JPH0684970B2 - 糞便中の潜血検出方法 - Google Patents
糞便中の潜血検出方法Info
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- JPH0684970B2 JPH0684970B2 JP62080472A JP8047287A JPH0684970B2 JP H0684970 B2 JPH0684970 B2 JP H0684970B2 JP 62080472 A JP62080472 A JP 62080472A JP 8047287 A JP8047287 A JP 8047287A JP H0684970 B2 JPH0684970 B2 JP H0684970B2
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Description
【発明の詳細な説明】 イ．発明の目的 （ａ）産業上の利用分野 この発明は，例えば大腸癌のスクリーニング等を目的に
消化官における微小出血を免疫学的手法を用いてヒト由
来の血液成分を特異的に検出する方法に関するものであ
る。
消化官における微小出血を免疫学的手法を用いてヒト由
来の血液成分を特異的に検出する方法に関するものであ
る。
（ｂ）従来技術 消化器系統の異常，例えば癌，潰瘍等を早期に発見する
検診方法として糞便中に混じた血液の代表的蛋白質であ
るヘモグロビンを免疫学的手法により検出することが行
われている。
検診方法として糞便中に混じた血液の代表的蛋白質であ
るヘモグロビンを免疫学的手法により検出することが行
われている。
糞便中のヘモグロビンの検出には従来からベンチジン法
等の化学的糞便潜血反応法や免疫学的測定法があるが，
一般に化学的反応法は非常に敏感であって偽陽性が多く
でる欠点があり，又同法では血液中のヘモグロビンのペ
ルオキシダーゼ活性を検出するがペルオキシダーゼ活性
は肉，野菜等にも存在するので検査前に食餌を制限する
必要がある。従って食事制限無しに検出するには免疫学
的方法が適当である。
等の化学的糞便潜血反応法や免疫学的測定法があるが，
一般に化学的反応法は非常に敏感であって偽陽性が多く
でる欠点があり，又同法では血液中のヘモグロビンのペ
ルオキシダーゼ活性を検出するがペルオキシダーゼ活性
は肉，野菜等にも存在するので検査前に食餌を制限する
必要がある。従って食事制限無しに検出するには免疫学
的方法が適当である。
最近Barrow（Am.J.Cli.Pathol.69:342,1978 March）ら
を始めとしてヒトヘモグロビンと抗ヒトヘモグロビンの
抗体−抗原反応を用いる免疫学的糞便潜血反応による測
定法が開発され，例えば特開昭61-137064号にあるよう
に濾紙に糞便を塗布しヒトヘモグロビン抗体を感作した
担体粒子と混合し，該混合物での担体粒子の凝集状態を
判定する方法や特願昭60-069598号のにあるように糞便
を疎水性樹脂に接触させてヘモグロビンを吸着させ，こ
れに酵素標識抗体試薬により抗原抗体反応を生ぜしめて
基質液に浸して呈色度により検出する方法等が公知であ
る。
を始めとしてヒトヘモグロビンと抗ヒトヘモグロビンの
抗体−抗原反応を用いる免疫学的糞便潜血反応による測
定法が開発され，例えば特開昭61-137064号にあるよう
に濾紙に糞便を塗布しヒトヘモグロビン抗体を感作した
担体粒子と混合し，該混合物での担体粒子の凝集状態を
判定する方法や特願昭60-069598号のにあるように糞便
を疎水性樹脂に接触させてヘモグロビンを吸着させ，こ
れに酵素標識抗体試薬により抗原抗体反応を生ぜしめて
基質液に浸して呈色度により検出する方法等が公知であ
る。
また血液に特異な物質としてヒトアルブミンを免疫学的
測定法で検出することが中山卓郎氏他により「医学のあ
ゆみ」Vol.140,NO.3,1987.1.17号に提案されている。
測定法で検出することが中山卓郎氏他により「医学のあ
ゆみ」Vol.140,NO.3,1987.1.17号に提案されている。
（ｃ）発明が解決しようとする問題点 一般にヘモグロビンは抗体に対する力価が弱いので免疫
学的測定での測定感度が低く不利であり，且つ消化酵素
や腸内細菌の産生する蛋白分解酵素の作用によって構造
変化をきたし易く免疫学的検出に不利であるが，特に糞
便中のヘモグロビンを免疫学的反応法で検出する場合， （ａ）ヘモグロビンが消化官から分泌される粘液成分や
腸内細菌の細胞壁成分と結合して免疫学的反応性が低下
する （ｂ）糞便中のヘモグロビンは腸内細菌によって分解さ
れ易く（細菌の栄養源となり易い），分解されて時間の
経過と共に減少する （ｃ）ヘモグロビンを免疫学的方法で検出すると微量で
も検出可能であるが，量が増加しても呈色度が一定の限
界に達しそれ以上の量的判定ができない という問題点があり糞便中の潜血をヘモグロビンのみを
利用して検出するのは基本的問題がある。
学的測定での測定感度が低く不利であり，且つ消化酵素
や腸内細菌の産生する蛋白分解酵素の作用によって構造
変化をきたし易く免疫学的検出に不利であるが，特に糞
便中のヘモグロビンを免疫学的反応法で検出する場合， （ａ）ヘモグロビンが消化官から分泌される粘液成分や
腸内細菌の細胞壁成分と結合して免疫学的反応性が低下
する （ｂ）糞便中のヘモグロビンは腸内細菌によって分解さ
れ易く（細菌の栄養源となり易い），分解されて時間の
経過と共に減少する （ｃ）ヘモグロビンを免疫学的方法で検出すると微量で
も検出可能であるが，量が増加しても呈色度が一定の限
界に達しそれ以上の量的判定ができない という問題点があり糞便中の潜血をヘモグロビンのみを
利用して検出するのは基本的問題がある。
またヒトアルブミンは消化官出血以外に蛋白喪失性胃腸
症の場合にも選択的に漏出する代表的蛋白であり，且つ
ヘモグロビンと同様に腸内細菌による影響がかなり大き
く糞便中の潜血を検出する方法としては不適当である。
症の場合にも選択的に漏出する代表的蛋白であり，且つ
ヘモグロビンと同様に腸内細菌による影響がかなり大き
く糞便中の潜血を検出する方法としては不適当である。
これに対し本発明者らはヒトアルブミンの代わりにトラ
ンスフェリンを免疫学的測定により検出する方法を発明
し，同日付けで特願昭62-80471号として出願した。トラ
ンスフェリンは血液中に含有されているもので，ヒトア
ルブミンのように出血以外の原因により糞便中に含まれ
ることはない。また他の蛋白質より時間的に減少する度
合いが少ない（細菌安定性）利点があり，この性質は溶
菌型酵素を糞便中に添加するとさらに保存性がよくなる
ものである。さらにトランスフェリンでは含有量が大き
い場合には免疫学的反応の強度が量に比例して大きくな
るという特長を有するものである。
ンスフェリンを免疫学的測定により検出する方法を発明
し，同日付けで特願昭62-80471号として出願した。トラ
ンスフェリンは血液中に含有されているもので，ヒトア
ルブミンのように出血以外の原因により糞便中に含まれ
ることはない。また他の蛋白質より時間的に減少する度
合いが少ない（細菌安定性）利点があり，この性質は溶
菌型酵素を糞便中に添加するとさらに保存性がよくなる
ものである。さらにトランスフェリンでは含有量が大き
い場合には免疫学的反応の強度が量に比例して大きくな
るという特長を有するものである。
しかしトランスフェリンとヘモグロビンより含有量が本
質的に少ないので，実際の検出では偽陰性の出現が避け
られないという問題があった。
質的に少ないので，実際の検出では偽陰性の出現が避け
られないという問題があった。
すなわち糞便中のヘモグロビンか或いはトランスフェリ
ンを別々に検出するのでは検出が不安定であるという問
題がある。
ンを別々に検出するのでは検出が不安定であるという問
題がある。
この発明は前記の従来技術の問題を解消して，より確実
に糞便中の潜血を検出して大腸癌等の早期検出を目的と
するものである。
に糞便中の潜血を検出して大腸癌等の早期検出を目的と
するものである。
ロ．発明の構成 （ａ）問題点を解決するための手段 本発明は採取した糞便の試料にグリコシダーゼ型細胞溶
解酵素（以下溶菌酵素という）を作用せしめて，該試料
中のヘモグロビンとトランスフェリンを同時平行的に免
疫学的測定方法により検出することを特徴とする糞便中
の潜血検出方法であり，前記の問題を解消するものであ
る。
解酵素（以下溶菌酵素という）を作用せしめて，該試料
中のヘモグロビンとトランスフェリンを同時平行的に免
疫学的測定方法により検出することを特徴とする糞便中
の潜血検出方法であり，前記の問題を解消するものであ
る。
（ｂ）作用 グリコシダーゼ型溶菌酵素を食品，医薬等の防腐剤とし
て用いることは公知であり，これを糞便中に混入すると
長時間での腸内細菌によるヘモグロビンの分解を防止す
る効果がある。
て用いることは公知であり，これを糞便中に混入すると
長時間での腸内細菌によるヘモグロビンの分解を防止す
る効果がある。
さらに本発明者らは種々実験の結果，グリコシダーゼ型
溶菌酵素は前記の防腐効果以外に糞便中の粘液成分や腸
内細菌の細胞壁成分に結合しているヘモグロビンの結合
を短時間で分離させて免疫学的反応性を回復させる効果
も有することを発見した。
溶菌酵素は前記の防腐効果以外に糞便中の粘液成分や腸
内細菌の細胞壁成分に結合しているヘモグロビンの結合
を短時間で分離させて免疫学的反応性を回復させる効果
も有することを発見した。
この場合に溶菌酵素としてはグリコシダーゼ型溶菌酵素
であれば良いが，リゾチームが一般に市販されており使
用し易い。
であれば良いが，リゾチームが一般に市販されており使
用し易い。
溶菌酵素を作用せしめるには単にその溶液に採取した糞
便を浸しても，溶液してもよい。また溶菌酵素を含有さ
せた寒天ゲル容器中に糞便の試料を差し込み吸収させる
方法や溶菌酵素を含ませた濾紙に糞便を塗りつける方法
等各種の方法で行うことができる。
便を浸しても，溶液してもよい。また溶菌酵素を含有さ
せた寒天ゲル容器中に糞便の試料を差し込み吸収させる
方法や溶菌酵素を含ませた濾紙に糞便を塗りつける方法
等各種の方法で行うことができる。
次ぎにトランスフェリンの同時測定について説明する。
消化官出血があるとヘモグロビンを含めて他の血液成分
も同時に糞便中に混在している。血液中の蛋白質構成は
血球成分の主成分である赤血球やヘモグロビン以外に多
種類の蛋白質が雑多に混在する。本発明者らは，血液中
に100mg/dl以上に存在する蛋白質について検討した。
も同時に糞便中に混在している。血液中の蛋白質構成は
血球成分の主成分である赤血球やヘモグロビン以外に多
種類の蛋白質が雑多に混在する。本発明者らは，血液中
に100mg/dl以上に存在する蛋白質について検討した。
（イ）アルブミン：前記の通り出血以外の漏出があり，
細菌の影響も大きい （ロ）免疫グロブリン：大腸粘膜の免疫機構に関与する
ものであり、出血とは無関係に腸内に多量に存在する。
細菌の影響も大きい （ロ）免疫グロブリン：大腸粘膜の免疫機構に関与する
ものであり、出血とは無関係に腸内に多量に存在する。
（ハ）フィブリノーゲン：腸内細菌の影響を多く受け，
且つ免疫学的反応性が弱い。
且つ免疫学的反応性が弱い。
（ニ）α１アンチトリプシン及びα２マクログロブリ
ン：出血以外糞便中に多量に存在する （ホ）ハプトグロブリン：ヘモグロビンと複合体を形成
して，その相互作用により両方の免疫反応性が弱い。
ン：出血以外糞便中に多量に存在する （ホ）ハプトグロブリン：ヘモグロビンと複合体を形成
して，その相互作用により両方の免疫反応性が弱い。
（ヘ）トランスフェリン：細菌に対する抵抗性が大き
く，蛋白喪失性胃腸症の場合にも漏出しにくい。免疫学
的反応性が大きい。また癌との関連性があり，糞便中の
干渉成分の影響が少ない。
く，蛋白喪失性胃腸症の場合にも漏出しにくい。免疫学
的反応性が大きい。また癌との関連性があり，糞便中の
干渉成分の影響が少ない。
以上の検討結果，実験を行ったところトランスフェリン
は血液中に約250mg/dl含まれ，量的にはヘモグロビンの
約1/60であるが充分に免疫反応により検出できるもので
あり，しかもトランスフェリンは大きな濃度域に対して
直線的な吸光度特性を示すことが分かった。
は血液中に約250mg/dl含まれ，量的にはヘモグロビンの
約1/60であるが充分に免疫反応により検出できるもので
あり，しかもトランスフェリンは大きな濃度域に対して
直線的な吸光度特性を示すことが分かった。
本発明の検出方法としては普通の免疫学的測定方法を用
いればよい。
いればよい。
次ぎに本発明の実際の検出方法の例を示す。
（１）検出方法１（ステイックEIA法） 例えばポリスチレン，ナイロン，塩化ビニール等の疎水
性プラスチック材料でサジの部分に溝をもうけた採便サ
ジを採取器とする。市販の抗ヒトヘモグロビン抗体（DA
KO社製）及び抗ヒトトランスフェリン抗体（DAKO社製）
をトリス緩衝液（pH8.4,0.05M）中にそれぞれ終濃度が2
00倍希釈,800倍希釈（濃度及びその比率はこれに限定さ
れるものでない）になるように加えて採便サジの先端を
浸積し,4〜８℃で一夜放置し，その後室温で乾燥して表
面にコーティングする。
性プラスチック材料でサジの部分に溝をもうけた採便サ
ジを採取器とする。市販の抗ヒトヘモグロビン抗体（DA
KO社製）及び抗ヒトトランスフェリン抗体（DAKO社製）
をトリス緩衝液（pH8.4,0.05M）中にそれぞれ終濃度が2
00倍希釈,800倍希釈（濃度及びその比率はこれに限定さ
れるものでない）になるように加えて採便サジの先端を
浸積し,4〜８℃で一夜放置し，その後室温で乾燥して表
面にコーティングする。
採便サジで糞便の異なった場所を数回突き刺し，トイレ
ットペーパーでサジの部分の溝の上の余剰の糞便を拭き
取りサジのくぼみに一定量の糞便を残して試料とする。
ットペーパーでサジの部分の溝の上の余剰の糞便を拭き
取りサジのくぼみに一定量の糞便を残して試料とする。
一方市販のアガロースを２％になるように食塩加リン酸
緩衝液（pH7.2,0.1M）に加え加熱溶解する。これを約60
℃に温度を下げた状態で溶菌酵素としてリゾチームを寒
天溶液1ml当たり3mgの割合で又NaN3を終濃度0.1％にな
るように加える。これを1mlづつ寒天ゲル容器に分注し
て冷却してゲル化する。
緩衝液（pH7.2,0.1M）に加え加熱溶解する。これを約60
℃に温度を下げた状態で溶菌酵素としてリゾチームを寒
天溶液1ml当たり3mgの割合で又NaN3を終濃度0.1％にな
るように加える。これを1mlづつ寒天ゲル容器に分注し
て冷却してゲル化する。
この寒天容器中に採取サジを差し込み固定して一定時間
放置する。
放置する。
そうすると採便サジに付いた糞便は寒天ゲル中に拡散
し，特に腸内細胞の細胞壁成分や粘液成分と結合してい
るヘモグロビンがリゾチームによって分解されて免疫的
反応が可能な状態となり，糞便中のヘモグロビンが完全
にサジの表面の抗ヒトヘモグロビン抗体に反応して補足
される。また糞便中のトランスフェリンも抗ヒトトラン
スフェリン抗体に補足される。またリゾチーム及びNaN3
は防腐剤として作用するので，採便直後に検査を必要と
する糞便試料を防腐効果のある状態で保持でき且つ抗原
抗体反応を輸送中にも安定した状態で行わせることがで
きる。またこの状態では臭気，不潔感がなく集団検診に
おけるサンプリング法として適している。
し，特に腸内細胞の細胞壁成分や粘液成分と結合してい
るヘモグロビンがリゾチームによって分解されて免疫的
反応が可能な状態となり，糞便中のヘモグロビンが完全
にサジの表面の抗ヒトヘモグロビン抗体に反応して補足
される。また糞便中のトランスフェリンも抗ヒトトラン
スフェリン抗体に補足される。またリゾチーム及びNaN3
は防腐剤として作用するので，採便直後に検査を必要と
する糞便試料を防腐効果のある状態で保持でき且つ抗原
抗体反応を輸送中にも安定した状態で行わせることがで
きる。またこの状態では臭気，不潔感がなく集団検診に
おけるサンプリング法として適している。
別に前記市販の抗血清（アガロース）に公知の（吉武氏
等著，免疫実験法XI,p3497〜3519,1982）方法でアルカ
リホスファターゼ標識抗体を調整する。すなわち抗ヒト
ヘモグロビンと抗ヒトトランスフェリンのアルカリホス
ファターゼ標識抗体をそれぞれ終濃度500倍希釈になる
ように,5％牛アルビミン,0.5mM塩化マグネシウムを含む
食塩加リン酸緩衝液に加えて酵素標識抗体使用液を調整
する。
等著，免疫実験法XI,p3497〜3519,1982）方法でアルカ
リホスファターゼ標識抗体を調整する。すなわち抗ヒト
ヘモグロビンと抗ヒトトランスフェリンのアルカリホス
ファターゼ標識抗体をそれぞれ終濃度500倍希釈になる
ように,5％牛アルビミン,0.5mM塩化マグネシウムを含む
食塩加リン酸緩衝液に加えて酵素標識抗体使用液を調整
する。
前記ヘモグロビンとトランスフェリンを補足した採便サ
ジを取り出して，表面を脱イオン水で洗浄して残存付着
糞便を除去し，この採便サジを酵素標識抗体使用液を0.
25mlを分注した小試験管に入れて37℃,60分間抗原抗体
反応を行わせる。
ジを取り出して，表面を脱イオン水で洗浄して残存付着
糞便を除去し，この採便サジを酵素標識抗体使用液を0.
25mlを分注した小試験管に入れて37℃,60分間抗原抗体
反応を行わせる。
次いで採便サジを脱イオン水でよく洗浄しアルカリホス
フエターゼをKind−King法で測定する。すなわち採便サ
ジをフェニルリン酸基質液0.3mlを入れた小試験管に入
れて37℃,30分間インキュベートして，呈色液0.3mlを加
え反応を停止させて呈色度（この場合には赤色）を肉眼
で測定し判定する。
フエターゼをKind−King法で測定する。すなわち採便サ
ジをフェニルリン酸基質液0.3mlを入れた小試験管に入
れて37℃,30分間インキュベートして，呈色液0.3mlを加
え反応を停止させて呈色度（この場合には赤色）を肉眼
で測定し判定する。
（２）検出方法２（ELISA法〔Enzyme−Linked Immunoso
rbent Assay〕） 溶菌酵素としてリゾチームを食塩加リン酸緩衝液（pH7.
2,0.1M）1ml中に4,NaN3を1mgの割合で溶解した液を染み
込ませて乾燥した厚手の濾紙のうんえにヘラで糞便を薄
く塗ったものをサンプルとする。または前記組成の溶液
を1ml小壜中に入れておき，細棒で糞便を少量とったも
のを入れて溶液サンプルとする。いずれのサンプリング
法においても糞便の量を一定にすることが望ましい。
rbent Assay〕） 溶菌酵素としてリゾチームを食塩加リン酸緩衝液（pH7.
2,0.1M）1ml中に4,NaN3を1mgの割合で溶解した液を染み
込ませて乾燥した厚手の濾紙のうんえにヘラで糞便を薄
く塗ったものをサンプルとする。または前記組成の溶液
を1ml小壜中に入れておき，細棒で糞便を少量とったも
のを入れて溶液サンプルとする。いずれのサンプリング
法においても糞便の量を一定にすることが望ましい。
抗ヒトヘモグロビン抗体（DAKO社製）と抗ヒトトランス
フェリン抗体（DAKO社製）を終濃度でそれぞれ200倍希
釈,800倍希釈の割合（これに限定されない）で含むトリ
ス緩衝液（pH8.4,0.05M）をELISA用マイクロプレートの
各穴に100μｌづつ分注し,4〜８℃で一夜放置し抗体コ
ーティングする。この抗体コーテイングプレートを脱イ
オン水で洗浄後各穴に１％牛アルブミンを含む食塩抗リ
ン酸緩衝液を100μｌ分注する。
フェリン抗体（DAKO社製）を終濃度でそれぞれ200倍希
釈,800倍希釈の割合（これに限定されない）で含むトリ
ス緩衝液（pH8.4,0.05M）をELISA用マイクロプレートの
各穴に100μｌづつ分注し,4〜８℃で一夜放置し抗体コ
ーティングする。この抗体コーテイングプレートを脱イ
オン水で洗浄後各穴に１％牛アルブミンを含む食塩抗リ
ン酸緩衝液を100μｌ分注する。
濾紙サンプリング法のばあいには直径5mmのパンチでく
り抜いた濾紙を各穴に一枚づつ入れる。溶液サンプリン
グ法の場合には溶液を各穴に50μｌいれる。
り抜いた濾紙を各穴に一枚づつ入れる。溶液サンプリン
グ法の場合には溶液を各穴に50μｌいれる。
次いで37℃,60分間抗原抗体反応をさせる。次ぎに良く
洗浄後アルカリホスファターゼ標識抗体使用液（抗ヒト
ヘモグロビン，抗ヒトトランスフェリンのいずれも500
倍希釈液）を100μｌづつ各穴に分注し,37℃,60分間抗
原抗体反応をさせる。脱イオン水でよく洗浄の後,Kind
−King法によるアルカリホスファターゼ測定用基質液を
100μｌづつ各穴に分注して37℃,30分間反応後直ちに呈
色試薬を100μｌ加えて反応を停止させる。
洗浄後アルカリホスファターゼ標識抗体使用液（抗ヒト
ヘモグロビン，抗ヒトトランスフェリンのいずれも500
倍希釈液）を100μｌづつ各穴に分注し,37℃,60分間抗
原抗体反応をさせる。脱イオン水でよく洗浄の後,Kind
−King法によるアルカリホスファターゼ測定用基質液を
100μｌづつ各穴に分注して37℃,30分間反応後直ちに呈
色試薬を100μｌ加えて反応を停止させる。
各穴の呈色度を肉眼測定またはマイクロプレート用光度
計で測光する。
計で測光する。
いずれの場合にも複数の健常者からヘパリン採血した全
血を混和して脱イオン水で３万倍に希釈した試料を50μ
ｌを用いて同時に検出を実施し呈色度を比較して判定す
ると良い。
血を混和して脱イオン水で３万倍に希釈した試料を50μ
ｌを用いて同時に検出を実施し呈色度を比較して判定す
ると良い。
本発明法の場合，通常ヘモグロビン換算で2.5〜５μg/m
lが検出されることに陽性と判定すれば良い。
lが検出されることに陽性と判定すれば良い。
（ｃ）実施例 実施例1. 多数（129人）の糞便の試料につき，そのままの試料と
リゾチームを添加した場合のヘモグロビンをELISA法に
よって測定した。
リゾチームを添加した場合のヘモグロビンをELISA法に
よって測定した。
その結果を無添加の試料の呈色度を横軸にリゾチーム添
加試料の呈色度を縦軸にプロットしたところ第１図のよ
うになった。リゾチームを添加した試料の測定値は添加
しない測定値より大で（45度の線より上にある）あり，
ヘモグロビンが完全に測定できていることが分かる。通
常上記のように検出においては吸光度が100〜200を限界
として判別しているが，かなりの試料が無添加では陰性
であるが、添加すると陽性となり検出の精度が上昇して
いることが分かる。
加試料の呈色度を縦軸にプロットしたところ第１図のよ
うになった。リゾチームを添加した試料の測定値は添加
しない測定値より大で（45度の線より上にある）あり，
ヘモグロビンが完全に測定できていることが分かる。通
常上記のように検出においては吸光度が100〜200を限界
として判別しているが，かなりの試料が無添加では陰性
であるが、添加すると陽性となり検出の精度が上昇して
いることが分かる。
実施例2. 健常者30人の便汁を混合して造った約25％便汁に全血を
終濃度10000倍の割合で添加してヘモグロビンの量の時
間的変化を調査した。結果は第２図の通りであった。こ
れによりリゾチームを添加した便汁ではヘモグロビンの
腸内細菌による分解の進行が阻止されていることが分か
る。
終濃度10000倍の割合で添加してヘモグロビンの量の時
間的変化を調査した。結果は第２図の通りであった。こ
れによりリゾチームを添加した便汁ではヘモグロビンの
腸内細菌による分解の進行が阻止されていることが分か
る。
実施例3. 前記ELISA法により60例の濃厚便汁中のトランスフェリ
ンを吸光度により測定し，次ぎに該60例の濃厚便汁に全
血30000倍希釈液を添加して同様に測定し，その結果を
無添加の試料の吸光度を横軸に全血添加試料の呈色度を
縦軸にプロットしたところ第３図のようになった。60例
の便汁には始めから血液を含有するものが含まれている
が，全ての便汁で全血を添加するとその添加量だけトラ
ンスフェリンによる吸光度が増加することが分かる。即
ちトランスフェリンは微量の測定が可能であり，しかも
糞便中の潜血を検出するのに有効であることが分かる。
ンを吸光度により測定し，次ぎに該60例の濃厚便汁に全
血30000倍希釈液を添加して同様に測定し，その結果を
無添加の試料の吸光度を横軸に全血添加試料の呈色度を
縦軸にプロットしたところ第３図のようになった。60例
の便汁には始めから血液を含有するものが含まれている
が，全ての便汁で全血を添加するとその添加量だけトラ
ンスフェリンによる吸光度が増加することが分かる。即
ちトランスフェリンは微量の測定が可能であり，しかも
糞便中の潜血を検出するのに有効であることが分かる。
実施例4. 健常者30人の便汁を混合して造った約25％便汁に全血を
終濃度10000倍の割合で添加して各種の蛋白質の量の時
間的変化を調査した。結果は第４図の通りであった。こ
れによりトランスフェリン以外の蛋白質は時間と共に腸
内細菌による分解が進行するが，トランスフェリンは殆
ど変化せず，従って糞便中の潜血を検出には最適である
ことが分かる。さらにこの試料に溶菌酵素としてリゾチ
ームを添加してトランスフェリン量の時間的変化を測定
した。その結果は第５図の通りであり，トランスフェリ
ンの腸内細菌による分解は少ないが，それもリゾチーム
を添加するとさらに分解が阻止されることが分かる。
終濃度10000倍の割合で添加して各種の蛋白質の量の時
間的変化を調査した。結果は第４図の通りであった。こ
れによりトランスフェリン以外の蛋白質は時間と共に腸
内細菌による分解が進行するが，トランスフェリンは殆
ど変化せず，従って糞便中の潜血を検出には最適である
ことが分かる。さらにこの試料に溶菌酵素としてリゾチ
ームを添加してトランスフェリン量の時間的変化を測定
した。その結果は第５図の通りであり，トランスフェリ
ンの腸内細菌による分解は少ないが，それもリゾチーム
を添加するとさらに分解が阻止されることが分かる。
実施例5. 便汁中に全血を種々の濃度に混合してELISA法によりヘ
モグロビン及びトランスフェリン含有量と吸光度との関
係を相互に独立に（抗ヒトヘモグロビン或いは抗ヒトト
ランスフェリンのみを使用）測定したところ第６図の通
りであった。ヘモグロビンは約2.5μg/mlの含有量まで
は非常に敏感であるが，それ以上の含有量になると吸光
度約250程度で飽和してしまう。一方トランスフェリン
は含有量に対し殆ど直線的に吸光度が増加することが分
かる。
モグロビン及びトランスフェリン含有量と吸光度との関
係を相互に独立に（抗ヒトヘモグロビン或いは抗ヒトト
ランスフェリンのみを使用）測定したところ第６図の通
りであった。ヘモグロビンは約2.5μg/mlの含有量まで
は非常に敏感であるが，それ以上の含有量になると吸光
度約250程度で飽和してしまう。一方トランスフェリン
は含有量に対し殆ど直線的に吸光度が増加することが分
かる。
実施例6. 実施例５と同様の試料に対し，ヘモグロビン及びトラン
スフェリンを独立に測定すると共に本発明の方法を用い
て測定した結果を第７図に示す。
スフェリンを独立に測定すると共に本発明の方法を用い
て測定した結果を第７図に示す。
この結果から本発明の方法によると，低濃度域から高濃
度域まで敏感に糞便中の潜血を敏感に検出，測定するこ
とができることが分かる。
度域まで敏感に糞便中の潜血を敏感に検出，測定するこ
とができることが分かる。
実施例7. 本発明の方法において，終濃度で抗ヒトヘモグロビン抗
体を200倍希釈，抗トランスフェリン抗体をそれぞれ20
0,400,800倍希釈になるように調整したトリス緩衝液を
用いた場合を実験した。
体を200倍希釈，抗トランスフェリン抗体をそれぞれ20
0,400,800倍希釈になるように調整したトリス緩衝液を
用いた場合を実験した。
結果は第８図に示す通りであった。
トランスフェリンの希釈倍数が変化しても結果には大き
な差がなく，良い直線性をもって検出，測定が可能であ
ることが分かる。また微量を検出するには抗ヒトトラン
スフェリン抗体を少なくし，全濃度域での測定は抗ヒト
トランスフェリン抗体の濃度を上げればよいことが分か
る。
な差がなく，良い直線性をもって検出，測定が可能であ
ることが分かる。また微量を検出するには抗ヒトトラン
スフェリン抗体を少なくし，全濃度域での測定は抗ヒト
トランスフェリン抗体の濃度を上げればよいことが分か
る。
実施例8. 大腸癌患者の51の糞便試料A,大腸ポリープ患者の40の糞
便試料B,健全者の110の糞便試料Ｃについて，ヘモグロ
ビンのみ，トランスフェリンのみ，及び本発明の方法に
よる両者同時検出法による潜血の検出を行って結果を比
較した。
便試料B,健全者の110の糞便試料Ｃについて，ヘモグロ
ビンのみ，トランスフェリンのみ，及び本発明の方法に
よる両者同時検出法による潜血の検出を行って結果を比
較した。
結果は第９図の通りであった。
大腸癌患者の51例でヘモグロビン，トランスフェリン単
独検出で両方とも陽性は27例であり，それ以外にヘモグ
ロビンのみ陽性は７例，トランスフェリンのみ陽性は７
例であった。本発明方法によると41例を検出できた。す
なわちヘモグロビン単独の場合の検出率66.7％に比しト
ランスフェリン検出を追加することにより検出率は80.4
％と，検出効果が大となり，偽陰性を防ぐことができる
ことが分かる。
独検出で両方とも陽性は27例であり，それ以外にヘモグ
ロビンのみ陽性は７例，トランスフェリンのみ陽性は７
例であった。本発明方法によると41例を検出できた。す
なわちヘモグロビン単独の場合の検出率66.7％に比しト
ランスフェリン検出を追加することにより検出率は80.4
％と，検出効果が大となり，偽陰性を防ぐことができる
ことが分かる。
大腸ポリープ患者の場合は単独検出で両方とも陽性は６
例であり，ヘモグロビンのみ陽性は３例，トランスフェ
リンのみ陽性は12例であった。すなわちヘモグロビン単
独の場合の検出率22.5％に比し，トランスフェリン検出
を追加する本発明の方法によると検出率は52.5％と増加
し，検出効果が大となり，偽陰性を防ぐことができるこ
とが分かる。
例であり，ヘモグロビンのみ陽性は３例，トランスフェ
リンのみ陽性は12例であった。すなわちヘモグロビン単
独の場合の検出率22.5％に比し，トランスフェリン検出
を追加する本発明の方法によると検出率は52.5％と増加
し，検出効果が大となり，偽陰性を防ぐことができるこ
とが分かる。
健常者では,110例中ヘモグロビンで陽性は１例，トラン
スフェリン陽性は２例であり，本発明では３例であっ
た。本発明によっても97.2％は陰性であり，偽陽性の出
現は少ないことが分かる。
スフェリン陽性は２例であり，本発明では３例であっ
た。本発明によっても97.2％は陰性であり，偽陽性の出
現は少ないことが分かる。
ハ．発明の効果 以上に詳しく説明したように，本発明は従来法に比し被
験者に食餌制限を必要とせず，従来のヘモグロビン検出
法に比し更に精密に糞便中の潜血を検出できるものであ
り，特に大腸癌のスクリーニング等に用いて非常に有効
な糞便中の潜血検出方法である。
験者に食餌制限を必要とせず，従来のヘモグロビン検出
法に比し更に精密に糞便中の潜血を検出できるものであ
り，特に大腸癌のスクリーニング等に用いて非常に有効
な糞便中の潜血検出方法である。
第１図は同じ糞便に溶菌酵素を添加した場合と無添加の
場合のヘモグロビンの測定結果を比較したグラフであ
り，第２図は糞便中のヘモグロビンの量の時間的変化を
比較した結果を示すグラフである。第３図はELISA法に
より濃厚便汁及びそれに全血30000倍希釈液を添加した
もののトランスフェリンを吸光度により測定して比較し
た結果を示すグラフであり，第４図は糞便中の各種蛋白
質の時間的変化を示すグラフ，第５図はリゾチームを添
加した場合のトランスフェリンの時間的変化を示すグラ
フである。第６図は便汁中のヘモグロビン及びトランス
フェリンの各濃度に対する吸光度の変化を示すグラフ，
第７図は本発明の方法による便汁中の潜血反応の結果を
示すグラフ，第８図は抗ヒトヘモグロビン抗体と抗ヒト
トランスフェリンの比率を変化させた場合の本発明方法
による吸光度の変化をしめすグラフである。第９図は各
種患者の糞便の潜血を検出した場合の陽性の頻度を示す
グラフである。
場合のヘモグロビンの測定結果を比較したグラフであ
り，第２図は糞便中のヘモグロビンの量の時間的変化を
比較した結果を示すグラフである。第３図はELISA法に
より濃厚便汁及びそれに全血30000倍希釈液を添加した
もののトランスフェリンを吸光度により測定して比較し
た結果を示すグラフであり，第４図は糞便中の各種蛋白
質の時間的変化を示すグラフ，第５図はリゾチームを添
加した場合のトランスフェリンの時間的変化を示すグラ
フである。第６図は便汁中のヘモグロビン及びトランス
フェリンの各濃度に対する吸光度の変化を示すグラフ，
第７図は本発明の方法による便汁中の潜血反応の結果を
示すグラフ，第８図は抗ヒトヘモグロビン抗体と抗ヒト
トランスフェリンの比率を変化させた場合の本発明方法
による吸光度の変化をしめすグラフである。第９図は各
種患者の糞便の潜血を検出した場合の陽性の頻度を示す
グラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】糞便中の潜血検出方法において，糞便試料
にグリコシダーゼ型溶菌酵素を作用させ，該試料中のヘ
モグロビンとトランスフェリンを同時に免疫学的測定法
により検出することを特徴とする糞便中の潜血検出方法 - 【請求項２】グリコシダーゼ型溶菌酵素としてリゾチー
ムを用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の糞便中の潜血検出方法 - 【請求項３】採便サジに抗ヒトヘモグロビン抗体と抗ヒ
トトランスフェリン抗体をコーテイングして採便し，該
試料を溶菌酵素を含むゲル中に差し込んで一定時間試料
を保存したのち免疫学的測定法によりヘモグロビンとト
ランスフェリンを同時に検出することを特徴とする特許
請求の範囲第１項あるいは第２項記載の糞便中の潜血検
出方法
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62080472A JPH0684970B2 (ja) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | 糞便中の潜血検出方法 |
| US07/247,616 US4920045A (en) | 1987-03-31 | 1988-09-22 | Detection of occult blood in feces |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62080472A JPH0684970B2 (ja) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | 糞便中の潜血検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63246669A JPS63246669A (ja) | 1988-10-13 |
| JPH0684970B2 true JPH0684970B2 (ja) | 1994-10-26 |
Family
ID=13719205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62080472A Expired - Lifetime JPH0684970B2 (ja) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | 糞便中の潜血検出方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4920045A (ja) |
| JP (1) | JPH0684970B2 (ja) |
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| JPH0259466U (ja) * | 1988-10-20 | 1990-05-01 | ||
| JPH0260870U (ja) * | 1988-10-26 | 1990-05-07 | ||
| US5166053A (en) * | 1990-02-23 | 1992-11-24 | Miles Inc. | Specimen adequacy control for chlamydia assays |
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| US5939252A (en) | 1997-05-09 | 1999-08-17 | Lennon; Donald J. | Detachable-element assay device |
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-
1988
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