JPH0678357B2

JPH0678357B2 - 新規ペプチド

Info

Publication number: JPH0678357B2
Application number: JP59178503A
Authority: JP
Inventors: 嘉之松尾; 賢治寒川; 幸夫広瀬; 保本間; 英斎足立
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1984-08-29
Filing date: 1984-08-29
Publication date: 1994-10-05
Anticipated expiration: 2009-10-05
Also published as: JPS6157518A

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の技術分野〕本発明は、新規ペプチドに関し、更に詳しくは、ニワト
リ鰓後体由来の血中Ca²⁺濃度を低下させる生理活性を有
する新規ペプチドに関するものである。

〔従来技術〕

カルシトニン（以下「CT」と称する）は、鳥類、魚類、
円口類などの鰓後体、哺乳類などの甲状腺に存在するペ
プチドホルモンである。このホルモンは、副甲状腺ホル
モンと拮抗する作用を示し、骨などに作用し血中Ca²⁺濃
度を低下させる作用が知られている。従来知られている
CTは、32個のアミノ酸よりなる単鎖のペプチドで、アミ
ノ基末端（以下「Ｎ末端」と称する）より１番目と７番
目のシステインがジスルフイド結合をし、カルボキシル
基末端（以下「Ｃ末端」と称する）がプロリンアミドで
ある点で共通している。現在までのところ、ブタ、ウ
シ、ヒツジ、ヒト、ラツト、サケ、ウナギからCTが抽出
精製され、前記の構造上の共通点を有しながら、動物種
によりペプチド構造が少しずつ異なることが明らかにさ
れている。

また、CTのＮ末端より１番目と７番目のジスルフイド結
合を切断するとその生物活性がほとんど消失し（H.B.Br
ewer,Jr.,et al,Federation Proc.,27,690（1968），2
8,383（1969））、このジスルフイド結合をアミノスベ
リン酸を用いてエチレン結合とすることによつて生物活
性が保持され（特公昭53−41677）、CTの1,7位の環状立
体構造が生物活性に必須であることが報告されている。

最近、本発明者らはニワトリ鰓後体からCTを抽出精製
し、得られたニワトリCTが、次式（Ｉ）：（式中、Cysはシステインを、Alaはアラニンを、Serは
セリンを、Leuはロイシンを、Thrはスレオニンを、Val
はバリンを、Glyはグリシンを、Lysはリジンを、Glnは
グルタミンを、Gluはグルタミン酸を、Hisはヒスチジン
を、Tyrはチロシンを、Proはプロリンを、Argはアルギ
ニンを、Aspはアスパラギン酸を表す）で示される新規な構造を有することを見い出し、特願昭
58−230593号（特開昭60−123500号）として既に出願し
ている。

更に、本発明者らはニワトリ鰓後体の抽出精製の過程に
おいて抽出精製条件を種々検討した結果、ニワトリ鰓後
体を酸性水溶液で抽出した後、特定の処理を施すことに
より前記式（Ｉ）で示されるCT（以下「ニワトリCT I」
と称する）と異なる今一つのCT様の新規ペプチド（以下
「ニワトリCT II」と称する）が単離され、このニワト
リCT IIは、ジスルフイド結合が開裂されているとい
う、従来知られているCTとは全く異なる構造であるにも
かかわらず、高いCT活性を有することを見い出し本発明
を完成するに至つた。

〔発明の構成〕

本発明のニワトリCT IIは、次式（II）：（式中、γ−Gluはγ−グルタミン酸を表し、Cys、Al
a、Ser、Leu、Thr、Val、Gly、Lys、Gln、Glu、His、Ty
r、Pro、Arg及びAspは、前記と同様である）で示されるものである。

本発明のニワトリCT IIの化学的性質は次の如くであ
る。

物質の性状：白色粉末溶媒に対する溶解性：水、特に、酸性水溶液に可
溶、クロロホルム、四塩化炭素、ベンゼン、ヘキサンな
どに不溶分子量:3,985 塩基性度：本発明のニワトリCT II＜ニワトリCT I 一次構造式：前記式（II）免疫学的性質：抗ウナギCT血清及び抗サケCT I血清
を用いて、本発明のニワトリCT IIが前記抗血清と交差
することを利用して検出し得る生物活性:3,000〜7,000 MRCU/mg（生物活性測定
法）被検体を１％酢酸ナトリウム（pH4.0;0.1％牛血清アル
ブミン含有）水溶液を用いて適当に希釈後、更に希釈し
た液数種を雄幼若ラツト（100g前後）１匹当り0.1mlを
尾静脈に注射し、注射１時間後に心臓より血液を採取
し、遠心分離して血清を採取し、血清中のCa²⁺濃度を分
光学的方法（試薬；ワコーカルシウム測定用キツト）に
て測定し、Ca²⁺濃度を10％低下させるのに必要な量を10
mMRC（Medical Research Council）Ｕと定義する。

薬効特続性：本発明のニワトリCT II＞ブタCT （測定法） 6pmol CT相当のCT水溶液をラツトに静注し、血清中Ca²⁺
濃度の経時変化を測定する。

本発明のニワトリCT IIは、次のようにしてトリ鰓後体
から採取することができる。

即ち、トリ鰓後体を酸性水溶液で抽出した後、次の処理
（ａ）及び（ｂ）：（ａ）抽出液をカチオン交換樹脂に接触せしめ、吸着し
た塩基性画分を水溶液で溶出させる（ｂ）ゲルクロマトグラフイーにより分子量3500〜6000
の画分を回収するのうち、少なくとも１種の処理を施すことにより採取す
ることができる。

抽出原料としては、ニワトリの鰓後体を用いる。鰓後体
は孵化前後からその存在が認められ、甲状腺及び上皮小
体の下方において総頚動脈に隣接し、成鶏では直径1mm
程度の球状の臓器である。ニワトリの週令により、鰓後
体の重量、CT含量は変化する。大量・均質なニワトリが
入手可能なこと、鰓後体が適度な大さであり摘出が容易
なことなどを考慮すると、ニワトリとしては、ブロイラ
ー種６〜80週令のものを用いることが好ましい。

出発原料からのCTの抽出は、次のようにして行うことも
できる。

例えば、出発原料をその約５〜10倍量（重量比）の酸性
水溶液、好ましくは、揮発性の酸性水溶液（例えば、酢
酸、ギ酸などの水溶液）中で破砕・混和し、ニワトリCT
I及びIIを含む懸濁液を得る。この場合、用いる酸性水
溶液は、pH1〜５であることが好ましい。次いで、この
溶液を遠心することにより、中間層にやや透明なCT抽出
液が形成される。ここで、沈澱物は、主に鰓後体の組織
片及び不溶物であり、上層部は、主に脂肪の白色のたま
りである。中間層を採取し、次の処理工程に供する。

以上のようにして得られる抽出物の精製は、前述の処理
（ａ）又は（ｂ）により行うことができるが、（ａ）及
び（ｂ）を組み合わせることが好ましく、処理（ｂ）を
施した後、処理（ａ）を行うことが更に好ましい。

処理（ａ）においては、抽出液又はその処理液を、カチ
オン交換樹脂、例えばSP−セフアデツクス又はカルボキ
シメチルセルロースを用いたクロマトグラフイーに付し
て、塩基性画分を回収する。該クロマトグラフイーは、
好ましくは水溶媒にて行われるが、低級アルコール、ア
セトンの如き親水性有機溶媒の添加された水溶液におい
ても行うことができる。

カチオン交換樹脂としてSP−セフアデツクスを用いる場
合、溶離液としては、pH8〜11の塩基性水溶液、通常、
ピリジン水溶液、アンモニア水溶液などを用いる。

カチオン交換樹脂としてカルボキシメチルセルロースを
用いる場合、溶離液としては、pH3〜６の酸性水溶液、
通常、ギ酸水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液、酢酸アン
モニウム水溶液などを用いる。

処理（ｂ）のゲルクロマトグラフイーは、例えば酢酸、
炭酸水素アンモニウム、ギ酸アンモニウムの如き揮発性
緩衝液中で行うことが好ましい。カラムの例としては、
Bio−gel P 10及びセフアデツクスG 50が挙げられる。

本発明の採取法には、前記処理に、次の処理（ｃ）及び／又は（ｄ）：（ｃ）目的物含有水溶液に親水性有機溶媒を添加して高
分子量体を沈澱せしめ除去する（ｄ）高速液体クロマトグラフイーによりCT様生理活性
を有する画分を回収するを組み合わせることが更に好ましい。

処理（ｃ）においては、本発明のニワトリCT II（分子
量3,985）を沈澱させず、それ以上の高分子量を沈澱さ
せるに足る充分量の親水性有機溶媒（例えば、低級アル
コール、アセトンなど）を前記抽出液に添加して、高分
子量体を除去する。

処理（ｄ）の高速液体クロマトグラフイー（以下「HPL
C」と称する）は、常法に従つて行うことができ、ギ酸
アンモニウム（10mM〜1.0M）−アセトニトリル、水−ア
セトニトリル−10％トリフルオロ酢酸（TFA）（90:10:1
〜40:60:1）（体積比）などの溶媒を用いて直線型濃度
勾配溶出し、カルシトニン様生理活性を有する画分を回
収する。

本発明の採取法においては、前述の処理を全て組み合わ
せ、（ｃ）、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）の順に行うことが
最も好ましい。

以上の各精製工程における各画分の検定は、抗ウナギCT
血清が本発明のニワトリCT IIと交差反応すること利用
して、放射性免疫検定法を用い、適宜、生物活性測定法
を併用した。

放射性免疫検定法では、抗原であるウナギCTを用いて、
ウサギに数回免疫し、免疫後、採血して抗血清を得る。
ここで、本放射性免疫検定法とは、ウナギCTの抗体（抗
血清）に対し、本発明のニワトリCT IIと放射線標識抗
原との競争反応により本発明のニワトリCT II量を検出
する方法である。一方、標識抗原は、ウナギCTのチロシ
ン部分に放射性ヨウ素（¹²⁵I）を結合するクロラミンＴ
法又はペルオキシダーゼ法により作製できる。次に、本
発明のニワトリCT II抽出液又は各工程の各画分（被検
体）を適宜希釈した数種の溶液と前記で得られた抗ウナ
ギCT血清とを良く反応させ（４℃、１夜）、抗体と結合
していない¹²⁵I−ウナギCT及び抗体と結合した¹²⁵I−ウ
ナギCTを分離後、どちらかの量をγ−カウンターで測定
することにより、被検体中に含まれる相対的なCT活性が
求められる。この放射性免疫検定法によれば、検定によ
つて消費されるCT量が生物活性検定法に比し、約1/100
に低減されるばかりか、手技が簡単である、定量性・再
現性が優れている、検定の所要時間が短かい、などの利
点を有し、放射性免疫検定法は本発明のニワトリCT II
の分離・精製を容易、かつ、迅速ならしめることができ
る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、新規ペプチドを提供することができ、
この新規ペプチドは、ジスルフイド結合が開裂されてい
るという、従来知られているCTとは全く異なる構造であ
るにもかかわらず、高いCT活性を有することから、医薬
品として有用であると考えられる。即ち、CTは強力な骨
吸収抑制作用を有することから、高Ca血症、骨ページエ
ツト病、骨粗鬆症の治療、胃酸分泌及び膵液分泌抑制作
用を有することから、消化性潰瘍、急性膵炎に対する効
果、抗炎症作用を有することから慢性関節リウマチに対
する効果など広範な薬効が期待されている。

〔発明の実施例〕

次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらにより制限されるものではない。

実施例１Ａ）出発原料 10週令食肉用ニワトリ3,384匹を放血し、直ちに、鰓後
体を摘出した。脂肪をできる限り除去し、ドライアイス
で凍結した。得られた鰓後体は約179.11gであつた。

Ｂ）抽出工程前記方法で得られた鰓後体を小分けし（約500匹分）、
それぞれについて1N酢酸（鰓後体重量の５倍量（重量
比））に浸漬し、ポリトロンでホモジナイズし、遠心分
離（9,000rpm30分間）した。次に、脂肪を含まないよう
に、中間層を採取し、この抽出液の一部を凍結乾燥し
た。

この凍結乾燥粉末の一部を0.1Nギ酸に溶解し、生物活性
を測定したところ、1.0〜1.2MRCU/匹（ニワトリ）であ
つた。

Ｃ）精製工程前記のようにして得た目的生理活性物質を含む酢酸水溶
液900mlにアセトン1800mlを徐々に添加後、一夜放置
し、高分子量体を沈澱させた。遠心分離（9,000rpm、30
分間）後、上清液を採取した。

この上清液を、SP−セフアデツクスＣ−25を充填し、1N
酢酸で平衡化したカラム（直径3.2cm×高さ22cm）上に
注入した。このとき、SP−セフアデツクスに吸着しない
酸性画分は除去され、目的生理活性物質を含む塩基性画
分はSP−セフアデツクスＣ−25にイオン的に吸着され
る。次いで、2Mピリジン水溶液（pH10）300mlでSP−セ
フアデツクスに吸着した塩基性画分からニワトリCT II
を含む画分を溶出した。この溶出液はCTの生理活性が認
められた。

これ以後の実験では、前記溶出液を濃酢酸で中和し、凍
結乾燥して用いた。この凍結乾燥粉末500mgを1N酢酸15m
lに溶解し、予めセフアデツクスＧ−50（Fine）を充填
し、1N酢酸で平衡化したカラム（直径3.0cm×高さ150c
m）上に、この溶液を注入した。このとき、溶出条件は
溶離液1N酢酸、溶出速度27ml/hであつた。溶出液を15ml
/本ずつ分画採取し、放射性免疫検定法による活性画分
（画分No48〜53）を回収した。これを凍結乾燥し、粉末
17.4mgを得た。

前記検定法から算出された免疫学的に反応した本発明の
ニワトリCT II量は219μｇ（3384匹相当）であつた。

この粉末17.4mgをＡ液（後述）1.5mlに溶解し、この溶
液を以下の測定条件に従いHPLCに付した。

測定条件：カラム；東洋曹達工業（株）製TSK GEL CM 2 SW（4.6mm
φ×250mm）流速;2.0ml/min 差圧;35Kg/cm² 溶離液;A液（10mMギ酸アンモニウム：アセトニトリル＝
9:1）（pH4.0）Ｂ液（1.0Mギ酸アンモニウム：アセトニトリル＝9:1）
（pH4.0）をサンプル注入１分後、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配
溶出（140分）得られた結果において、放射性免疫検定法に基づく活性
と吸光測定法による280nmにおけるペプチド由来の吸光
度とが一致した。更に、同様に以下の条件にて試料を三
つに分けてHPLCを繰り返した。

測定条件：カラム；ケムコ社製Chemcosorb 5 ODS−Ｈ（4.6mmφ×2
50mm）溶出液;0.5ml/本流速;1.0ml/min 差圧;140Kg/cm² 溶離液;A液（水：アセトニトリル:10％TFA＝90:10:1）Ｂ液（水：アセトニトリル:10％TFA＝40:60:1）をサンプル注入８分後、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配
溶出（160分）その結果、活性画分（保持時間84分）にペプチドに基づ
く強い吸光度（A₂₈₀,A₂₁₀）が認められた。この活性画
分を凍結乾燥して活性粉末36.1μｇを得た。この粉末の
生物活性は、5300MRCU/mgであつた。

以上のようにして得られた活性粉末のアミノ酸分析値を
表１に示す。

測定法は活性粉末3.5μｇを6N塩酸を用いて110℃で22時
間加水分解し、脱塩酸後50μの0.2Nクエン酸緩衝液
（pH3.25）に溶解し、全量を分析に供した。

更に、主としてニワトリCT Iとの類似性を利用し、公知
の蛋白決定法により前記式（II）に示す新規ペプチドの
アミノ酸配列が決定された。

実施例２実施例１と同様にして、ニワトリ鰓後体（500匹）より
本発明のニワトリCT IIを含む抽出酢酸水溶液625mlを得
た。

この溶液を、予め1N酢酸で平衡化したSP−セフアデツク
スＣ−25カラム（直径2.0cm×高さ17cm）に注入した。
次いで、2Mピリジン溶液で溶出した。この溶出液中に本
発明のニワトリCT IIが含まれていた。

この溶出液120mlにアセトン240mlを添加し、一夜放置
後、遠心分離（9,000rpm,30分間）し、上清液を採取
し、凍結乾燥して粉末100mgを得た。

この凍結乾燥粉末を1N酢酸に溶解して約1mlの溶液と
し、セフアデツクスＧ−50（Fine）カラム（直径1.2cm
×高さ103cm）に注入した。このとき、溶出条件は溶離
液1N酢酸、溶出速度5.7ml/hであつた。放射性免疫検定
法による活性画分を回収し、これを凍結乾燥して凍結乾
燥粉末2.0mgを得た。前記検定法から算出された免疫学
的に反応した本発明のニワトリCT II量は55μｇであつ
た。この粉末を実施例１と同様の方法にて高速液体クロ
マトグラフイー操作を実施し、ニワトリCT IIの活性粉
末５μｇを得た。この粉末の生物活性は4,800MRCU/mgで
あつた。

更に、アミノ酸分析を行うとともに、常法のアミノ酸配
列決定法に基づいてアミノ酸配列を決定し、この活性粉
末が本発明のニワトリCT IIであることを確認した。

実施例３実施例１と同様にして、ニワトリ鰓後体（500匹）よ
り、本発明のニワトリCT IIを含む抽出酢酸溶液を625ml
を得、凍結乾燥して粉末1.5gを得た。

この粉末を1N酢酸15mlに溶解した後、遠心分離（3,000r
pm,20分間）して、その上清液をセフアデツクスＧ−50
（Fine）カラム（直径1.2cm×高さ103cm）に注入した。

この活性画分をSP−セフアデツクスＣ−25カラムに注入
し、実施例１と同様にして、CT活性を有する粉末1.0mg
を得た。

この粉末を実施例１と同様の方法にて高速液体クロマト
グラフイー操作を実施し、CTの活性粉末４μｇを得た。
この粉末の生物活性は5,100MRCU/mgであつた。

更に、アミノ酸分析を行うとともに、実施例１と同様に
してアミノ酸配列を決定し、この活性粉末が本発明のニ
ワトリCT IIであることを確認した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者本間保茨城県稲敷郡阿見町大字若栗1315番地三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者足立英斎大阪府大阪市旭区新森５丁目16の６

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式：（式中、Cysはシステインを、Alaはアラニンを、Serは
セリンを、Leuはロイシンを、Thrはスレオニンを、Val
はバリンを、Glyはグリシンを、Lysはリジンを、Glnは
グルタミンを、Gluはグルタミン酸を、Hisはヒスチジン
を、Tyrはチロシンを、Proはプロリンを、Argはアルギ
ニンを、Aspはアスパラギン酸を、γ−Gluはγ−グルタ
ミン酸を表す）で示される新規ペプチド。