JPH0675B2 - 肝炎表面抗原の精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 この発明は、組み換え体細胞によつて生産されるタンパ
ク質の精製に関する。更に詳しくは、この発明は肝炎表
面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質を生産する組み換え体
細胞、特に哺乳類動物の組み換え体細胞の培養から、効
果的にこのタンパク質を精製する方法を提供するもので
ある。

ウイルス性Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス保有者によつ
て、血液および体の分泌物を介して伝播される。その血
清からＨＢｓＡｇを精製し、ワクチンが製造される〔パ
ーセル（Purcell，Ｒ．Ｈ．）およびゲリン（Gerin，
Ｌ．Ｌ．）、「バイラル、ヘパテイテイス（Viral Hepa
titis）」、ザ、フランクリン、インステイテユート（T
he Franklin Institute）刊（１９７８年）、４９１
頁、およびヒルマン（Hilleman，Ｍ．Ｒ．）ら、同書、
５２５頁〕。この刊行物にはＨＢｓＡｇの分離方法が記
載されており、それは、Ｂ型肝炎ウイルス保有者から得
た血漿を脱線維素化し、血清中のＨＢｓＡｇを(1)硫酸
アンモニウム沈澱法によつて濃縮し、(2)臭化ナトリウ
ムをグラジエント（勾配）媒質として使用する遠心にか
けて、等密度ゾーン分離を行ない、(3)しよ糖密度勾配
を用いるレートゾーン沈降処理にかけ、(4)種々の手順
を経由して不活性化し、(5)ゲル過処理をして、(6)ワ
クチンを製造する方法である。ＨＢｓＡｇ源として血清
を使用することは、Ｂ型肝炎ウイルスが存在するだけで
なく、未確認の偶発性作用物質が存在しているという理
由で危険である。また、ＨＢｓＡｇの精製に用いる該技
法は多く時間を要し、しかも煩雑である。

ワクチンを目的とする肝炎表面抗原の製剤化は、水酸化
アルミニウム（前記、「バイラル、ヘパテイテイス」）
およびリーリンク−ブロンガーズ（Reerink-Brongers，
Ｅ．Ｅ．）らの記載〔デベロツプメンツ、イン、バイオ
ロジカル、スタンダリゼーシヨン（Developments in Bi
ological Standarization）、カーガー編（Ｓ．Karge
r）、バーゼル、スイス（Basel,Switzerland）、（１９
８３年）、５４巻、１９７頁〕のようにリン酸アルミニ
ウムのようなアルミニウム・アジユバントと結合するこ
とにより達成された。

組み換え体細胞内で生産されたＨＢｓＡｇのようなタン
パク質の精製は、血清のような“天然”材料源からＨＢ
ｓＡｇを精製する場合に利用される技法とは、２つの材
料の組成がいちじるしく異なるため、異なつた技法を必
要とする。したがつてＨＢｓＡｇを天然材料源から精製
するのに有用な技法が、そのままＨＢｓＡｇを組み換え
体細胞から精製するのに有用であると予断することはで
きない。また、例えばヒト用ワクチンとして使用するよ
うに、最終生成物が極端に純粋であることを要する場合
には、その予測性はますます低下する。この発明は、ク
ロマトグラフイに基盤をおき、組み換え体細胞培養から
ＨＢｓＡｇを効果的に分離し得る方法を提供するもので
ある。独特な一連の分別化技法によつて、ヒト用ワクチ
ンに使用し得る高純度のＨＢｓＡｇの生産を達成する。
この生成物中には、活性偶発物質は全く含まれていな
い。

〔発明の概要〕

本発明によれば、組み替え体細胞培養で生産されたＨＢ
ｓＡｇの精製方法により、ワクチンに組み入れるのに充
分な純度を有する生成物が得られる。まず、ＨＢｓＡｇ
を含有している細胞培地から、細胞残屑を分離する。つ
いで、透明にしたＨＢｓＡｇを含有している培養液を、
好ましくは限外過し、つづいて、好ましくは硫酸アン
モニウムによる沈澱で、第１段階で汚染タンパク質を除
去し、第２段階でＨＢｓＡｇを沈澱させる２段階分画法
で処理し、培養液を濃縮する。沈澱した生成物を再溶解
し、透析によつて塩を除去する。血清を添加していない
細胞培養から得られるＨＢｓＡｇにも適用し得る１態様
として、透析したＨＢｓＡｇ溶液をアニオン交換床に通
し、ＨＢｓＡｇ含有画分を収得する。ついで、この画分
を、好ましくはゲル浸透クロマトグラフイーによつて、
分子量により分別して、精製されたＨＢｓＡｇ生成物を
製造する。

イオン交換分別化に引き続き、サイズ分別化を行なう別
法では、硫酸アンモニウム沈澱によつて得た画分を免疫
親和性吸着法によつて精製する。この別法は、血清を含
有している培地からＨＢｓＡｇを分離するのにも適用可
能である。この方法のさらにもう１つの別法は、沈殿化
および透析手順による分別化を要しない幾つかの例に有
用である。この発明は、前記諸方法のいずれかにより精
製されたＨＢｓＡｇに関し、またこのタンパク質から製
造されるワクチン類、特に先行技術のワクチンより抗原
性がはるかにまさるワクチン類に関する。

〔発明の開示〕

Ａ．定義 この明細書に用いる“肝炎表面抗原”または“ＨＢｓＡ
ｇ”は、Ｂ型肝炎ウイルス・ゲノムによつて暗号化され
ている表面抗原アミノ酸配列をもつたあらゆる形のタン
パク質を意味する。そのような変異体は全てこの定義に
包含される。またよく知られているように、タンパク質
の配列はグリコシル化、アセチル化、またはその他の化
学的誘導によつてしばしば修飾されることがあり、脂質
と結合することもできる。最後に、これらのタンパク質
は、２量体、３量体、あるいはさらに大きい集合体とも
なり、またそれらを前記のように変化させることもある
各種の凝集状態で存在することも可能である。これらの
凝集体には脂質も含むことができる。これらは、ＨＢｓ
Ａｇの定義の中にすべて包含される。

ラツター（Rutter，Ｗ，Ｊ．）らは、Ｂ型肝炎がＢ型肝
炎表面抗原を暗号化しており、それは２２，０００ダル
トンの分子量を有する２２６個の長さのアミノ酸から成
つていると述べている〔ヨーロツパ公開特許出願第００
７２３１８号（１９８３年２月１６日公告）〕。Ｂ型肝
炎ウイルスの慢性保有者の血清から分離されたＢ型肝炎
表面抗原は、直径２２ｎｍの球状粒子であり、その分子
量は２〜４００万ダルトンである。この粒子は脂質およ
びＢ型肝炎表面抗原タンパク質の２量体から成つている
と考えられている。然し、この２２ｎｍ粒子の精密な構
造はまだ充分に決定されていない。哺乳類動物の組み換
え体細胞の培養から分離されたＨＢｓＡｇは２２ｎｍ粒
子の形をしており、標準的な実験室試験による判定で
は、血清から誘導されたものと区別がつかなかつた。組
み換え体酵母から分離された表面抗原も、２２ｎｍ粒子
の形をしているようである〔バレンツエラ（Valenzuel
a，Ｐ．）ら、ネーチヤー（Nature）、２９８巻、３４
７頁（１９８２年）〕。

この発明において採用した諸技法は、本来、それが有し
ている標準的な意味で使用されている。即ち、限外過
は、分子量の大きい側の物質を通さない十分に径の小さ
い小孔を有する分子ふるいまたはフイルターを備えるこ
とによつて、低分子量の物質、例えば水、塩類、若干の
タンパク質等を高分子量側の物質と分離し得る方法に属
する。アニオン交換クロマトグラフイーは、アニオン性
物質を保持体上に吸着させ、ついで溶媒条件を変えるこ
とによつて溶出し得る技法に属する。ゲル浸透クロマト
グラフイーは、混在している分子をその大きさにしたが
つて分離する分子ふるい操作に属する。これらの独立し
た各技法は、運用し得る諸条件の範囲で、いずれも技術
的によく知られているものである。

Ｂ．一般的方法 B.1好適な細胞培養 ＨＢｓＡｇは、種々の微生物および組織培養細胞を組み
換え体宿主として使用し、生産されている。細菌系〔ヨ
ーロツパ公開特許公告第００２０２５１号（１９８０年
１２月１０日公告）〕、酵母系〔ヨーロツパ公開特許公
告第０７３６５７号（１９８３年３月９日公告）および
同第００７２３１８号〕および細胞培養系〔ヨーロツパ
公開特許公告第００７３６５６号（１９８３年３月９日
公告）〕が使用されている。このようにして作成された
ＨＢｓＡｇは免疫原性を示す（前記、ヨーロツパ公開特
許公告第００７３６５６号、参照）。タンパク質を培地
中に分泌する細胞源を使用することは、そのことにより
一層純粋な出発材料から開始し得るので、特に好まし
い。然し所望のタンパク質が分泌されなければ、音波処
理、ホモジナイズ化または浸透圧シヨツク法などのよう
な標準的手段を使用して細胞の溶解を行なうと、ＨＢｓ
Ａｇを効果的に培地へ遊離することができ、前記精製方
法を適用することができる。この発明の１態様において
は、細胞培養培地として、血清の代わりに、特殊ビタミ
ン、微量元素およびその他の栄養素から成るある特定の
培地を使用する。もう１つの態様では、培地中に血清が
使用される。

B.2方法の説明 この発明において、実質的に血清を含んでいない培養物
からＨＢｓＡｇを精製する場合に適用し得る１方法を、
第１図に示した工程系統図にしたがつて説明する。変法
を用いれば出発培養物に血清を含んでいても適用でき
る。

まず、血清を添加していない細胞培養培地からの精製に
ついて説明を行なう。

第１手順では、過または遠心のような通常の固相−液
相分離法によつて、宿主細胞残屑、好ましくは非破砕型
の宿主細胞を、上清から分離する。

第２手順では、下記の第３〜４手順に記載する効果的な
２段階分別沈澱が充分可能となる程度まで可溶性画分を
濃縮する。このためには、この段階でＨＢｓＡｇを少な
くとも２５〜３０倍、さらに５０倍またはそれ以上にま
で濃縮することが望ましい。この目的は、限外過によ
つて非常によく達成される。セルロースエステルまたは
ポリスルホンから作成された市販の膜、例えばアミコン
（Amicon）ＹＭ−３０よおびＰＭ−１０、およびドルー
オリバー（Dorr-Oliver）Ｃ−３０が使用できる。この
膜で好適に遮断できる分子量は、１００，０００より小
さい。好適に加えられる圧は、２０〜６０psi（ポン
ド）程度である。ロミコン（Romicon）ＰＭ−１００お
よびＰＭ−１０のような中空フアイバー束型の限外過
膜の使用は、血清加細胞培養培地の場合に効果的であ
る。

次いで、第２手順の限外過によつて得られた保持液を
第１図の第３、第４および第５手順に示した２段階法に
よつて分別する。前記の限外過の項で説明した濃縮能
の程度が、好収量を得るための重要な因子となる。

第３手順において、組織培養とりわけＣＨＯ細胞から生
産されたＨＢｓＡｇには、特に分別沈澱の第１段階が効
果的である。好適な第１段階、即ち予備沈澱段階は、第
２手順で得られた濃縮物にタンパク沈澱剤を加えること
によつて行なわれ、不純（汚染）タンパク質の第１画分
を沈澱させる。これは、遠心または過などの好適な清
澄化技法により、残りの溶液から除去する。ＨＢｓＡｇ
の沈澱を生じることなく、混入している所望量の不純タ
ンパク質だけを充分沈澱し得る量の固型硫酸アンモニウ
ムを加えることによつて、第１段階の分別化が特に有効
に達成される。この目的のために、硫酸アンモニウムの
濃度が２０〜３０％、好ましくは２５％飽和となるまで
硫酸アンモニウムの充分量を、濃縮培養液に、例えば４
〜８℃で添加する。

第４手順は、沈澱または沈降に続いて過を行なうこと
により、好適に実施される清澄化工程であつて、これよ
り不純タンパク質の沈澱が除去される。

第５手順は、清澄化によつて得られた上清画分の硫酸ア
ンモニウム塩濃度を、すべてのＨＢｓＡｇが実質的に溶
液から沈澱する有効量となるまで増量することにより実
施される分別沈澱の第２段階である。これを成就する好
ましい技法は、硫酸アンモニウムを追加し、約６０％飽
和になるまで硫酸アンモニウム濃度を上げることであ
る。生成物が沈澱し、これを遠心にかけて採取する。

前記の目的を成就し得るものであれば、他のタンパク沈
澱剤を硫酸アンモニウムの代わりに使用できる。このよ
うな沈澱剤として、ポリエチレングリコール、特に、Ｐ
ＥＧ８０００が第３段階では２〜４％（Ｗ／Ｖ）、第４
手順では８〜１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で使用できること
が判明した。

第６手順では、沈澱を再溶解し、透析して、アニオン交
換クロマトグラフイーによる第７段階の分別化に用いる
調製液の塩除去を行なう。透析は、そのようなアニオン
交換クロマトグラフイーを妨害する塩を除去するために
実施する。この段階は好ましくはｐＨ約６〜８の希緩衝
液に沈澱を溶解し、主として硫酸アンモニウムを除去す
るため、低温で、希緩衝液に対し透析することにより達
成される。好適な緩衝液は、１〜５０ｍＭトリス−Ｃｌ
またはリン酸ナトリウムであつて、好ましくは約１０ｍ
Ｍトリス−Ｃｌである。その他、塩除去の方法として
は、ゲル過または透析過のような方法を用いる。

第７手順では、さらに溶液をアニオン交換樹脂を使用す
る分別化で処理する。この目的に好適な樹脂は、ＤＥ−
セフアロース〔DE-Sepharose、フアルマシア社（Phaqma
cia Inc.）〕、ＤＥ−トリサクリル〔DE-Trisacryl、Ｌ
ＫＢ−プロダクター（ＬＫＢ−Productor）〕およびＤ
Ｅ−５２セルロース〔ワツトマン社（Whatman Inc.）〕
が挙げられる。好ましい樹脂はＤＥ−５２セルロース
（ワツトマン社）である。分離または分別化を行なう条
件は、個々の樹脂に適合するように選ぶ。一般に、樹脂
はカラムに充填して使用する。１０ｍＭトリス−Ｃｌを
ｐＨ7.5で使用する条件が、特に効果的である。第６手
順の生成物を、充分な樹脂を充填したカラムに通し、す
べてのＨＢｓＡｇを吸着させる。血清を含んでいない細
胞培養によつて生産したＨＢｓＡｇと、ＤＥ−５２セル
ロースを使用する場合、硫酸アンモニウムと透析した第
６手順の画分中に含まれるタンパク質１４mg当たり、充
填する樹脂量は約１mlの割合いが好適である。

カラムに吸着した後、吸着しているＨＢｓＡｇをカラム
から微分的に溶離させるため、濃度勾配を有する溶出系
が好ましく使用される。ｐＨの好適な変化、塩濃度また
は温度などは、この分野の当業者にとつて自明のことで
ある。ＤＥ−５２セルロースに吸着しているＨＢｓＡｇ
に好適な溶離液は、塩化ナトリウムについて０→0.3Ｍ
の濃度勾配を有するものである。

第７手順の後、好ましくはゲル浸透クロマトグラフイー
によるサイズ分別化を行なうため、ＨＢｓＡｇタンパク
質含有画分をプールする。そのような画分の同定は、好
適なＨＢｓＡｇ検定方法により確認する。このような技
法の１つは、ラエムリ（Laemmli）が記載したドデシル
硫酸ナトリウムの存在下に行なうポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である〔ネーチヤー
（Nature）、２２７巻、７８１頁（１９７０年）〕。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥの視覚化は、塩化銀で染色するメリル
（Merrill）らの方法〔サイエンス（Science）、２１１
巻、１４３７頁（１９８１年）〕によつて達成される。
以下の手順において６０，０００以上の分子量のタンパ
ク質だけを除去するのは困難が伴なうと思われるので、
前記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によつて高分子量の不純タン
パク質の混入量が低いと判定したＨＢｓ−Ａｇ含有画分
だけをプールすることが好ましい。

第８手順では、アニオン交換クロマトグラフイーによつ
て得たＨＢｓＡｇ含有画分をゲル浸透クロマトグラフイ
ーによつてサイズ分別化処理する。好適なゲルとして
は、ビオゲル（Biogel）Ａ−５ｍ〔ビオ−ラド（Bio-Ra
d）〕またはセフアロース（Sepharose）ＣＬ−６Ｂ〔フ
アルマシア（Pharmacia）〕が挙げられる。ゲルの所要
量は、ゲルの性質によつて異なる。ビオゲルＡ−５ｍま
たはセフアロースＣＬ−６Ｂの好適量は、ＨＢｓＡｇの
１５０〜２００mgに対し樹脂カラム約１mlである。ゲル
浸透クロマトグラフイーは、0.5〜１Ｍ濃度でNaClを含
んでいるｐＨ６〜８の緩衝液中、温度約２℃〜８℃、好
ましくは４℃で行なわれる。

ゲル浸透クロマトグラフイーにより得られるプールすべ
き画分のＨＢｓＡｇの検定（アツセイ）の場合も、同じ
くＳＤＳ−ＰＡＧＥ技法を使用できる。血清を含んでい
ない細胞培養液からＨＢｓＡｇまでの通算精製度は、ほ
ぼ５０倍である。通算収率は約４０％である。精製画分
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、Ｂ型肝炎の表面
抗原タンパク質はグリコシル型および非グリコシル型の
典型的な両型の存在がわかる。標品の電子顕微鏡的測定
により、２０〜２５ｎｍのサイズ範囲の粒子の存在が認
められる。

ＨＢｓＡｇの純度は９８％以上であり、他のタンパク質
を全く含有せず、現在使用し得る如何なる方法で測定し
ても本質的にＤＮＡを含有していない。

第２図は、ＨＢｓＡｇ培地に血清が含まれていても、い
なくても好適に使用し得る変法を示す。第９〜１４手順
は、第１図の第１〜６手順と同様な方法で行なわれる。

第１５手順では、第１４手順から得た溶液を、ＨＢｓＡ
ｇに特異的なモノクロナール抗体を含有している免疫親
和性吸着剤カラムに通して精製する。ＨＢｓＡｇはカラ
ムに吸着し、不純物はカラムから流れ去るか、または洗
い流される。その後、好適な溶離液を通して、吸着して
いるＨＢｓＡｇを脱着させる。

第１５手順に使用される好適な免疫親和性吸着剤カラム
は、セフアロース（Sepharose）ＣＬ−２Ｂ〔フアルマ
シア社（Pharmacia Inc.）〕のように、ベセル（Bethel
l，Ｇ．Ｓ．）らの方法〔ジヤーナル、オブ、バイオロ
ジカル、ケミストリー（Ｊ．Biol.Chem.）２４４巻、２
５７２頁（１９７９年）〕を用いて、カルボニルジイミ
ダゾールと交叉結合させたアガロースへＨＢｓＡｇの特
異的モノクロナール抗体を共有結合的に結合させること
により作成する。ＨＢｓＡｇは、動物血清の存在下で培
養した哺乳類細胞培養から得られた粗細胞培養液をこの
免疫親和性吸着剤カラムに１回通すだけで、ほとんど均
質な形で得ることができる。

粗培養液をカラムに通した後、塩化ナトリウム1.0Ｍを
含有している１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ7.5）のよう
な好適な緩衝性溶出液を使用して、カラムを洗滌する。
結合しているＨＢｓＡｇは、好適な溶離液〔例えば、1.
0ＭNaClを含有している0.1Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸（ｐ
Ｈ4.0）、または1.0NaClおよび３ＭＫＳＧＮを含有して
いる１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ7.5）〕によつて溶離
する。

第１６手順では、免疫親和性カラムから溶離した溶出液
を、0.18ＭNaClを含有する１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ
7.5）のような好適な媒質で好ましく透析または透析
過する。透析は第６手順と同様の方法で行なうことがで
きる。透析過はアミコン（Amicon）ＰＭ−１０または
ＹＭ−３０膜で行なうことができる。

第１７手順では、第１６手順からの生成物をアニオン交
換クロマトグラフイーにかける。好適な技法は、0.18Ｍ
NaClを含有している１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ7.5）
で洗滌したＤＥ−５２のカラムを通過させることによつ
て行なう。溶出液と洗滌液をプールして精製した生成物
を調製する。

もう１つの態様は、ある細胞培養では第１１〜１４手順
を省略できることである。

B3.医薬組成物 この発明にしたがつて精製したＨＢｓＡｇは、既知の方
法によつて、医薬的に有用な組成物を製造するのに使用
できる。この場合、ＨＢｓＡｇは薬学的に許容し得る担
体ビヒクルと混和して結合させる。好適なビヒクルとそ
の製剤は、参照文献に挙げたレミントンズ、フアーマシ
ユーテイカル、サイエンス（Reminton's Pharmaceutica
l Science）〔マーチン（Ｅ．Ｗ．Martin）編〕に記載
されている。

B4.ワクチン製剤 これまで記載したように精製したＨＢｓＡｇを含有して
いるこの発明のワクチンは、ＨＢｓＡｇを好適なビヒク
ルと混合して結合させる既知の方法によつて調製でき
る。好適なビヒクルは、各種既知のアジユバントから成
る。そのようなワクチンは、宿主に効果的に投与し得る
ワクチンを調製するため、有効量のＨＢｓＡｇと適量の
ビヒクルを含有している。

特に有効なワクチンは、アルミニウム塩をアジユバント
とし、これとＨＢｓＡｇをゲルの形で結合させることに
より製造する。このゲルは、充分量のＨＢｓＡｇを、カ
リウム硫酸アルミニウム塩のような充分量の可溶性塩と
（例えば、ｐＨ3.5で）混合することにより、溶解した
まま形成し、ついでｐＨの高い塩基性滴定液（例えば、
５〜７）で滴定することによりＨＢｓＡｇとアルミニウ
ム塩を共沈させてゲルを形成することができる。そのよ
うな塩基性滴定液は水酸化ナトリウムのようなアルカリ
水酸化物がよく、またはリン酸ナトリウムのようなアル
カリ塩でもよい。ここに示した“水酸化アルミニウム・
アジユバント”とは、アルミニウムを主として水酸化物
として含有する注射用製剤の形のこの発明のＨＢｓＡｇ
ワクチンに用いるアジユバントを意味する。一方、“リ
ン酸アルミニウム・アジユバント”の語は、アルミニウ
ムを主としてリン酸塩として含有している注射用製剤の
形のＨＢｓＡｇワクチンに用いるアジユバントを意味す
る。マウスの腹腔内注射実験の成績から、リン酸アルミ
ニウム・アジユバント・ワクチンは、水酸化アルミニウ
ム・アジユバント・ワクチンと比較してすぐれた抗原性
を有しており、またこれらは、いずれも市販の血清から
調製したワクチン、ヘプタバクスＢ（HeptavaxB）より
すぐれた性質を示すことが判明した。

これらのワクチンの活性成分を製造する独特な方法か
ら、得られたワクチン類は、本質的に異種タンパク質、
ウイルス性および細胞性成分、およびＤＮＡを全く含有
していないようである。したがつて、これらは血清から
製造されたウイルス・ワクチン製剤で生じる副作用が更
に少ないであろうと思われる。

また、この発明のワクチンは、ヒルマン（HillmanＭ．
Ｒ．）らの報告〔バイラル、ヘパテイテイス、インター
ナシヨナル、シンポジウム（Viral Hepatitis，Interna
tional Symposium）、ザ、フランクリン、インステイチ
ユート、プレス（The Franklin Institute press）〕の
ように、チンパンジーにおいてヘプタバクスＢ（Heptav
ax Ｂ）より抗体性がはるかにすぐれていることが判明
した。これらの成績は、ヘプタバクスが用いているＨＢ
ｓＡｇの製造について比較的杜撰な精製方法が報告され
ているのに比べ、この発明の用いている精製方法に帰す
るところが大きいと信じられる。とりわけ、これらの方
法に報告されている不快なタンパク質分解酵素およびタ
ンパク質変性を、この発明は回避している。比較に用い
たこの発明の方法は、第１図に示した方法で精製した
が、別の精製方法を行つたとしても、同様の改良結果を
提供し得るであろうと考えられる。

この発明をさらに詳細に説明するため、以下の方法およ
び結果を示すが、但し、これらはこの発明を制限するも
のではない。

Ｃ．実施例１ この実施例は、第１図の方法（第１〜８手順）を説明す
る。細胞培養液は、中国産ハムスターの卵巣細胞を、血
清を含有していない回転瓶中で培養した細胞培養から得
る。

培養液を、酢酸セルロースおよびセルロースから作成し
た0.22ミクロンのザルトリウス・フイルターで過し、
細胞培養期間中に生じた細胞および細胞残屑を除去す
る。細胞培養液約１００を２平方フイートの膜で急速
に過する。

セルロース・エステルから作成したＣ−３０の膜で行な
うドール・オリバー・システム（Dorr-Oliver system）
を用いる限外過によつて、澄明化した細胞培養液を濃
縮する。このシステムは、膜を保持する過プレス、濃
縮される液の再循環用ポンプ、および貯蔵槽用の加圧容
器から成つている。細胞培養液を濃縮し、貯留液は系外
に排出される。このシステムを精製水0.5で２回洗い
流し、ＨＢｓＡｇを定量的に回収するため、その水を前
記の貯留液と一緒にする。洗滌液は貯留液とプールす
る。透過率は約３〜６／時／平方フイートで行なう。

濃縮した細胞培養液は２段階で分別する。濃縮細胞培養
液に、４〜８℃で、固型硫酸アンモニウムを加え、２５
％飽和濃度とする（４℃で７０６ｇ／を１００％飽和
として用いた）。６０００Ｇで２０分間遠心し、溶液を
透明にする。ペレツトを棄て、上清に塩化アンモニウム
を加えて６０％飽和濃度とする。６０００Ｇで２０分間
遠心し、第２段階のペレツトを採取する。

硫酸アンモニウムによる分別の収率は、限外過で達成
した濃縮率によつて左右される。濃縮率が３５に等しい
かそれより大きい場合に、通常この段階の最高収率を与
える。濃縮率が３５以上となつても、硫酸アンモニウム
分別化の収率に実質的な増加は見られない。

硫酸アンモニウム分別化によつて得た第２段階のペレツ
トを、もとの培地の容量の0.25倍にほぼ等しいml容量
となるように、ｐＨ7.5の１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ
は室温で測定）に溶解する。この溶液を１０ｍＭトリス
−Ｃｌ（ｐＨ7.5）に対して４℃で透析し、硫酸アンモ
ニウムを除去する。限外過、硫酸アンモニウム分別
化、およびペレツトの再溶解を組み合わせることによつ
て、出発の細胞培地容量から約２０００倍の濃縮率とな
る。

カラムに充填したワツトマンＤＥ−５２セルロースを使
用して、透析した６０％硫酸アンモニウム画分を分別す
る。クロマトグラフイ条件は下記の通りである。１０ｍ
Ｍトリス−Ｃｌ緩衝液を使用して、樹脂をｐＨ7.5に平
衝化する。溶出に用いる勾配は、NaClの０→0.3Ｍの範
囲で直線的に変化させる。ＨＢｓＡｇは、このタンパク
質バルクの、カラムからの溶出を現わしているピークの
リーデイング（前側）端での部分的溶解ピークとして溶
出する。

ＤＥ−５２セルロース・アニオン交換クロマトグラフイ
ーによつて得たＨＢｓＡｇ画分をプールし、次の手順の
ゲル浸透クロマトグラフイーによつて処理する。ＤＥ−
５２セルロース処理段階の収率は５０％である。これ
は、純度が不充分なためにプールされないＨＢｓＡｇ含
有画分の再処理による追加的な回収分を含んでいない。
プールした画分は、２５psiの加圧でＹＭ−３０膜を使
用する撹拌セル〔アミコン（Amicon）〕で濃縮する。約
１／時／ｆｔ^２の流束が得られる。

ＤＥ−５２セルロース・カラムで濃縮したＨＢｓ−Ａｇ
画分をセフアロースＣＬ−６Ｂ樹脂カラムにかける。細
胞培養液２００から得られる生成物（ＨＢｓＡｇ約１
００mg）はセフアロースＣＬ−６Ｂの0.5カラムで処
理できる。カラムは、1.0ＭNaClを含有している１ｍＭ
トリス−Ｃｌ（ｐＨ7.5、室温で測定）の溶液中、４℃
で操作する。

この方法全体を通算した収率は約３５％である。

第８手順または第１７手順を経た生成物は、希釈する
か、または例えばアミコン撹拌セルを使用してＰＭ−１
０またはＹＭ−３０膜で限外過を行なつて濃縮するこ
とによつて、約0.2mg／mlの濃度に調節する。得られた
溶液を0.22ミクロンのフイルターで過し、液を３〜
１０時間、６０℃で加熱する。

ＨＢｓＡｇは、下記に示すようにアルミニウム塩をアジ
ユバントし、これとゲルの形で結合することによつて、
ワクチンに製剤化する。

ＨＢｓＡｇ２０μｇを0.1ＭNaClおよび0.88％（ｗ／
ｖ）みようばんと混合し、さらに防腐剤として0.05％
（ｗ／ｖ）チメロサールを加えて混合する。ついで、ｐ
Ｈ１２の0.1Ｍリン酸ナトリウムでこの溶液をｐＨ５〜
７（5.5）に滴定する。アジユバント・ワクチンは、各
１ml当たり、Ａｌ_＋３イオン0.5mg当量、ＨＢｓＡｇ２
０μｇおよびチメロサール0.05％（ｗ／ｖ）を含有す
る。

Ｃ．生成物の特徴 この報告例に記載した方法で製造したＨＢｓＡｇ１mg当
たりのＤＮＡ量は２０ｐｇよりも少ない。この値は、１
００万のＤＮＡ処理によるクリアランス（浄化）係数、
１mg／である細胞培養液中のＨＢｓＡｇ濃度およびド
ツト・ブロツト・ハイブリダイゼーシヨンによつて２０
μｇと算出された細胞培養液１当たりのＤＮＡ量を用
いて決定した。ドツト・ブロツト・ハイブリダイゼーシ
ヨンによつて、この生成物中のＤＮＡを直接測定する
と、ＨＢｓＡｇ１mg当たりのＤＮＡは１０ｐｇよりも少
ないことが判明する。

このＨＢｓＡｇ生成物の４℃における安定性は６ケ月以
上の観察でも、なんら有意の減少をも認めなかつた。１
０ｍＭＢトリス−Ｃｌ（ｐＨ7.5）、0.15ＭNaClおよび
ここに概略を説明した方法で精製した0.025mg／mlのＨ
ＢｓＡｇからなる溶液を６０℃で１０時間加熱して、イ
ライサ（ELISA）およびアボツト、オースリアII（Abbot
AUSRIA II）の両検定法により力価を測定し、その消失
はほとんど無視し得るものであつた。

また、このＨＢｓＡｇはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、９８
％より高い純度を示すことが特徴である。

実施例２ この実施例は、第２図に示した方法により、血清を含有
している細胞培養培地からＨＢｓＡｇを精製する方法を
示す。

細胞培養液に添加する血清濃度の範囲は、０〜7.5％
（ｗ／ｖ）である。この実施例の第９〜１４手順は、下
記に示す諸点を除き、実施例１に記載した第１〜６手順
と本質的に同じである。

第１０手順において、血清を含有している細胞培養液
は、ＰＭ−１００型またはＰＭ−１０型の膜を有するロ
ミコン（Romicon）中空フアイバー・システムを使用す
る限外過により濃縮する。限外過は２５psiまでの
加圧下に環境温度で行なう。細胞培養液は濃縮され、貯
留液は系外に排出される。システムを精製水で洗滌し、
ＨＢｓＡｇを定量的に回収するため、洗滌水は貯留液に
プールする。血清7.5％を含有している細胞培養培地の
場合、ＰＭ−１００型膜を使用する透過率は６〜１０
／時／ft^２となる。添加血清が１％（ｖ／ｖ）に等しい
か、またはそれより多く含有している細胞培養液におい
て、２０またはそれより大きい濃縮率を達成するには、
以下に述べる精製手順において最適の収率をあげる必要
がある。

濃縮した細胞培養液は、実施例１の記載と同様に、硫酸
アンモニウムで分別化する。

第１３手順では、実施例１の第５手順と同様に、ＨＢｓ
Ａｇを硫酸アンモニウムで沈澱させる。第１４手順で
は、実施例１の第６手順と同様に、生成物を透析する。
透析用媒質は1.0ＭNaClを含有している１０ｍＭトリス
−Ｃｌ（ｐＨ7.5）であり、透析は２〜８℃で行なわれ
る。

第１５手順では、透析液を免疫親和性カラムにかけ、カ
ラムを1.0ＭNaCl含有１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ7.5）
で洗滌する。カラムに結合したＨＢｓＡｇは1.0ＭNaCl
を含有している0.1Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ4.0）で溶出
する。この方法は、なんら有意差なく、冷凍温度（２〜
８℃）または室温で行なわれる。

第１６手順では、第１５手順で得た溶出液を、0.18ＭNa
Clを含有している１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ7.5）に
対して透析する。別法として、同じ緩衝液に対し、アミ
コンＹＭ−３０またはＰＭ−１０膜を使用して透析過
を行なう。

第１７手順では、透析した溶出液をＤＥ−５２カラムに
通す。この媒質中ではＨＢｓＡｇはＤＥ−５２に結合し
ない。0.18ＭNaClを含有している１０ｍＭトリス−Ｃｌ
（ｐＨ7.5）でカラムを洗滌すると、ＨＢｓＡｇが定量
的に回収される。ＨＢｓＡｇ１０〜２０mgに対してＤＥ
−５２約１mlを使用する。

実施例２の全体を通算して、ＨＢｓＡｇの収率は約８０
％である。実施例１または実施例２に記載した方法で製
造したいずれの生成物の純度も、ほぼ同等である。

実施例３ マウスの力価検定により、実施例１のリン酸アルミニウ
ム・アジユバント・ワクチンを、(a)この方法でリン酸
アルミニウムを水酸化アルミニウムに代えて調製した水
酸化アルミニウム・アジユバント・ワクチン、および
(b)メルク、シヤープ、アンド、ドーム社（Merk Sharp
and Dohme）によつて市販されているヘプタバクスＢ（H
eptavaxB）と比較した。その結果は第１表に示した通
り、市販製剤と比較して、この発明のワクチンの力価が
高まつていることが証明された。

^ａアルミニウムゲル・アジユバントを含有するワクチン
１mlづつをマウスに腹腔内注射した。注射後２８日目
に、マウスを瀉血し、その血漿画分を、オーサブ（Ausa
b）放射線免疫検定法〔アボツト・ラボラトリーズ（Abb
ott Laboratories）〕により、抗ＨＢｓ抗体の存在を試
験した。^ｂ １群２０匹のマウスを使用。^ｃ ＥＤ_５０はマウスの５０％が血清陽性となるワクチン
投与量を表わしている。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はいずれも組み換え体細胞培養から
ＨＢｓＡｇを精製する方法の手順を示す工程系統図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）２２６個のアミノ酸残基からなるＨ
   ＢｓＡｇを生産する組み換え体細胞培地中の宿主細胞残
   屑から該ＨＢｓＡｇを分離し、 （ｂ）手順（ａ）で分離したＨＢｓＡｇを限外濾過によ
   り濃縮し、 （ｃ）手順（ｂ）で得た濃縮物に、硫酸アンモニウム濃
   度が６０％飽和となるまで硫酸アンモニウムを添加し、 （ｄ）手順（ｃ）で沈殿したＨＢｓＡｇを再溶解し、 （ｅ）この分離されたＨＢｓＡｇを、ＨＢｓＡｇに特異
   的なモノクローナル抗体を含有する免疫親和性吸着カラ
   ムに通してＨＢｓＡｇを吸着させ、一方、不純物を除去
   し、 （ｆ）カラムに溶出液を通して吸着したＨＢｓＡｇを遊
   離させ、 （ｇ）溶出液をアニオン交換床に通すことによって、該
   溶出液中のＨＢｓＡｇを分別し、少なくとも１個の純化
   したＨＢｓＡｇ−含有フラクションを得ることからな
   る、２２６個のアミノ酸残基からなるＨＢｓＡｇの精製
   方法。
2. 【請求項２】手順（ｆ）の溶出液が酢酸ナトリウム／酢
   酸を含んでいる特許請求の範囲第１項に記載の精製方
   法。