JPH0684971B2 - 軟骨組織異常の診断法 - Google Patents
軟骨組織異常の診断法Info
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- JPH0684971B2 JPH0684971B2 JP60063179A JP6317985A JPH0684971B2 JP H0684971 B2 JPH0684971 B2 JP H0684971B2 JP 60063179 A JP60063179 A JP 60063179A JP 6317985 A JP6317985 A JP 6317985A JP H0684971 B2 JPH0684971 B2 JP H0684971B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は軟骨または関連の組織に影響する障害を検出す
る方法に関し、特に、そのような障害を末梢血のケラタ
ン硫酸の濃度を測定する事により検出する方法に関す
る。
る方法に関し、特に、そのような障害を末梢血のケラタ
ン硫酸の濃度を測定する事により検出する方法に関す
る。
従来の技術 多くの人が軟骨または軟骨類似組織の障害に苦しんでお
り、したがつて軟骨組織の分解同様正常および異常軟骨
組織の組立てが現在の探究の重要な話題である。骨関節
炎は軟骨組織の分解により特徴付けられる状態であり、
55才以上の多くの人に起こる。仕事場での常習的欠席の
一つの最も重要な理由は慢性背痛であり、脊椎の間にあ
り、軟骨に非常に類似した組織から形成されている椎間
板の劣化に多くの場合関連する。軟骨に関係のある他の
組織は眼の角膜の組織であり、角膜混濁、視覚消失症、
斑状変性症は正常角膜組織に存在する巨大分子の生合成
ができない人に起こる事が示されている。
り、したがつて軟骨組織の分解同様正常および異常軟骨
組織の組立てが現在の探究の重要な話題である。骨関節
炎は軟骨組織の分解により特徴付けられる状態であり、
55才以上の多くの人に起こる。仕事場での常習的欠席の
一つの最も重要な理由は慢性背痛であり、脊椎の間にあ
り、軟骨に非常に類似した組織から形成されている椎間
板の劣化に多くの場合関連する。軟骨に関係のある他の
組織は眼の角膜の組織であり、角膜混濁、視覚消失症、
斑状変性症は正常角膜組織に存在する巨大分子の生合成
ができない人に起こる事が示されている。
軟骨、椎間板または角膜障害の診断はしばしば関節また
は背部に痛みを感じ、斑状変性症の場合には視覚の消失
が始まる比較的進んだ段階に障害が達してからのみくだ
される。軟骨、椎間板または角膜組織の障害が症候性に
なる前にその開始を診断する方法が望まれている。
は背部に痛みを感じ、斑状変性症の場合には視覚の消失
が始まる比較的進んだ段階に障害が達してからのみくだ
される。軟骨、椎間板または角膜組織の障害が症候性に
なる前にその開始を診断する方法が望まれている。
プロテオグリカンは軟骨の細胞外マトリツクスの主成分
であり、会合体に高度に組織化されているのが観察され
る。これらの会合体はヒアルウロン酸結合領域と称され
る分子部分を通してヒアルウロン酸と特異的に結合でき
るプロテログリカン分子を含んでいる。
であり、会合体に高度に組織化されているのが観察され
る。これらの会合体はヒアルウロン酸結合領域と称され
る分子部分を通してヒアルウロン酸と特異的に結合でき
るプロテログリカン分子を含んでいる。
軟骨組織プロテオグリカン分子は約2000-4000アミノ酸
残基のコアタンパク質中心を持つ。このコアタンパク質
の一つの末端はＮ−結合少糖類を含有し、非常に特異的
にヒアルウロン酸と相互作用できる。それはヒアルウロ
ン酸結合領域と称されている。タンパク質部分の大部分
は共有結合的に結合したグリコサミノグリコン部分（特
にケラタン硫酸およびコンドロイチン硫酸）が豊富であ
る。ケラタン硫酸部分はコンドロイチン硫酸が少いケラ
タン硫酸潤沢領域およびコンドロイチン硫酸鎖の大多数
が観察される主多糖類結合領域の両方に観察される。コ
ンドロイチン硫酸部分はヒトでは椎間板組織の約5000か
ら若者の関節軟骨での約15,000から20,000までの範囲の
分子量を持つている。ケラタン硫酸はその分子量が約30
00から約9000の範囲であり、椎間板組織のものが関節軟
骨のものよりわずかに大きい。ケラタン硫酸は二糖類
（グルコサミン−ガラクトース）の繰り返し配列からな
つている。各々のこれら２つの糖が硫酸化されている程
度はケラタン硫酸の起源により異る。ケラチン硫酸分子
をタンパク質に結合している結合領域を作つている糖の
配列の正確な組成が何であるかはまだ明確でない。
残基のコアタンパク質中心を持つ。このコアタンパク質
の一つの末端はＮ−結合少糖類を含有し、非常に特異的
にヒアルウロン酸と相互作用できる。それはヒアルウロ
ン酸結合領域と称されている。タンパク質部分の大部分
は共有結合的に結合したグリコサミノグリコン部分（特
にケラタン硫酸およびコンドロイチン硫酸）が豊富であ
る。ケラタン硫酸部分はコンドロイチン硫酸が少いケラ
タン硫酸潤沢領域およびコンドロイチン硫酸鎖の大多数
が観察される主多糖類結合領域の両方に観察される。コ
ンドロイチン硫酸部分はヒトでは椎間板組織の約5000か
ら若者の関節軟骨での約15,000から20,000までの範囲の
分子量を持つている。ケラタン硫酸はその分子量が約30
00から約9000の範囲であり、椎間板組織のものが関節軟
骨のものよりわずかに大きい。ケラタン硫酸は二糖類
（グルコサミン−ガラクトース）の繰り返し配列からな
つている。各々のこれら２つの糖が硫酸化されている程
度はケラタン硫酸の起源により異る。ケラチン硫酸分子
をタンパク質に結合している結合領域を作つている糖の
配列の正確な組成が何であるかはまだ明確でない。
生出後、プロテオグリカン分子は大きさおよび化学的組
成物が変化する。変化はコアタンパク質に共有的に結合
しているコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸および少糖
類分子の相対的含量同様コンドロイチン硫酸鎖の長さの
変更も含んでいる。グリコサミノグリカン部分特にケラ
タン硫酸は最近の研究の目標であつた。例えば、骨関節
炎軟骨から単離されたプロテオグリカンは未熟の組織か
ら単離されたプロテオグリカンと類似した組成を持つて
いる事が示されてきた。コンドロサイト（軟骨細胞）は
組織複製の試みにおいて、明らかにケラタン硫酸が少い
未熟プロテオグリカンの生合成へスイツチされている。
ケラタン硫酸含量は軟骨の硬さに相関する事が観察され
ており、低ケラタン硫酸プロテオグリカンは関節の負荷
耐性要求に対し不適である事が示唆されてきた。
成物が変化する。変化はコアタンパク質に共有的に結合
しているコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸および少糖
類分子の相対的含量同様コンドロイチン硫酸鎖の長さの
変更も含んでいる。グリコサミノグリカン部分特にケラ
タン硫酸は最近の研究の目標であつた。例えば、骨関節
炎軟骨から単離されたプロテオグリカンは未熟の組織か
ら単離されたプロテオグリカンと類似した組成を持つて
いる事が示されてきた。コンドロサイト（軟骨細胞）は
組織複製の試みにおいて、明らかにケラタン硫酸が少い
未熟プロテオグリカンの生合成へスイツチされている。
ケラタン硫酸含量は軟骨の硬さに相関する事が観察され
ており、低ケラタン硫酸プロテオグリカンは関節の負荷
耐性要求に対し不適である事が示唆されてきた。
軟骨組織に関する最近の探究の目標がケラタン硫酸であ
つた事実にもかかわらず、比較的ケラタン硫酸について
知られていない。ケラタン硫酸はまだ十分に特徴付けら
れていないだけでなく、その分解またはそれ以上に一般
的にその代謝についてほとんど知られていない。
つた事実にもかかわらず、比較的ケラタン硫酸について
知られていない。ケラタン硫酸はまだ十分に特徴付けら
れていないだけでなく、その分解またはそれ以上に一般
的にその代謝についてほとんど知られていない。
それにもかかわらず、ケラタン硫酸はきわめて組織特異
的であり天然には軟骨、椎間板および角膜組織にのみ存
在する事が知られている。一方コンドロイチン硫酸は組
織特異的でなく種々の他の結合組織に見い出されてい
る。明らかにケラタン硫酸は軟骨群組織、その前駆体お
よびその分解生成物に対しコンドロイチン硫酸よりはよ
り特異的な指標である。
的であり天然には軟骨、椎間板および角膜組織にのみ存
在する事が知られている。一方コンドロイチン硫酸は組
織特異的でなく種々の他の結合組織に見い出されてい
る。明らかにケラタン硫酸は軟骨群組織、その前駆体お
よびその分解生成物に対しコンドロイチン硫酸よりはよ
り特異的な指標である。
発明の要約 軟骨、椎間板または角膜組織の異常を持つ患者の末梢血
中のケラタン硫酸は普通低レベルである事が観察されて
いるが、ケラタン硫酸は異常に高いまたは異常に低いレ
ベルで存在するらしい事が観察された。末梢血中のケラ
タン硫酸のための定量的な免疫検定法が開発されてき
た。末梢血中のケラタン硫酸の異常なレベルと軟骨椎間
板または角膜組織の障害の間の相関が存在する事が観察
された。末梢血中のケラタン硫酸の異常な低レベルおよ
び異常な高レベルは関連する角膜障害同様に斑状変性症
（一般的に失明に結びつく角膜障害）にも相関した。骨
関節炎の患者はケラタン硫酸の異常に高いレベルを持つ
傾向がある。
中のケラタン硫酸は普通低レベルである事が観察されて
いるが、ケラタン硫酸は異常に高いまたは異常に低いレ
ベルで存在するらしい事が観察された。末梢血中のケラ
タン硫酸のための定量的な免疫検定法が開発されてき
た。末梢血中のケラタン硫酸の異常なレベルと軟骨椎間
板または角膜組織の障害の間の相関が存在する事が観察
された。末梢血中のケラタン硫酸の異常な低レベルおよ
び異常な高レベルは関連する角膜障害同様に斑状変性症
（一般的に失明に結びつく角膜障害）にも相関した。骨
関節炎の患者はケラタン硫酸の異常に高いレベルを持つ
傾向がある。
良好な具体例の詳細な説明 本発明に従うと、末梢血中のケラタン硫酸のレベルは軟
骨、椎間板および角膜組織の障害の重要な指標である事
が見い出される。本明細書においては以後これらのケラ
タン硫酸含有組織は総称的に軟骨群組織と称する。特
に、末梢血中のケラタン硫酸の異常な低レベルおよび異
常な高レベルは斑状変性症および関連する角膜組織に相
関した。末梢血中のケラタン硫酸の異常な高レベルは骨
関節炎と相関した。
骨、椎間板および角膜組織の障害の重要な指標である事
が見い出される。本明細書においては以後これらのケラ
タン硫酸含有組織は総称的に軟骨群組織と称する。特
に、末梢血中のケラタン硫酸の異常な低レベルおよび異
常な高レベルは斑状変性症および関連する角膜組織に相
関した。末梢血中のケラタン硫酸の異常な高レベルは骨
関節炎と相関した。
本発明の良好な例に従うと、末梢血血漿または血清中の
ケラタン硫酸レベルは免疫検定法により定量され、末梢
血中のケラタン硫酸の低、普通および上昇したレベルの
差を十分に感度よく区別する。特に酵素連結免疫吸着検
定法が開発され、それはケラタン硫酸に特異的に反応性
を持つモノクローナル抗体を使用する阻害工程を含んで
いる。
ケラタン硫酸レベルは免疫検定法により定量され、末梢
血中のケラタン硫酸の低、普通および上昇したレベルの
差を十分に感度よく区別する。特に酵素連結免疫吸着検
定法が開発され、それはケラタン硫酸に特異的に反応性
を持つモノクローナル抗体を使用する阻害工程を含んで
いる。
末梢血中のケラタン硫酸レベルは以前にはほとんど研究
されていず、重要な情報を示す事は期待されていなかつ
たので末梢血中の異常ケラタン硫酸レベルで軟骨群組織
障害が示される事は驚くべき事であり、期待されていな
かつた。病的状態の指標としての末梢血中のケラタン硫
酸レベルは、末梢血中のケラタン硫酸レベルがとても低
く有効には検出できないと考えられていたので、以前は
考慮されていなかつた。そのような状態であるので末梢
血中のケラタン硫酸レベルは厳密に試験されていない。
さらに、ケラタン硫酸は血清および血漿中に有意に高い
レベルで存在する成分に化学的に類似しており、血中に
存在するレベルにおいてのケラタン硫酸に対する特異的
な定量的試験法の以前の欠落は末梢血中のケラタン硫酸
レベルの観測を妨げていた。末梢血中のケラタン硫酸の
臨床的に意味のあるレベルの発見は軟骨組織のケラタン
硫酸に対する検定法の開発により実現した。ケラタン硫
酸をほとんど含有しないと信じられている末梢血血清ま
たは血漿をケラタン硫酸検定の適した陰性対照として選
択した。全く期待していなかつたが、血液試料は本当に
低かつたが有意のレベルのケラタン硫酸を含んでいる事
が観察され、末梢血中のそのような有意なケラタン硫酸
レベルが軟骨群組織障害を示すかどうかの調査を導き、
この事が明らかになつた。
されていず、重要な情報を示す事は期待されていなかつ
たので末梢血中の異常ケラタン硫酸レベルで軟骨群組織
障害が示される事は驚くべき事であり、期待されていな
かつた。病的状態の指標としての末梢血中のケラタン硫
酸レベルは、末梢血中のケラタン硫酸レベルがとても低
く有効には検出できないと考えられていたので、以前は
考慮されていなかつた。そのような状態であるので末梢
血中のケラタン硫酸レベルは厳密に試験されていない。
さらに、ケラタン硫酸は血清および血漿中に有意に高い
レベルで存在する成分に化学的に類似しており、血中に
存在するレベルにおいてのケラタン硫酸に対する特異的
な定量的試験法の以前の欠落は末梢血中のケラタン硫酸
レベルの観測を妨げていた。末梢血中のケラタン硫酸の
臨床的に意味のあるレベルの発見は軟骨組織のケラタン
硫酸に対する検定法の開発により実現した。ケラタン硫
酸をほとんど含有しないと信じられている末梢血血清ま
たは血漿をケラタン硫酸検定の適した陰性対照として選
択した。全く期待していなかつたが、血液試料は本当に
低かつたが有意のレベルのケラタン硫酸を含んでいる事
が観察され、末梢血中のそのような有意なケラタン硫酸
レベルが軟骨群組織障害を示すかどうかの調査を導き、
この事が明らかになつた。
ケラタン硫酸レベル測定のために特に開発した免疫検定
法は、サンドイツチ技術に基づく酵素連結免疫吸着検定
法（ELISA）であり、抗原を定性的および定量的に測定
するため同様抗血清の力価および特異性を決定するため
に以前使用されていたものである。特に開発された検定
法においては、抗原（ケラタン硫酸）は抗体阻害工程で
の取り込みにより定量的に測定される。簡単に記載する
と、ミクロ力価プレートをウシ鼻骨D1プロテオグリカン
（BNP）のごときケラタン硫酸含有物質で被覆する。
（種々の哺乳類種のケラタン硫酸はヒトのケラタン硫酸
と同じ構造を持つており、ヒトのケラタン硫酸と反応す
る抗体と同じように反応する；しかしながら、ヒトのケ
ラタン硫酸のレベルの測定に非ヒトプロテオグリカンを
標準物質として使用した場合はヒトケラタン硫酸レベル
を非ヒトプロテオグリカン当量レベルとして表現するの
が適当である。） 阻害段階では、別のバイアルで、ケラタン硫酸反応性抗
体（良好なのはモノクローナル抗体）を含有する溶液の
一部を、未知の血液の血漿または血清の検体と同様に種
々の既知濃度のケラタン硫酸含有物質と抗体がケラタン
硫酸と実質的に完全に反応するのを可能にする十分な時
間インキユベートする。その後、等量のインキユベーシ
ョン混合物をケラタン硫酸被覆プレートに入れ、溶液中
でケラタン硫酸と前もつて反応していない（阻害され
た）抗体に十分な期間インキユベートし、プレートに被
覆されたケラタン硫酸と反応せしめる。プレートに結合
していないすべての抗体、ケラタン硫酸および抗体−ケ
ラタン硫酸複合体を除去するためプレートを徹底的に洗
浄する。
法は、サンドイツチ技術に基づく酵素連結免疫吸着検定
法（ELISA）であり、抗原を定性的および定量的に測定
するため同様抗血清の力価および特異性を決定するため
に以前使用されていたものである。特に開発された検定
法においては、抗原（ケラタン硫酸）は抗体阻害工程で
の取り込みにより定量的に測定される。簡単に記載する
と、ミクロ力価プレートをウシ鼻骨D1プロテオグリカン
（BNP）のごときケラタン硫酸含有物質で被覆する。
（種々の哺乳類種のケラタン硫酸はヒトのケラタン硫酸
と同じ構造を持つており、ヒトのケラタン硫酸と反応す
る抗体と同じように反応する；しかしながら、ヒトのケ
ラタン硫酸のレベルの測定に非ヒトプロテオグリカンを
標準物質として使用した場合はヒトケラタン硫酸レベル
を非ヒトプロテオグリカン当量レベルとして表現するの
が適当である。） 阻害段階では、別のバイアルで、ケラタン硫酸反応性抗
体（良好なのはモノクローナル抗体）を含有する溶液の
一部を、未知の血液の血漿または血清の検体と同様に種
々の既知濃度のケラタン硫酸含有物質と抗体がケラタン
硫酸と実質的に完全に反応するのを可能にする十分な時
間インキユベートする。その後、等量のインキユベーシ
ョン混合物をケラタン硫酸被覆プレートに入れ、溶液中
でケラタン硫酸と前もつて反応していない（阻害され
た）抗体に十分な期間インキユベートし、プレートに被
覆されたケラタン硫酸と反応せしめる。プレートに結合
していないすべての抗体、ケラタン硫酸および抗体−ケ
ラタン硫酸複合体を除去するためプレートを徹底的に洗
浄する。
プレートに結合している抗体の量を可視化する手段とし
ては、プレートを抗−ケラタン硫酸抗体と反応し、酵素
で適切に標識した過剰の第２抗体に暴露する。例えば、
もし第１抗体が抗ケラタン硫酸モノクローナルマウス抗
体であるなら、酵素標識は抗マウス免疫グロブリンに結
合される。第２抗体を標識する良好な手段は、発色反応
を触媒しそれによりその存在がわかるペルオキシダーゼ
のごとき酵素を結合する事である。適したペルオキシダ
ーゼ触媒伝達反応の例はJournal of Biological Chemis
try 257；14173-14180、1982、に記載されている。ケ
ラタン硫酸結合抗体の可視化の方法として他の酵素伝達
系もペルオキシダーゼ伝達系に置換されうる。
ては、プレートを抗−ケラタン硫酸抗体と反応し、酵素
で適切に標識した過剰の第２抗体に暴露する。例えば、
もし第１抗体が抗ケラタン硫酸モノクローナルマウス抗
体であるなら、酵素標識は抗マウス免疫グロブリンに結
合される。第２抗体を標識する良好な手段は、発色反応
を触媒しそれによりその存在がわかるペルオキシダーゼ
のごとき酵素を結合する事である。適したペルオキシダ
ーゼ触媒伝達反応の例はJournal of Biological Chemis
try 257；14173-14180、1982、に記載されている。ケ
ラタン硫酸結合抗体の可視化の方法として他の酵素伝達
系もペルオキシダーゼ伝達系に置換されうる。
この特定の検定系において、検体中により多いケラタン
硫酸が存在すると、発色がおさえられる。発色の程度は
検体中のケラタン硫酸の関数であるが直線関係ではな
い。従つて未知の検体の発色を比較する既知のケラタン
硫酸標準濃度からの標準曲線を作る必要がある。この検
定の標準曲線は限られたケラタン硫酸濃度範囲でのみ一
般に直線的であり、未知の検体中のケラタン硫酸のレベ
ルを標準曲線から正確に読み取るためには、各々の検体
の連続的希釈により各々の検体検定の一つまたはそれ以
上の連続的希釈液が直線範囲にはいる事を確かめて検定
を実施するのが望ましい。
硫酸が存在すると、発色がおさえられる。発色の程度は
検体中のケラタン硫酸の関数であるが直線関係ではな
い。従つて未知の検体の発色を比較する既知のケラタン
硫酸標準濃度からの標準曲線を作る必要がある。この検
定の標準曲線は限られたケラタン硫酸濃度範囲でのみ一
般に直線的であり、未知の検体中のケラタン硫酸のレベ
ルを標準曲線から正確に読み取るためには、各々の検体
の連続的希釈により各々の検体検定の一つまたはそれ以
上の連続的希釈液が直線範囲にはいる事を確かめて検定
を実施するのが望ましい。
上に記載したELISA検定の変更は抗ケラタン硫酸抗体を
固体支持体に結合せしめる事である。この場合また必要
とされるのは酵素がケラタン硫酸含有分子に結合される
事である。既知の量の酵素結合ケラタン硫酸含有分子を
既知の量の試験検体に添加し、その混合物の一定の量を
被覆ウエルに置く。試験検体中のケラタン硫酸が酵素結
合分子中のケラタン硫酸と抗体結合部位を競合する。適
当な時間の後ウエルを洗浄し続いて酵素触媒発色反応が
進行する試薬系を加えると、この場合は、より多い色の
発色は反応混合物中の遊離ケラタン硫酸はより少い事を
示す。この検定系はいく分簡易である利点を持つてお
り、プレートに結合された抗体、酵素結合ケラタン硫酸
溶液および酵素基質溶液のみを必要とする。医学研究室
へはこの検定系をキツトの形で提供する方がより適して
いるであろう。
固体支持体に結合せしめる事である。この場合また必要
とされるのは酵素がケラタン硫酸含有分子に結合される
事である。既知の量の酵素結合ケラタン硫酸含有分子を
既知の量の試験検体に添加し、その混合物の一定の量を
被覆ウエルに置く。試験検体中のケラタン硫酸が酵素結
合分子中のケラタン硫酸と抗体結合部位を競合する。適
当な時間の後ウエルを洗浄し続いて酵素触媒発色反応が
進行する試薬系を加えると、この場合は、より多い色の
発色は反応混合物中の遊離ケラタン硫酸はより少い事を
示す。この検定系はいく分簡易である利点を持つてお
り、プレートに結合された抗体、酵素結合ケラタン硫酸
溶液および酵素基質溶液のみを必要とする。医学研究室
へはこの検定系をキツトの形で提供する方がより適して
いるであろう。
ラジオイムノアツセイは別の適した技術を代表し、それ
により未知の検体のケラタン硫酸が定量でき、本発明は
採用する免疫検定を特定の型に制限しない。酵素連結ま
たは他の非放射性比色検定法が安全配慮および試薬安全
性の観点からラジオイムノアツセイ技術より望ましい。
により未知の検体のケラタン硫酸が定量でき、本発明は
採用する免疫検定を特定の型に制限しない。酵素連結ま
たは他の非放射性比色検定法が安全配慮および試薬安全
性の観点からラジオイムノアツセイ技術より望ましい。
末梢液中のケラタン硫酸のレベルに鋭敏な検定の開発
は、部分的にはケラタン硫酸に特異的に反応するモノク
ローナル抗体の開発により可能になつた。最初の開発は
Bruce Caterson〔J.of Biological Chemistry 258、88
48-8854（1983）〕により、軟骨組織に対するモノクロ
ーナル抗体を開発している際になされた。ある種のこれ
らのモノクローナル抗体がケラタン硫酸部分と特異的に
反応性がある事が観察され、ケラタン硫酸部分が離れた
存在として存在していても反応する。その後、他のケラ
タン硫酸特異性モノクローナル抗体が開発された。
は、部分的にはケラタン硫酸に特異的に反応するモノク
ローナル抗体の開発により可能になつた。最初の開発は
Bruce Caterson〔J.of Biological Chemistry 258、88
48-8854（1983）〕により、軟骨組織に対するモノクロ
ーナル抗体を開発している際になされた。ある種のこれ
らのモノクローナル抗体がケラタン硫酸部分と特異的に
反応性がある事が観察され、ケラタン硫酸部分が離れた
存在として存在していても反応する。その後、他のケラ
タン硫酸特異性モノクローナル抗体が開発された。
哺乳類種のケラタン硫酸の本質的な類似性のため、１つ
の種からのケラタン硫酸反応性モノクローナル抗体は他
の種からのケラタン硫酸ともしばしば反応する。しかし
ながら、ケラタン硫酸に対する反応性は１つの種から他
の種に変わると変化し、もしケラタン硫酸標準品をケラ
タン硫酸レベルを測定している種と異つた種から得たな
らば、ケラタン硫酸レベルは標準品当量で表現される。
さらに、別個の測定から誘導される変換因子によりレベ
ルが相関づけられる。最も標準化されたケラタン硫酸含
有物質の一つはウシ鼻骨D1プロテオグリカン（BNP）で
あり、それに対するヒト血液ケラタン硫酸レベルを測定
するとその場合ヒト血液レベルはng/ml、BNP当量として
表現される。ヒトケラタン硫酸濃度に変換するにはBNP
当量に0.10の因子を掛ける。
の種からのケラタン硫酸反応性モノクローナル抗体は他
の種からのケラタン硫酸ともしばしば反応する。しかし
ながら、ケラタン硫酸に対する反応性は１つの種から他
の種に変わると変化し、もしケラタン硫酸標準品をケラ
タン硫酸レベルを測定している種と異つた種から得たな
らば、ケラタン硫酸レベルは標準品当量で表現される。
さらに、別個の測定から誘導される変換因子によりレベ
ルが相関づけられる。最も標準化されたケラタン硫酸含
有物質の一つはウシ鼻骨D1プロテオグリカン（BNP）で
あり、それに対するヒト血液ケラタン硫酸レベルを測定
するとその場合ヒト血液レベルはng/ml、BNP当量として
表現される。ヒトケラタン硫酸濃度に変換するにはBNP
当量に0.10の因子を掛ける。
ケラタン硫酸に対するモノクローナル抗体（Bruce Cate
rsonにより開発されたような）の反応性はいくぶん硫酸
化の程度に依存しており、免疫検定において絶対ケラタ
ン硫酸レベルの不確定さの程度をいくらか上げている事
も知られている。それにもかかわらず、ELISAはケラタ
ン硫酸の異常レベルを明瞭に検出するためには十分定量
的である。ELISAはたとえ異つた技術者で実施しても同
一の試料においては良好な再現性を持つている。さら
に、特定の患者のケラタン硫酸の末梢血レベルは24時間
の間はどの時間においても全く安定に残存する傾向があ
る事が観察されている。それ故、患者のケラタン硫酸レ
ベルの有意な変化は患者の状態の悪化または処置に対す
る応答を表わしている。
rsonにより開発されたような）の反応性はいくぶん硫酸
化の程度に依存しており、免疫検定において絶対ケラタ
ン硫酸レベルの不確定さの程度をいくらか上げている事
も知られている。それにもかかわらず、ELISAはケラタ
ン硫酸の異常レベルを明瞭に検出するためには十分定量
的である。ELISAはたとえ異つた技術者で実施しても同
一の試料においては良好な再現性を持つている。さら
に、特定の患者のケラタン硫酸の末梢血レベルは24時間
の間はどの時間においても全く安定に残存する傾向があ
る事が観察されている。それ故、患者のケラタン硫酸レ
ベルの有意な変化は患者の状態の悪化または処置に対す
る応答を表わしている。
正常成人末梢ヒト血液血清または血漿は約3000から約90
00ng/ml、BNP当量を含んでおり、約300から約900ng/ml
のヒトケラタン硫酸に相当する。約900ng/ml以上のケラ
タン硫酸レベルがヒト成人においては異常に高いと考え
られ、例えば骨関節炎のごとき軟骨群組織の悪化を示
す。成人において300ng/ml以下のケラタン硫酸レベルは
異常に低いと考えられケラタン硫酸欠乏を示す。ヒト成
人において1100ng/ml以上または100ng/ml以下のケラタ
ン硫酸レベルは異常な軟骨代謝を強く示していると考え
られる。これらのレベルは特定の標品によつて数値的に
表わされたものであり、他の標品ではこれらの参考値が
変わる事を理解されたい、より一般的には、平均より約
10％以上、特に平均より約30％以上のケラタン硫酸レベ
ルが異常に高いと考えられ、平均より約20％以下特に平
均より約40％以下が異常に低いと考えられる。ヒト成人
の正常ケラタン硫酸レベルはいくぶん年令依存性であ
り、正常ケラタン硫酸レベルはより密接に年令群に相関
する事に注目しなければならない。小児は一般的に成人
よりも高いケラタン硫酸レベルを持ち、種々の発達段階
での小児のための正常値を決めなければならない。
00ng/ml、BNP当量を含んでおり、約300から約900ng/ml
のヒトケラタン硫酸に相当する。約900ng/ml以上のケラ
タン硫酸レベルがヒト成人においては異常に高いと考え
られ、例えば骨関節炎のごとき軟骨群組織の悪化を示
す。成人において300ng/ml以下のケラタン硫酸レベルは
異常に低いと考えられケラタン硫酸欠乏を示す。ヒト成
人において1100ng/ml以上または100ng/ml以下のケラタ
ン硫酸レベルは異常な軟骨代謝を強く示していると考え
られる。これらのレベルは特定の標品によつて数値的に
表わされたものであり、他の標品ではこれらの参考値が
変わる事を理解されたい、より一般的には、平均より約
10％以上、特に平均より約30％以上のケラタン硫酸レベ
ルが異常に高いと考えられ、平均より約20％以下特に平
均より約40％以下が異常に低いと考えられる。ヒト成人
の正常ケラタン硫酸レベルはいくぶん年令依存性であ
り、正常ケラタン硫酸レベルはより密接に年令群に相関
する事に注目しなければならない。小児は一般的に成人
よりも高いケラタン硫酸レベルを持ち、種々の発達段階
での小児のための正常値を決めなければならない。
骨関節炎患者はケラタン硫酸の異常に高いレベルを持つ
傾向が明瞭に示されたけれども、一方斑状変性症の患者
の末梢血はケラタン硫酸が実質的にないかまたはケラタ
ン硫酸がきわめて上昇したレベルである事が観察され、
正常軟骨群組織を持つ患者と軟骨群組織の異常な発現ま
たは劣化を持つ患者の間のレベル範囲にいくらかの重り
がある。それ故異常ケラタン硫酸レベルは必ずしも結論
的に軟骨群組織異常を示すわけではなく、ケラタン硫酸
が正常レベルであるといつて軟骨群組織異常を除外する
わけではない。しかし、ある種の異常レベルにおいて
は、軟骨群組織異常を持つている可能性は有意に上昇す
る。
傾向が明瞭に示されたけれども、一方斑状変性症の患者
の末梢血はケラタン硫酸が実質的にないかまたはケラタ
ン硫酸がきわめて上昇したレベルである事が観察され、
正常軟骨群組織を持つ患者と軟骨群組織の異常な発現ま
たは劣化を持つ患者の間のレベル範囲にいくらかの重り
がある。それ故異常ケラタン硫酸レベルは必ずしも結論
的に軟骨群組織異常を示すわけではなく、ケラタン硫酸
が正常レベルであるといつて軟骨群組織異常を除外する
わけではない。しかし、ある種の異常レベルにおいて
は、軟骨群組織異常を持つている可能性は有意に上昇す
る。
本発明は特定の実施例によりさらに詳細に以下に記載さ
れる。
れる。
実施例1. ９つのポリスチレンプレートを50％エタノール中に30分
間置く。プレートを風乾し、BNPを含有する200マイクロ
リツトルの20mM炭酸塩／炭酸水素塩、0.02％ナトリウム
アジド、pH9.2緩衝液を96のウエルの各々に入れる。各
々のプレートをプラスチツクの袋に入れ４℃で保存し、
90日以内に使用する。
間置く。プレートを風乾し、BNPを含有する200マイクロ
リツトルの20mM炭酸塩／炭酸水素塩、0.02％ナトリウム
アジド、pH9.2緩衝液を96のウエルの各々に入れる。各
々のプレートをプラスチツクの袋に入れ４℃で保存し、
90日以内に使用する。
検定自身は以下のごとく実施する。150μｌの未知の血
液血清検体および５から0.04μg/mlの濃度範囲の150μ
ｌのBNP標準品を150μｌの抗−ケラタン硫酸1/20/5−Ｄ
−４抗体（Caterson,前記文献）と1/2000で、5mM EDTA
を含む１％BSA、リン酸緩衝化塩溶液、0.05％Tween20中
で１時間インキユベートする。
液血清検体および５から0.04μg/mlの濃度範囲の150μ
ｌのBNP標準品を150μｌの抗−ケラタン硫酸1/20/5−Ｄ
−４抗体（Caterson,前記文献）と1/2000で、5mM EDTA
を含む１％BSA、リン酸緩衝化塩溶液、0.05％Tween20中
で１時間インキユベートする。
１時間インキユベートが終了したら200μｌのインキユ
ベーシヨン混合物を調製したプレートのウエル中へ入れ
37℃で１時間置く。続いてリン酸緩衝化塩溶液（Tween
0.05％）で洗浄し（３×５分）、続いてウエルの水気
を切り、200μｌのペルオキシダーゼとつながつた抗−
マウスIgG（１％BSA、リン酸緩衝化塩溶液、Tween 2
0、0.05％中）を各々のウエルに添加する。１時間後、
溶液を除きウエルを洗浄する（３×５分）。
ベーシヨン混合物を調製したプレートのウエル中へ入れ
37℃で１時間置く。続いてリン酸緩衝化塩溶液（Tween
0.05％）で洗浄し（３×５分）、続いてウエルの水気
を切り、200μｌのペルオキシダーゼとつながつた抗−
マウスIgG（１％BSA、リン酸緩衝化塩溶液、Tween 2
0、0.05％中）を各々のウエルに添加する。１時間後、
溶液を除きウエルを洗浄する（３×５分）。
ペルオキシダーゼの存在を示すための基質溶液（Journa
l of Biological Chemistry,（1982）前記文献）を加
え、60分間放置して発色せしめる。Titertekマルチスキ
ヤン装置（Flow Laboratories）を用いて、記載したご
とく各々の場合で生じる色の量を決定する。検定の最後
に得たÅ492値を既知量の精製BNPで得たÅ492値から構
成した標準曲線と比較する。
l of Biological Chemistry,（1982）前記文献）を加
え、60分間放置して発色せしめる。Titertekマルチスキ
ヤン装置（Flow Laboratories）を用いて、記載したご
とく各々の場合で生じる色の量を決定する。検定の最後
に得たÅ492値を既知量の精製BNPで得たÅ492値から構
成した標準曲線と比較する。
実施例２ 盲目試験においては、患者の名前または病歴を提供せず
に40の血清試料を検定に供した。検定実施後、試料の６
つが斑状変性症を持つと診断された患者（患者１と示さ
れている）から得たものであり、試料の３つは斑状変性
症に関連する角膜障害を持つと診断された第２の患者
（患者２と示されている）からの試料である。結果を以
下の表１の表にした。
に40の血清試料を検定に供した。検定実施後、試料の６
つが斑状変性症を持つと診断された患者（患者１と示さ
れている）から得たものであり、試料の３つは斑状変性
症に関連する角膜障害を持つと診断された第２の患者
（患者２と示されている）からの試料である。結果を以
下の表１の表にした。
患者１は事実上血清にケラタン硫酸を持たない。患者２
はその血清中のケラタン硫酸が非常に高いレベルであ
る。それ故血中のケラタン硫酸の異常なレベルは斑状変
性症および関係する障害を示した。反復検体はこの検定
の結果の良好な再現性をさらに示した。
はその血清中のケラタン硫酸が非常に高いレベルであ
る。それ故血中のケラタン硫酸の異常なレベルは斑状変
性症および関係する障害を示した。反復検体はこの検定
の結果の良好な再現性をさらに示した。
実施例３ 関節の疾病の治療の患者を除いて一般的な病院患者の集
団から180の血清検体を得た。（これは一般的な集団を
示すわけではなく、また関節の疾病を持つているが他の
理由で病院へかかつている患者を排除しない）同一の病
院において関節疾病の治療している患者から117の血液
検体もまた得た。すべての血液試料は実施例１の方法に
よりケラタン硫酸を検定した。
団から180の血清検体を得た。（これは一般的な集団を
示すわけではなく、また関節の疾病を持つているが他の
理由で病院へかかつている患者を排除しない）同一の病
院において関節疾病の治療している患者から117の血液
検体もまた得た。すべての血液試料は実施例１の方法に
よりケラタン硫酸を検定した。
結果が決定された後、関節疾病の患者の病歴を調べ、骨
関節炎を持つと以前に診断されたすべての117関節疾病
患者の結果を再計算した。結果を表２に要約した。
関節炎を持つと以前に診断されたすべての117関節疾病
患者の結果を再計算した。結果を表２に要約した。
一般および症候性群の血液試料中のケラタン硫酸レベル
は重なつているが、末梢血血清中に約900ng/ml以上のケ
ラタン硫酸レベルを持つ患者は関節疾病集団の方が一般
の集団よりもより以上に多いらしい事が観察できるよう
である。骨関節炎を持つ事が知られている群においては
結果はより劇的で、ケラタン硫酸レベルが上昇しており
軟骨変質の本質的な指標を提供している。
は重なつているが、末梢血血清中に約900ng/ml以上のケ
ラタン硫酸レベルを持つ患者は関節疾病集団の方が一般
の集団よりもより以上に多いらしい事が観察できるよう
である。骨関節炎を持つ事が知られている群においては
結果はより劇的で、ケラタン硫酸レベルが上昇しており
軟骨変質の本質的な指標を提供している。
前記の表から、900ng/mlまたはそれ以上のケラタン硫酸
レベルは軟骨群組織悪化の指標であり、ケラタン硫酸の
レベルが上昇している患者（特に老人患者）は軟骨組織
変質の他の指標を更に検査しなければならないと結論さ
れる。一般的病院患者集団の約３分の１が選択された域
値900ng/ml以上のケラタン硫酸レベルを持つている事は
真実であるが、この集団は本当の一般的な集団ではな
く、むしろ多くのヒトが骨関節炎を持つ事が予想される
老人患者を不釣合いに高いパーセントで含有する事を思
い起こさねばならない。
レベルは軟骨群組織悪化の指標であり、ケラタン硫酸の
レベルが上昇している患者（特に老人患者）は軟骨組織
変質の他の指標を更に検査しなければならないと結論さ
れる。一般的病院患者集団の約３分の１が選択された域
値900ng/ml以上のケラタン硫酸レベルを持つている事は
真実であるが、この集団は本当の一般的な集団ではな
く、むしろ多くのヒトが骨関節炎を持つ事が予想される
老人患者を不釣合いに高いパーセントで含有する事を思
い起こさねばならない。
ある良好な具体例によつて本発明を記載してきたが、本
発明の範囲から離れる事なく改変できる事は通常の当事
者には明らかである。例えば、免疫検定に使用する抗体
はモノクローナルである必要がなく、もしケラタン硫酸
に対して十分特異的であればポリクローナル抗体分画も
使用する事ができる。しかしながら、モノクローナル抗
体が入手可能である事実を考えると、モノクローナル抗
体の使用は確かに良好である。本発明は主としてヒト末
梢血中のケラタン硫酸レベルの測定について記載してお
り、その中で軟骨群組織異常の診断が最も興味ある点で
ある；しかしながら本方法は同様に下等動物にも適用で
き、種々の哺乳種類においてケラタン硫酸の構造が保存
されているため下等動物におけるケラタン硫酸の異常レ
ベルの診断に同一のモノクローナル抗体を使用して多く
の場合本明細書に記載した検定を使用する事ができる。
発明の範囲から離れる事なく改変できる事は通常の当事
者には明らかである。例えば、免疫検定に使用する抗体
はモノクローナルである必要がなく、もしケラタン硫酸
に対して十分特異的であればポリクローナル抗体分画も
使用する事ができる。しかしながら、モノクローナル抗
体が入手可能である事実を考えると、モノクローナル抗
体の使用は確かに良好である。本発明は主としてヒト末
梢血中のケラタン硫酸レベルの測定について記載してお
り、その中で軟骨群組織異常の診断が最も興味ある点で
ある；しかしながら本方法は同様に下等動物にも適用で
き、種々の哺乳種類においてケラタン硫酸の構造が保存
されているため下等動物におけるケラタン硫酸の異常レ
ベルの診断に同一のモノクローナル抗体を使用して多く
の場合本明細書に記載した検定を使用する事ができる。
本発明の種々の特色を特許請求の範囲に示した。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭53−101522（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−150861（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，258（14）, 1983，Ｐ．8848−8854 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，257（１）, 1982，Ｐ．464−471 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，97（５Ｐａｒ ｔ２），1983，232Ａ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，257，1982，Ｐ. 14173−14180
Claims (6)
- 【請求項１】ケラタン硫酸に反応性のあるモノクローナ
ル抗体を使用した免疫検定によって哺乳動物の抹消血の
血清または血漿検体中のケラタン硫酸のレベルを測定
し、検体中のケラタン硫酸の異常レベルに注目すること
からなる、哺乳動物の軟骨、椎間板および角膜組織の異
常性を示す方法。 - 【請求項２】哺乳動物がヒトである、特許請求の範囲第
１項の方法。 - 【請求項３】示すべき異常性が骨関節炎であり、血清ま
たは血漿検体中のケラタン硫酸のレベルが異常に高い特
許請求の範囲第２項の方法。 - 【請求項４】示すべき異常性が斑状角膜変性症であり、
血清または血漿検体中のケラタン硫酸のレベルが異常に
低い特許請求の範囲第２項の方法。 - 【請求項５】免疫検定が酵素連結免疫吸着検定法である
特許請求の範囲第３項の方法。 - 【請求項６】免疫検定が酵素連結免疫吸着検定法である
特許請求の範囲第４項の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US594112 | 1984-03-27 | ||
| US06/594,112 US4704356A (en) | 1984-03-27 | 1984-03-27 | Method of diagnosing cartilage tissue abnormalities |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60224065A JPS60224065A (ja) | 1985-11-08 |
| JPH0684971B2 true JPH0684971B2 (ja) | 1994-10-26 |
Family
ID=24377566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60063179A Expired - Lifetime JPH0684971B2 (ja) | 1984-03-27 | 1985-03-27 | 軟骨組織異常の診断法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4704356A (ja) |
| JP (1) | JPH0684971B2 (ja) |
| CA (1) | CA1243261A (ja) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62294968A (ja) * | 1986-06-16 | 1987-12-22 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | モノクロ−ナル抗体からなる診断用薬剤 |
| SE8605270D0 (sv) * | 1986-12-08 | 1986-12-08 | Pharmacia Ab | Hyaluronsyrabestemningsmetod och reagenssats for anvendning vid metoden |
| US5378637A (en) * | 1987-07-07 | 1995-01-03 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Method for measuring hyaluronic acid |
| WO1990004417A1 (en) * | 1988-10-24 | 1990-05-03 | Bruce Caterson | Methods of and compositions for diagnosing, monitoring and treating the early stages of osteoarthritis |
| CA2005795A1 (en) * | 1988-12-19 | 1990-06-19 | Peter Ghosh | Sandwich-elisa method for the detection and/or quantification of keratan sulphate peptides in biological fluids |
| CA2005794A1 (en) * | 1988-12-19 | 1990-06-19 | Peter Ghosh | Monoclonal antibodies which recognise polysulphated polysaccharides |
| US5185245A (en) * | 1989-02-24 | 1993-02-09 | Thomas Jefferson University | Immumoassays and kit for detection of proteoglycans |
| US5498781A (en) | 1994-05-23 | 1996-03-12 | Basf Corporation | Passification of optically variable pigment and waterborne coating compositions containg the same |
| US5527848A (en) | 1994-12-14 | 1996-06-18 | Basf Corporation | Pacification of optically variable pigments for use in waterborne coating compositions |
| US7089420B1 (en) | 2000-05-24 | 2006-08-08 | Tracer Detection Technology Corp. | Authentication method and system |
| US7162035B1 (en) | 2000-05-24 | 2007-01-09 | Tracer Detection Technology Corp. | Authentication method and system |
| US7152047B1 (en) | 2000-05-24 | 2006-12-19 | Esecure.Biz, Inc. | System and method for production and authentication of original documents |
| CN1549711A (zh) * | 2001-08-30 | 2004-11-24 | ��Ĭ���� | 稠合的吡咯化合物在治疗关节软骨或软骨下骨组织退化中的用途 |
| AU2003231220A1 (en) * | 2002-04-30 | 2003-11-17 | Saint Louis University | A method for detecting lysosomal storage diseases |
| US8171567B1 (en) | 2002-09-04 | 2012-05-01 | Tracer Detection Technology Corp. | Authentication method and system |
| WO2004102195A1 (en) * | 2003-05-14 | 2004-11-25 | Index Pharmaceuticals Ab | Method for identifying tff2 regulating agents and agents identified using said method |
| DE102004049095A1 (de) * | 2004-10-08 | 2006-04-13 | Basf Coatings Ag | Wässrige Effektpigmentpaste, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
| WO2007045661A1 (en) * | 2005-10-20 | 2007-04-26 | Nordic Bioscience Diagnostics A/S | Detection or quantification of aggrecan and its fragments |
| US20070161074A1 (en) * | 2005-12-27 | 2007-07-12 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Diagnostic method of mucopolysaccharidoses |
| US8557536B2 (en) * | 2007-02-05 | 2013-10-15 | Seikagaku Corporation | Method of detecting articular cartilage degeneration or damage |
| US7995196B1 (en) | 2008-04-23 | 2011-08-09 | Tracer Detection Technology Corp. | Authentication method and system |
| JP5706617B2 (ja) | 2008-12-26 | 2015-04-22 | 生化学工業株式会社 | ケラタン硫酸の測定方法および測定用キット、これらを用いる関節疾患の検知方法等 |
| ITMI20110829A1 (it) | 2011-05-12 | 2012-11-13 | Gnosis Spa | Condroitin solfato biotecnologico solfatato in posizione 4 o 6 sulla stessa catena polisaccaridica e procedimento per la sua preparazione |
| ITMI20120136A1 (it) * | 2012-02-02 | 2013-08-03 | Gnosis Spa | Condroitin solfato biotecnologico a basso peso molecolare solfatato in posizione 4 o 6 sulla stessa catena polisaccaridica dotato di attivita' antiinfiammatoria e antiartritica e procedimento per la sua preparazione |
| AU2012252415B2 (en) * | 2011-05-12 | 2016-11-24 | Gnosis S.P.A. | "Biotechnological sulphated chondroitin sulphate at position 4 or 6 on the same polysaccharide chain, and process for the preparation thereof" |
| FR3135081A1 (fr) | 2022-04-28 | 2023-11-03 | Saint-Gobain Glass France | Article verrier, son procédé d’obtention et vitrage automobile comprenant un tel article verrier |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1549069A (en) * | 1976-12-10 | 1979-08-01 | Erba Farmitalia | Enzyme linked immunoassay |
| JPS58150861A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-09-07 | Terumo Corp | 酵素免疫測定法およびその方法に使用する測定器具 |
-
1984
- 1984-03-27 US US06/594,112 patent/US4704356A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-03-13 CA CA000476437A patent/CA1243261A/en not_active Expired
- 1985-03-27 JP JP60063179A patent/JPH0684971B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ，９７（５Ｐａｒｔ２），１９８３，２３２Ａ |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５７（１），１９８２，Ｐ．４６４−４７１ |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５８（１４），１９８３，Ｐ．８８４８−８８５４ |
| ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５７，１９８２，Ｐ．１４１７３−１４１８０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1243261A (en) | 1988-10-18 |
| US4704356A (en) | 1987-11-03 |
| JPS60224065A (ja) | 1985-11-08 |
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