を接触させ
て、表面から前記のタンパク質で汚された物質を除去す
る方法に関する。
【００１７】特定の実施例においては、アルカリ性プロ
テアーゼはライゾバクテール酵素種より誘導され、１３
８番目，１５８番目，１６３番目のアミノ酸置換、また
はその組合せを含む。
【００１８】
【実施例】本発明で用いられる「アルファ分解性プロテ
アーゼ」または「ＡＬＰ」という用語は、Bone他により
Biochem 26:7609-7614で示された、３次構造（たとえば
結晶形）を有するカルシウムから独立したアルカリ性プ
ロテアーゼを指す。天然の母タンパクの１次配列は、図
２に、残基＋１から始まるものとして示されている。
「アルカリ性」という言葉は、アルカリ性範囲で、たと
えばｐＨ７．０ないし１１．０で触媒活性がｐＨ最適性
を示すことを指す。
【００１９】図２に示されたＡＬＰの１次配列には、母
タンパクにある残基の数に従って番号が振られている。
しかし、本発明では、残基「１９２」，「２１３」，
「２１７ａ」において置換を有するＡＬＰの変異体を指
している。これらの数字は、よく特徴づけられたプロテ
アーゼ・キモトリプシンのＡＬＰ配列と一致している。
このため、ＡＬＰの残基１３８は、キモトリプシンの１
９２と一致し、ＡＬＰの残基１５８は２１３と、また残
基１６３は２１７と一致している。
【００２０】ここでは、特定の微生物から「誘導され
た」アルカリ性プロテアーゼとは、Whitaker(1970)Meth
ods Enzymol 19:599-613により最初に識別された天然の
アルファ分解性酵素を指す。誘導された酵素は必ずしも
微生物から物理的に誘導されたものである必要はなく、
たとえば組換え型の微生物ホストからの発現などの任意
の方法で生成したものでもよい。
【００２１】一定の種の生物に自然に発生する酵素や特
定の種には多少変動があるが、同種の生物により生産さ
れる特定の種類の酵素は通常、基質の特異性，熱安定
性，さまざまな条件下（たとえば温度やｐＨ）での活性
レベル，酸化安定性などに関しては実質的に等しい。Ａ
ＬＰなどの自然に発生する酵素のこのような特性が必ず
しも産業用に活用されているわけではない。遺伝子工学
の発展によりタンパク触媒のさまざまな特性を変化させ
る方法が提供されてきたが、それに対する理解は経験的
な判定に限られている。すなわち、特定のアミノ酸置換
により、構造にわずかな変化が起こり、それが運動パラ
メータ，物理特性および自己分解活性などに予測できな
い変化を起こすことがある。そのため、ＡＬＰの１つ以
上の天然の特性を改良して、特定の洗濯環境で用いられ
る現在市販されているプロテアーゼに対して改良を加え
ることが望ましい。
【００２２】天然のＡＬＰ酵素は、安定性に関しては市
販のプロテアーゼよりも改良されていることがわかって
いるが、本発明によりさらに、いくつかのＡＬＰ変異体
が提供される。洗剤に利用することのできるこれらのＡ
ＬＰ変異体（またはそれと機能的に同等なもの）は、産
業用に有利だと思われる天然酵素の物理特性を示す。こ
れには、熱安定性の増加，耐酸化性，天然酵素の触媒性
を犠牲にすることなく洗浄性能が向上することなどが含
まれ、またこれだけに限らない。
【００２３】ＡＬＰの野生種とその変異体は、天然のＡ
ＬＰまたはサブチリシンよりも強化された熱安定性を示
す。熱安定性は溶液内でのタンパク質の総合的な耐性の
よい指標となる。高度な熱安定性を示すタンパク質は、
カオトロピック剤や洗剤が存在する場合や、タンパク質
を不活性にしやすいその他の条件下でも安定であること
が多い。そのため、タンパク質の生来の安定性を改善す
ることが、耐高温性，厳しい溶媒条件または貯蔵寿命の
延長が要求される産業用の用途にも有効であると期待さ
れる。部位特定および無作為の方法の両者の突然変異体
を用いて安定性が語られているが、これはサブチリシン
・プロテアーゼへのカルシウム結合を改良することによ
り溶液安定性を高めるためである（Amgen, Inc.出願のW
O88/08033参照）。示差走査熱量測定を用いると、プロ
テアーゼの安定性は酵素の変性（溶融）温度（Ｔm）の
判定により評価することができる。さらに、３００個以
上の一連のサブチリシン突然変異体に関して、示差走査
熱量測定を用いてＴm値を測定して得られた安定性のラ
ンクづけは、長期貯蔵寿命と相関関係があることが証明
されている（Casteleijn、WO91/00334参照）。
【００２４】酵素の準備 ＤＮＡ配列をコード化する天然ＡＬＰは、ヌクレオチド
置換で、またＡＬＰ変異体は、機能的に同等の変異体酵
素となる置換，追加または削除で変性させることができ
る。たとえば、遺伝コードの変質により、図２に示され
るものと実質的に同じアミノ酸配列をコード化する他の
ＤＮＡ配列は、ここで示す目的のアミノ酸の位置を含め
て、本発明の洗浄性組成物に用いられるプロテアーゼを
生成するために用いることができる。
【００２５】このため、ＡＬＰの特定の残基のある機能
を識別することにより得られる情報を用いて、天然の酵
素と類似の特性を有する他の変異体を生成することがで
きる。たとえば、配列内の重要でない領域の１個以上の
アミノ酸残基を、機能的に同等に振舞う類似の極性を持
つ他のアミノ酸に置換することができる。結果としての
酵素の活性に影響を与えないアミノ酸の置換物として
は、その置換が酵素の活性部位または臨界部位でない限
り、目的のアミノ酸が属する他の分類の構成物から残基
が選択されたものである。
【００２６】さらに、置換物群を組み合わせて、特性が
改良された他の分類の変異体を生成してもよい。たとえ
ば、１個以上のアミノ酸残基の置換物を以下の例１に示
される情報を用いて１個の分子に組み合わせることがで
きる。あるいは、ライゾバクテールに密接に関連した他
の微生物から誘導されたアルファ分解性プロテアーゼを
改良することもできる。関連性の近密度すなわち相同性
は、配列を比較することにより測定することができる。
タンパク質の配列を一致させる方法は数多くあるが、近
密度の度合が小さいときにその差が顕著になる。SEARCH
and ALIGNという題名で、ワシントンＤ．Ｃ．のGeorge
town University Medical CenterのNational Biomedica
l Research FoundationのM.O. Dayoff, editor, vol.5,
supplement 2 (1976)によるAtlas of Protein Sequenc
e and Structureに示された方法により、その関連性が
定義されている。
【００２７】当技術ではよく知られていることである
が、同類のタンパク質は、アミノ酸の数と、鎖の各アミ
ノ酸の識別記号とが異なることがある。すなわち、２個
の構造が最大の一致を示しているとき、削除または挿入
が有り得る。目的のプロテアーゼに置換される残基がた
とえばライゾバクテール酵素種の残基に類似の対応物を
有するとすると、ライゾバクテール酵素種のＡＬＰに起
きる望ましい突然変異体を、目的のプロテアーゼとし
て、１つ以上の特性の向上を導くことができる。
【００２８】本発明のためのＡＬＰ変異体の発達は、Ａ
ＬＰの活性部位領域にある目的の残基に集中している。
Bone他（１９８９年）によるsupraの初期研究（１９２
番目と２１３番目のメチオニン残基を目的とした）で
は、合成のテトラペプチド誘導体を用いた基質の特異性
の変化に言及している。合成ペプチド基質に対する特異
性の変化が示されているが、繊維上のタンパク質性の汚
れに対する実際の設定におけるこれらの改良されたプロ
テアーゼの利用はよく理解されていない。特に合成ペプ
チド基質は、広い特異性を数量化することはできるが、
これらの測定可能な変化が酵素の長所を予測させるよう
な実際の利点を持つこと（すなわち洗浄性組成物のマト
リクス内で、タンパク性の汚れが除去できるなど）を示
してはいない。
【００２９】ＡＬＰの類似種を準備する技術は、当業者
にはよく知られており、これには、部位を特定した突然
変異が含まれる（Sambrook, Fritsch & Maniatis, Mole
cular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition
(1989)）。この方法には、プロテアーゼＤＮＡ配列内
の所定の部位における少なくとも１個のアミノ酸の変
態，削除および／または挿入が含まれる。たとえば、カ
セット突然変異として知られる手順では、制限部位が、
目的のコドンまたはコドン群の近くに位置するプロテア
ーゼ遺伝子に誘導され、その部位間のフラグメントが除
去される。二重合成ＤＮＡカセットは、目的の部位で変
性コドンを誘導するよう設計されており、制限ＤＮＡに
結合されて、プロテアーゼのコード化配列を回復するよ
うになっている。
【００３０】別の手順では、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を採用して、希望の遺伝子の一部を増幅している
（本件に参考文献として含まれる米国特許第４，６８
３，２０２号および第４，９６５，１８８号を参照）。
アニーリングされるＤＮＡらせん構造に完全に相補的に
はならない少なくとも１個のプリマーを設計することに
より、すなわち、不整合性が変更されるヌクレオチドを
包含することで、コドン変化を内包する希望のＤＮＡを
簡単に増幅し、増幅されたＤＮＡ製品を実質的に目的の
遺伝子配列に結び付けることができる。
【００３１】洗浄性組成物 本発明のプロテアーゼを洗剤，洗浄研磨剤，漂白剤およ
びその他の従来の成分と結合させて、洗濯やその他の洗
浄技術、たとえば洗剤（粉末および液体），洗濯用予浸
剤，全繊維用漂白剤，自動食器洗い器用洗剤（液体およ
び粉末），住宅用洗剤特に配水管の洗浄性組成物に用い
ることのできる、さまざまな新規の洗浄性組成物を生産
することができる。また、ＡＬＰは、コンタクト・レン
ズやその他の膜を、本洗浄性組成物の水溶液に接触させ
ることにより、このような素材の洗浄に用いることもで
きる。
【００３２】本発明の、プロテアーゼを含む洗浄性組成
物には、洗濯用洗剤，洗濯用予浸剤，（漂白剤）および
自動食器洗い器用洗剤がある。このような製品の組成
は、本発明にとっては重要ではなく、有効量のＡＬＰ酵
素を、それぞれの技術で認知されている量の合成物の従
来の成分と組み合わせることにより、これらの製品は簡
単に調整することができる。
【００３３】界面活性剤 本発明の洗浄性組成物は、陰イオン系，陽イオン系また
は非イオン系の界面活性剤から選択された少なくとも１
つの界面活性剤を含む。特に有効な界面活性剤は、非イ
オン系であると思われる。好適な界面活性剤としては、
Neodolの商標名でShell Chemical Companyにより販売さ
れているような、線形エトキシレート・アルコールであ
る。その他の好適な非イオン系界面活性剤としては、６
ないし１６個の炭素原子の平均長と、アルコール１モル
について約２ないし２０モルの酸化エチレンを持つ他の
線形エトキシレート・アルコール；平均長約６ないし１
６炭素原子で、アルコール１モルにつき、平均０ないし
１０モルの酸化エチレンおよび約１ないし１０モルの酸
化プロピレンを持つ線形および枝分かれ１次および２次
エトキシレート，プロポシキレート・アルコール平均鎖
長８ないし１６個の炭素原子とアルコール１モルにつき
平均１．５ないし３０モルの酸化エチレンを持つ線形お
よび枝分かれアルキルフェノキシ（ポリエトキシ）アル
コールまたはエトキシレート・アルキルフェノール；お
よびそれらの混合体がある。
【００３４】さらに好適な非イオン系界面活性剤として
は、ポリオキシエチレン・カルボキシル酸エステル，脂
肪酸グリセロール・エステル，脂肪酸およびエトキシレ
ート脂肪酸アルカノラミド，酸化プロピレンおよび酸化
エチレンの一定のブロック共重合体，およびブロック重
合体または酸化プロピレンおよび酸化エチレンとプロポ
キシレート・エチレン・ジアミンでもよい。アミン酸化
物、ホスフィン酸化物，スルホキシド，それらのエトキ
シレート誘導体などの半極性非イオン系界面活性剤もあ
る。
【００３５】陰イオン系界面活性剤も適している。この
ような陰イオン系界面活性剤の例としては、アンモニ
ア，置換アンモニア（たとえば、モノ−，ジ−，および
トリエタノールアンモニア），アルカリ金属，Ｃ6−Ｃ
20脂肪酸およびロジン酸のアルカリ土類金属塩，線形お
よび枝分かれアルキル・ベンゼン・スルフォナート，ア
ルキル硫酸塩，ヒドロキシアルキル硫酸塩，脂肪酸モノ
グリセリド硫酸塩，アルキル・グリセリル・エーテル硫
酸塩，アシル・サルコシナート，アシルＮ−メチル・タ
ウライドなどがある。
【００３６】好適な陽イオン系界面活性剤としては、窒
素原子に結合している基のうち通常１個がＣ12−Ｃ18ア
ルキル基であり、残りの３基が、フェニール基などの非
活性置換物を持つ短鎖アルキル基であるような、４次構
造のアンモニア化合物がある。
【００３７】さらに、陰イオン系水溶基，陽イオン系
基，疎水性有機基を含む、適切な両性および双極性界面
活性剤としては、アミノ・カルボキシル酸とその塩，ア
ミノ・ジカルボキシル酸とその塩，アルキルベタイン，
アルキル・アミノプロピルベタイン，スルホベタイン，
アルキル・イミダゾリニウム誘導体，ある種の４次アン
モニア化合物，ある種の４次ホスホニウム化合物，ある
種の３次スルホニウム化合物がある。好適なものとなり
うる双極性の界面活性剤の他の例は、本件に参考文献と
して含まれている、米国特許第４，００５，０２９号の
コラム１１−１５に見ることができる。
【００３８】本発明で用いることが適している陰イオン
系，非イオン系，陽イオン系および両性の界面活性剤の
別の例は、Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Te
chnology, 第３版、第２巻347-387ページと、McCuteche
on s Detergents and Emulsifiers, North American Ed
itoin, 1983に示され、これらは、本件に参考文献とし
て含まれている。
【００３９】洗浄研磨剤 本発明の洗浄性組成物は、鉱物硬度の制御を助けるため
の、無機または有機の洗浄研磨剤（ビルダー）を任意に
含むことができる。これらの研磨剤は、組成重量の０な
いし約８０％とすることができる。研磨剤を含むとき
は、これらの研磨剤は通常、洗剤の組成の重量の約６０
％までとする。調整された液体調剤は、約１０ないし約
２５％の洗浄研磨剤を含むことが好ましく、粒子調剤で
は約１０ないし約５０％の重量の洗浄研磨剤を含むこと
が好ましい。
【００４０】適切な洗浄研磨剤としては、本件に参考文
献として添付されている米国特許第４，６１１，２８８
号に開示されている、結晶性アルミノシリケート・イオ
ン交換物質がある。
【００４１】洗浄研磨剤の他の例としては、さまざまな
水溶性アルカリ金属，アンモニアまたはアンモニア置換
リン酸塩，ポリリン酸塩，ホスホネート，カルボキシレ
ート，ポリカルボキシレートなどがある。アルカリ金
属、特にナトリウムと上記の塩が好ましい。
【００４２】その他のオプションの洗浄成分 本発明の洗浄性組成物に含有することのできる、他のオ
プションの洗浄成分は、従来の技術で確立されたレベル
で用いられ（すなわち０ないし約２０％）、これに含ま
れるのは、溶剤，漂白剤，漂白活性剤，汚れ浮遊剤，腐
食防止剤，染料，充填剤，殺菌剤，ｐＨ調整剤（モノエ
タノラミン，炭酸ナトリウム，苛性ソーダなど），酵素
安定剤，香料，繊維柔軟成分，静電気制御剤などであ
る。
【００４３】染料には、アントラキノンおよび類似の青
色染料がある。群青（ＵＭＢ）などの顔料も用いること
ができ、ＵＭＢを含む漂白剤で洗濯した繊維に付着させ
ることにより、青色化効果を持つ。モナストラル色素も
含有することができる。
【００４４】スチルベン，スチレン，スチルナフタレン
増白剤（蛍光増白剤）などの光学増白剤を含有すること
もできる。美的な目的で用いられる香料は、Norda, Int
ernational FlavorsおよびFragrances and Givaudonか
ら、市販されている。安定剤としては、硫酸マグネシウ
ムなどの加水塩や、ホウ酸塩がある。
【００４５】洗剤の調剤 本発明の洗浄性組成物を具体化する粒子状または乾燥調
剤は、従来の技術、すなわち水中で個々の成分をスラリ
ー化して、できあがった混合物を噴霧およびスプレー乾
燥させるか、あるいは成分をパンまたはドラムで粒子化
することにより形成することができる。粒子状調剤の場
合は、通常陰イオン系の約１０ないし約３０％の界面活
性剤によって構成されることが好ましい。
【００４６】洗浄性組成物を具体化する液体調剤も、研
磨剤含有（built）または未含有（unbuilt）とすること
ができる。未含有の場合は、これらの合成物は従来は、
約１５ないし５０％の総合界面活性剤，０ないし１０％
のモノ−，ジ−またはトリ−アルカノル・アミンなどの
有機塩基，アルカリ金属水酸化物などの中性化系および
エタノールまたはイソプロパノールなどの低級第１アル
コールと約２０ないし８０％の水とを含む。このような
合成物は一般的には、粘度の低い（華氏７５度において
約１００ないし１５０センチポアズ）均一な単相液であ
る。本発明の液体洗浄合成物は、重量で約０．５ないし
２．５％のプロテアーゼ酵素調剤を含むことが好まし
い。
【００４７】研磨剤を含有した液体洗浄合成物は、研磨
剤が使用レベルにおける混合物に溶解しているときは、
単相の液体の形とすることができる。このような液体
は、従来は１０ないし２５％の総合界面活性剤，有機ま
たは無機の１０ないし２５％の研磨剤，３ないし１０％
の屈水性誘発物質系と４０ないし７７％の水を含む。こ
のような種類の液体もまた、粘度は低い（摂氏７５度で
１００ないし１５０センチポアズ）。異成分の混合物を
形成する成分を含む研磨剤（または、完全に溶解できな
いレベルの研磨剤）入りの液体洗剤も、本発明の洗浄性
組成物を構成することができる。このような液体は、従
来、塑性せん断特性を有する系を生成するための粘度改
良剤を利用して、安定した拡散を維持し、位相の分離や
固形分の沈澱を防いでいる。
【００４８】以下の例は、本発明の実行の特定の説明を
行うためのものであるが、請求項の範囲を制限するもの
ではない。 例 例１．部位を特定した突然変異，発現およびアルファ分
解性プロテアーゼの精製 Ａ．遺伝子の突然変異と発現 ペプチド結合の広いスペクトルを効率よく加水分解する
ことのできるＡＬＰ分子の変異体が生成された。最近の
研究では、基質結合ポケット内のこの特定のアミノ酸
が、合成基質に対するＡＬＰのタンパク質分解特異性を
決定する際に重要であることが証明されている（Bone
他、supura）。これらの残基は、１９２番目のメチオニ
ン（Ｍ１９２）と、２１３番目のメチオニン（Ｍ２１
３）である。さらに２１７ａ番目のバリン（Ｖ２１７
ａ）も、基質の結合ポケットの大きさを決定する際に重
要な役割を果たすことがある。これら３つの位置に特定
のアミノ酸変化を含む突然変異体のＡＬＰ分子の集まり
が構築された。この突然変異は、Bio-Rad から出ている
「Muta-Gene」突然変異キットを用いて、メーカーの指
示に従って行われた。このキットは、Kunkel他（１９８
７）により、Methods in Enzymol 154:367-382に説明さ
れている計画に基づいたものである。すべてのアニーリ
ング反応の鋳型として、プラスミドｐＤＡ１６ＸＭ（Si
len他(1989) J Bacteriol 171:1320-1325）が採用され
た。ＤＮＡ配列による望ましい突然変異の識別に続き、
便利なＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いて、それ
ぞれが発現ベクトルｐＡＬＰ５（Silen他(1985)supra；
図１参照）に、サブクローン化された。生成された突然
変異体と、それを作るために用いられたオリゴヌクレオ
チドを、以下にリストアップする：
【００４９】 １９２番目： 野生種 5'- GCC GCG GCC CAT GCA CGC GT -3' MG192 5'- GCC GCG GCC GCC GCA CGC GT -3' MF192 5'- GCC GCG GCC GAA GCA CGC GT -3' MD192 5'- GCC GCG GCC GTC GCA CGC GT -3' MS192 5'- GCC GCG GCC CGA GCA CGC GT -3' MA192 5'- GCC GCG GCC CGC GCA CGC GT -3'
【００５０】 ２１３番目： 野生種 5'- GCC GCC CGA CAT CAC GCC CT -3' MG213 5'- GCC GCC CGA GCC CAC GCC CT -3' MS213 5'- GCC GCC CGA CGA CAC GCC CT -3' ML213 5'- GCC GCC CGA CAG CAC GCC CT -3' MT213 5'- GCC GCC CGA GGT CAC GCC CT -3' MV213 5'- GCC GCC CGA CAC CAC GCC CT -3' MF213 5'- GCC GCC CGA GAA CAC GCC CT -3' MD213 5'- GCC GCC CGA GTC CAC GCC CT -3' MA213 5'- GCC GCC CGA CGC CAC GCC CT -3'
【００５１】 ２１７ａ番目： 野生種 5'- GTT GGA CTG CAC GTT GCC GC -3' VS217a 5'- GTT GGA CTG CGA GTT GCC GC -3' VA217a 5'- GTT GGA CTG CGC GTT GCC GC -3' VF217a 5'- GTT GGA CTG GAA GTT GCC GC -3' VD217a 5'- GTT GGA CTG GTC GTT GCC GC -3'
【００５２】上記の表にリストアップされたそれぞれの
突然変異体では、最初の字が野生種分子にあるアミノ酸
を示す；２番目の文字が挿入された新しい残基を示し、
番号は変化が起こったタンパク質内の位置を表す。すな
わち、ＭＧ１９２は１９２番目のメチオニンからグリシ
ンへの変化である。
【００５３】以下にリストアップした突然変異に加え、
３個の二重突然変異体が作られた（ＭＡ１９２／ＭＧ２
１３，ＭＡ１９２／ＶＳ２１７，ＭＳ２１３／ＶＡ２１
７ａ）。このうち２つは、突然変異の鋳型はｐＤＡ１６
ＸＭではなく、ＭＡ１９２突然変異を含むプラスミドの
変異体である。これは、ｐＡＬＰ５ＭＡ１９２から７６
２塩基対のＢａｍＨＩフラグメントを、Ｍ１２ｍｐ１８
のＢａｍＨＩ部位にサブクローン化することにより簡単
に得られた。その結果でき上がったファージＤＮＡを、
次にＭＧ２１３およびＶＳ２１７オリゴヌクレオチドの
鋳型として用いて、二重突然変異体を作った。これらの
突然変異体は、ＤＮＡの配列と上記のようなｐＡＬＰ５
へのサブクローン化により識別される。第３の変異体
は、ＭＳ２１３突然変異体に対するスクリーニング中の
配列により識別された。
【００５４】図２及び図３は、プレプロペプチド配列，
コード化配列，対応するアミノ酸配列を含む天然のＡＬ
Ｐ遺伝子のＤＮＡ配列を示したものである。プレプロペ
プチド配列は（−１９８）番目から始まる。また、図２
及び図３には、置換が行われた変性コドンとアミノ酸の
位置が示されている。ＤＮＡで行われた置換には、一定
の制限酵素により認定される開裂配列を誘導するものも
ある；このような置換では、対応するアミノ酸は変性し
ない。特に、１００５番目のＣからＧへの置換は、Ｍｌ
ｕＩ部位を導入するために行われ、ＡＧＣからＴＣＧへ
の置換は、ＸｈｏＩ制限部位を導入するためにヌクレオ
チド１１２９−１１３１で行われた。 Ｂ．精製 この手順は、ＭＡ１９２またはＭＡ２１３酵素を含む野
生種ＡＬＰまたはＡＬＰの変異体の１０リッター・スケ
ールの発酵の典型的な精製を示したものである。
【００５５】約１０リッターの発酵ブロスが、Amiconの
限外濾過システムを用いて、０．２ミクロンの中空ファ
イバ・カートリッジで濾過された。濾液は、同じシステ
ムと、Amicon S10Y3カートリッジ（３，０００分子量カ
ットオフ「ＭＷＣＯ」）とを用いて約１リッターに濃縮
された。この限外濾液が、同じカートリッジを用いて、
１５リッターの水に対してダイアフィルトレーションさ
れる。
【００５６】限外濾液濃縮液は、ｐＨ７．２に調整さ
れ、１００ｍＬのカロボキシメチルセルローズの放射流
カラムに吸着された。プロテアーゼは、ｐＨ７．２に調
整された、１０Ｍｍのリン酸ナトリウム内で、０．２Ｍ
の塩化ナトリウムを用いて、カラムから抽出された。
【００５７】カルボキシメチルセルローズのカラムから
のプロテアーゼ活性を含む分画が結合され、脱イオン化
された水に５倍希釈され、酢酸によりｐＨ５．５に調整
された。この材料が、２０ｍＭの酢酸ナトリウムで平衡
状態となり、ｐＨ５．５に調整された２０ｍＬのモノＳ
スルホプロピル陽イオン交換カラム（Pharmacia）に塗
布された。プロテアーゼは、ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢
酸ナトリウム１２０ｍＬ内で、０−０．０２５Ｍの塩化
ナトリウムの線形傾斜を用いて抽出された。
【００５８】モノＳ陽イオン交換カラムから来たプロテ
アーゼを含む分画を結合させ、混合したイオン交換樹脂
（ＡＧ５０１−Ｘ８，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて脱塩し
た。
【００５９】例２．ｐＨおよび温度プロフィル Ａ．加水分解活性の評価 各プロテアーゼの加水分解活性が、それぞれのプロテア
ーゼに取って好適な合成ペプチド・パラニトロアニリド
基質を用いて測定された。野生種のアルファ分解性プロ
テアーゼ，ＭＧ２１３，ＭＴ２１３，ＭＬ２１３，ＭＳ
２１３については、好適な基質は、スクシニル−アラ−
プロ−アラ−パラ−ニトロアニリド（ｓＡＰＡｐＮＡ）
である。検証されたその他のすべてのプロテアーゼにつ
いては、好適な基質は、スクシニル−アラ−アラ−プロ
−フェ−パラ−ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦｐＮＡ）で
ある。この評価における基質の濃度は、ｓＡＰＡｐＮＡ
については５ｍＭ，ｓＡＡＰＦｐＮＡについては１ｍＭ
であった。
【００６０】活性は、４０５ｎｍにおけるパラ−ニトロ
アニリドの放出をモニタすることにより評価される。活
性は、吸光係数＝１０．４ｍＭ-1−ｃｍ-1を用いて、１
または３ｍＬのキュベット内で分光測光的に判定する
か、あるいは、吸光係数＝５．８４ｍＭ-1を用いて、体
積０．２ｍＬのマイクロ滴定プレートリーダーで判定し
た。プロテアーゼと、基質とは、ｐＨ８．０に調整され
た１００ｍＭのTris緩衝液に希釈され、少なくとも２分
間の線形速度を与えるようにした。分析は摂氏２５度で
行った。
【００６１】Ｂ．ｐＨの関数としての活性 ｐＨ５．０ないし１２．０の範囲で評価溶液のｐＨを可
変することにより、特定のプロテアーゼの最大活性パー
センテージ（最高測定活性のパーセンテージ）を測定す
ることにより、最適な加水分解活性が判定された。最適
な活性は、上記の加水分解活性の評価により、最大活性
の３０％以上と定義されている。
【００６２】これらの評価のそれぞれで用いられた緩衝
液は、すべて０．１ Ｍ ＫＣｌを含有し、以下の性質
を持つ： ｐＨ３．８：２０ｍＭギ酸エステル ｐＨ４．７：２０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ６．１：２０ｍＭ ＭＥＳ （２−［Ｎ−モルホリノ］エタン・スルホン酸） ｐＨ６．８：２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ （１，４−ピペラジン・ジエタン・スルホン酸） ｐＨ７．２：２０ｍＭ リン酸 ｐＨ８．０：２０ｍＭ Tris ｐＨ８．４：２０ｍＭ ＴＡＰＳ （トリス［ヒドロキシメチル］メチルアミノプロパン・
スルホン酸） ｐＨ９．２：２０ｍＭ ＣＨＥＳ （２−［Ｎ−シクロヘキシラミノ］エタン・スルホン
酸） ｐＨ９．８：２０ｍＭ グリシン ｐＨ１０．４：２０ｍＭ 炭酸塩 ｐＨ１２．０：２０ｍＭ リン酸。
【００６３】これらの実験の結果を表１に示す。 表 １ 最大活性％ 酵素 ｐＨ 5 6 7 8 9 10 11 12 wt ALP 2 19 75 88 95 99 100 95 MA192 3 19 54 75 100 89 80 25 MA213 2 21 71 84 89 91 100 79 MS192 2 21 79 89 100 91 97 55 MA192/MG213 4 20 62 82 100 94 100 62 MS213/VA217a 1 16 69 85 100 95 100 72 MG213 1 8 45 59 92 99 100 92 MT213 1 11 48 59 94 97 100 88 ML213 2 16 63 65 98 96 100 88 MS213 1 10 48 59 96 97 100 89 アルカラーゼR 2 14 50 72 95 100 82 9 サビナーゼR 4 4 5 52 94 100 96 2 結果は、ｐＨ６ないし８では、アルファ分解性プロテア
ーゼと、試験されたすべての変異体酵素とは、アルカラ
ーゼ（Alcalase）Rまたはサビナーゼ（Savinase）Rより
も高い加水分解活性を示す。洗濯水のｐＨが乾燥品より
もはるかに低い液体洗剤についてはこれは非常に重要で
ある。野生種のＡＬＰとその変異体とは、７ないし１２
のｐＨ範囲で最適活性を有する。ｐＨ１２では、すべて
のアルファ分解性プロテアーゼは、サビナーゼRまたは
アルカラーゼRよりも高い活性を示す。
【００６４】Ｃ．温度プロフィル 加水分解活性の評価を用いて、適切な温度にあらかじめ
平衡状態となっているｐＨ８の緩衝反応溶液に酵素を加
えることにより、野生種のアルファ分解性プロテアーゼ
の活性が温度関数として判定された。この実験の結果を
図４に示す。
【００６５】このデータは、アルファ分解性プロテアー
ゼが、広い温度範囲において働き、最適活性（３０％以
上）は摂氏１５度ないし７０度であることを示してい
る。
【００６６】例３．比タンパク質分解活性の分析 特定のプロテアーゼの比タンパク質分解活性は、ｐＨ９
でカゼインを基質として用いて判定された。この評価で
は、フォリン・シオカルト試薬の反応による標準条件下
（摂氏２５度、ｐＨ９．０で３０分の培養）でのプロテ
アーゼの培養中に放出された、３塩化酢酸に溶解するペ
プチドを測定する。比活性は、チロシン標準との比較に
より決定された。１単位は、１分あたり１ｕｇのチロシ
ンに同等の反応をする、酵素放出ペプチドの量として定
義される。比活性は、摂氏２５度、ｐＨ９．０で３０分
間の培養の後、判定された。表２にその結果を示す。 表２ 比活性 酵素 ug Tyr/mg.min wtアルファ分解性プロテアーゼ 33 MA192 13 MA213 22 アルカラーゼ 220 サビナーゼ 270
【００６７】例４．熱安定性 摂氏５０度の溶液中での、野生種のアルファ分解性プロ
テアーゼと、突然変異体ＭＡ１９２およびＭＡ２１３と
の熱安定性を検証し、現在利用されている洗剤用プロテ
アーゼであるサビナーゼRおよびアルカラーゼRと比較し
た。酵素は、１ｍｇ／ｍＬの濃度で、摂氏５０度におい
て３種類のｐＨ値で培養された：すなわちｐＨ５（５０
ｍＭ酢酸、１０ｍＭ ＣａＣｌ2），ｐＨ８（５０ｍＭ
Bicine、１０ｍＭ ＣａＣｌ2），ｐＨ１０．５（５
０ｍＭ ＣＡＰＳ，１０ｍＭ ＣａＣｌ2）である。適
当な時点で、アリコートが除去され、加水分解活性の分
析で述べられた好適な合成ペプチド基質に対する活性が
分析された。すべての酵素の不活性は、１次動性を示
し、活性は少なくとも２半減期にわたって監視された。
その結果を表３に示す。
【００６８】表３ 摂氏５０度でｔ１／２（時間） 酵素 ｐＨ ｐＨ ｐＨ10.5 wt ALP 65 10 6 MA192 170 28 6 MA213 1000 110 8 サビナーゼ 27 6 4 アルカラーゼ 30 4 8 このデータは、ｐＨ５およびｐＨ８において、突然変異
体ＭＡ１９２およびＭＡ２１３の両方とも、野生種の酵
素よりも安定であることを示している。特に、ＭＡ２１
３は、野生種の酵素に比べ、非常に安定である。さら
に、アルファ分解性プロテアーゼと、試験された突然変
異体とは、ｐＨ５およびｐＨ８において、サビナーゼR
またはアルカラーゼRのいずれよりも実質的に安定であ
る。酵素の不安定性のために製品の貯蔵寿命が制限され
る液体洗剤にとって、これは重要である。また、逆に、
ｐＨ１０．５におけるプロテアーゼ間での安定性のばら
つきはあまり目立たない。
【００６９】また示差走査熱量測定によっても、プロテ
アーゼの熱安定性が検証され、タンパク質の変性温度が
決定された。変性温度は、タンパク質の熱力学的安定性
に直接関連し、耐展開（unfolding）性の尺度となる。
類似のタンパク質の変性温度（Ｔm）を比較することに
より、熱安定性のランクづけができる（Pantoliano他、
(1989) Biochem 28:7205-7213）。
【００７０】熱量測定は、Setaram Micro DSCを用い
て、毎分０．７度の走査速度で行われた。プロテアーゼ
は、自己分解を防ぐために、アルカラーゼRとサビナー
ゼRについては１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニ
ル，アルファ分解性プロテアーゼと突然変異体について
は、１ｍＭのジイソプロピルフロロフォスフェートを用
いて、分析に先立ち不活性としておく。熱量測定は、２
−４ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でｐＨ５．０（５０ｍ
Ｍ酢酸、１０ｍＭ ＣａＣｌ2）、またはｐＨ８．０
（５０ｍＭのBicine、１０ｍＭ ＣａＣｌ2）で行っ
た。変性温度は、変性内温動物の中間点で判定された。
【００７１】これらの測定結果を表４にリストアップす
る。 表４ Ｔｍ（゜Ｃ） 酵素 ｐＨ５ ｐＨ８ wt ALP 78.6 73.2 MA192 79.1 73.7 MG213 80.0 73.0 ML213 81.6 nd MT213 83.0 nd MA213 83.0 76.5 サビナーゼ 73.4 71.4 アルカラーゼ 71.5 69.1 nd = 未判定 いずれのｐＨ値においても、アルファ分解性プロテアー
ゼの変性温度がサビナーゼRやアルカラーゼRの変性温度
に比べて高いことは、アルファ分解性プロテアーゼがサ
ビナーゼRとアルカラーゼRのいずれよりも、本質的によ
り安定であることを示している。野生種の酵素に比べ、
変異体の変性温度が高いことは、これらすべての突然変
異により熱安定性が増大したことを示している。
【００７２】例５．洗剤の安定性／洗濯性 通常の乾燥洗剤および液体洗剤中のアルファ分解性プロ
テアーゼの安定性を、アルカラーゼRおよびサビナーゼR
の安定性と比較した。
【００７３】酵素は、使用レベルの洗剤１００ｕｇ／ｍ
Ｌで、１２分間摂氏５０度（熱湯洗浄）で培養した。培
養終了時の残渣活性を、カゼイン活性分析により判定し
た。その結果を表５に示す。 表５ 摂氏５０度で１２分間後の％活性残渣 酵素 粉末a 液体b wt ALP 91 99 MA192 75 78 MA213 83 80 アルカラーゼ 21 60 サビナーゼ 33 94 a：界面活性剤９．１％，研磨剤７７．９％，その他１
３％、漂白剤，繊維漂白剤，その他の少量成分を含む。 b：界面活性剤３２．５％，研磨剤１．１％，水５２．
４％，その他１３％、繊維漂白剤，溶剤，安定剤，その
他の少量成分を含む。
【００７４】この結果から、アルファ分解性プロテアー
ゼと試験された突然変異体とは、通常の熱湯洗濯条件下
で、初期活性の少なくとも７５％を維持することがわか
る。アルカリ性洗濯条件下（すなわち粉末洗剤）では、
活性のレベルはアルカラーゼRまたはサビナーゼRの少な
くとも２倍となっている。液体洗剤においても、アルカ
ラーゼと比較すると安定性が強化されていることがわか
る。
【００７５】アルファ分解性プロテアーゼと突然変異体
との洗濯性能を、市販されている洗剤用プロテアーゼで
あるアルカラーゼR，サビナーゼR，エスペラーゼRと、
ビーカー内で比較した（表６参照）。これらの実験で用
いられたタンパク質レベルは、カゼインに対する等しい
タンパク質分解活性により判定された。ｐＨ９またはｐ
Ｈ１０．５に調整された、使用レベル（１．９ｇ／Ｌ）
の液体洗剤溶液（WiskR, Lever Bros., １９％陰イオン
系界面活性剤（ＮａＬＡＳ），７％の非イオン系界面活
性剤（ＡＥＯ），７％の屈水性誘発物質，１０％の研磨
剤（Nacitrate），０．０９％の増白剤，５６％の水と
０．１％のその他の成分）内で、摂氏２５度において木
綿の小ぎれから草の汚れをどの程度除去できるかについ
てプロテアーゼが分析された。結果は、酵素を含まない
制御剤に比較して汚れの落ちた割合として示され、表６
に示される。
【００７６】 表６ △％ＳＲＥ 酵素 ｐＨ９ ｐＨ１０．５ wt ALP 5.3 0 MA192 4.4 22.4 MA213 9.7 23.6 アルカラーゼ 11.2 11.8 エスペラーゼ 9.2 15.5 サビナーゼ 6.8 14.9 この実験の結果から、アルファ分解性プロテアーゼ突然
変異体ＭＡ１９２およびＭＡ２１３は、ｐＨ１０．５に
おいて長所が強調されていることがわかる。
【００７７】同じ重量（０．５ｍｇ活性プロテアーゼ／
ｅ）を基準とし、摂氏３７度で、ｐＨ１０．５の粉末洗
剤（１０４ｇ／６９リッター）を用いて準備された溶液
内で草の汚れの除去が同様に比較された。その結果を表
７に示す。 表７ 酵素 △％ＳＲＥ サビナーゼ 51 wt ALP 32 MA192 31 MA213 52 ML213 45 MS213 44 MT213 46 MG213 44 MS192 48 MS213/VA217a 53 LSD （最小有意差） ＝ ７．０％ アルファ分解性変異体の性能は、ＭＡ１９２を例外とし
て、洗剤液内のプロテアーゼを等しくして用いた草の汚
れ除去に対する場合のサビナーゼRに等しかった。
【００７８】例６．酸化に対する安定性 示差走査熱量測定を用いて、アルファ分解性プロテアー
ゼと突然変異体ＭＡ１９２およびＭＡ２１３の安定性に
対して、酸化が与える効果を検証した。酵素は、ｐＨ５
の５０ｍＭの酢酸，１０ｍＭのＣａＣｌ2中の０．５％
過酸化水素で、１６時間、摂氏２５度で培養された。未
反応の過酸化水素は、少量のカタラーゼを添加すること
により破壊された。変性温度は例４と同様に判定され
た。その結果を表８に示す。 表８ Ｔｍ（゜Ｃ） △Ｔｍ 天然 酸化 （天然−酸化） wt ALP 78.5 71.5 7.0 MA192 79.1 76.3 2.8 MA213 83.0 76.0 7.0 酸化された酵素の変性温度が下がったことは、酸化によ
り各酵素の安定性が減少したことを示す。しかし、酸化
されていない形のＭＡ１９２およびＭＡ２１３の両変異
体の安定性のために、酸化された形のこれらの酵素も、
酸化されていない野生種の酵素とほぼ同等の安定性を持
つ。さらに、ＭＡ１９２の酸化に関してＴmの変化が小
さいことは、この位置でメチオニンが酸化に感受性のな
い残基と置換されたことによって、酸化に対する安定性
が増大していることを示す。
【００７９】アルファ分解性プロテアーゼと突然変異体
ＭＡ１９２およびＭＡ２１３の酸化に対する安定性を、
各酵素にとって好適な合成ペプチド基質に対する加水分
解活性に与える効果を検証することにより、アルカラー
ゼRおよびサビナーゼRと比較した。活性は、摂氏２５度
で、１時間、１ｍＭのBicine、１０ｍＭのＣａＣｌ2内
で、２％の過酸化水素が存在するｐＨ８において、加水
分解活性の分析の場合と同量の酵素を培養した後、加水
分解活性分析と同様の方法で評価された。その結果を表
９に示す。 表９ 初期活性％ wt ALP 39 MA192 89 MA213 95 アルカラーゼR 52 サビナーゼＲR 12 表９のデータは、野生種のＡＬＰとその変異体とは、サ
ビナーゼRに比較して酸化に対する安定性が増大してい
ることを示している。また、１９２番目または２１３番
目のメチオニンを酸化に感受性のない残基と置換するこ
とにより、酸化に対する安定性が増大する。アルファ分
解性プロテアーゼ変異体ＭＡ１９２およびＭＡ２１３は
いずれも、酸化剤がある場合に、アルカラーゼRまたは
サビナーゼRよりもかなり大きな活性を維持する。
【００８０】例７．ＡＬＰの溶液安定性に対するカルシ
ウムの効果 サブチリシン・プロテアーゼは、１カ所以上のカルシウ
ム結合部位を有する。これらのプロテアーゼが妥当な安
定性を持つには、ミリモル・レベルのＣａ+2が存在する
ことが必要である（Adebodun and Jordan (1989) Bioch
em 28:7524-7531）。結晶構造を調べても、ＡＬＰ内の
カルシウムの結合部位は明かでない。示差走査熱量測定
を用いて、カルシウム（Ｃａ+2）の存在に対するＡＬＰ
安定性の依存度がないことを証明した。サビナーゼRの
安定性のＣａ+2に対する依存度を検証して比較した。熱
量測定は例４で述べたように実行した。タンパク質溶液
は、ｐＨ５の５０ｍＭの酢酸および、ｐＨ８の５０ｍＭ
のBicine内に、両方のｐＨ値において１０ｍＭのＣａＣ
ｌ2がある場合とない場合を準備した。
【００８１】野生種ＡＬＰおよびサビナーゼRの変性温
度を表１０にリストアップしてある。さらに関しては、
ｐＨ５においてもｐＨ８においても、Ｃａ+2がある場合
は、Ｔmが大きく上昇した。一方、ＡＬＰについては、
Ｃａ+2があってもなくても、またいずれのｐＨにおいて
も、Ｔm値の差はない。ＡＬＰがＣａ+2から独立してい
ることは、Ｃａ+2を封鎖する研磨剤が存在する洗浄剤の
調剤においては、サブチリシンよりも有利である。 表１０ Ｔｍ（゜Ｃ） pH wt ALP サビナーゼ 5 -Ca++ 78.6 62.0 +Ca++ 78.6 73.4 8 -Ca++ 73.2 64.1 +Ca++ 73.2 71.4。
【００８２】例８．本発明のプロテアーゼと市販のプロ
テアーゼの洗濯性能 植物抽出物により汚された木綿繊維を用いて、全自動洗
濯機で汚れの除去性能を測定した。この実験は、以下の
条件下で、標準的な粉末洗剤を用いて行った：洗濯温度
摂氏９５度、１２分間で、すすぎ温度は摂氏６８度。そ
れぞれの処置に関して４検体の汚れが用いられた。この
実験結果を、製造された洗剤に典型的な洗濯レベルにお
いて、汚れの除去具合を％で表し、表１１に示す。 表１１ 処理 汚れの除去％ 洗剤のみ 39% サビナーゼ 0.5ug/ml 90% MA213 0.5ug/ml 89% サビナーゼ 0.7ug/ml 91% MA213 0.7ug/ml 91%。
【００８３】この実験の結果、本発明によるプロテアー
ゼ（ＭＡ２１３）の性能は、最も広く用いられている市
販の製品と同等であることがわかる。配列のリスト （１）概要 (i) 出願者： Anderson, Susan Ottoboni, Susan Tamm, Joseph (ii) 発明の名称：アルファ分解性プロテアーゼ洗浄剤 (iii) 配列数：２ (iv) 問い合わせ先： (A)宛先：McCutche, Doyle, Brown & Enersen (B)ストリート名：Three Embarcadero Center (C)都市：San Francisco (D)州：California (E)国：USA (F)郵便番号：94111 (v) コンピュータ読み取り形式 (A)媒体タイプ：フロッピー・ディスク (B)コンピュータ：IBM PC互換 (C)オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS (D)ソフトウェア：特許リリース＃１．２４ (vi) 現在の出願データ： (A)出願番号：US (B)出願日： (C)分類： (viii)代理人／代理店情報 (A)名前：Murphy, Lisabeth Feix (B)登録番号：31,547 (C)参考／文書番号：17652-002 (ix) 通信情報 (A)電話：(415)393-2403 (B)テレファックス：(415)393-2288。
【００８４】（２）配列番号（SEQ ID NO）１の情報 (i) 配列特性： (A)長さ：１１９４塩基対 (B)種類：核酸 (C)らせん構造：単一 (D)位相構造：線形 (ii) 分子種類：ＤＮＡ（ゲノム） (iii) 仮説：N (iv) アンチセンス：N (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１００５ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＣまたは
Ｇ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１００９ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＡ，Ｔ，Ｃ
またはＧ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１０１０ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＡ，Ｃ，Ｇ
またはＴ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１０１１ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＴ，Ｃ，Ｇ
またはＡ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１０６９ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＡ，Ｔ，Ｃ
またはＧ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１０７０ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＡ，Ｃ，Ｇ
またはＴ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１０７１ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＴ，Ｃ，Ａ
またはＧ」 (ix) 特徴：（Ａ）名前／キー：− (B)場所：１０８４ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＡ，Ｔ，Ｃ
またはＧ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１０８５ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＡ，Ｃ，Ｇ
またはＴ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１０８６ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＣ，Ｇ，Ｔ
またはＡ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１１２９ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＴまたは
Ａ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１１３０ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＣまたは
Ｇ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１１３１ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＧまたは
Ｃ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：− (B)場所：１１３３ (D)その他の情報：／注記＝「ここの残基はＣまたは
Ｇ」 (ix) 特徴： (A)名前／キー：ＣＤＳ (B)場所：１．．．１１９４ (D)その他の情報： (xi) 配列記述：SEQ ID NO:1: ATGTACGTAT CGAACCACCG TTCGCGCCGC GTCGCGCGCG TGTCCGTTTC CTGCCTCGTC 60 GCCGCGCTGG CGGCGATGTC CTGCGGCGCT GCGCTGGCGG CCGATCAGGT CGATCCTCAG 120 CTAAAATTCG CAATGCAGCG CGATCTGGGC ATCTTCCCGA CCCAGCTGCC GCAGTACCTG 180 CAGACCGAAA AACTCGCGCG CACCCAGGCT GCGGCGATCG AGCGCGAGTT CGGTGCTCAG 240 TTCGCCGGCA GCTGGATCGA GCGCAACGAA GACGGCAGCT TCAAGCTCGT CGCCGCGACC 300 TCGGGCGCGC GCAAGTCGAG CACGCTGGGC GGGGTGGAAG TGCGCAACGT GCGCTACAGC 360 CTCAAGCAGC TGCAGTCGGC GATGGAGCAG CTCGACGCCG GTGCCAACGC GCGGGTGAAG 420 GGCGTCAGCA AGCCGCTCGA CGGCGTGCAG AGCTGGTACG TGGATCCGCG CAGCAACGCG 480 GTGGTGGTCA AAGTCGACGA CGGCGCGACG GATGCCGGCG TCGACTTCGT CGCCCTCAGC 540 GGCGCCGACA GTGCGCAGGT GCGGATCGAA AGCTCGCCGG GCAAGCTGCA GACCACGGCC 600 AACATCGTCG GCGGCATCGA ATACTCGATC AACAACGCCT CGCTGTGCTC GGTCGGCTTC 660 TCGGTCACCC GCGGCGCGAC CAAGGGCTTC GTCACCGCCG GCCACTGCGG CACGGTCAAT 720 GCGACCGCGC GCATCGGCGG CGCGGTGGTC GGCACCTTCG CCGCGCGCGT GTTCCCCGGC 780 AACGACCGCG CCTGGGTCAG CCTGACCAGC GCGCAGACTC TGCTGCCGCG CGTGGCCAAC 840 GGCAGCAGCT TCGTCACCGT GCGCGGCAGC ACCGAGGCCG CGGTCGGCGC GGCGGTGTGC 900 CGCTCGGGCC GCACCACCGG TTACCAGTGC GGCACCATCA CCGCCAAGAA CGTCACCGCC 960 AACTACGCCG AAGGCGCGGT GCGCGGCCTG ACCCAGGGCA ACGCNTGCNN NGGCCGCGGC 1020 GATTCGGGCG GTTCGTGGAT CACCAGCGCC GGCCAGGCGC AGGGCGTGNN NTCGGGCGGC 1080 AACNNNCAGT CCAACGGCAA CAACTGCGGC ATCCCGGCCT CGCAGCGCNN NANCCTGTTC 1140 GAGCGTCTGC AGCCGATCCT GAGCCAGTAC GGCCTGAGCC TGGTCACCGG CTGA 1194。
【００８５】（２）配列番号２の情報 (i) 配列特性： (A)長さ：１９８個のアミノ酸 (B)種類：アミノ酸 (D)位相構造：線形 (ii) 分子種類：タンパク質 (ix) 特徴 (A)名前／キー：変態部位 (B)場所：１３８ (D)その他の情報：／注記＝「ここのアミノ酸は、Met,
Gly, Phe, Ser,AlaまたはAsp」 (ix) 特徴 (A)名前／キー：変態部位 (B)場所：１５８ (D)その他の情報：／注記＝「ここのアミノ酸は、Met,
Gly, Ser, Ala,Leu, Thr, Val, PheまたはAsp」 (ix) 特徴 (A)名前／キー：変態部位 (B)場所：１６３ (D)その他の情報：／注記＝「ここのアミノ酸は、Val,
Ser, Ala, PheまたはAsp」 (xi)配列記述：SEQ ID NO:2: Ala Asn Ile Val Gly Gly Ile Glu Tyr Ser Ile Asn Asn Ala Ser Leu 1 5 10 15 Cys Ser Val Gly Phe Ser Val Thr Arg Gly Ala Thr Lys Gly Phe Val 20 25 30 Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Asn Ala Thr Ala Arg Ile Gly Gly 35 40 45 Ala Val Val Gly Thr Phe Ala Ala Arg Val Phe Pro Gly Asn Asp Arg 50 55 60 Ala Trp Val Ser Leu Thr Ser Ala Gln Thr Leu Leu Pro Arg Val Ala 65 70 75 80 Asn Gly Ser Ser Phe Val Thr Val Arg Gly Ser Thr Glu Ala Ala Val 85 90 95 Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly Arg Thr Thr Gly Tyr Gln Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Thr Ala Lys Asn Val Thr Ala Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Val 115 120 125 Arg Gly Leu Thr Gln Gly Asn Ala Cys Xaa Gly Arg Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Trp Ile Thr Ser Ala Gly Gln Ala Gln Gly Val Xaa Ser Gly 145 150 155 160 Gly Asn Xaa Gln Ser Asn Gly Asn Asn Cys Gly Ile Pro Ala Ser Gln 165 170 175 Arg Ser Ser Leu Phe Glu Arg Leu Gln Pro Ile Leu Ser Gln Tyr Gly 180 185 190 Leu Ser Leu Val Thr Gly 195。
【００８６】本出願に関して、理解を明確にするために
図と例とを用いて詳細な説明を行ってきたが、請求項の
範囲内で一定の変更や修正が実行できることは明白であ
ろう。
【００８７】
【図面の簡単な説明】
【図１】さまざまなＡＬＰ変異体を表現するために用い
られた表現ベクトルｐＡＬＰ５の機能マップである。
（ここで示されているＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ制限部位
は、１個以上の変態コドンのＡＬＰ属配列を含むＤＮＡ
制限フラグメントを挿入する場合に便利な部位であ
る。）
【図２】天然のプレプロＡＬＰのＤＮＡ配列（上段）
と、対応するアミノ酸配列（下段）である。（母タンパ
クは、所定のアラニン残基より始まる。ヌクレオチドの
２つの上線部分は、ＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ制限部位を
示し、箱で囲んだ部分はアミノ酸置換の部位を示す。）
【図３】天然のプレプロＡＬＰのＤＮＡ配列（上段）
と、対応するアミノ酸配列（下段）である。（母タンパ
クは、所定のアラニン残基より始まる。ヌクレオチドの
２つの上線部分は、ＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ制限部位を
示し、箱で囲んだ部分はアミノ酸置換の部位を示す。）
【図４】温度関数として決定された、合成基質、スクシ
ニル−アラ−プロ−アラ−パラニトロアニリドを用い
た、野生のＡＬＰの加水分解活性のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョセフ・エム・タム アメリカ合衆国カリフォルニア州リバモ ア、マルクィーニー・コモン 4830

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 界面活性剤と、タンパク質を含む物質の
    除去を強化するために有効な量の以下の配列（SEQ ID N
    o.2）を有するアルカリ性セリン・プロテアーゼとによ
    って構成される洗浄性組成物であって： ［ＡＡ1-137］−Ｘａａ138−［ＡＡ139-157］−Ｘａａ
    158−［ＡＡ159-162］−Ｘａａ163−［ＡＡ164-198］ ただし、 ＡＡ1-137は、アミノ酸１ないし１３７の天然のアルフ
    ァ分解性プロテアーゼである；Ｘａａ138は、メチオニ
    ン，セリン，アラニンからなる群から選択されたもので
    ある；ＡＡ139-157は、アミノ酸１３９ないし１５７の
    天然のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘａａ158
    は、メチオニン，アラニン，スレオニン，グリシン，セ
    リン，ロイシンからなる群から選択されたものである；
    ＡＡ159-162は、アミノ酸１５９ないし１６２の天然の
    アルファ分解性プロテアーゼである；Ｘａａ163は、バ
    リン，アラニンからなる群から選択されたものである；
    およびＡＡ164-198は、アミノ酸１６４ないし１９８の
    天然のアルファ分解性プロテアーゼである；であるとこ
    ろの洗浄性組成物。
  2. 【請求項２】 アルカリ性プロテアーゼが： ａ）ｐＨ約７ないし１２の範囲のｐＨにおいて最適な加
    水分解活性を持ち； ｂ）ｐＨ約５ないし１０．５のｐＨ範囲で、水溶液中で
    安定した活性を持ち；および ｃ）ｐＨ５において摂氏約７５度よりも大きな融解温度
    を有する；特性を有する請求項１の洗浄性組成物：。
  3. 【請求項３】 アルカリ性プロテアーゼがライゾバクテ
    ール属から誘導される請求項２の洗浄性組成物。
  4. 【請求項４】 アルカリ性プロテアーゼがライゾバクテ
    ール酵素種から誘導される、請求項３の洗浄性組成物。
  5. 【請求項５】 １３８番目の残基が、アラニンとセリン
    よりなる群より選択された請求項３の洗浄性組成物。
  6. 【請求項６】 １３８番目の残基がセリンである、請求
    項５の洗浄性組成物。
  7. 【請求項７】 １５８番目の残基が、アラニン，グリシ
    ン，スレオニン，セリン，ロイシンよりなる群より選択
    された請求項３の洗浄性組成物。
  8. 【請求項８】 １５８番目の残基が、アラニン，グリシ
    ン，スレオニン，セリン，ロイシンよりなる群より選択
    された請求項５の洗浄性組成物。
  9. 【請求項９】 １６３番目の残基が、アラニンとバリン
    よりなる群より選択された請求項３の洗浄性組成物。
  10. 【請求項１０】 アルカリ性プロテアーゼが： ａ）ｐＨ約７ないし１２の範囲のｐＨにおいて最適な加
    水分解活性を持ち； ｂ）ｐＨ約５ないし８のｐＨ範囲で、水溶液中で安定し
    た活性を持ち；および ｃ）ｐＨ８において摂氏約７５度よりも大きな融解温度
    を有する；特性を有する請求項１の洗浄性組成物。
  11. 【請求項１１】 界面活性剤と、タンパク質を含む物質
    の除去を強化するために有効な量の以下の配列（SEQ ID
    No.2）を有するカルシウムに依存しないアルカリ性セ
    リン・プロテアーゼとによって構成される洗浄性組成物
    であって： ［ＡＡ1-137］−Ｘａａ138−［ＡＡ139-157］−Ｘａａ
    158−［ＡＡ159-162］−Ｘａａ163−［ＡＡ164-198］ ただし、ＡＡ1-137は、アミノ酸１ないし１３７の天然
    のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘａａ138は、
    メチオニン，セリン，アラニンからなる群から選択され
    たものである；ＡＡ139-157は、アミノ酸１３９ないし
    １５７の天然のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘ
    ａａ158は、メチオニン，アラニン，スレオニン，グリ
    シン，セリン，ロイシンからなる群から選択されたもの
    である；ＡＡ159-162は、アミノ酸１５９ないし１６２
    の天然のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘａａ
    163は、バリン，アラニンからなる群から選択されたも
    のである；およびＡＡ164-198は、アミノ酸１６４ない
    し１９８の天然のアルファ分解性プロテアーゼである；
    であるところの洗浄性組成物。
  12. 【請求項１２】 過酸化物の存在下でプロテアーゼが安
    定である請求項１の洗浄性組成物。
  13. 【請求項１３】 洗濯用洗剤または添加剤である、請求
    項１の洗浄性組成物。
  14. 【請求項１４】 前記洗濯用洗剤または添加剤が少なく
    とも１種の界面活性剤によって構成される、請求項１３
    の洗浄性組成物。
  15. 【請求項１５】 液体または乾燥調剤である、請求項１
    ３の洗浄性組成物。
  16. 【請求項１６】 全自動食器洗い用洗剤である、請求項
    １の洗浄性組成物。
  17. 【請求項１７】 タンパク性物質で汚された表面を、有
    効な量の請求項１の洗浄性組成物に接触させる段階によ
    って構成される洗浄方法。
  18. 【請求項１８】 洗浄性組成物が溶液状態である、請求
    項１７の方法。
  19. 【請求項１９】 前記表面が繊維素材である、請求項１
    ７の方法。
  20. 【請求項２０】 前記表面が、皿と、ガラス製品と、食
    用および配膳用具と、食品容器とより構成される群から
    選択された、請求項１７の方法。
  21. 【請求項２１】 表面から、タンパク質で汚された物質
    を除去する方法であって、前記表面を、前記タンパク質
    で汚された物質の除去を強化するのに有効な量の、以下
    の配列（SEQ ID No.2）を有するアルカリ性セリン・プ
    ロテアーゼを含む洗浄性組成物と接触させる段階によっ
    て構成される方法： ［ＡＡ1-137］−Ｘａａ138−［ＡＡ139-157］−Ｘａａ
    158−［ＡＡ159-162］−Ｘａａ163−［ＡＡ164-198］ ただし、ＡＡ1-137は、アミノ酸１ないし１３７の天然
    のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘａａ138は、
    メチオニン，セリン，アラニンからなる群から選択され
    たものである；ＡＡ139-157は、アミノ酸１３９ないし
    １５７の天然のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘ
    ａａ158は、メチオニン，アラニン，スレオニン，グリ
    シン，セリン，ロイシンからなる群から選択されたもの
    である；ＡＡ159-162は、アミノ酸１５９ないし１６２
    の天然のアルファ分解性プロテアーゼである；Ｘａａ
    163は、バリン，アラニンからなる群から選択されたも
    のである；およびＡＡ164-198は、アミノ酸１６４ない
    し１９８の天然のアルファ分解性プロテアーゼである。
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