JPH068320B2 - 天然型ヒトインタ−フエロン−αの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトインターフェロン−αの製造法に関する。

従来の技術 ヒトインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）はヒト白血球
インターフェロンとも称され、各種腫瘍に対する効果も
明らかとなり、また遺伝子組換え技術による大量生産も
可能となって〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ．Ｂiol.Ｃhem.），２５６，９７５０
（１９８１）〕、抗腫瘍剤としての市販も間近となって
いる。

ヒトインターフェロン−αは、ＤＮＡ組換え法を適用し
た場合、大腸菌中で回収し得る程度の量で発現されてお
り通常モノクローナル抗体カラムを用いて培養液から分
離される〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ．Ｂiol.Ｃhem.），２５６，９７５０（１９
８１）。このようにして分離されたインターフェロンに
は天然型の蛋白質以外にジスルフィド結合，スルフヒド
リル基に起因すると考えられる不純物が混在する。ＥＰ
Ｃ公開１０８５８５−Ａ号公報においては、これらの不
純物は非還元条件下にドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析にかけて
サイズを測定すると単量体蛋白質の数倍の分子量を示す
低重合体（オリゴマー）であることがわかる物質、およ
び非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてやや緩慢に
移動する“スローモノマー”から成ると述べている。

ヒトインターフェロン−αは、Ｎ末端から第１，第２，
第３および第４の４個のシステイン残基を有しており、
組換え型ヒトインターフェロン−α２（ＩＦＮ−α２；
ＩＦＮ−αＡとも称される）の場合は、アミノ酸番号
１，２９，９８および１３８のアミノ酸にシステイン残
基を有している。天然型の分子配置ではアミノ酸番号１
−９８，および２９−１３８でこれらが結合している。
２９−１３８結合が活性に必要であり、活性は１−９８
結合が破壊された後も維持されていると考えられてい
る。上記ＥＰＣ公開特許公報によるとヒトインターフェ
ロン−α２の場合、２９−１３８結合はそのままで１−
９８結合が切れることにより“スローモノマー”が生ず
ると考えられると述べている。そしてこれらの“スロー
モノマー”など還元型インターフェロン−αは、精製の
途中で、空気酸化を受けて、ランダムなジスルフィド結
合を形成し、多くはオリゴマーとなり、一部は、そのま
まの状態でとどまり、製品中に存在すると考えられる。

オリゴマーはヒトインターフェロン−α２の活性が低
い。“スローモノマー”は、これ自身活性であるが免疫
原性を有すると云われ、またオリゴマーを形成しやす
い。従って天然型のものから、これら不純物を分離除去
することが強く望まれる。

従来不純物中のオリゴマーはゲルろ過によって除去され
る。しかしながらこの方法は回収率が良くないばかり
か、より重大な欠点として“スローモノマー”を除去で
きない。この欠点を克服した方法として上記ＥＰＣ公開
特許公報では、比較的濃厚な溶液（５〜１０mg/ｍ）
をpH３．５〜４．１，３０〜３４゜Cで１０−１４時間イ
ンキュベートすることにより“スローモノマー”とオリ
ゴマーを沈澱させる方法を開示しているが、この方法に
よると菌体中に多量に存在する“スローモノマー”が同
時に沈澱してしまうことになり非常に不経済である。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは組換え大腸菌中に蓄積されているヒトイン
ターフェロン−αは、ジスルフィド結合をした天然型モ
ノマー（“ファストモノマー”）と同時に含まれる“ス
ローモノマー”が大部分未酸化のスルフヒドリル基のま
まの完全もしくは部分還元型モノマーで存在しているこ
とを明らかにした。すなわち出来るだけ短時間でモノク
ローナル抗体カラムに吸着し、弱酸性で溶出して得たイ
ンターフェロン溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると
“スローモノマー”に一致する大きなスポットが認めら
れること、および逆相系のＨＰＬＣで分析すると“スロ
ーモノマー”に一致する位置に大きなピークが認められ
ること、さらに逆相系の高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の“スローモノマー”のピークが単一では
なく複雑に分かれていることから、大腸菌中に蓄積され
ているのは、大部分はスルフヒドリル基を有する完全も
しくは部分還元型であることを明らかにした。

上記知見に基づき、“スローモノマー”をオリゴマーへ
ほとんど移行させず、“ファストモノマー（天然型）”
に選択的に酸化移行させる技術を確立し、それに基づき
本発明を完成した。

問題を解決するための手段 本発明は、３０％以上が還元型であるヒトインターフェ
ロン−αを０．２mg／ｍ〜０．８mg／ｍ含有する水
溶液を熟成することを特徴とする天然型ヒトインターフ
ェロン−αの製造法を提供するものである。

上記ヒトインターフェロン−αは、天型物として得られ
るものおよび遺伝子組換え技術で製造されたもののいず
れをも意味する。

また各種公知のヒトインターフェロン−αスピーシーズ
も前記第１〜第４のシステインを有し〔ファーマコロジ
ー・アンド・テラポイティクス（Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈ
ｅｒ．），２７，３７１−４０１（１９８５）〕、上記
ヒトインターフェロンに包含される。とりわけ大腸菌で
生産された第４図で示されるアミノ酸配列を有するヒト
インターフェロン−αＡが好ましい。

還元型ヒトインターフェロン−αとは、スルフヒドリル
基のままの完全もしくは部分還元型の側鎖を１〜４有す
るヒトインターフェロンを意味し、“スローモノマー”
と称する。

本発明においては、３０％以上（分子数比）、好ましく
は４５％以上の“スローモノマー”を含むヒトインター
フェロン−α水溶液が有利に使用される。

熟成は、適切な条件下通常空気酸化することにより達成
される。

例えば、pHを、酢酸などの有機酸を用いて（０．１〜
０．５Ｎのものが好ましい）３．０〜３．５，とりわけ
３．０〜３．３に調整し、温度２５〜４５゜C，好ましく
は３０〜４０゜Cで自然放置により行う。

なお、上記熟成による空気酸化の温度は、上記に制約さ
れるものではない。低温になるほど長時間を要するの
で、通常２５〜４５゜Cで行う。熟成は、攪拌等などの操
作を加えない方がオリゴマーの生成防止の見地から好ま
しい。

熟成は、上記条件下２〜８日間、好ましくは３〜５日間
行う。

上記熟成による本発明の空気酸化の速度をスローモノマ
ーの、ファストモノマーへの移行による減少であらわせ
ば、その半減期は２日である。

なお、上記したオリゴマーとは部分的に重合したものを
意味する。このような重合生成物は単量体の別々の分子
間のジスルフィド結合に起因すると推測されている。オ
リゴマーには、二量体，三量体，四量体およびそれ以上
の高分子量の重合体が含まれる。

本発明方法の出発物質である３０％以上が還元型である
ヒトインターフェロン−αを０．２mg／ｍ〜０．８mg
／ｍ含有する水溶液は、例えばヒトインターフェロン
−α遺伝子を組込んだ大腸菌を培養して得た菌体を、例
えば、酸で菌を殺し、遠心分離して菌体を集め、凍結
し、抽出バッファーで抽出し、モノクローナル抗体カラ
ムに吸着し、酢酸水溶液で溶出して得た精製液や還元剤
で還元して人工的に“スローモノマー”となった還元型
などを必要に応じ緩衝剤により濃度調整したものを用い
ることができる。

本発明により製造される天然型ヒトインターフェロン−
αは高純度，高収率である天然のヒトインターフェロン
−αと同様、第１番目と第３番目および第２番目と第４
番のシステインがジスルフィド結合で結ばれた立体構造
を有し、公知の天然のヒトインターフェロン−αと同様
の生理活性を有し、抗腫瘍剤，抗ウィルス剤等として用
いることができる。

とりわけ、従来の方法に対し“スローモノマー”が“フ
ァストモノマー”に移行するため“ファストモノマー”
が増加するとともにオリゴマーの生成が防止できること
から、所望により行う後の精製工程が容易になるばかり
か、収量も増大する。

作用および実施例 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
これらにより本発明が制限的に解釈されるものではな
い。

なお、実施例に開示する原料としてのヒトインターフェ
ロン−α水溶液は、ＥＰＣ公開第１４４０６４号公報に
記載の方法で製造したものである。

実施例１ 菌体中に蓄積されているインターフェロン−αのスルフ
ヒドリル基の存在を明確にするために、下記の迅速精製
法を行って得たモノクローナル抗体カラム溶出液のスル
フヒドリル基を，エルマン（Ｅ１１man）の試薬を用い
て測定した。まず酸で殺した菌体を遠心分離機で分離し
て得た菌体ペーストの凍結物を出発原料とし，４倍量の
塩酸グァニジン（蛋白変性剤）とトライトンＸ−１００
（界面活性剤）を含む抽出バッファーで抽出した。抽出
液を遠心分離して得た上澄液に６倍量のバッファーを加
え薄め析出物を除いた上澄液を小さなモノクローナル抗
体カラムに通液し、カラムを洗浄バッファーで洗浄後、
０．２Ｎ酢酸で溶出し、インターフェロン−αの精製液
を得た。抽出から溶出迄約５時間で行った。その結果を
第１表に示す。

第１表から明らかなように迅速精製法で得たモノクロー
ナル抗体溶出液中には多量のＳＨ基が検出された。

実施例２ 実施例１と同様モノクローナル抗体溶出液を非還元条件
下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し“ファストモノマー”，
“スローモノマー”，オリゴマー含量を測定した。その
結果を第２表に示す。

第２表からもＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に於ても多量の“ス
ローモノマー”の存在は明らかである。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥは分子量に応じて物質を分析する電気
泳動の方法である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、例えば、β−
メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトールの様
な還元剤の存在下であらゆるジスルフィド結合を対応す
るスルフヒドリル基に還元した状態で泳動を行う還元条
件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥと、還元剤を使用しないで泳
動を行う非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥがある。非
還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥはジスルフィド結合に
帰因するオリゴマー等の存在を知る上に良い方法であ
る。

実施例３ ０．１％ＴritonＸ−１００を含む０．２Ｍ酢酸溶液で
モノクローナル抗体カラムから溶出した組換え型ヒトイ
ンターフェロン−α２溶液（pH３．３）の一部（２ｍ
）をとり、蛋白濃度を１．２mg／ｍに調整しpHを種
々に変えて２５゜Cで１５時間保温した。これらのサンプ
ルを非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルをCoom
assie Brilliant Blue Ｒ−２５０で染色し、脱色後、
デンシトメーターでファストモノマー，スローモノマー
およびオリゴマーの含量を測定した。その結果を第１図
に示す。

第１図から明らかなようにpHは低い方が良く、活性に与
える影響を考慮するとpH３．０〜３．５が最適条件であ
る。

実施例４ 実施例３と同様にヒトインターフェロン−α２溶液（pH
３．３）の一部（２ｍ）をとり、蛋白濃度を０．２mg
／ｍに調整し、種々の温度で１５時間保温した。これ
らのサンプルを実施例３と同様に非還元条件下のＳＤＳ
−ＰＡＧＥでファストモノマー，スローモノマーおよび
オリゴマーの含量を測定した。その結果を第２図に示
す。ただし、５０゜Cで保温した場合には沈澱が生じ、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥの分離用ゲル中に泳動されないため、デ
シントメーターで測定した回収率が６３％にまで低下し
た。第２図から明らかなように温度は高い方が変換率は
良くなるが、５０゜C以上では沈澱が生じるため、２５゜C
〜４５゜Cの温度が最適である。

実施例５ 実施例３と同様にヒトインターフェロン−α２溶液（pH
３．３）の一部（２ｍ）をとり、濃度を０．２mg／ｍ
に調整し、pH３．３、37゜Cで種々の時間保温した。こ
れらのサンプルを実施例３と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで
ファストモノマー，スローモノマーおよびオリゴマーの
含量を測定した。その結果を第３図に示す。本条件下で
長時間保温するにしたがい、スローモノマーが減少し、
ファストモノマーが増加した。オリゴマーの増加はほと
んどみられなかった。

発明の効果 本発明により、これまで不純物として利用できず除去さ
れていた還元型ヒトインターフェロン−αから有用な天
然型ヒトインターフェロン−αが製造できる。

【図面の簡単な説明】

第１図，第２図および第３図は、実施例３，４および５
に開示したＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果をそれぞ
れ示す。図中、●はファストモノマー，○はスローモノ
マー，△はオリゴマーをそれぞれ示す。 第４図は、ヒトＩＦＮ−αＡのアミノ酸配列を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】３０％以上が還元型であるヒトインターフ
   ェロン−αを０．２mg／ｍ〜０．８mg／ｍ含有する
   水溶液を熟成することを特徴とする天然型ヒトインター
   フェロン−αの製造法。