JPH0686670A - エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子 - Google Patents

エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子

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JPH0686670A
JPH0686670A JP5031163A JP3116393A JPH0686670A JP H0686670 A JPH0686670 A JP H0686670A JP 5031163 A JP5031163 A JP 5031163A JP 3116393 A JP3116393 A JP 3116393A JP H0686670 A JPH0686670 A JP H0686670A
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transferase
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一秀 岡澤
Kiyozou Asada
起代蔵 浅田
Ikunoshin Katou
郁之進 加藤
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 キシログルカン（以下、ＸＧと称する）分子
の転移反応に関するエンド型ＸＧ転移酵素、該酵素をコ
ードする遺伝子、該遺伝子のクローニング方法、及び該
遺伝子及び該酵素の用途を提供する。 【構成】 エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子。該遺伝子をプ
ローブとする該遺伝子のクローニング法。該遺伝子のア
ンチセンスのＤＮＡ又はＲＮＡ。該遺伝子を用いて、酵
素を製造する方法、生物体内での該酵素の発現を調節、
植物の形態の制御方法とそれらの植物体。該酵素、及び
それを用いるＸＧ分子の転移方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、植物の細胞壁の成長に
関与する新規なエンド型キシログルカン転移酵素、その
遺伝子及びその用途に関する。更に本発明は該酵素を用
いるキシログルカン分子の転移方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】キシログルカン（以下ＸＧと略す）は植
物細胞壁の主要成分であり、植物細胞壁中ではセルロー
スミクロフィブリルの表面に結合してセルロースミクロ
フィブリルを架橋し、複雑な網目構造を形成している。
細胞壁の構築と再構築には、ＸＧの架橋の分解と再構築
が必要であると考えられているが、その機構は明らかに
されていない。アルバーシャイム (Albersheim) はＸＧ
の再構築の機構についてエンド型のトランスグリコシラ
ーゼが作用するという仮説を示した〔プラント バイオ
ケミストリー (Plant Biochemistry) 、１９７６年 ア
カデミックプレス (Academic Press) 発行、第２２５〜
２７４頁〕。また、本発明者らも、先にマメ科植物であ
るビグナ アンギュラリス (Vignaangularis)種子の芽
生えの上胚軸アポプラスト部分（植物体のうち、細胞の
原形質膜の外側のすべて、すなわち細胞壁と細胞間隙と
から成る部分）より得た抽出液について検討し、２０％
飽和から８０％飽和硫安沈殿画分に、ＸＧ分子の分子量
を不均化する作用を見出した〔ニシタニ( Nishitani )
ら、フィジオロジアプランタルム (Physiologia Planta
rum)、第８２巻、第４９０〜４９７頁（１９９１）〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このＸ
Ｇ分子の再構築及び分子量を不均化する作用に関与する
物質はいまだ特定されておらずその詳細な作用機構もい
まだ解明されていない。本発明の目的は、ＸＧの再構
築、分子量の不均化等に関与する酵素を単離し、該酵
素、及び該酵素をコードする遺伝子、及び該遺伝子のク
ローニング方法を提供すること、該遺伝子を用いる該酵
素の製造方法を提供すること、該遺伝子のアンチセンス
ＤＮＡ及び該遺伝子のアンチセンスＲＮＡを提供するこ
と、生物体内での該酵素の発現を調節する方法、植物体
の形態を制御する方法、該酵素を用いるＸＧ分子の転移
方法等を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子に関す
る。また本発明の第２の発明は、エンド型ＸＧ転移酵素
遺伝子のクローニング方法に関し、本発明の第１の発明
のエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子又はその一部をプローブ
として用いることを特徴とする。本発明の第３の発明は
エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＤＮＡに関
し、本発明の第４の発明はエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子
のアンチセンスＲＮＡに関する。本発明の第５の発明は
エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子より得られる少なくとも１
５塩基対からなるＤＮＡ配列を、転写によりエンド型Ｘ
Ｇ転移酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するよう
に、細胞内で作用しうるプロモーターに連結したことを
特徴とするアンチセンスＲＮＡ生成用カセットに関す
る。本発明の第６の発明は本発明の第５の発明のアンチ
センスＲＮＡ生成用カセットを生物体に導入することを
特徴とするエンド型ＸＧ転移酵素の発現の制御方法に関
する。更に本発明の第７の発明は本発明の第５の発明の
アンチセンスＲＮＡ生成用カセットを植物体に導入し、
エンド型ＸＧ転移酵素の発現を制御することを特徴とす
る植物体の形態の制御方法に関し、本発明の第８の発明
は本発明の第５の発明のアンチセンスＲＮＡ生成用カセ
ットを導入した植物体に関する。本発明の第９の発明は
エンド型ＸＧ転移酵素が発現されるようにエンド型ＸＧ
転移酵素遺伝子を細胞内で作用しうるプロモーターに連
結したことを特徴とするエンド型ＸＧ転移酵素発現用カ
セットに関する。本発明の第１０の発明は本発明の第９
の発明のエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを生物体
に導入することを特徴とするエンド型ＸＧ転移酵素の発
現方法に関し、本発明の第１１の発明は本発明の第９の
発明のエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを植物体に
導入することを特徴とする植物体の形態の制御方法に関
する。本発明の第１２の発明は本発明の第９の発明のエ
ンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを導入した植物体に
関する。本発明の第１３の発明は本発明の第１の発明の
エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を導入して形質転換した生
物又は細胞を培養し、該培養物からエンド型ＸＧ転移酵
素を採取することを特徴とするエンド型ＸＧ転移酵素の
製造方法に関する。更に本発明の第１４の発明は、エン
ド型ＸＧ転移酵素に関する。本発明の第１５の発明はＸ
Ｇ分子の転移方法に関し、エンド型ＸＧ転移酵素を用い
て、ＸＧ分子内のＤ−グルコース間の結合を切断して、
生じたＸＧ分子断片の還元末端を他のＸＧ分子の非還元
末端のＤ−グルコースに結合させることを特徴とする。
【０００５】本発明者らは、ビグナ アンギュラリスよ
り、ＸＧの再構築、分子量の不均化等に関与する酵素を
単離精製することに成功した。次に該酵素が、ＸＧ分子
を切断し、生じたＸＧ分子断片を他のＸＧに再結合する
という新規で植物生理学的に重要な作用を有しており、
該酵素がＸＧの転移方法に使用できることを見出し、該
作用を有する酵素をエンド型ＸＧ転移酵素と命名した。
【０００６】更に本発明者らは、ビグナ アンギュラリ
ス由来のエンド型ＸＧ転移酵素のアミノ酸分析を行い、
部分アミノ酸配列を決定し、次に、そのアミノ酸配列よ
りＰＣＲ用のプライマーを調製し、ビグナ アンギュラ
リスｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、エンド型ＸＧ
転移酵素をコードする遺伝子を増幅しプローブを作製し
た。続いて、該プローブを用いてビグナ アンギュラリ
スのｃＤＮＡライブラリー中よりエンド型ＸＧ転移酵素
をコードする遺伝子を含有するクローン体を検索し、エ
ンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子を単離し、次い
で、該遺伝子をプローブとして用いて種々の植物より目
的の遺伝子をクローニングした。更に本発明者らは該遺
伝子を導入して形質転換した生物又は細胞を培養し、該
培養物からエンド型ＸＧ転移酵素を採取することに成功
した。更に本発明者らは、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子
のアンチセンスＤＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡを細
胞内に導入することにより、若しくは、エンド型ＸＧ転
移酵素遺伝子より得られる少なくとも１５塩基対からな
るＤＮＡ配列を、転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子のアンチセンスＲＮＡが生成するように、細胞内で作
用しうるプロモーターに連結したことを特徴とするアン
チセンスＲＮＡ生成用カセットを細胞内に導入すること
により、生物体内でのエンド型ＸＧ転移酵素の発現を制
御しうることを見出し、これらの方法によって植物体の
形態を制御しうることを見出し、これらを導入した植物
体を創製した。また本発明者らは、エンド型ＸＧ転移酵
素が発現されるようにエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を細
胞内で作用しうるプロモーターに連結したことを特徴と
するエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを生物体に導
入することによって、生物体内でエンド型ＸＧ転移酵素
を発現させることに成功し、該方法によって植物の形態
を制御しうることを見出し、該発現用カセットを導入し
た植物体を創製することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】本発明において使用される植物は、エンド
型ＸＧ転移酵素を生産する植物であればいかなる植物で
もよく、例えばビグナ アンギュラリスを用いることが
できる。酵素を採取する部位は特に限定されるものでは
ないが、例えば芽生えの上胚軸のアポプラスト部分が好
適である。
【０００８】以下、このビグナ アンギュラリスを例に
より詳細に説明する。ビグナ アンギュラリスを発芽さ
せ、これよりアポプラスト部分の粗抽出溶液（以下、ア
ポプラスト溶液と称する）を得る方法は、例えば前出の
フィジオロジア プランタルムに記載の方法が効果的で
ある。得られたアポプラスト溶液から酵素を精製する手
段としては、例えば硫安塩析、アフィニティクロマトグ
ラフィー、ゲルろ過、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー等の方法を組合せて用いるのが効果的であり、これ
らの方法によりグリコシダーゼ活性の混在がない、精製
された酵素を得ることができる。
【０００９】以下に本発明で得られるビグナ アンギュ
ラリス由来のエンド型ＸＧ転移酵素（以下、本発明の酵
素と称する）の理化学的性質を詳細に説明する。
【００１０】
【作用】本発明の酵素の作用機作は次の様に決定した。
水素化シアノホウ素ナトリウムを用いて還元アミノ化を
行うことによって、後述の方法で精製したタマリンド−
ＸＧの還元末端に２−アミノピリジンを結合させ、ピリ
ジルアミノＸＧ（以下、ＸＧ−ＰＡと略す）を得た。１
８μｇの６３０kDa のＸＧと２μｇの１５kDa のＸＧ−
ＰＡの混合物を、２０ngの精製した本発明の酵素標品と
共に、後述する酵素活性の測定方法に記載した条件に従
って２０分間又は６０分間反応させた後、反応液を酵素
活性の測定に用いたのと同じＨＰＬＣシステムで検出し
た。検出は、パルスアンペロメトリック検出器（ダイオ
ネックス社製、以下ＰＡＤと略す）、及び蛍光検出器
（島津製作所製、ＲＦ５３５、Ｅx ３２０nm／Ｅm ４０
０nmに設定）によって行った。ＰＡＤによる検出結果を
図６に、蛍光検出器による検出結果を図７に示す。各図
中の矢印ａは６３０kDa のＸＧの溶出位置、矢印ｂは１
５kDa のＸＧ−ＰＡの溶出位置を示す。なお、図６にお
いて、縦軸はＰＡＤ応答（ｎＡ）、横軸は溶出容積(ml)
を示す。また図７において縦軸は蛍光相対強度、横軸は
溶出容積(ml)を示す。図６に示したＰＡＤによる測定結
果によれば、ピークの溶出位置が反応の進行に伴い高分
子側にシフトしている。更に、蛍光検出器による測定結
果（図７）によれば、蛍光標識されたＸＧの溶出位置は
高分子側にシフトしている。以上の結果より、６３０kD
a のＸＧの切断により新たに生じたＸＧ断片が１５kDa
のＸＧ−ＰＡに再結合し、その結果蛍光標識されたＸＧ
の分子量が増大していることは明確である。
【００１１】本発明の酵素は、後述する表２に示すよう
に、ＸＧ−ＰＡ及び還元末端を還元して糖アルコールと
して修飾したＸＧ（以下、ＸＧ−ＯＨと略す）を基質と
して用いても、未修飾のＸＧを基質として用いても酵素
の活性は変化しない。したがって、図６及び図７に示し
たＸＧ分子の分子量の増大は、単に６３０kDa のＸＧ分
子の還元末端が１５kDa のＸＧ−ＰＡの非還元末端と結
合することによって起こるのではなく、６３０kDa のＸ
Ｇのグリコシド結合の切断により新たに生成したＸＧ断
片の還元末端が１５kDa のＸＧ−ＰＡ分子の非還元末端
に再結合する反応により起こることがわかる。
【００１２】更に、基質分子量が本発明の酵素の酵素反
応に及ぼす影響を、以下の方法で検討した。種々の分子
量のタマリンド由来ＸＧの２０μｇを基質として、２０
ngの本発明の酵素の精製標品と反応させ、後述する方法
に従って酵素活性を測定した。この結果を図８に、縦軸
に酵素活性（単位）、横軸に基質の分子量(kDa) をとっ
て示す。図８から明らかな様に、本発明の酵素は、高分
子量の基質に対してより高い活性を示し、低分子量の基
質に対してはより低い活性を示す。本発明の酵素の精製
標品の１μｇ、又はオートクレーブで１２０℃、５分の
処理により変性した本発明の酵素の精製標品の１μｇの
それぞれを１mgのタマリンド由来ＸＧと共に酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ5.８）中で２５℃で２時間反応させた
後、−５０℃に冷却して反応を停止させた。反応混合物
を８０％エタノール溶液で繰返し沈殿させることによ
り、ＸＧを回収し、このＸＧを重水中で凍結乾燥した。
この凍結乾燥物を重水0.６ml当り１mgの割合で溶解し、
８５℃でJEOL GSX400（日本電子社製）によりプロトン
ＮＭＲを測定した。化学シフトを、内部標準として用い
た４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン
酸ナトリウムからの相対値として求めた結果、図９に示
すスペクトルが得られた。（ａ）は変性しない酵素を用
いた場合、（ｂ）は変性した酵素を用いた場合のスペク
トルを示す。（ａ）及び（ｂ）において、のシグナル
は１個の水素が重水素で置換された水分子（ＨＤＯ）由
来のシグナルであり、化学シフトが4.５３〜4.５４ppm
であるシグナルは、タマリンドＸＧ分子の主鎖を形成
するβ−（1,４）−結合したグルコース残基、及びタマ
リンドＸＧ分子の２種類の側鎖のうち、 Gal−β−（1,
２）− Xyl−α−（1,６）−なる配列を持つ側鎖の非還
元末端に位置するガラクトース残基のアノメリックプロ
トンであり、化学シフトが4.９２７ppm であるシグナル
は、もう１種類の側鎖である非還元末端のキシロース
残基のアノメリックプロトンであり、化学シフトが5.１
１６ppm のシグナルは、 Gal−β−（1,２）− Xyl−
α−（1,６）−なる結合を持つ側鎖中のキシロース残基
のアノメリックプロトンである。（ａ）と（ｂ）に示し
た各シグナルの化学シフトに違いが見られないこと、及
び（ａ）における、、の各シグナルで示される各
々の糖のアノメリックプロトンの量比が、（ｂ）におけ
る、、の各シグナルで示される各々の糖のアノメ
リックプロトンの量比と同じであることから、本発明の
酵素によりＸＧ分子間のつなぎかえ反応が生じた後も、
反応前と同じ分子間の結合様式が保持されていることが
わかる。
【００１３】以上より、本発明の酵素がＸＧ分子内のＤ
−グルコース間の結合を切断して、生じたＸＧ分子断片
の還元末端を他のＸＧ分子の非還元末端のＤ−グルコー
スに結合する作用を持つことがわかる。
【００１４】（エンド型ＸＧ転移酵素によるピリジルア
ミノ化ＸＧ７量体の細胞壁標品への転移反応）酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ5.７）４０μｌ中、後述する方法で
得た細胞壁標品６００μｇ（乾燥重量）、及びＸＧ７量
体〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（J.Biol.Chem.）、第２６７巻、第２１０５８〜２１０
６４頁（１９９２）にＸＧオリゴマーＩ（XG oligomer
I)として記載、以下ＸＧ７と称する〕に水素化シアノホ
ウ素ナトリウムを用いて還元アミノ化を行うことによっ
て、還元末端に２−アミノピリジンを結合させて得たピ
リジルアミノ化ＸＧ７量体（以下、ＸＧ７−ＰＡと略
す）を５μｇ、本発明の酵素の精製標品３μｇ、又はオ
ートクレーブで１２０℃、５分の処理により変性、失活
処理したものの３μｇを混ぜて、２５℃、１２時間反応
させた。反応液を限外ろ過膜ウルトラフリーＣ３ＨＶ
（ミリポア社製）で第１の不溶画分と第１の可溶画分と
に分けた。第１の不溶画分を水２１０μｌに懸濁し、上
記と同様に再度限外ろ過することによって第２の不溶画
分と第２の可溶画分とに分け、第１と第２の可溶画分を
合計すると、この可溶画分の液量は２５０μｌとなっ
た。この画分をＳ−画分と命名した。第２の不溶画分
を、粗製のトリコデルマ・ビリデ酵素製剤 (Meiselase
−Ｐ、明治製菓社製）から、ガーゼカラムクロマトグラ
フィーを用いて精製した〔トヤマ (Toyama) ら、ジャー
ナル オブ ファーメンテーション テクノロジー(
Ｊ．Ferment. Technol. ) 、第４２巻、第１９９〜２０
６頁（１９６４）〕トリコデルマ・ビリデ・セルラーゼ
(Trichoderma viride cellulase) 〔（1,４）−β−Ｄ
−グルカングルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ. 3. 2. 1.
4〕３０μｇを含む水１００μｌに懸濁し、４０℃で４
時間反応させた。反応液を限外ろ過により第３の不溶画
分と可溶画分に分けた。第３の不溶画分を0.２Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ5.７）１００μｌに懸濁し、再度限外ろ
過により第４の不溶画分と可溶画分に分けた。第３及び
第４の可溶画分を合せた水溶液をＣ−画分と命名した。
したがってＣ−画分の液量は２００μｌとなった。Ｓ−
画分及びＣ−画分各々について、３倍量のアセトニトリ
ルを加え、これらを、予め６５％アセトニトリルを含む
0.１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.７）で平衡化した
ＴＳＫゲルアミド８０（4.６×２５０mm、東ソー社製）
を備えたノン−メタル（non-metal)ＨＰＬＣシステム
（ダイオネックス社製）に注入した。このカラムを６５
％−３５％アセトニトリルの直線濃度勾配を有する０．
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.７）を１ml／分の流
量で用いて溶離し、溶出液の蛍光吸収を前出の蛍光検出
器で検出した。
【００１５】Ｃ−画分のＨＰＬＣによる解析結果を図１
０の（ａ）、（ｂ）に示す。図１０において、縦軸は蛍
光相対強度、横軸は溶出容積(ml)を示す。図１０中、
（ａ）は変性した酵素を用いた場合、（ｂ）は変性して
いない酵素を用いた場合のクロマトグラムである。なお
図１０の（ｃ）は未反応のＸＧ７−ＰＡを溶出した際の
クロマトグラムであり、図中矢印（ア）で示すピークが
ＸＧ７−ＰＡの溶出位置を示すピークである。表１に、
Ｓ−画分、Ｃ−画分について検出されたＸＧ７−ＰＡ量
の比を示す。
【００１６】
【表１】 表１ ＸＧ７−ＰＡの検出量の比 ──────────────────────────────────── ＸＧ７−ＰＡ量 * （％） ──────────────────────────────────── 添加したＸＧ７−ＰＡ量 １００ 検出されたＸＧ７−ＰＡ量 変性酵素を使用 Ｓ−画分 １００ Ｃ−画分 ０ 未回収 ０ 未変性酵素を使用 Ｓ−画分 ２1.５（１） Ｃ−画分 ２7.５（２） 未回収 ５1.０ ** ────────────────────────────────────
【００１７】* ＸＧ７−ＰＡを示すピークの面積の
比として算出した。 ** 細胞壁中に取り込まれている状態のＸＧ７−ＰＡ
量であり、１００−〔（１）＋（２）〕として算出し
た。
【００１８】図１０の（ｂ）において、（ｃ）と同様に
矢印（ア）で示すピークが現れること、及び表１におい
て、変性酵素を用いた場合にはＸＧ７−ＰＡはＳ−画分
からのみ検出されるが、未変性酵素を使用した場合に
は、Ｃ−画分からＸＧ７−ＰＡが検出されること等よ
り、本発明の酵素の作用により、ＸＧ７−ＰＡが細胞壁
標品中のＸＧ鎖に一旦取り込まれた後、セルラーゼによ
り切り出されたことがわかる。
【００１９】（基質特異性）後述する方法に従って製造
した各基質の２０μｇを６０ngの本発明の酵素の精製標
品と共に２５℃で１時間反応させ、後述する方法により
酵素活性を測定した。結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】 表 ２ ──────────────────────────────────── 基 質（２０μｇ） 平均分子量(kDa) 酵素活性（単位） ──────────────────────────────────── ビグナ属由来ＸＧ ２０２ 1.７３ ビグナ属由来ＸＧ−ＯＨ ２００ 1.６３ タマリンド属由来ＸＧ ５１ 0.８７ タマリンド属由来ＸＧ−ＰＡ ５１ 0.８２ トロペオルム属由来ＸＧ １４１ 1.１８ カルボキシメチルセルロース １２３ ０ カラス麦由来β−（1,３）；β− （1,４）−グルカン １４４ ０ トウモロコシ由来キシラン ８４ ０ ローダイメニア由来β−（1,４） 結合含有β−（1,３）キシラン １４５ ０ ────────────────────────────────────
【００２１】ＸＧの基本的構造は、主鎖を形成するβ
（1,４）−結合グルコシル残基とこのグルコシル残基の
いくつかのＯ−６位に結合している側鎖とで構成されて
いる。側鎖の種類と、それらの主鎖上での配列は由来と
なる植物によって異なっている。トロペオルム属由来の
ＸＧとタマリンド属由来のＸＧは２種の側鎖すなわちXy
l −α−（1,６）−と Gal−β−（1,２）− Xyl−α−
（1,６）−で置換されているが、ビグナ属由来のＸＧ
は、 Xyl−α−（1,６）−と Gal−β−（1,２）−Xyl
−α−（1,６）−に加えて、 Fuc−α−（1,２）− Gal
−β−（1,２）− Xyl−α−（1,６）−の側鎖を含有し
ている。本発明の酵素は表２に示すごとく、ビグナ属、
タマリンド属、トロペオルム属由来の３種のＸＧに対し
て同等に作用するが、β−1,４−グルカナーゼの良好な
基質となるβ−1,４−グルカン類〔カルボキシメチルセ
ルロース若しくはエンバク（カラス麦）のふすま由来の
β−（1,３）；β−（1,４）−グルカン等〕には作用し
ない。
【００２２】（至適ｐＨ）本発明の酵素の活性に対する
ｐＨの影響を以下の条件で検討した。ｐＨ３〜７の範囲
ではマクイルベイン( McIlvaine ) 緩衝液、ｐＨ７〜１
０の範囲ではホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて、本発明
の酵素の精製標品２０ngを２０μｇのタマリンド由来Ｘ
Ｇと共に２５℃で３０分間反応させ、後述する方法で酵
素活性を測定した。結果を図１１に示す。図中の白丸印
はマクイルベイン緩衝液、黒丸印はホウ酸ナトリウム緩
衝液を用いた測定結果を示す。本発明の酵素の至適ｐＨ
はｐＨ5.８付近である。
【００２３】（至適温度）本発明の酵素の活性に対する
温度の影響を、以下の条件で検討した。本発明の酵素の
精製標品２０ngを、タマリンド由来のＸＧ２０μｇと共
に酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.８）中で各温度で３０
分間反応させ、後述する方法で酵素活性を測定した。結
果を図１２に示す。本発明の酵素の至適温度は３０℃付
近である。
【００２４】（分子量）後述する精製工程により得られ
た本発明の酵素の精製標品は、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により、分子量約３3,０００の単一のバ
ンドとして確認された。
【００２５】（酵素活性の測定方法）本発明の酵素の活
性測定は次の様に行う。すなわち、２〜２０μｇのタマ
リンド由来ＸＧに、0.２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ5.８）で希釈した酵素液１０μｌを加え、２５℃で３
０分間反応させた後、反応混合物を−５０℃で凍結する
ことにより反応を停止する。反応混合物を２０μｌの５
０mM ＮａＯＨに溶解し、ＴＳＫゲル−３０００ＰＷカ
ラム（８×３００mm、東ソー社製）及びＴＳＫゲル−５
０００ＰＷカラム（８×３００mm、東ソー社製）を備え
たノン−メタルＨＰＬＣシステムに供して、１５mMの酢
酸ナトリウムを含有する３０mMのＮａＯＨ溶液を用いて
１ml／分の流量で溶出する。溶出液を、金電極を備えた
ＰＡＤで検出する。図１３に、検出結果の例を示す。す
なわち、図１３は、上記の方法によるＰＡＤのクロマト
グラフを表す図であり、縦軸にＰＡＤ応答（ｎＡ）、横
軸に溶出容積（ml）を表す。（ａ）はオートクレーブで
１２０℃、５分の処理により変性した本発明の酵素の精
製標品を用いた場合、（ｂ）はアポプラスト溶液を用い
た場合、（ｃ）は精製した酵素を用いた場合のクロマト
グラムを各々示し、矢印１はタマリンド由来の基質Ｘ
Ｇ、矢印２は単糖類の溶出位置を示す。（ｃ）におい
て、１のピークの高さの１／２の位置におけるピークの
幅は、反応系に添加した酵素の量に比例して増大するの
で、基質由来のピークの高さの１／２の位置におけるピ
ークの幅の増大を、本発明の酵素の活性の指標として用
いる。基質としてタマリンド由来のＸＧを用いた場合の
酵素活性の１単位は、２５℃で３０分間に上記のピーク
の幅を2.３ml相当増大させる酵素の量と定義する。
【００２６】なお、本発明に用いる各々の基質の調製方
法を次に示す。 （ＸＧ類）ビグナ・アンギュラリスの６日齢の黒褐色の
芽生えの上胚軸由来の粗精製ＸＧ〔前出のフィジオロジ
ア プランタルム、第８２巻、第４９０〜４９７頁（１
９９１）、及び第５２巻、第４８２〜４９４頁（１９８
１）〕、及びトロペオルム・マジュス Ｌ. (Tropeolum
majusＬ.)の乾燥種子由来〔マクドゥガル (McDougall)
ら、プラント フィジオロジー( Plant Physiol. )、第
８９巻、第８８３〜８８７頁（１９８８）〕の粗精製Ｘ
Ｇを調製した。またタマリンド (Tamarindus Indica
Ｌ.)由来の粗精製ＸＧを大日本製薬社より得た（商品名
Glyloid ９Ｓ）。これらの粗精製ＸＧの各々３００mg
を、前出のトリコデルマ・ビリデ・セルラーゼ１５０μ
ｇにより４０mlの水溶液中で、４５℃で２時間、部分的
に加水分解した。生成物をオートクレーブにかけてセル
ラーゼを変性し、次いで限外ろ過法〔ダイアフロ( Diaf
lo )ＸＭ−３００及びＹＭ５、アミコン社製〕により分
画した。ＸＭ−３００を通過し、ＹＭ５で残留した画分
（４０mg以上）を２mlの水に溶解してスペロース (Supe
rose) ６ prep カラム（１６×５００mm、ファルマシア
社製）を備えたＨＰＬＣ（島津ＬＣ６Ａ）（以下このＨ
ＰＬＣシステムをシステムＡと称す）に供して、0.５ml
／分の水で溶離した。画分（1.５mlずつ）を収集して凍
結乾燥し、ＸＧ標品を得た。これらの標品の分子量は、
前述の、酵素活性の測定に用いたのと同じクロマトグラ
フィーのシステムにより測定した。
【００２７】（他のグルカン類）４０mlの水に溶解した
カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（５００m
g）を、１００μｇの上述のトリコデルマ・ビリデ・セ
ルラーゼを用い４５℃で３時間部分的に加水分解し、限
外ろ過法とクロマトグラフィーで分画し１２３kDa の画
分を得た。 β−（1,３）−；β−（1,４）−グルカン（５０mg）を
ニシタニらの方法〔プラント フィジオロジー、第８７
巻、第８８３〜８９０頁（１９８８）〕によって、エン
バクのふすまから製造し、これを５μｇの精製バシラス
・サチリス・グルカナーゼ〔1,３−1,４−β−Ｄ−グル
カン−４−グルカノヒドロラーゼ、バシラスサチリスα
−アミラーゼ製剤（ノボ社製バン＜Ban ＞Ｌ−２０）か
ら上述のプラント フィジオロジー、第８７巻、第８８
３〜８９０頁（１９８８）に記載の方法により精製し
た〕を用い４０℃で１時間部分的に加水分解し、前述の
システムＡにより分画し、１４４kDa のグルカン類を得
た。
【００２８】（キシラン類）平均分子量が８４kDa のグ
ルクロノアラビノキシランを６日齢のトウモロコシ黄化
芽生えの茎から製造した〔ニシタニら、ジャーナル オ
ブバイオロジカル ケミストリー、第２６６巻、第６５
３９〜６５４３頁（１９９１）〕。 β−（1,４）−結合を有するβ−（1,３）−キシラン
（１４６kDa ）を、ローダイメニア キシラン (Rhodym
enia xylan) から抽出し、上述のシステムＡを用いて精
製した〔プラント フィジオロジー、第８７巻、第８８
３〜８９０頁（１９８８）〕。またタマリンド−ＸＧ
（１０mg）を前述のジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリーに記載の方法に従って水素化ホウ素ナトリ
ウムで還元し、スペロース６prepでゲルろ過分析を行っ
て分画して末端が還元されたＸＧ（ＸＧ−ＯＨ）を製造
した。
【００２９】（細胞壁標品）ビグナ・アンギュラリス種
子（渡辺種子社製）を暗所で発芽させ、胚軸３cmを切断
し−５０℃で凍結した。これを0.３％ＮａＣｌを含む水
溶液中、０℃でホモジナイズした後、１Ｍ ＮａＣｌ水
溶液に懸濁して洗浄した。更に冷水で２回洗浄し、８０
％エタノール中で１０分間煮沸した後、エタノールで洗
浄し、ナイロンメッシュ（穴径３５μｍ）でろ過し、乾
燥して細胞壁を抽出した。該細胞壁を再度水に懸濁して
１２０℃で２０分間オートクレーブし、植物組織由来の
酵素を失活させ、これを大量の水で洗浄した後、凍結乾
燥して、細胞壁標品を調製した。
【００３０】エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子は次のように
して単離することができる。精製されたエンド型ＸＧ転
移酵素について、例えばプロテインシークエンサーを用
いてアミノ酸配列の解析を行うことにより、配列表の配
列番号１１で表される、Ｎ末端部分のアミノ酸配列が決
定される。該配列を基に、ＰＣＲ用のミックスプライマ
ーを作成することができる。例えば、配列表の配列番号
１２で表されるミックスプライマーｐＡＺ−１、及び配
列表の配列番号１３で表されるミックスプライマーｐＡ
Ｚ−２がそれぞれＤＮＡ合成機で合成され、精製後、エ
ンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の検索に使用することができ
る。例えば、ビグナ アンギュラリスよりＲＮＡを調製
し、次にオリゴテックス−ｄＴ３０（日本ロシュ社製）
を用いてポリ（Ａ）+ ＲＮＡの精製を行い、次に例えば
該ポリ（Ａ）+ ＲＮＡと、配列表の配列番号１４で示さ
れる、Ｍ１３プライマーＭ４（宝酒造社製）の配列を持
ち、更に３′側にＴが連なった配列を有するプライマー
ｐＴＭ４を用い、逆転写酵素を作用させ、ｃＤＮＡを合
成する。このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことに
より、エンド型ＸＧ転移酵素をコードするｃＤＮＡを増
幅することができる。目的のＤＮＡを効率良く増幅する
ためには２段階ＰＣＲが効果的で、例えば、プライマー
として上述のミックスプライマーｐＡＺ−１及びＭ１３
プライマーＭ４を用いて１段階目のＰＣＲを行い、この
反応生成物を鋳型として、ミックスプライマーｐＡＺ−
２及びＭ１３プライマーＭ４を用いて２段階目のＰＣＲ
を行うことにより、約1.１kbp のＤＮＡ断片が増幅され
る。増幅されたＤＮＡ断片は、例えばｐＵＣ１１９のHi
nc II サイトにサブクローニングすることができる。次
に、例えばこれらの増幅ＤＮＡをプローブとし、ビグナ
アンギュラリスより調製したｃＤＮＡライブラリー又
はゲノムライブラリーより、エンド型ＸＧ転移酵素をコ
ードする遺伝子を組込んだクローン体を検索することが
できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば前述のビグナ
アンギュラリスｃＤＮＡよりｃＤＮＡ合成キットシス
テムプラス（アマシャム社製）を用いて調製することが
できる。前述の増幅ＤＮＡ断片をプローブとしてプラー
クハイブリダイゼーションを行うことにより、例えば１
×１０4 個のプラークより５個の陽性プラークが得ら
れ、該プラークのファージベクターに挿入されているＤ
ＮＡ断片を抽出して、例えば約1.１kbp の長さのＤＮＡ
断片を得ることができる。該断片の制限酵素地図を図１
に示す。また、該断片のＤＮＡ塩基配列の一部を配列表
の配列番号１５に示す。
【００３１】該断片を適当なプラスミドの制限酵素部位
に挿入し、該断片の挿入されたプラスミドを用いて適当
な宿主を形質転換することができる。該断片をｐＵＣ１
１９のEcoRＩサイトに組込んだプラスミドは、ｐＶＸ１
０３と命名され、ｐＶＸ１０３で形質転換された大腸菌
ＪＭ１０９株は、Escherichia coli JM109／pVX103と命
名、表示され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第４１０４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１０４）とし
て寄託されている。
【００３２】該形質転換体よりｐＶＸ１０３を調製し、
上述の挿入されているＤＮＡ断片を調製し、適当な発現
用プラスミドに組込み、適当な宿主に導入して宿主を培
養することにより、エンド型ＸＧ転移酵素を工業的に生
産することができる。例えばMuatan−ＫTM（宝酒造社
製）を用い、クンケル( Kunkel )の方法〔プロシーディ
ングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ ザ
サイエンシーズ オブザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA.)、第８２巻、第４８８〜４９２頁（１９
８２）〕に従って、部位特異的変異法によりｐＶＸ１０
３中のエンド型ＸＧ転移酵素をコードしている遺伝子配
列の上流部分に制限酵素 HincII の認識部位を持つプラ
スミドを構築し、該プラスミドを制限酵素 HincII によ
り切断して、エンド型ＸＧ転移酵素をコードしている遺
伝子配列を含む約1.１kbp の断片を切り出すことができ
る。該断片にＮｃｏＩリンカー（宝酒造社製）をライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いて付加し、Ｎｃｏ
Ｉにより消化した後、該断片をプラスミド pTV119N（宝
酒造社製）のＮｃｏＩサイトに挿入しｐＶＸ１１０と命
名したプラスミドを調製する。次に該プラスミドｐＶＸ
１１０を導入した大腸菌ＪＭ１０９を培養することによ
り、培養物中にエンド型ＸＧ転移酵素を生産させること
ができる。ｐＶＸ１０３からｐＶＸ１１０への構築図を
図１４に示す。なお、図中Ｈは制限酵素 HincII の認識
部位、ＥはEcoRＩの認識部位、ＮはＮｃｏＩの認識部位
をそれぞれ示す。ｐＶＸ１１０を導入した大腸菌ＪＭ１
０９の培養には、形質転換体の培養に通常用いる方法を
用いることができ、例えばアンピシリンを含むＬ−ブロ
ス（Broth ）にｐＶＸ１１０を導入した大腸菌ＪＭ１０
９を植菌し、前培養を行った後ＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加え、３７℃で
一夜振とう培養することにより培養物中に酵素が蓄積す
る。培養物よりエンド型ＸＧ転移酵素を精製する方法と
しては、例えば培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、超音波処理で菌体を破砕し、遠心処理、透析、
イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過等の方
法を組合せて用いることができる。
【００３３】上述のビグナ アンギュラリス由来のエン
ド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子は、該酵素をコー
ドする遺伝子の一例であり、該遺伝子、若しくはその部
分配列をプローブとして用いることにより、他の植物種
よりエンド型ＸＧ転移酵素の遺伝子をクローニングする
ことができる。また、該遺伝子のクローニングに用いら
れるプライマーを使用して、他の植物種について、エン
ド型ＸＧ転移酵素の遺伝子を増幅し、クローニングする
こともできる。対象とする植物としては、例えば双子葉
植物であれば、ダイズ、ナズナ、トマト、ジャガイモ、
アブラナ、ヒマワリ、ワタ、タバコ等が、また例えば単
子葉植物であれば、コムギ、イネ、トウモロコシ、サト
ウキビ等が挙げられる。例えば、上述の操作で得られる
約1.１kbp のｃＤＮＡを、ランダムプライマーＤＮＡラ
ベリングキットによって〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰで標識
し、これをハイブリダイゼーションのプローブとして用
いてダイズ (Glycine max)組織ｍＲＮＡから作製された
ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）をプラーク
ハイブリダイゼーション法により検索することができ
る。陽性プラークよりファージを単離し、例えばファー
ジベクター中に挿入されているエンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子を約１kbp のEcoRＩ断片として切り出し、精製する
ことができる。該断片の制限酵素地図を図２に示す。ま
たこのEcoRＩ断片のＤＮＡ塩基配列の一部を配列表の配
列番号１６に示す。
【００３４】該EcoRＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１９の
EcoRＩサイトにサブクローニングしたプラスミドはｐＳ
Ｘ１０２と命名され、ｐＳＸ１０２を用いて形質転換さ
れた大腸菌ＪＭ１０９株は、Escherichia coli JM109/p
SX102 と命名、表示され、微工研菌寄第１３３３３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３３）として寄託されている。
【００３５】同様の操作により、シロイヌナズナ、トマ
ト、コムギのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を含むＤＮＡ
断片を調製することができ、これらのＤＮＡ断片の制限
酵素地図を図３、図４、図５にそれぞれ示す。またこれ
らのＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の一部をそれぞれ配列
表の配列番号１７、１８、１９に示す。シロイヌナズ
ナ、トマト、コムギのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を含
むＤＮＡ断片を導入したプラスミドはそれぞれｐＡＸ１
０１、ｐＴＸ２０１、ｐＷＸ１０１と命名され、これら
のプラスミドを用いて形質転換された大腸菌ＪＭ１０９
株はそれぞれEscherichia coli JM109/pAX101 、Escher
ichia coli JM109/pTX201 、Escherichiacoli JM109/pW
X101 と命名され、Escherichia coli JM109/pWX101 は
微工研菌寄第１３３３２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３
２）として寄託されている。
【００３６】これらの菌株からエンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子を調製し、該遺伝子を用いて適当な発現用プラスミ
ドを構築し、該発現用プラスミドを用いて適当な宿主を
形質転換し、該形質転換体を培養することにより、エン
ド型ＸＧ転移酵素を生産することができる。
【００３７】生物体内、例えば植物体内においてエンド
型ＸＧ転移酵素遺伝子の発現を調節することにより、植
物の細胞壁の成長を調節することができ、例えば、これ
らの遺伝子の発現を制御することにより、細胞壁の再構
築を阻害し、矮性の植物を作出することができる。エン
ド型ＸＧ転移酵素遺伝子の発現を制御する方法として
は、例えばエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンス
ＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡを生物体に導入する方法
を用いることができる。導入するアンチセンスＤＮＡと
しては、例えばエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセ
ンスＤＮＡ若しくはその一部を用いることができる。該
アンチセンスＤＮＡの例を配列表の配列番号１番〜５番
に示す。すなわち、配列表の配列番号１番〜５番は、そ
れぞれ配列表の配列番号１５番〜１９番で示されるエン
ド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＤＮＡの配列を
示すものである。アンチセンスＤＮＡとしては例えば、
これらのアンチセンスＤＮＡの一部を適当に切断して得
た断片を用いても良いし、これらのアンチセンスＤＮＡ
配列に基づいて合成したＤＮＡを用いてもよい。導入す
るアンチセンスＲＮＡとしては、例えばエンド型ＸＧ転
移酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡ若しくはその一部を
用いることができる。該アンチセンスＲＮＡの例を配列
表の配列番号６番〜１０番に示す。すなわち、配列表の
配列番号６番〜１０番は、それぞれ配列表の配列番号１
５番〜１９番で示される、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子
のアンチセンスＲＮＡの配列を示すものである。例え
ば、これらのアンチセンスＲＮＡの一部を適当に切断し
て得た断片を用いても良いし、これらのアンチセンスＲ
ＮＡ配列に基づいて合成したＲＮＡや、例えばエンド型
ＸＧ転移酵素遺伝子若しくはその一部を用いて、イン
ビドロ (in vitro) 転写系でＲＮＡポリメラーゼを作用
させて生成したＲＮＡを用いてもよい。導入するアンチ
センスＤＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡの領域、及び
長さに関しては、導入するアンチセンスＤＮＡ又はアン
チセンスＲＮＡが生物体内でエンド型ＸＧ転移酵素の内
在性のＲＮＡと会合することによってその機能を抑制す
るものであれば特に限定はないが、挿入断片の長さは１
５塩基対以上が望ましい。また、アンチセンスＤＮＡ及
びアンチセンスＲＮＡには、生体内で分解されにくい様
に化学的な修飾等を施しておくことができる。
【００３８】アンチセンスＤＮＡ若しくはアンチセンス
ＲＮＡを生物体に導入する方法としては、例えばマイク
ロインジェクション法〔モレキュラー ジェネラル ジ
ェネティクス（Mol. Gen. Genetics）、第２０２巻、第
１７９〜１８５頁（１９８５）〕、ポリエチレングリコ
ール法〔ネイチャー (Nature）、第２９６巻、第７２〜
７４頁（１９８２）〕、パーティグルガン法〔ネイチャ
ー、第３２７巻、第７０〜７３頁（１９８７）〕や、ア
ンチセンスＤＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡを含有す
る小細胞、細胞、リソソーム等とプロトプラストとの融
合法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル ア
カデミー オブ ザ サイエンシーズオブ ザ ＵＳ
Ａ、第７９巻、第１８５９〜１８６３頁（１９８
２）〕、エレクトロポレーション法〔プロシーディング
ズ オブ ザ ナショナル アカデミーオブ ザ サイ
エンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８２巻、第５８２４
〜５８２８頁（１９８５）〕等の方法を挙げることがで
きる。
【００３９】また、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子より得
られるＤＮＡ配列を、細胞内で作用しうるプロモーター
に、転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセ
ンスＲＮＡが生成されるように連結した、アンチセンス
ＲＮＡ生成用カセットを構築して植物体内に導入する方
法も有効である。アンチセンスＲＮＡ生成用カセット
は、例えば、プロモーターの下流に転写によりエンド型
ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するよ
うにエンド型ＸＧ転移酵素の遺伝子の配列又はその一部
を連結して構築することができる。ここで用いる遺伝子
配列としては、転写により生成されるアンチセンスＲＮ
Ａが生物体内でエンド型ＸＧ転移酵素の内在性のＲＮＡ
と会合することによってその機能を抑制するものであれ
ば特に限定はないが、挿入断片の長さは１５塩基対以上
が望ましい。例えばエンド型ＸＧ転移酵素の遺伝子の一
部を適当な制限酵素で切断して、プロモーターの下流の
適当な部位に転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の
アンチセンスＲＮＡが生成されるように連結することが
できる。また、例えば本発明で得られるエンド型ＸＧ転
移酵素遺伝子配列に基づいて、エンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子の適当な領域が増幅されるようなＰＣＲ用プライマ
ーを作製し、該プライマーを用いてエンド型ＸＧ転移酵
素遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮ
Ａ断片を適当なベクターに組込まれているプロモーター
領域の下流に、転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子
のアンチセンスＲＮＡが生成されるように連結してアン
チセンスＲＮＡ生成用カセットを構築してもよい。この
場合には、挿入する増幅ＤＮＡ断片を、転写によりエン
ド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成さ
れるように、ベクター内に存在する適当な制限酵素サイ
トを選択して挿入するが、これらの制限酵素の認識配列
を５′末端側に有するプライマーを用いて、ＰＣＲを行
うのが有効である。
【００４０】また例えばエンド型ＸＧ転移酵素が発現さ
れるように細胞内で作用しうるプロモーターに連結した
エンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを構築し、該カセ
ットを生物体、例えば植物体に導入して植物体内でエン
ド型ＸＧ転移酵素を発現させることができ、よって植物
体の形態を制御することができる。エンド型ＸＧ転移酵
素発現用カセット中に挿入されるエンド型ＸＧ転移酵素
遺伝子としては、植物細胞中でエンド型ＸＧ転移酵素の
活性が発現されるために必要な領域を含んでいればよい
が、例えばシグナルペプチドをコードする配列から終止
コドンまでを含んでいることが望ましい。例えばエンド
型ＸＧ転移酵素の遺伝子の一部を適当な制限酵素で切断
してプロモーターの下流の適当な部位にエンド型ＸＧ転
移酵素が発現されるように連結することができる。ま
た、例えば本発明で得られるエンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子配列に基づいて、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の適当
な領域が増幅されるようなＰＣＲ用プライマーを作製
し、該プライマーを用いてエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子
を鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡ断片を
適当なベクターに組込まれているプロモーター領域の下
流にエンド型ＸＧ転移酵素が発現されるように連結して
エンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを構築してもよ
い。この場合挿入する増幅ＤＮＡ断片を、ベクター内に
存在する適当な制限酵素サイトを選択して挿入するが、
アンチセンスＲＮＡ生成用カセットの場合と同様に、こ
れらの制限酵素の認識配列を５′末端側に有するプライ
マーを用いてＰＣＲを行うのが有効である。
【００４１】アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しく
はエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットに用いられるプ
ロモーター配列は、細胞内で機能しうるものであれば特
に限定はなく、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子に由来する
ものでも、他の遺伝子由来のものでも良い。プロモータ
ーには転写開始点（＋１）から２０〜３０塩基対上流に
あって正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始
させる機能を担っているTATAボックスと呼ばれる領域が
含まれるが、本発明で用いられるプロモーター配列は必
ずしもTATAボックスの前後の領域に限定される物ではな
く、この領域以外に、発現調整のためにＲＮＡポリメラ
ーゼ以外のタンパク質が会合するために必要な、更に上
流の領域を含んでいてもよい。
【００４２】例えば、アンチセンスＲＮＡ生成用カセッ
トを構築する際に、天然の植物体内でエンド型ＸＧ転移
酵素遺伝子が発現の支配を受けていたプロモーターを用
いれば、植物の器官全体に生活環の全ステージを通して
生産されるエンド型ＸＧ転移酵素の量を減少させること
ができ、矮性をもたらすことができる。また他の遺伝子
に由来するもので、非調節性のプロモーターを用いるこ
とによっても、植物の器官全体に生活環の全ステージを
通して形態変化をもたらすことができる。非調節性のプ
ロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウィ
ルスの３５Ｓプロモーターを用いることができ、これは
ｐＢＩ１２１（クロンテック社製）に含まれている。ま
た刺激によって誘導可能なプロモーターを用いれば、生
育環境に応じてその形態が変化しうる植物体を作製する
ことができる。例えば、光に応答するプロモーターを用
いれば、光照射の条件によって植物体の形態を変化させ
ることができる。例えば、器官、又は組織特異的なプロ
モーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけに形態
変化を生じさせることができる。例えば葉で特異的に転
写されている遺伝子のプロモーターを用いれば、葉の形
態だけを変化させることができる。また例えば、生活環
のあるステージに特異的に機能するプロモーターを用い
ることによって、生活環の一定のステージだけエンド型
ＸＧ転移酵素の活性を増大又は減少させることができ、
その結果特定の器官、又は組織だけに形態変化を生じさ
せることができる。例えば花器形成時にだけ転写を起こ
させうるプロモーターを用いることによって、花器だけ
に形態の変化をもたらすことができる。また、花粉管形
成時にだけ機能するプロモーターを用いて構築したアン
チセンスＲＮＡ生成用カセットを用いて花粉管の伸張を
抑制することができ、その結果雄性不稔性の植物体を作
製することができる。
【００４３】アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しく
はエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットにおいて、プロ
モーターの下流に転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子のアンチセンスＲＮＡが生成されるように、若しくは
エンド型ＸＧ転移酵素が発現されるように連結されてい
るエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子若しくはその一部の配列
を有する遺伝子断片（以下挿入配列と称する）の下流
に、転写終止配列を連結させることによって、転写を効
率よく終了させることができる。該転写終止配列は、エ
ンド型ＸＧ転移酵素遺伝子に由来するものであっても良
いし、また他の遺伝子に由来するものでもよい。またポ
リＡ付加配列を挿入配列の下流に連結させることによっ
て翻訳の効率を高めることができる。該ポリＡ付加配列
はエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子に由来するものであって
も良いし、他の遺伝子、例えばアグロバクテリウムのオ
クトピンシンテターゼ〔ジ エンボ ジャーナル（The
EMBOJournal）、第３巻、第８３５〜８４６頁（１９８
４）〕やノパリンシンテターゼ〔モレキュラー アンド
アプライド ジェネティクス（Mol.and Appl.Genet.)
第１巻、第５６１〜５７３頁（１９８２）〕に由来する
ものであってもよい。
【００４４】アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しく
はエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを生物体に導入
する方法としては、種々の公知の方法を用いることがで
き、例えば、適当なベクターにこれらのカセットを挿入
し、該ベクターを生物体に導入する方法が有効である。
この場合、ベクターに応じて、これらのカセット中には
存在せず、ベクター中のカセットを挿入したい部位にの
み存在する制限酵素認識配列をこれらのカセットの５’
末端及び３’末端に付加しておくことができる。
【００４５】これらのカセットを挿入するベクターは、
形質転換された植物を容易に選別できるように選別マー
カー遺伝子を含有することが望ましい。選別マーカー遺
伝子としては、例えば抗生物質耐性の形質をもたらす遺
伝子（抗生物質耐性遺伝子）を用いることができる。こ
のような遺伝子として、例えばＧ４１８、ハイグロマイ
シン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシ
ン、クロラムフェニコールに対する耐性をもたらす遺伝
子を挙げることができる。抗生物質耐性遺伝子がベクタ
ーに含有されていれば、抗生物質を含む培地中で生育す
る生物体を選ぶことによって形質転換された生物体、す
なわちこれらのカセットが導入された生物体を容易に選
択することができる。
【００４６】これらのカセットを挿入したベクターを直
接生物体、例えば植物体に導入する方法は、前出のマイ
クロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、
パーティグルガン法、ベクターを含有する小細胞、細
胞、リソソーム等とプロトプラストとの融合法、エレク
トロポレーション法等の方法を挙げることができる。
【００４７】また植物ウイルスをベクターとして用いる
ことによって、これらのカセットを植物体に導入するこ
とができる。利用する植物ウイルスとしては、例えばカ
リフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）を用いること
ができる。すなわち、まずウイルスゲノムを一旦大腸菌
等由来のベクターに挿入して組換体を調製した後、ウイ
ルスのゲノム中にこれらのカセットを挿入する。このよ
うにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素により該
組換体から切り出し、植物に接種することによって、こ
れらのカセットを植物体に挿入することができる〔ホー
ン（Hohn）ら、モレキュラー バイオロジー オブ プ
ラント チューモアーズ（Molecular Biology of Plant
Tumors)、アカデミック プレス、ニューヨーク（Acad
emic Press、New York）、第５４９〜５６０頁（１９８
２）、米国特許第4,４０7,９５６号〕。
【００４８】更にまた、アグロバクテリウム属に属する
細菌が植物に感染すると、それが持っているプラスミド
ＤＮＡの一部を植物のゲノム中に移行させるという性質
を利用して、これらのカセットを植物体に導入すること
もできる。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちア
グロバクテリウム チュメファシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens)は植物に感染してえい瘤（crown gall)
を、また、アグロバクテリウム リゾゲネス（Agrobact
erium rhizogenes) は植物に感染して毛状根を引起こす
が、これらは感染の際にＴｉプラスミド、又はＲｉプラ
スミドと呼ばれるそれぞれの細菌中に存在するプラスミ
ド上のＴ−ＤＮＡ領域（Transferred ＤＮＡ）と呼ばれ
る領域が植物中に移行し植物のゲノム中に組込まれるこ
とに起因する。更に、Ｔｉ、又はＲｉプラスミド上には
Ｔ−ＤＮＡ領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組
込まれるために必須であるｖｉｒ領域と言われる領域が
ある。ｖｉｒ領域自身は、植物中に移行されることはな
く、またこのｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ領域が存在するの
と異なったプラスミド上にあっても機能しうる〔ネイチ
ャー、第３０３巻、第１７９〜１８９頁（１９８
３）〕。
【００４９】Ｔｉ、又はＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ
領域中に、植物のゲノム中に組込みたいＤＮＡを挿入し
ておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染
する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むこと
ができる。ここで、Ｔｉ、又はＲｉプラスミドのＴ−Ｄ
ＮＡ中のえい瘤、又は毛状根を引起こす部分を、目的と
する移行機能を損なうことなく取り除き、得られたもの
をベクターとして使用することもできる。本発明におい
てはこの様な種々のベクターを用いることができ、例え
ば、バイナリーベクターと呼ばれるｐＢＩ１２１（クロ
ンテック社）、pBI-H1-35S-IG （名古屋大学、中村研三
博士より供与）等のベクターに、アンチセンスＲＮＡ生
成用カセット、若しくはエンド型ＸＧ転移酵素発現用カ
セットを挿入して、これらのカセットの植物体への導入
を行うことができる。なお、これらのベクターは、前出
のｖｉｒ領域を有しておらず、該ベクターを導入して用
いるアグロバクテリウム属の細菌は、ｖｉｒ領域を有し
ている他のプラスミドを含有している必要がある。
【００５０】またこれらのベクターはアグロバクテリウ
ム属の細菌だけではなく、大腸菌中でも増幅することが
できるシャトルベクターであり、したがって、Ｔｉプラ
スミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことができ
る。更に、これらのベクターは、抗生物質耐性遺伝子を
含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌、及
び植物体等を形質転換する際に、形質転換体を容易に選
別することができる。また、これらのベクターにはＣａ
ＭＶの３５Ｓプロモーターが存在しており、これらのベ
クターに挿入された遺伝子を植物ゲノム中に組込んだ
後、非調節的に発現させることが可能となる。
【００５１】アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しく
はエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを挿入したこれ
らのベクターを用い、アグロバクテリウム属の細菌を介
してこれらのカセットを植物体のゲノム中に移行させて
形質転換を行う際には、アグロバクテリウム属の細菌が
感染しうるものでその再生系が確立されている植物体で
あれば、どの様な植物体でも形質転換を行うことができ
る。大抵の双子葉植物は、アグロバクテリウム属の細菌
を用いて形質転換を行うことができ、特に自然界でアグ
ロバクテリウム属の細菌の宿主となっている植物体は、
すべて試験管内で形質転換させることができる。穀類を
含め、単子葉植物は自然界ではアグロバクテリウム属の
細菌の宿主ではないが、例えばライムギ〔ネイチャー、
第３２５巻、第２７４〜２７６頁（１９８７）〕、トウ
モロコシ〔サイエンス、第２４０巻、第２０４〜２０７
頁（１９８８）〕、イネ〔ネイチャー、第３３８巻、第
２７４〜２７６頁（１９８９）〕等は、試験管内で形質
転換させることができる。
【００５２】形質転換は、（１）プロトプラストを用い
て行うか、（２）組織片又は未処理の細胞を用いて行う
ことができる。（１）の方法を用いるには形質転換され
たプロトプラストから植物体を再生させる系を予め確立
しておく必要があり、（２）の方法を用いるにはアグロ
バクテリウム属の細菌を用いて組織片又は未処理の細胞
を形質転換させ、それを植物体に再生する系を確立して
おく必要がある。形質転換された植物は、上述の形質転
換のマーカーとなりうる薬剤を含有する培地で植物体を
生育させることにより選択することができる。
【００５３】植物体の再生方法は、植物の種類により異
なっているが、一般的には、（１）の場合には形質転換
されたプロトプラストの懸濁液、（２）の場合には形質
転換されたプレート上の組織片又は未処理の細胞からカ
ルスを誘導し、次いでシュートを形成させることによっ
て行うことができる。また、一般的に、培地には種々の
アミノ酸のほかにオーキシンやサイトカイニン等のホル
モンを含有させておくことができる。形質転換された植
物のゲノム中に目的のアンチセンスＲＮＡ生成用カセッ
ト若しくはエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットが挿入
されているかどうかはサザンハイブリダイゼーション等
の方法で確かめることができ、また、エンド型ＸＧ転移
酵素遺伝子のセンスＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡが
植物体内で生成されているかどうかはノザンハイブリダ
イゼーション等の方法で確かめることができる。
【００５４】上記のごとく作製されたアンチセンスＲＮ
Ａ生成用カセット若しくはエンド型ＸＧ転移酵素発現用
カセットが挿入された植物体を用いて、交配によってア
ンチセンス鎖転写用カセット若しくはエンド型ＸＧ転移
酵素発現用カセットを次世代の植物体に移して行くこと
ができる。例えば、ベクターpBI-H1-35S-IG に、本発明
により得られるエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子あるいはそ
の一部を、転写によりアンチセンスＲＮＡが生成するよ
うに、若しくはエンド型ＸＧ転移酵素が発現するように
組込むことにより、上流にCaMV35S プロモーター、その
下流にエンド型XG転移酵素遺伝子あるいはその一部を結
合した、アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しくはエ
ンド型XG転移酵素発現用カセットを含有するプラスミド
を構築することができる。次に、このようにして構築さ
れたプラスミドを用いて、適当なアグロバクテリウム属
に属する菌株、例えばアグロバクテリウム チュメファ
シエンス LBA4404株〔Agrobacteriumtumefaciens LBA44
04 ；ネイチャー、第３０３巻、第１７９〜１８０頁
（１９８３）、クローンテック社より入手可能〕を形質
転換し、該形質転換体を目的とする植物体に感染させる
ことにより、植物を形質転換することができる。また、
これらのプラスミド、例えば後述のpAX301、pAX302、pT
X301、pTX302を適当な制限酵素、例えばHind III及び S
acＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により目的のフ
ラグメントを切り出し精製して、これらのフラグメント
をエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセット若しくはアンチ
センスＲＮＡ生成用カセットとして、他のプラスミド、
例えば pBI101 のHind III-SacＩサイトに組込み、植物
の形質転換に用いることができる。
【００５５】本発明で得られる、配列表の配列番号１７
で示されるシロイヌナズナのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子の配列に基づいて、配列表の配列番号２０、２１、２
２、２３に示す４種類のプライマー、ＡＴＸ−ＡＳ、Ａ
ＴＳ−ＡＳ、ＡＴＸ−Ｓ、ＡＴＳ−Ｓをデザインし、合
成することができる。プライマーＡＴＳ−ＡＳ及びＡＴ
Ｘ−Ｓは配列表の配列番号１７の塩基番号４０〜５６に
対応する５′→３′の向きに相当する配列の５′側に制
限酵素ＳａｃＩ、若しくはＸｂａＩの切断部位を付加し
たもの、ＡＴＸ−ＡＳ、及びＡＴＳ−Ｓは塩基番号１０
０７〜１０２３に対応する３′→５′の向きに相当する
配列の５′側に制限酵素ＸｂａＩ、若しくはＳａｃＩの
切断部位を付加したものである。例えばシロイヌナズナ
のエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を鋳型として、上記のプ
ライマーのうちＡＴＳ−ＡＳ及びＡＴＸ−ＡＳの対を用
いてＰＣＲ法により遺伝子配列の増幅を行い、増幅され
た約１kbp のＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩ及びＳａ
ｃＩにより切断し、精製した後、pBI-H1-35S-IG のＸｂ
ａＩサイトからＳａｃＩサイトの部位に挿入することが
できる。このプラスミドをｐＡＸ３０１と命名する。ｐ
ＡＸ３０１は、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプ
ロモーターを持ち、その下流のＸｂａＩサイト−Ｓａｃ
Ｉサイトに配列表の配列番号１７の塩基番号４０番〜１
０２３番で表される部分の配列を転写によりアンチセン
スＲＮＡが生成するように組込んだもので、カナマイシ
ン及びハイグロマイシン耐性の遺伝子を有している。ま
た同様にプライマーＡＴＸ−Ｓ、及びＡＴＳ−Ｓの対を
用いてＰＣＲ法で遺伝子配列の増幅を行い、増幅された
約１kbp のＤＮＡ断片をpBI-H1-35S-IG のＸｂａＩサイ
トからＳａｃＩサイトの部位に挿入したプラスミドをｐ
ＡＸ３０２と命名する。ｐＡＸ３０２はｐＡＸ３０１と
同様のプロモーター及び同様の耐性遺伝子を持ち、配列
表の配列番号１７の塩基番号４０番〜１０２３番の配列
をエンド型キシログルカン転移酵素が発現されるように
組込んだものである。
【００５６】プラスミドｐＡＸ３０１及びｐＡＸ３０２
を用いて、例えばアグロバクテリウム チュメファシエ
ンス LBA4404株を、エレクトロポレーション法〔植物細
胞工学 第４巻、第１９３〜２０３頁、１９９２年秀潤
社発行〕により形質転換することができる。なお、ｐＡ
Ｘ３０１により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して得ら
れた該形質転換体は Escherichia coli JM109/pAX301と
命名、表示され、微工研菌寄第１３３２９号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３３２９）として寄託されている。
【００５７】形質転換したアグロバクテリウムにより目
的の植物を形質転換する方法は特に限定されるものでは
ない。例えば、無菌の植物を栽培し、該植物体の切片を
カルス誘導培地〔ＣＩＭプレート：ＭＳＯプレート（ム
ラシゲ−スクーグ無機塩類4.６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０
００×ビタミンストック液１ml／リットル、ｐＨ6.２）
に2,４−ジクロロフェノキシ酢酸（和光純薬社製）を終
濃度0.５μｇ／ml、カイネチン（和光純薬社製）を0.０
５μｇ／mlとなるように加えたもの〕で数日間生育させ
たものに形質転換したアグロバクテリウムを感染させる
方法を用いることができる。感染した切片を除菌し、培
養した後に、使用したベクターの選択マーカーとなる抗
生物質を含有するプレートに移植し培養すれば、形質転
換された植物体を選択することができる。これらの抗生
物質を含有するプレート上に得られた植物体のゲノム中
に、アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しくはエンド
型ＸＧ転移酵素発現用カセットが挿入されていることの
確認は、該植物体、又はその種子から形成された植物体
のＤＮＡを抽出し、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子、又は
その一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーシ
ョン等の方法で行うことができる。また、形質転換され
た植物体中において、エンド型ＸＧ転移酵素の発現が調
節されていることの確認は、形質転換された植物体又は
その種子のＲＮＡを抽出し、エンド型ＸＧ酵素遺伝子を
プローブとして用いて、ノザンハイブリダイゼーション
等の方法で行うことができる。
【００５８】例えば、シロイヌナズナ種子を常法に従っ
て無菌的に栽培し、その根の切片を用いて前出のＣＩＭ
プレート上でカルス培養を行う。ｐＡＸ３０１及びｐＡ
Ｘ３０２により形質転換したアグロバクテリウム、及び
pBI-H1-35S-IG により形質転換したアグロバクテリウム
をそれぞれ培養し、希釈したものをチューブに分注し、
カルス化した根の切片を浸し、数日間ＣＩＭプレート上
で共存培養する。各々の菌株が肉眼で観察できるまで十
分に増殖したら、除菌操作を行い、更にＳＩＭＣプレー
ト｛ＭＳＯプレートに、２−ｉｐ〔Ｎ6 −（２−イソペ
ンタニル）アデニン〕（和光純薬社製）を終濃度５μｇ
／ml、ＩＡＡ（３−インドール酢酸、和光純薬社製）を
終濃度0.１５μｇ／ml、クラフォラン（ヘキスト社製）
を終濃度５００μｇ／mlとなるように加えたもの｝上で
数日間培養を行う。これらの切片を最終的にＳＩＭＣＳ
プレート（カナマンシン及びハイグロマンシンＢを含有
するＳＩＭＣプレート）上で培養し、１週間ごとに、新
しいプレートに移植を繰返す。形質転換した切片は増殖
を続け、塊状に盛り上がったカルスとなるが、非形質転
換切片は褐変する。形質転換体を、ロゼット葉を形成す
るまで培養し、形質転換体の根元をカルス部分を含まな
い様にメスで切り取り、ＲＩＭプレート（ＭＳＯプレー
トにＩＡＡを終濃度0.５μｇ／mlとなるように加えたも
の）に移す。８〜１０日後、後述する無機塩類培地に浸
したロックファイバーミニポット（日東紡績社製）上に
移して培養する。開花し、さやを形成した植物体は無機
塩類培地に浸した土に移植し、種子を得ることができ
る。この種子を滅菌処理し、ＭＳＨプレート（ＭＳＯプ
レートにハイグロマイシンＢを終濃度５Ｕ／mlとなるよ
うに加えたもの）に播種して発芽させることにより形質
転換体を得ることができる。
【００５９】この形質転換体より、常法に従ってＤＮＡ
を抽出し、このＤＮＡを制限酵素Hind III又は PstＩで
切断し、プローブとして、プライマーＡＴＸ−Ｓ及びＡ
ＴＳ−Ｓの対を用いて増幅した約１kbp のＤＮＡ配列を
用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、形質転換
の有無を確認することができる。すなわち、形質転換を
行っていないＷＳ株（１）、ｐＡＸ３０１を導入した形
質転換体（２）、ｐＡＸ３０２を導入した形質転換体
（３）、ベクターpBI-H1-35S-IG のみを導入した形質転
換体（４）において、（２）、（３）両方には（１）〜
（４）共通の内在性のシグナルのほかに、Hind IIIで切
断したサンプルでは約１kbp の、ＰｓｔＩで切断したサ
ンプルでは約３kbp の特異的なシグナルが観察され、エ
ンド型ＸＧ転移酵素をコードするＤＮＡが（２）、
（３）両方に組込まれていることが確認できる。
【００６０】また、（１）〜（４）より常法に従ってＲ
ＮＡを抽出し、約１kbp のセンスＤＮＡ配列若しくはア
ンチセンスＤＮＡ配列を有するプローブを作成し、これ
らのプローブを用いてノザンハイブリダイゼーションを
行い、（１）〜（４）におけるエンド型ＸＧ転移酵素の
発現の状態を観察することができる。すなわち、センス
ＤＮＡ配列を有するプローブを用いた場合、前出の
（１）、（３）、（４）にはバンドは確認されず、
（２）にのみ約１kbp のバンドが確認される。一方、ア
ンチセンスＤＮＡ配列を有するプローブを用いた場合、
前出の（１）〜（４）すべてに約１kbp のバンドが確認
され、該バンドのシグナルは（１）と比べて（３）が強
く、（２）は弱く検出され、エンド型ＸＧ転移酵素の発
現が（３）において増強され、一方、（２）において抑
制されていることが確認できる。
【００６１】上記の方法と同様にして、例えば本発明で
得られるトマトのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子配列を用
いて、他の種類の植物、例えばタバコの形質転換体を作
出することができる。例えば、配列表の配列番号１８で
示されるタバコと同科の植物であるトマトのエンド型Ｘ
Ｇ転移酵素遺伝子の配列に基づいて、配列表の配列番号
２４、２５、２６、２７に示す４種類のプライマーＴＯ
ＭＸＳＰ、ＴＯＭＳＡＰ、ＴＯＭＳＳＰ、ＴＯＭＸＡＰ
をデザインし、合成することができる。プライマーＴＯ
ＭＸＳＰ、及びＴＯＭＳＳＰは配列表の配列番号１８の
塩基番号４６〜６６に対応する５′→３′の向きに相当
する配列の５′側に制限酵素ＸｂａＩ、若しくはＳａｃ
Ｉの切断部位を付加したもの、ＴＯＭＳＡＰ、ＴＯＭＸ
ＡＰは塩基番号９２１〜９４１に対応する３′→５′の
向きに相当する配列の５′側に制限酵素ＳａｃＩ、若し
くはＸｂａＩの切断部位を付加したものである。
【００６２】例えばトマトのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子を鋳型として、上記のプライマーのうちＴＯＭＸＳ
Ｐ、及びＴＯＭＳＡＰの対を用いてＰＣＲ法により遺伝
子配列の増幅を行い、増幅された約９３０bpのＤＮＡ断
片を、制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩにより切断し、精
製した後、pBI-H1-35S-IG のＸｂａＩサイトからＳａｃ
Ｉサイトの部位に挿入することができる。このプラスミ
ドをｐＴＸ３０１と命名する。ｐＴＸ３０１は、配列表
の配列番号１８の塩基番号４６番〜９４１番で表される
トマトのエンド型ＸＧ転移酵素の遺伝子の部分配列をカ
リフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの下流
のＸｂａＩサイトからＳａｃＩサイトの部位にエンド型
ＸＧ転移酵素が発現されるように組込んだもので、カナ
マイシン及びハイグロマイシン耐性の遺伝子を有してい
る。また同様にプライマーＴＯＭＸＡＰ及びＴＯＭＳＳ
Ｐの対を用いてＰＣＲ法で遺伝子の増幅を行い、増幅さ
れた約９３０bpのＤＮＡ断片をpBI-H1-35S-IG のＸｂａ
ＩサイトからＳａｃＩサイトの部位に挿入したプラスミ
ドをｐＴＸ３０２と命名する。ｐＴＸ３０２はｐＴＸ３
０１と同様のプロモーター及び同様の耐性遺伝子を持
ち、配列表の配列番号１８の塩基番号４６番〜９４１番
の配列を転写によりアンチセンスＲＮＡが生成するよう
に組込んだものである。これらのプラスミドを用いて、
前述の方法と同様の方法を用いて適当なアグロバクテリ
ウムの菌株、例えばアグロバクテリウム チュメファシ
エンスLBA4404株を形質転換することができる。
【００６３】なお、ｐＴＸ３０１及びｐＴＸ３０２によ
り形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、それぞれEsch
erichia coli JM109/pTX301 、及びEscherichia coli J
M109/pTX302 と命名、表示され、それぞれ微工研菌寄第
１３３３０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３０）、及び微工
研菌寄第１３３３１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３１）と
して寄託されている。
【００６４】ｐＴＸ３０１及びｐＴＸ３０２により形質
転換されたアグロバクテリウムの菌株を用いて、前述の
シロイヌナズナの場合と同様にして、ｐＴＸ３０１及び
ｐＴＸ３０２で形質転換されたタバコの植物体を作製す
ることができる。これらの形質転換体より、常法に従っ
てＤＮＡを抽出し、制限酵素ＰｓｔＩで消化し、例えば
上記のプライマーＴＯＭＳＳＰ、ＴＯＭＸＡＰの対を用
いてＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をプローブとして
用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、形質転換
の有無を確認することができる。すなわち、ｐＴＸ３０
１及びｐＴＸ３０２を導入したタバコでは、コントロー
ルとしてpBI-H1-35S-IG を導入したタバコ及び形質転換
を行っていないタバコと比べて、タバコのエンド型ＸＧ
転移酵素遺伝子と考えられるバンドのほかにバンドが現
れ、あるいは他のバンドと明らかに異なる強いシグナル
のバンドが検出され、ｐＴＸ３０１及びｐＴＸ３０２を
導入したタバコには、トマトエンド型ＸＧ転移酵素の遺
伝子が導入されていることが確認できる。
【００６５】また、これらの形質転換体よりＲＮＡを抽
出し、センスＤＮＡ配列若しくはアンチセンスＤＮＡ配
列を有するプローブを作製し、ノザンハイブリダイゼー
ションを行い、エンド型ＸＧ転移酵素の発現の状態を確
認することができる。すなわち、センスＤＮＡ配列を有
するプローブを用いた場合、pBI-H1-35S-IG 及びｐＴＸ
３０１を導入したタバコ及び形質転換を行っていないタ
バコでは相応するバンドは認められないが、ｐＴＸ３０
２を導入したタバコでは相応するバンドが確認され、一
方、アンチセンスＤＮＡ配列を有するプローブを用いた
場合、pBI-H1-35S-IG を導入したタバコ及び形質転換を
行っていないタバコでは相応するバンドが得られ、ｐＴ
Ｘ３０１を導入したタバコでは更に強いバンドが認めら
れる。ｐＴＸ３０２を導入したタバコでは、かすかにし
かバンドは認められず、このことより、内因性のエンド
型ＸＧ転移酵素の発現は、ｐＴＸ３０１を導入すること
により増強され、ｐＴＸ３０２を導入することにより抑
制されることが確認できる。
【００６６】本発明で得られるエンド型ＸＧ転移酵素を
用いて、適当な条件下でＸＧ分子のつなぎ換えを複数回
繰返すことにより、任意の構造を持つＸＧ分子を作成す
ることができ、キメラ多糖の合成等に利用することがで
きる。また、エンド型ＸＧ転移酵素を用いて、植物細胞
壁の構造を変化させることができ、工業分野で用いられ
る植物原料の加工に有用である。
【００６７】本発明で得られるエンド型ＸＧ転移酵素を
コードする遺伝子や該遺伝子にハイブリダイズする遺伝
子又はその一部の配列を有するポリヌクレオチドを用い
て、エンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子の発現過
程の観察や調節を行うこともできる。また、本発明で得
られる、エンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子を発
現させ、製造されるポリペプチドを用いて、種々の抗体
を作成することもでき、これらの抗体も、エンド型ＸＧ
転移酵素の精製等に有用である。
【００６８】
【実施例】以下に本発明を実施例をもって示すが、本発
明はこれらの実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
【００６９】実施例１ エンド型ＸＧ転移酵素の精製 ビグナ アンギュラリス オウヴィ エ オオハシ、c
v、タカラ( Ohwi et Ohashi, cv. Takara )の種子（渡
辺種子社製）をフィジオロジア プランタルム、第８２
巻、第４９０〜４９７頁（１９９１）に記載の方法で発
芽させ、アポプラスト溶液を得た。
【００７０】（硫安沈殿）合計６００mlのアポプラスト
溶液を、１０ｇのポリビニルピロリドン粉末、及び５０
mMのジチオスレイトールと２mMのＥＤＴＡを含有する0.
５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.８）６０mlと０
℃で混合して５分間保持した。不溶物質を１８０００×
ｇで３０分間遠心分離して除去した後、上澄み液に硫酸
アンモニウム粉末を添加して８０％飽和として、生成し
た沈殿（１0.５mgのタンパク質を含む）を遠心分離によ
って回収した。得られた沈殿を２mlの0.２Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ5.７）に溶解し、１mlの１００％硫酸
アンモニウム飽和溶液を添加して３３％飽和とした。生
成した沈殿を、１８０００×ｇにて３０分間遠心分離し
て回収し、1.８mgのタンパク質を含む画分を得た。
【００７１】（ Con−Ａ Sepharose ６Ｂによる分画）
上記の操作で得た沈殿を、0.１５ＭのＮａＣｌ、１mMの
ＭｎＣｌ2 、１mMのＭｇＣｌ2 、及び１mMのＣａＣｌ2
を含有する酢酸ナトリウム緩衝液ａ（ｐＨ5.７）の2.４
mlに溶解し、同じ緩衝液ａであらかじめ平衡化したコン
−Ａセファロース６Ｂ（ Con−Ａ Sepharose ６Ｂ、フ
ァルマシア社製）（４ml）のカラムに注入した。そのカ
ラムを、３６mlの緩衝液ａ、７mMのメチル−α−Ｄ−マ
ンノピラノシドを含有する緩衝液ａの２０ml、及び５０
０mMのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを含有する緩
衝液ａの４０mlで連続して溶離した。５００mMのメチル
−α−Ｄ−マンノピラノシドを含有する緩衝液ａで溶出
した画分に、本発明の酵素の活性が認められた。その活
性画分をウルトラフリー( Ultrafree 、ミリポア社製）
を用いて限外ろ過により濃縮し、４００μｌ中に６６８
μｇのタンパク質を含有する画分を得た。
【００７２】（ＴＳＫゲル２０００ＳＷによる分画）上
記の操作で得た画分のタンパク質２００μｌをＴＳＫゲ
ルＧ２０００ＳＷ（7.５×３００mm、東ソー社製）を用
い、溶離液として0.１５Ｍ酢酸ナトリウ緩衝液（ｐＨ5.
７）を0.５ml／分の流量で用いるカラムクロマトグラフ
ィーに付した。このクロマトグラフィーを繰返し、活性
画分を分画して濃縮し、上記緩衝液１００μｌ中に６０
μｇのタンパク質を含有する画分を得た。
【００７３】( Mono−Ｓによる分画）上記の操作で得た
画分を５００μｌの２０mM酢酸ナトリウム溶液で希釈
し、４０mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.７）てあらか
じめ平衡化したモノ−Ｓ( Mono−Ｓ、ファルマシア社
製）のカラム（５×５０mm）に注入した。このカラム
を、2.５mlの４０mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.７）
で溶離し、次に０−１Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配を有
する４０mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.７）の２０ml
を0.４ml／分の流量で用いて溶離し、約３０μｇの本発
明の酵素の精製標品を得た。以上の各々の精製工程の結
果を表３に示す。
【００７４】
【表３】 表３ ビグナ・アンギュラリスよりエンド型ＸＧ転移酵素の精製経過 ──────────────────────────────────── 精製工程 全タンパク質 全活性 比活性 収 率 精製度 （単位／μg (mg) （単位） タンパク質 （％） （倍） ──────────────────────────────────── アポプラスト溶液 10.5 2136 0.203 100 1 ３３％ 硫安分画 1.513 1766 1.17 82 5.7 Con-Ａ セファロース 0.668 938 1.40 43 6.9 ＴＳＫ 2000SW 0.06 816 13.6 38 67 Mono−Ｓ 0.03 530 17.7 24 87 ────────────────────────────────────
【００７５】また、前述した図１３において、（ｂ）は
アポプラスト溶液を用いて反応を行った際のクロマトグ
ラフである。図中矢印２は混在するグリコシダーゼによ
り生じたモノマー糖の溶出位置を示している。（ｃ）の
精製酵素画分においてはモノマー糖のピークは現れず、
精製操作により混在するグリコシダーゼが除去されたこ
とを示している。
【００７６】（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）上記の精製工程で得られた本発明の酵素の精製標品
をラエンミリ( Laemmili )らの方法〔ネイチャー、第２
２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０）〕に従って、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。す
なわちＳＤＳを含有する１２％ポリアクリルアミドゲル
（１０×１０cm、１mm厚）を使用して泳動し、銀染色を
行い、発色させると、本発明の酵素の精製標品は分子量
約３3,０００の単一のバンドとして確認された。
【００７７】実施例２ エンド型ＸＧ転移酵素をコード
する遺伝子のクローニング ポリ（Ａ）+ ＲＮＡの調製 ビグナ アンギュラリス オウヴィ エ オオハシ，c
v. タカラの種子を前出のフィジオロジア プロンタル
ムに記載の方法で発芽させた。発芽より１週間後、芽の
先端から２〜５cmの下方の茎を切取り、約３ｇの植物組
織を得た。これを直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素
存在下乳鉢ですりつぶして粉末にし、約３０mlの変性液
〔４Ｍグアニジンチオシアネート、２５mMクエン酸ナト
リウム（ｐＨ7.０）、0.１Ｍ ２−メルカプトエタノー
ル、0.５％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム〕で
溶解した。ここに２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ4.０）３m
l、水飽和酸性フェノール３０ml、４９：１ クロロホ
ルム／イソアミルアルコール６mlを順次加え、よくかく
はんし、この懸濁液を遠心して水層を分離し、この水層
にイソプロピルアルコールを加えて遠心分離することに
よりＲＮＡの沈殿約１mgを得た。この沈殿を溶出用緩衝
液〔１０mMトリス(Tris)−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）、１mM
ＥＤＴＡ（ｐＨ8.０）、0.１％ＳＤＳ〕４００μｌを溶
かし、オリゴテックス−ｄＴ３０（日本ロシュ社）１ml
を加えることによりポリ（Ａ）+ ＲＮＡのみを樹脂に吸
着させた。樹脂を滅菌した純水で洗浄して、約１０μｇ
のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを回収した。
【００７８】 エンド型ＸＧ転移酵素のＮ末端アミノ
酸配列の決定 実施例１で得られたエンド型ＸＧ転移酵素の精製標品の
約１nmolを用いて、アプライド バイオシステムズ社製
の４７０Ａプロテインシークエンサーにより、Ｎ末端よ
り約３０残基のアミノ酸配列を決定した。該アミノ酸配
列を、配列表の配列番号１１に示す。
【００７９】 ＰＣＲ法によるエンド型ＸＧ転移酵素
ｃＤＮＡの増幅 で得られたアミノ酸配列を基に、配列表の配列番号１
２で表されるプライマーｐＡＺ−１、及び配列表の配列
番号１３で表されるプライマーｐＡＺ−２をデザイン
し、ＤＮＡ合成機で合成した。また、Ｍ１３プライマー
Ｍ４（宝酒造社製）の３′側に更にＴが２０個連なった
配列を有するプライマーｐＴＭ４を同様に合成した。プ
ライマーｐＴＭ４の配列を配列表の配列番号１４に示
す。
【００８０】で得られたポリ（Ａ）+ ＲＮＡ２μｇ
を、５mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＫＣｌ、１０mMトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、0.０１％ゼラチン、ｄＮＴＰ各
１mM、2.５μＭのプライマーｐＴＭ４、２０Ｕの RNase
インヒビター、５０Ｕの逆転写酵素ＲＡＶ−２（宝酒造
社製）を含む総液量２０μｌの反応液に加え、４２℃で
４０分間逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
【００８１】このチューブに２５mM ＭｇＣｌ2 ４μ
ｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液〔５００mMＫＣｌ、１００mMト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、0.１％ゼラチン〕８μｌ、
滅菌蒸留水６5.５μｌ、アンプリタックTMＤＮＡポリメ
ラーゼ（シータス社製）2.５Ｕ、２０pmolのプライマー
ｐＡＺ−１、２０pmolのＭ１３プライマーＭ４（宝酒造
社製）を順次加え、ミネラルオイルを添加してＰＣＲに
供した。反応は９４℃（0.５分）、４５℃（２分）、７
２℃（１分）のサイクルを３０回繰返した後、７２℃に
７分間維持した。次いで、この反応液１μｌを鋳型とし
て、ｐＡＺ−２をセンスプライマーとして、Ｍ１３プラ
イマーＭ４をアンチセンスプライマーとしてそれぞれ用
いて同様にＰＣＲを行い、上述のサイクルを２５回繰返
した。反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供
し、約1.１kbp のｃＤＮＡが特異的に増幅されているこ
とを確認した。このｃＤＮＡを精製し、プラスミドｐＵ
Ｃ１１９の制限酵素 Hinc IIサイトにサブクローニング
した。
【００８２】 ｃＤＮＡライブラリーの作製及びスク
リーニング で得られたポリ（Ａ）+ ＲＮＡより、ｃＤＮＡ合成キ
ットシステムプラス（アマシャム社製）を用いて、ジー
ン( Gene )第２５巻、第２６３頁（１９８３）に記載の
方法に準じて、λgt１０をベクターとするｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。でサブクローニングした約1.１
kbp のｃＤＮＡを、ランダムプライマーＤＮＡラベリン
グキット（宝酒造社製）を用いて（α−32Ｐ）ｄＣＴＰ
で標識し、ハイブリダイゼーションのプローブとした。
このプローブを用いて、上記で作製したｃＤＮＡライブ
ラリーについてプラークハイブリダイゼーション法を行
った。１×１０4 個のプラークについて検索を行った結
果、５個の陽性プラークが得られた。これらのプラーク
よりファージを単離し、挿入されているＤＮＡを抽出し
た。これらのＤＮＡを制限酵素EcoRＩにより切断し、ア
ガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片の長さを確認し
た。約1.１kbp のＤＮＡ断片を精製し、プラスミドｐＵ
Ｃ１１９のEcoRＩサイトにサブクローニングし、該プラ
スミドをｐＶＸ１０３と命名した。得られた約1.１kbp
のＤＮＡ断片を数種の制限酵素で切断し、アガロースゲ
ル電気泳動により分析した。
【００８３】その結果を図１に示す。すなわち、図１は
約1.１kbp のＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図であ
る。制限酵素BamHＩ、Hind III、 KpnＩ等は該断片を切
断しない。
【００８４】プラスミドｐＶＸ１０３を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、形質転換体をEscherichia co
li JM109／pVX103と命名、表示した。該菌株は、微工研
条寄第４１０４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１０４）として
寄託されている。
【００８５】実施例３ エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の塩基配列の決定 実施例２で得られたプラスミドｐＶＸ１０３の１０μｇ
を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断した。次いでヘ
ニコフ（Henikoff）らの方法〔ジーン、第２８巻、第３
５１〜第３５９頁（１９８４）〕に従い、キロシークエ
ンス用デレーションキット（宝酒造社製）を用いて、ベ
クターに組込まれたＤＮＡ断片をＸｂａＩの認識配列側
の末端より分解し、種々の大きさの断片を含むクローン
を得た。この中から適当な大きさの断片を含むプラスミ
ド８個を選択し、サンガー（Sanger）の方法〔サイエン
ス（Science)、第２１４巻、第１２０５〜１２１０頁
（１９８１）〕に従ってＢｃａＢＥＳＴTMダイデオキシ
シークエンシングキット（宝酒造社製）を用いて約１．
１kbp のＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その塩基配
列の一部を配列表の配列番号１５に示す。配列表の配列
番号１５の塩基番号５７番〜８７２番はビグナ アンギ
ュラリスのエンド型ＸＧ転移酵素の成熟タンパク質をコ
ードする部分である。
【００８６】実施例４ （４−１）ダイズエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のクロー
ニング及び塩基配列の決定 実施例２で得られた約1.１kbp のｃＤＮＡを、ランダム
プライマーＤＮＡラベリングキットを用いて［α−
32Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、ハイブリダイゼーションのプ
ローブとした。ダイズ（Glycine max)組織ｍＲＮＡから
作製されたｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）
についてプラークハイブリダイゼーション法を行った。
５×１０4 個のプラークについて検索を行った結果、３
個の陽性プラークが得られた。これらのプラークよりフ
ァージを単離し、ファージからＤＮＡを精製した。この
ＤＮＡを制限酵素EcoRＩにより切断し、アガロースゲル
電気泳動によりｃＤＮＡ挿入断片の長さを確認した。３
個の陽性プラークのうち最長の約１kbp の長さのｃＤＮ
Ａ断片を確認することができ、これを精製した後プラス
ミドｐＵＣ１１９のEcoRＩサイトにサブクローニング
し、得られたプラスミドをｐＳＸ１０２と命名した。得
られた約１kbp のｃＤＮＡ断片を数種の制限酵素で切断
し、アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果
を図２に示す。すなわち、図２は約１kbp のｃＤＮＡ断
片の制限酵素地図を示す図である。
【００８７】プラスミドｐＳＸ１０２を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、形質転換体をEscherichia co
li JM109/pSX102 と命名、表示した。該菌株は、微工研
菌寄第１３３３３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３３）とし
て寄託されている。プラスミドｐＳＸ１０２を制限酵素
ＸｂａＩ及びＳｐｈＩで切断し、このｃＤＮＡ断片を用
いて、実施例３に記載の方法と同様にして約１kbp のｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。配列の一部を配列表
の配列番号１５番に示す。
【００８８】（４−２）シロイヌナズナエンド型ＸＧ転
移酵素遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定 実施例２で得られた約1.１kbp のｃＤＮＡを、ランダム
プライマーＤＮＡラベリングキットを用いて［α−
32Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、ハイブリダイゼーションのプ
ローブとした。シロイヌナズナ（Arabidopsis thalian
a）組織ｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリー
（クロンテック社製）についてプラークハイブリダイゼ
ーション法を行った。５×１０4 個のプラークに対し
て、約３個の割合で陽性プラークが得られた。これらの
プラークよりファージを単離し、ＤＮＡを精製した。こ
れらのＤＮＡを制限酵素EcoRＩにより切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりｃＤＮＡ挿入断片の長さを確認し
た。３個の陽性プラークのうち最も長い約1.３kbp の長
さのｃＤＮＡ断片を確認することができ、これを精製し
た後、プラスミドｐＵＣ１１９のEcoRＩサイトにサブク
ローニングし、得られたプラスミドをｐＡＸ１０１と命
名した。得られた約1.３kbp のｃＤＮＡ断片を数種の制
限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動により分析し
た。その結果を図３に示す。すなわち、図３は約1.３kb
p のｃＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。プラ
スミドｐＡＸ１０１を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換し、形質転換体をEscherichia coli JM109/pAX101
と命名、表示した。プラスミドｐＡＸ１０１をＸｂａＩ
及びＳｐｈＩで切断し、このＤＮＡ断片を用いて、実施
例３に記載の方法と同様にして約1.３kbp のＤＮＡ断片
の塩基配列を決定した。配列の一部を配列表の配列番号
１７番に示す。
【００８９】（４−３）トマトエンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子のクローニング及び塩基配列の決定 トマト（Lycopersicon esculentum)の種子（渡辺採取場
社製）を発芽させ、芽の上胚軸部分の組織から、実施例
２−と同様にして１０μｇのポリ（Ａ）+ ＲＮＡを抽
出し、λＥＸｌｏｘTMイントロダクトリークローニング
キット（ノバジェン社）を用いてｃＤＮＡライブラリー
を作製した。すなわち、ジーン、第２５巻、第２６３頁
（１９８３）に記載の方法に従い、ｃＤＮＡを合成した
あと、キット中にあるEcoRＩリンカー及びHind IIIリン
カーを用いて、ベクターλＥＸＬＸ〔パラゾロ（Palazz
olo)ら、ジーン、第８８巻、第２５〜３６頁（１９９
０）〕にライゲーションした後、ｃＤＮＡライブラリー
を作製した。
【００９０】実施例２で得られた約1.１kbp のｃＤＮＡ
を、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキットを用い
て〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰで標識し、ハイブリダイゼーシ
ョンのプローブとして用いて上記のｃＤＮＡライブラリ
ーについてプラークハイブリダイゼーション法を行っ
た。１×１０5 個のプラークに対して、約２個の割合で
陽性プラークが得られた。これらのプラークより前述の
パラゾロらの方法に従い、λファージＤＮＡからｃＤＮ
Ａを含む断片をプラスミドとして回収した。このＤＮＡ
を制限酵素EcoRＩ及びHind IIIにより切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりＤＮＡ断片の長さを確認した。２
個の陽性プラークのうち長い方の約1.２kbp の長さのｃ
ＤＮＡ断片を確認することができ、これを精製した後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）により突出末端
を平滑末端として、プラスミドｐＵＣ１１８のHincIIサ
イトにサブクローニングし、得られたプラスミドをｐＴ
Ｘ２０１と命名した。得られた約1.２kbp のＤＮＡ断片
を数種の制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動に
より分析した。その結果を図４に示す。すなわち、図４
は約1.２kbp のＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図であ
る。プラスミドｐＴＸ２０１を制限酵素BamHＩ及び Sac
Ｉで切断し、このＤＮＡ断片を用いて、実施例３に記載
の方法と同様にして約1.２kbp のＤＮＡ断片の塩基配列
を決定した。配列の一部を配列表の配列番号１８番に示
す。
【００９１】（４−４）コムギエンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子のクローニング及び塩基配列の決定 実施例２で得られた約1.１kbp のｃＤＮＡを、ランダム
プライマーＤＮＡラベリングキットを用いて［α−
32Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、ハイブリダイゼーションのプ
ローブとした。コムギ（Triticum aestivum)組織ｍＲＮ
Ａから作製されたｃＤＮＡライブラリー（クロンテック
社製）についてプラークハイブリダイゼーション法を行
った。１×１０5 個のプラークに対して、約１個の割合
で陽性プラークが得られた。これらのプラークよりファ
ージを単離し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを制限酵
素EcoRＩにより切断し、アガロースゲル電気泳動により
ｃＤＮＡ挿入断片の長さを確認した。約0.９kbp のｃＤ
ＮＡ断片を確認することができ、これを精製した後、プ
ラスミドｐＵＣ１１９のEcoRＩサイトにサブクローニン
グし、該プラスミドをｐＷＸ１０１と命名した。得られ
た約0.９kbp のＤＮＡ断片を数種の制限酵素で切断し、
アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図
５に示す。すなわち、図５は約0.９kbp のＤＮＡ断片の
制限酵素地図を示す図である。
【００９２】プラスミドｐＷＸ１０１を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、形質転換体をEscherichia co
li JM109/pWX101 と命名、表示した。該菌株は、微工研
菌寄第１３３３２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３２ ）と
して寄託されている。プラスミドｐＷＸ１０１を制限酵
素ＸｂａＩ及び Sse8387Ｉで切断し、このＤＮＡ断片を
用いて、実施例３に記載の方法と同様にして約0.９kbp
のＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。配列の一部を配列
表の配列番号１９番に示す。
【００９３】実施例５ エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の
発現 ５−１（発現用プラスミドpVX110の構築） 実施例２で得られたプラスミドｐＶＸ１０３を出発材料
として、Mutan-ＫTMを用いて、クンケルの方法に従って
配列表の配列番号１５番の塩基番号５８番のＣをＴに変
換して、塩基番号５７番〜６２番に制限酵素HincIIの認
識部位を持つプラスミドを構築し、ｐＶＸ１０６と命名
した。ｐＶＸ１０６を上記の操作で作製したHincIIの認
識部位とマルチクローニングサイトのHincIIの認識部位
とでHincIIにより切断し、約1.１kbp の断片を切り出し
た。該断片に１０mer の NcoＩリンカーをライゲーショ
ンキットを用いて付加し、 NcoＩにより消化した。アガ
ロースゲル電気泳動により約1.１kbp のｃＤＮＡ断片を
精製し、該断片をプラスミドpTV119N の NcoＩサイトに
挿入した。挿入断片内には PvuIIの切断部位が非対称の
位置に存在するので、挿入した断片の向きを PvuIIによ
る消化物の大きさにより確認し、該断片がエンド型ＸＧ
転移酵素遺伝子のｍＲＮＡがｌａｃプロモーターにより
転写されるような向きに挿入されているプラスミドをpV
X110と命名した。図１４にpVX110の構築図を示す。pVX1
10を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、該形質転換
体をEscherichia coli JM109/pVX110 と命名した。
【００９４】５−２（大腸菌によるエンド型ＸＧ転移酵
素の発現） ５−１で得られたEscherichia coli JM109/pVX110 を１
００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロス５０mlに
懸濁し、３７℃で振とう培養した。培養後の濁度がＯ．
Ｄ．660 ＝0.３となったところで、終濃度２mMとなるよ
うにＩＰＴＧを加え、ＩＰＴＧ添加後３７℃で８時間振
とう培養した。培養終了後、Ｏ．Ｄ．660 ＝0.１の１ml
に相当する菌体を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。発現用ベ
クターpTV119のみを用いて形質転換した大腸菌ＪＭ１０
９株を上記と同様の条件で培養し、これを対照として、
同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ゲルを
クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ、ナカライテスク
社製）により染色し、７％酢酸、２５％メタノール液に
て脱色を行った。Escherichia coli JM109/pVX110 には
目的とする分子量約３１kDa のバンドが見られ、エンド
型ＸＧ転移酵素の発現を確認した。
【００９５】５−３（エンド型ＸＧ転移酵素の精製） Escherichia coli JM109/pVX110 を５−２と同様の方法
で、１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロス２
００mlに懸濁し培養した。培養終了後、培養液を遠心分
離して菌体を集め、１０mlのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
7.５）に懸濁したあと、超音波処理で菌体を破砕し、遠
心処理して上清画分と沈殿画分に分けた。沈殿画分は１
０mlの蒸留水に懸濁した。上清と沈殿各々2.５μｌずつ
について５−２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行っ
たところ、沈殿画分に目的のタンパク質があることが確
認された。懸濁液を再び遠心して得た沈殿画分１０mgを
７Ｍ尿素、５０mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２０
mMトリス−塩酸（ｐＨ7.５）を含む緩衝液で溶解し、２
０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.５）、１mMＥＤＴＡを含む外
液２ で一晩透析した。透析内液は、ウルトラフィルト
レーションメンブレン（アミコン社製）により濃縮し、
２倍量の１００％飽和硫酸アンモニウム水溶液を最終濃
度６６％となるように加え、15000rpmで１０分間遠心す
ることによって、沈殿したタンパク質を回収した。この
沈殿タンパク質を２０mMトリス−塩酸、１５０mlＮａＣ
ｌ水溶液７５０μｌに溶解し、その１５０μｌを、２０
mMトリス−塩酸、１５０mlＮａＣｌ水溶液で平衡化した
ＴＳＫゲル2000ＳＷ（7.６×３００mm）を備えたＨＰＬ
Ｃに注入した。流速0.５ml／分で、２分毎に溶出液を分
取し、溶出液の２８０nmにおける吸光度を測定してタン
パクの溶出位置を確認した。ゲルろ過終了後、各々のフ
ラクションについて、分子量５０kDa のＸＧとピリジル
アミノ化したＸＧ７量体を基質として、エンド型ＸＧ転
移酵素活性を測定した。この結果、分子量約３１kDa の
溶出画分に、エンド型ＸＧ転移酵素活性が検出された。
【００９６】実施例６ シロイヌナズナの形質転換体の
作成 ６−１ プラスミドｐＡＸ３０１及びｐＡＸ３０２の構
築 配列表の配列番号１７に示したシロイヌナズナのエンド
型ＸＧ転移酵素遺伝子の配列に基づいて、４種類のプラ
イマー、ＡＴＸ−ＡＳ、ＡＴＳ−ＡＳ、ＡＴＸ−Ｓ、Ａ
ＴＳ−Ｓをデザインし、合成した。それぞれの配列を配
列表の配列番号２０、２１、２２、２３に示す。ＡＴＳ
−ＡＳ及びＡＴＸ−Ｓはそれぞれ配列表の配列番号１７
の塩基番号４０〜５６に対応する５′→３′の向きに相
当する配列の５′側に制限酵素ＳａｃＩ若しくはＸｂａ
Ｉの切断部位を付加したもの、ＡＴＸ−ＡＳ、ＡＴＳ−
Ｓはそれぞれ塩基番号１００７〜１０２３に対応する
３′→５′の向きに相当する配列の５′側に制限酵素Ｘ
ｂａＩ若しくはＳａｃＩの切断部位を付加したものであ
る。鋳型として、実施例４−（２）で得られたｃＤＮＡ
約１ng（１μｌ）を0.５ml用チューブにとり、ジーンア
ンプTMキット中の１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ、1.２５
mMｄＮＴＰ混合液１６μｌ、アンプリタックTMＤＮＡポ
リメラーゼ2.５Ｕ、２０pmolのプライマーＡＴＸ−ＡＳ
及びＡＴＳ−ＡＳに滅菌蒸留水を加えて１００μｌと
し、ミネラルオイルを添加してＰＣＲに供した。反応条
件は９４℃（１分）、５５℃（１分）、７２℃（２分）
のサイクルを３５回繰返した後、７２℃に７分間維持し
た。プライマーＡＴＸ−Ｓ、ＡＴＳ−Ｓを用いた場合に
も、同じ条件でＰＣＲを行った。反応後、反応液をアガ
ロースゲル電気泳動に供し、約１kbp のｃＤＮＡが特異
的に増幅されていることを確認した。これらのｃＤＮＡ
をＸｂａＩ、ＳａｃＩで切断後、それぞれ精製し、バイ
ナリーベクターpHI-H1-35S-IG の制限酵素ＸｂａＩサイ
トからＳａｃＩサイトの部位にサブクローニングした。
プライマーのＡＴＳ−ＡＳ及びＡＴＸ−ＡＳの対を用い
て増幅されたＤＮＡ断片を挿入したプラスミドをｐＡＸ
３０１と命名し、プライマーＡＴＸ−Ｓ、及びＡＴＳ−
Ｓの対を用いて増幅されたＤＮＡ断片を挿入したプラス
ミドをｐＡＸ３０２と命名した。なお、ｐＡＸ３０１を
用いて形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、Escheric
hia coli JM109/pAX301 と命名、表示され、微工研菌寄
第１３３２９号（ＦＥＲＭＰ−１３３２９）として寄託
されている。
【００９７】６−２ ｐＡＸ３０１、ｐＡＸ３０２のア
グロバクテリウムへの導入 ６−１で得たプラスミドｐＡＸ３０１及びｐＡＸ３０２
各々２０ngを用いて、アグロバクテリウム チュメファ
シエンス LBA4404株を、エレクトロポレーション法〔植
物細胞工学、第４巻、第１９３〜２０３頁、１９９２年
秀潤社発行〕により形質転換した。プラスミドＤＮＡ１
μｇ当り１×１０7 個の効率で形質転換体が得られ、該
形質転換体をLB-Km-Hg培地（バクトトリプトン１０ｇ、
酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌの５ｇ、５０mgカナマイシ
ン、4,６００Ｕハイグロマイシン １リットル、ｐＨ7.
５）で各々純化した。ｐＡＸ３０１、ｐＡＸ３０２で形
質転換された菌株をそれぞれ LBA4404／pAX301株、 LBA
4404／pAX302株と命名した。対照実験としてバイナリー
ベクターpBI-H1-35S-IG のみを用いて同様にアグロバク
テリウム チュメファシエンス LBA4404株を形質転換
し、得られた形質転換体を LBA4404／pBI-H1-35S-IG 株
と命名した。
【００９８】６−３ 形質転換植物の作成 ６−３−(1) 無菌シロイヌナズナの栽培 シロイヌナズナ Wassile wskija 株（以下ＷＳ株と称
す）の種子〔アラビドプシス インファメーション サ
ービス（Arabidopsis Information Service)、Ｊ．Ｗ．
Goethe大学内、Ａ．Ｒ．クランズ（Kranz)、フランクフ
ルト、ドイツ〕数１０粒を1.５mlチューブに入れ、７０
％エタノール１mlに２分浸した。続いて滅菌液（５％次
亜塩素酸ナトリウム、0.０２％トライトンＸ−１００）
に５分浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、ＧＭプレート
〔ムラシゲ−スクーグ培地無機塩類（和光純薬社製）4.
６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液
（シグマ社製）１ml、５％ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ5.７）
１０ml、ジェランガム（和光純薬社製）５ｇ／リット
ル〕に置き並べた。このプレートを４℃に２日間放置し
て低温処理を行い、続いて植物インキュベーター（トミ
ー精工社製、CFH-300)中に２２℃、光強度６０００ルク
ス、長日条件下（明期１６時間、暗期８時間）にて、２
０日間培養した。
【００９９】６−３−(2) アグロバクテリウムの感染 ６−３−(1) で２０日間培養したＷＳ株の根を数株ずつ
そろえて、メスで1.５cm程度に切りそろえ、ＣＩＭプレ
ートに置き並べた。光強度３０００ルクス、１６時間明
期、８時間暗期で３日間培養し、根の切片をカルス化さ
せた。一方、６−２で得た LBA4404／pAX301株、 LBA44
04／pAX302株、 LBA4404／pBI-H1-35S-IG をLB-Km-Hg液
体培地で２８℃２日間培養し、ＭＳ希釈液（ムラシゲ−
スクーグ無機塩類6.４ｇ／リットル、ｐＨ6.２）で３倍
に希釈したものをそれぞれ１mlずつチューブに分注し、
この中にカルス化した根の切片を１０分間浸した。２枚
重ねた滅菌ろ紙上に並べ、余分な水分を除き、新しいＣ
ＩＭプレートに各々を置き並べた。同条件にて２日間共
存培養した。
【０１００】６−３−(3) 除菌 各々の菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖した切片
を除菌液〔ＭＳ希釈液にクラフォランを終濃度２００μ
ｇ／mlになるように加えたもの〕に移し、ゆっくり振と
うさせながら３０分間洗った。この操作を５回繰返した
あと、滅菌ろ紙上で水分を除き、ＳＩＭＣプレートに置
き並べ、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間
暗期で２日間培養した。
【０１０１】６−３−(4) 形質転換植物の選択 ６−３−(3) で培養した切片をＳＩＭＣＳプレート（Ｓ
ＩＭＣプレートにハイグロマイシンＢを終濃度4.６Ｕ／
mlとなるように加えたもの）に移し、６−３−(3) と同
条件で培養した。以後、１週間毎に新しいＳＩＭＣＳプ
レートに移植した。形質転換した切片は増殖を続け、塊
状に盛り上がったカルスとなるが、非形質転換切片は褐
変した。形質転換体は約２週間後、カルスが緑色を呈
し、約１ヵ月後、葉が形成され、その後ロゼット葉とな
った。
【０１０２】６−３−(5) 形質転換植物の再生 ロゼット葉となった植物体の根元を、カルス部分を含ま
ないようにメスで切り取り、ＲＩＭプレートに移した。
８〜１０日間後、２cm程度の根が数本形成したものをピ
ンセットで無機塩類培地〔５mMＫＮＯ3 、2.５mMＫ−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ5.５）、２mMＭｇＳＯ4 、２mMＣａ
（ＮＯ3 ）2 、５０μM Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微
量養素（Micronutrients) （７０mMＨ3 ＢＯ3 、１４mM
ＭｎＣｌ2、0.５mMＣｕＳＯ4 、１mMＺｎＳｏ4 、0.２m
MＮａＭｏＯ4 、１０mMＮａＣｌ、0.０１mMＣｏＣ
ｌ2 ）１ml／リットル〕に浸したロックファイバーミニ
ポット（日東紡績社製）に定植させ、培養した。開花
し、さや形成後は、パーライトとバーミキュライト（Ｔ
ＥＳ社製）を１：１に混合し無機塩類混合培地に浸した
土に植え換えた。約１ヵ月後、１株につき約千粒の種子
が得られた。これを以後、Ｔ２種子と称す。
【０１０３】６−３−(6) 抗生物質耐性株の取得 Ｔ２種子約１００粒を３−(1) と同様の方法で滅菌し、
ＭＳＨプレートに播種した。ほぼ３：１の割合でハイグ
ロマイシンＢ耐性株が発芽した。
【０１０４】６−４ ＤＮＡ抽出とサザンハイブリダイ
ゼーション ６−３−(6) で発芽したＴ２種子を無機塩類培地に浸し
たロックファイバーミニポットにピンセットで移植し、
光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期、２
２℃の条件下で培養した。２週間後、メスで地上部を切
り取り、直ちに液体窒素で凍結した。これを乳鉢にて液
体窒素も加えながら乳棒ですりつぶし粉末にした。液体
窒素が蒸発した直後に、１ｇ当り、３mlのＤＮＡ抽出用
緩衝液〔２００mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）、１００
mMＥＤＴＡ−２Ｎａ、１％Ｎ−ラウロイルサルコシンナ
トリウム、１００μｇ／mlプロティネースＫ（ベーリン
ガー社製）〕を入れ６０℃に予熱したチューブに上記の
粉末を移し、かくはんした。６０℃で１時間保温後、遠
心し上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロ
ホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出
を３回行った後、エタノール沈殿を行った。沈殿をＴＥ
緩衝液〔１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）、１mMＥＤ
ＴＡ〕に溶解した。それぞれの植物体約1.７ｇずつか
ら、１２μｇずつのゲノムＤＮＡが得られた。このうち
１μｇのＤＮＡを用いて、それぞれを制限酵素Hind II
I、 PstＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動及び
サザンハイブリダイゼーションに供した。
【０１０５】また、形質転換を行っていないＷＳ株の種
子を発芽、生育させ、植物体より、同様にＤＮＡを抽出
し、制限酵素Hind III、 PstＩによる消化を行い、１％
アガロースゲル電気泳動及びサザンハイブリダイゼーシ
ョンに供した。ハイブリダイゼーション用のプローブ
を、実施例６−１で増幅し、精製したセンスＤＮＡ配列
をもつ約１kbp のＤＮＡ断片を、下記のごとくランダム
プライマーラベリングキット（宝酒造社製）により（α
−32Ｐ）ｄＣＴＰで標識して作成した。すなわち、２５
mgの上記ＤＮＡ断片、２μｌのランダムプライマーをチ
ューブにとり、蒸留水で５μｌとし、９５℃で３分間加
熱後氷中で急冷した。そこに、１０倍濃度緩衝液、ｄＮ
ＴＰ混合液を各々2.５μｌ、標識ｄＣＴＰを５μｌ加
え、蒸留水で２４μｌとし、クレノウフラグメント１μ
ｌを加えて３７℃で３時間インキュベートした。酵素を
失活させたあと、９５℃で３分間加熱し、氷中で急冷し
て熱変性させ、全量をハイブリダイゼーションに用い
た。
【０１０６】サザンハイブリダイゼーションは、マニア
ティス（Maniatis) ら編、モレキュラー クローニン
グ，ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Clonin
g, a Laboratory Manual) 、第９章、第３１〜５８頁
〔コールド スプリング ハーバー（Cold Spring Harb
or) 社、１９８９年刊〕に記載の方法に従って行った。
すなわち、それぞれのＤＮＡ試料について１％アガロー
スゲル電気泳動を行い、泳動後、アルカリ変性を行いナ
イロンメンブラン〔ハイボンド−Ｎ（Hybond-N）、アマ
シャム社製〕に一晩サザンブロットした。紫外線トラン
スイルミネーター（２５４nm）に５分間照射させ、ＤＮ
Ａを固定した。このメンブランをプレハイブリダイゼー
ション緩衝液（５×デンハーツ液、６×ＳＳＣ、0.１％
ＳＤＳ、１０μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）５ml中で５０
℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。プロ
ーブを加え、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行
った。ハイブリダイゼーションの後、メンブランを２×
ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳを含む洗浄液で室温１０分間２回
洗浄し、続いて同じ洗浄液で５０℃、３０分間で２回洗
浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ線フイルム（コ
ダック社製）を入れたカセット内で−８０℃一晩感光さ
せ、オートラジオグラフィーをとった。形質転換を行っ
ていないＷＳ株（１）、ｐＡＸ３０１を導入した形質転
換体（２）、ｐＡＸ３０２を導入した形質転換体
（３）、ベクターpBI-H1-35S-IG のみを導入した形質転
換体（４）について、サザンハイブリダイゼーションに
より検出されたシグナルのパターンを比較した。
（２）、（３）両方には、（１）〜（４）共通の内在性
のシグナルのほかに、Hind IIIで切断したサンプルでは
約１kbp 、ＰｓｔＩで切断したサンプルでは約３kbp の
位置に特異的なシグナルが観察され、エンド型ＸＧ転移
酵素をコードするＤＮＡが（２）、（３）両方に組込ま
れていることが確認された。また、Hind IIIで切断した
サンプルでは、（２）では約１０kbp の、（３）では約
２０kbp の位置に特異的なシグナルが観察された。
（４）については、（１）と同様なパターンのシグナル
が得られた。
【０１０７】６−５ ＲＮＡ抽出とノザンハイブリダイ
ゼーション ６−４と同様の方法で、ハイグロマイシンＢ耐性株３０
株の地上部を切り取り、1.８ｇの植物組織を得た。オリ
ゴテックスｄＴ−３０による操作を除いて、実施例２−
と同様の方法で約５００μｇのＲＮＡを調製した。ノ
ザンハイブリダイゼーション用のプローブを、以下の方
法で作成した。前出のプライマーＡＴＸ−Ｓの５′末端
をメガラベルキット（宝酒造社製）を用いて32Ｐにより
標識し、一方、プライマーＡＴＳ−Ｓの５′末端をビオ
チンにより標識した。この２種のプライマーを用い、実
施例４−（２）で得られた約1.３kbp のｃＤＮＡを鋳型
として実施例６−１と同様の条件でＰＣＲを行い、反応
液にアビジンビーズ〔ダイナル（ＤＹＮＡＬ）社製〕を
加えて、ＰＣＲ産物を回収した。ＰＣＲ産物を熱変性さ
せ、アビジンビーズを回収すると、５′末端を32Ｐによ
り標識されている方のＤＮＡが溶液中に遊離する。実施
例４に記載の方法と同様の方法によりこのＤＮＡの塩基
配列を確認し、センスＤＮＡ配列を有するプローブとし
た。同様に、５′末端を32Ｐで標識したＡＴＳ−Ｓと
５′末端をビオチンで標識したＡＴＸ−Ｓを用いて上記
と同様の操作を行い、アンチセンスＤＮＡ配列を有する
プローブを作成した。
【０１０８】ノザンハイブリダイゼーションは、前出の
モレキュラー クローニング第７章第３９〜５２頁に記
載の方法に従い、以下の方法で行った。すなわち、抽出
したＲＮＡ全量を、ホルムアルデヒド・ランニングアガ
ロースゲル（１％）で電気泳動した後、酢酸アンモニウ
ム溶液中で中和し、ナイロンメンブラン（ハイボンド−
Ｎ）に一晩ノザンブロットした。紫外線トランスイルミ
ネーター（２５４nm）に５分間照射させ、ＲＮＡを固定
した。このメンブランをプレハイブリダイゼーション緩
衝液〔５０％ホルムアルデヒド、0.６５Ｍ ＮａＣｌ、
0.１Ｍ Ｎａ−Pipes(ｐＨ6.８）、５×デンハーツ液、
0.１％ＳＤＳ、５mMＥＤＴＡ、１００μｇ／mlサケ精子
ＤＮＡ〕２０ml中で４２℃、３時間プレハイブリダイゼ
ーションを行った。上述の方法で調製した32Ｐ標識プロ
ーブをハイブリダイゼーション緩衝液〔５０％ホルムア
ルデヒド、0.６５Ｍ ＮａＣｌ、0.１Ｍ Ｎａ−Pipes
(ｐＨ6.８）、５×デンハーツ液、0.１％ＳＤＳ、５mM
ＥＤＴＡ、１０％硫酸デキストラン〕２０mlに加え、
このプローブ溶液にプレハイブリダイゼーションを行っ
たメンブランを移し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーションの後、メンブラ
ンを２×ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳを含む洗浄液で５０℃、
１０分間４回洗浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ
線フイルム（コダック社製）を入れたカセット内で−８
０℃で一晩感光させ、オートラジオグラフィーをとっ
た。センスＤＮＡ配列を有するプローブを用いた場合、
前出の（１）、（３）、（４）にはシグナルは認められ
なかったが、（２）には約１kbp のバンドが検出され、
エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生
成していることが示された。一方、アンチセンスＤＮＡ
配列を有するプローブを用いた場合、（１）〜（４）す
べてに約１kbp のバンドが検出された。そのうち（３）
では、バンドのシグナルが（１）と比較して強く検出さ
れたが、反対に（２）ではシグナルが弱く検出された。
すなわち、ｐＡＸ３０２を導入することにより、エンド
型ＸＧ転移酵素の発現は転写レベルで増強され、一方、
ｐＡＸ３０１を導入することにより、転写レベルで抑制
されていることが示された。
【０１０９】実施例７ タバコの形質転換体の作成 ７−１ プラスミドｐＴＸ３０１、ｐＴＸ３０２の構築 配列表の配列番号１８に示したトマトのエンド型ＸＧ転
移酵素遺伝子の配列に基づいて、４種類のプライマー、
ＴＯＭＸＳＰ、ＴＯＭＸＡＰ、ＴＯＭＳＡＰ、ＴＯＭＳ
ＳＰをデザインし、合成した。それぞれの配列を配列表
の配列番号２４、２５、２６、２７に示す。ＴＯＭＸＳ
Ｐ及びＴＯＭＳＳＰはそれぞれ配列表の配列番号１８の
塩基番号４６〜６６に対応する５′→３′の向きに相当
する配列の５′側に制限酵素ＸｂａＩ若しくはＳａｃＩ
の切断部位を付加したもの、ＴＯＭＳＡＰ、ＴＯＭＸＡ
Ｐはそれぞれ塩基番号９２１〜９４１に対応する３′→
５′の向きに相当する配列の５′側に制限酵素ＳａｃＩ
若しくはＸｂａＩの切断部位を付加したものである。鋳
型として、実施例４−（３）で得られたｃＤＮＡ約１ng
（１μｌ）を0.５ml用チューブにとり、ジーンアンプTM
キット中の１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ、1.２５mMｄＮ
ＴＰ混合液１６μｌ、アンプリタックTMＤＮＡポリメラ
ーゼ2.５Ｕ、及び0.１μｇ／μｌのプライマーＴＯＭＸ
ＳＰ及びＴＯＭＳＡＰそれぞれ１μｌに滅菌蒸留水を加
えて１００μｌとし、ミネラルオイルを添加してＰＣＲ
に供した。反応条件は９４℃（３０秒）、３７℃（２
分）、７２℃（１分）のサイクルを２５回繰返した。プ
ライマーＴＯＭＳＳＰ及びＴＯＭＸＡＰを用いた場合に
も、同じ条件でＰＣＲを行った。反応終了後、反応液を
各々エタノール沈殿により濃縮し、ＸｂａＩ、ＳａｃＩ
で切断後、それぞれ精製し、バイナリーベクターpBI-H1
-35S-IG の制限酵素ＸｂａＩサイトからＳａｃＩサイト
の部位にサブクローニングした。プライマーのＴＯＭＸ
ＳＰ及びＴＯＭＳＡＰの対を用いて増幅されたＤＮＡ断
片を挿入したプラスミドをｐＴＸ３０１と命名し、プラ
イマーＴＯＭＳＳＰ、及びＴＯＭＸＡＰの対を用いて増
幅されたＤＮＡ断片を挿入したプラスミドをｐＴＸ３０
２と命名した。
【０１１０】なお、ｐＴＸ３０１を用いて形質転換され
た大腸菌ＪＭ１０９株は、Escherichia coli JM109/pTX
301 と命名、表示され、微工研菌寄第１３３３０号（Ｆ
ＥＲＭＰ−１３３３０）として寄託され、ｐＴＸ３０２
を用いて形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、Escher
ichia coli JM109/pTX302 と命名、表示され、微工研菌
寄第１３３３１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３１）として
寄託されている。
【０１１１】７−２ ｐＴＸ３０１、ｐＴＸ３０２のア
グロバクテリウムへの導入 実施例６−２と同様の方法でｐＴＸ３０１及びｐＴＸ３
０２各々２０ngを用いてアグロバクテリウム チュメフ
ァシエンス LBA4404株を形質転換した。また、コントロ
ールとしてpBI-H1-35S-IG のみを用いてアグロバクテリ
ウム チュメファシエンス LBA4404株を形質転換した。
各々の形質転換体を純化し、それぞれの形質転換体を L
BA4404／pTX301株、 LBA4404／pTX302株、 LBA4404／pB
I-H1-35S-IG 株と命名した。
【０１１２】７−３ 形質転換植物の作成 タバコへの導入は、リーフディスク法で行った。すなわ
ち、まず無菌的に生育させたタバコＳＲ−１株の葉を取
り、滅菌したメスで葉脈を含むように約１cm平方のリー
フディスクを作った。実施例７−２で得られた LBA4404
／pTX301株、 LBA4404／pTX302株、 LBA4404／pBI-H1-3
5S-IG 株をＬＢ培地で一晩培養したもの２００μｌをム
ラシゲ−スクーグ（ＭＳ）培地５mlの入った滅菌シャー
レに加え、滅菌ピンセットでリーフディスクを１０枚移
した。シャーレを回すように混ぜた後、水分が蒸発しな
いようにパラフイルムでシールし、２８℃暗所で３日間
静置し、共存培養した。その後、ＭＳ培地２０mlの入っ
たシャーレにリーフディスクを移し、シャーレを回すよ
うにして過剰なアグロバクテリウムを洗い除いた。この
操作を３回繰返し、ペーパータオルで過剰な水分を除い
た後、葉の表面を下にして、カナマイシン−ハイグロマ
イシン−カルベニシリンを含み、植物ホルモンとして0.
２μｌ／mlの１−ナフタレン酢酸、１μｌ／mlのベンジ
ルアデニンを含む固形ＭＳ培地に載せ、２６℃、１２時
間明所、１２時間暗所のサイクルで、植物インキュベー
ター CFH-300（トミー精工社製）中で培養した。４週間
後、カミソリでカルス部分をできるだけ除き、出現した
茎葉をディスクから切り離し、カナマイシン−ハイグロ
マイシン−カルベニシリンを含むＭＳ培地にさし、同じ
条件で培養した。２週間後発根した植物体をピートモス
・バーミキュライト３：２の土に移植し、植物インキュ
ベーター中で生育させた。
【０１１３】７−４ ＤＮＡ抽出とサザンハイブリダイ
ゼーション ７−３で生育した植物体の葉の組織をメスで切り取り、
６−４と同様にしてゲノムＤＮＡを調製した。１０μｇ
のゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで完全に消化した
後、１％アガロースゲルで電気泳動し、更に６−４と同
様にサザンハイブリダイゼーションに供した。ハイブリ
ダイゼーション用のプローブは、実施例７−１で増幅
し、精製した、約９３０bpのＤＮＡ断片を６−４と同様
の方法で32Ｐにより標識して作成したものを用いた。そ
の結果、ｐＴＸ３０１、及びｐＴＸ３０２を導入したタ
バコでは、コントロールとしてpBI-H1-35S-IG を導入し
たタバコ及び形質転換を行っていないタバコと比べて、
タバコのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子と考えられるバン
ドのほかにバンドが現われ、あるいは他のバンドと明ら
かに異なる強いシグナルのバンドが検出された。このこ
とより、ｐＴＸ３０１及びｐＴＸ３０２を導入したタバ
コには、トマトエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の配列が導
入されていることが確認された。
【０１１４】７−５ ＲＮＡ抽出とノザンハイブリダイ
ゼーション ７−３で生育した植物体の葉の組織をメスで切り取り、
６−５と同様の方法でＲＮＡを調製した。６−５と同様
の方法により、ノザンハイブリダイゼーション用のプロ
ーブを作成した。すなわち、５′末端を32Ｐ標識したＴ
ＯＭＸＳＰと、５′末端をビオチン標識したＴＯＭＳＡ
ＰによりセンスＤＮＡ配列を有するプローブを、５′末
端を32Ｐ標識したＴＯＭＳＡＰと５′末端をビオチン標
識したプライマーＴＯＭＸＳＰを用いてアンチセンスＤ
ＮＡ配列を有するプローブをそれぞれ作成した。６−５
に記載の方法と同様にして、ノザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。その結果、センスＤＮＡ配列を有するプ
ローブを用いた場合、pBI-H1-35S-IG及びｐＴＸ３０１
を導入したタバコ及び形質転換を行っていないタバコで
はバンドは認められなかったが、ｐＴＸ３０２を導入し
たタバコでは相応するバンドが確認された。一方、アン
チセンスＤＮＡ配列を有するプローブを用いた場合、pB
I-H1-35S-IG を導入したタバコ及び形質転換を行ってい
ないタバコでは相応するバンドが得られ、ｐＴＸ３０１
を導入したタバコでは更に強いバンドが認められた。ｐ
ＴＸ３０２を導入したタバコでは、かすかにしかバンド
は認められなかった。このことより、ｐＴＸ３０１を導
入することによりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のｍＲＮ
Ａの量が増加していることが確認され、その結果エンド
型ＸＧ転移酵素の発現が増強されていることが確認され
た。またｐＴＸ３０２を導入することにより、エンド型
ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成されて
おり、その結果、内因性のエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子
の発現が抑制されていることが確認された。
【０１１５】
【発明の効果】本発明により、植物細胞壁の成長の機構
において重要な意義をもつ、ＸＧ分子の転移反応に関与
するエンド型ＸＧ転移酵素及び該酵素をコードする遺伝
子が提供される。またエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のク
ローニング方法、エンド型ＸＧ転移酵素の遺伝子組換体
による製造方法、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチ
センスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡが提供され、更に
エンド型ＸＧ転移酵素の発現の調節方法、植物体の形態
制御方法、ＸＧ分子の転移方法が提供される。
【０１１６】
【配列表】
【０１１７】配列番号：1 配列の長さ：1133 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源：生物名：ビグナ アンギュラリス(Vigna angular
is) 配列： TTTTTTTTTT AACCAGTATA AACTAGTAGT ATTACTAGTA TATTGATTCA GAGTGAAACA 60 GAATTACAGA TACAAATTAA GGCACAGAGC CATATCTGGT ACATAGCCAA ACAGTAGCAG 120 CAATAAATGA TGATATGATT ATCAACAATA CAGGAAGCAA TAGCAAGCTC AAATGAAATC 180 TGTATCAGCA CTTAGGTGGG AACTTTATGG GAGTGTGATA TTGAAAATAA TGAGGCCTTA 240 AAGTATAGGT TAAAATGATT AAATGTCACG GTCTCTGGTG CACTCTGGAG GGACTTGAGA 300 GTAGCGTTTG CGATCAGTGC AGTAGTTGTA GATGGTGTAT TTGTTGCGTA CCCAAGCCAG 360 TTTTTGCCAC TGAGCAGCAT CAAGGTCACG AAACTCTGGT TGATCCCACC ACCTCTTGCC 420 TTGTGTGTCA CAGAACTTGG CATTCACTGA GGCCTCACAC CCATCAATGT GGAAGCCCTT 480 GTAAGAGGCT ATGAAGGGGG CTTTGGACCA ATCTGTTTTC TCCAAACCAC CCCTTGTAGC 540 CCAGTCATCT GCATTCCACA AACTGTTGTA TATTTTCATT GGTTGATTGA AGGGGAACTT 600 CACTCCCAAG TCATTGCTGT TCTTGAACAC CCTTATTGGG TAGTCATCCA CATAGAATAC 660 AATCTGGTAC ATGTTCCATA GCACTGAATA TCTGTGGTAT TGAGTCGTAG GGTCAAACCA 720 GAGGTAGATT CTCTGCTCTC TGTCACCTTT GCCTCCGGTG AACACATTTG TTTGTAAAAT 780 GTATGGTTGC CCAGTTCTGT TTCCCAAGAA CTCGAAGTCT ATTTCATCAT GTTCTGCGTT 840 TGTGGACGAT AAATAGAAAG CAGTGACTGT GCCAGCTGAA TCACCAGGAA CCAATTTTAT 900 GTACATGCTG AAGTGACCAA ACAAGTATGA CCCTTTGGAC TGGAATCCAG TACCAGTGTA 960 CTTATCGAGA TGAAGCTGAA TCTCAGAACC TCCATTGAGA TATTTGATAT GATCAAAGGC 1020 CCAAGTAGGC ACATAGTTTC TGCCAAATGG TACATCAATT GGAGTTCTTG GGTTGGCAGC 1080 GAAAGAAGCA GAAGCCAGTG ATAACAGAAT CAGACAAGTC CACAAAGAAG AAC 1133
【０１１８】配列番号：2 配列の長さ：957 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源： 生物名：ダイズ(Glycine max) 配列： TGAAAAGAGA AGCAACAATA ATAAAGTGAA TGAGAAATTT AAATATCACG GACTAAAATA 60 TCTATTCACT CGAAATTTAA ATGTCACGGT CTCTTTTGCA CTCAGGAGGA GAGATATGAG 120 GATAGCGTTT AGTGTCAGTG CAGTAGTTGT AGATGGTGTA TTTCTGGCGC ACCCATCTGA 180 GCCTACGCCA CTGGGCGGCG TCAAGGTCAC GGAACTCAGG CTGGTCCCAC CACCTCTTGC 240 CCTGCGTGTC GCAGAACTTG GCGTTCACCG AAGCCTCGCA CCCGTCGATG TGAAACCCCT 300 TGTACGCTGC TATGAAGGGT GCTTTCGACC AATCCGTTTT CTCCAAACCA CCCCTCGTTG 360 CCCAGTCATC AGCGTTCCAC AAACTGTTGT AGATCTTCAT TGGCTGGTCG AATGGGAATT 420 TCACTCCCAA GTCCTTGCTG TTCTTGAACA CCCTGATTGG CACCTCGTCC ACAAAGAACA 480 CAATCTGATA CAAGTTCCAG AGAATGGAGT ATCTGTGGTA TTCTTTCGTG GGATCAAACC 540 AGAGATAGAT TCTTTGCTCT CTATCACCCT TGCCTCCGGT GAACACATTT GTTTGCAGAA 600 TGTAAGGTTG TCCTGTTCTG TTCCCCAAGA ACTCAAAGTC TATCTCATCA TGCTCCGCGT 660 TTTGGGAAGA TAAATAGAAA GCAGTGACTG TGCCAGCAGA ATCTCCAGGA ACCATCTTTA 720 TGTACATGCT GAAGTGACCA AACAAGTAAG ACCCTTTGGA CTGGAAGCCA GTACCAGTGT 780 ACTTGTCAAG ATGAAGCTGA ATGTCAGAAC CACCATTGAA ATATTTGATG TGATCAAAGG 840 CCCATGTGGG CACGTAGTTT CGGCCAAATT GTACATCCAC TGGCCTGCGT GGGTTGGCAC 900 AGAGTGCTGC AGAGGCCAGT GATGCCAAAA TCACACACAC CGTCCACACA GAAAAAA 957
【０１１９】配列番号：3 配列の長さ：1320 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源： 生物名：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) 配列： TTTTTTTTTT TTTTTTATGA AAATACATAG CTAATCAATA CATATATGAA TTATAACATG 60 TAATTTTAGG CCCAAATATA GCATAAACAT CATGGGCCAA CAAACAATAC ATATATCAAT 120 CTCTTGAACA AGCATAATTC AAATAATAAT GATAGCATAA ATTCATTAAA ACCCTCAAGA 180 GTAGTAACTT ATGCGTCTCT GTCCCTTTTA CATTCAGCTG GCATAACCGG GAACCTAGTC 240 CGGTCGGTAC AGTAGTTGTA GATGGTCCAC TTCATACGAA CCCATTTGAG ACGACGCCAT 300 TGTTCAGCGT CAAGGTCACG GAACTCTTTC TGATCCCACC ACATGCGGCC TTGTGTGGCA 360 CAGTACTTGG CTTCCACAGA AGCTTGGCAA CCATCTATGT GGAATCCTTT GTAAGATGCA 420 ACGAAAGGTG CATTGGCCCA ATTGGTCTTC TCTAAACCGC CTCTCGTGGC CCAATCATCC 480 GCGTTCCAAA GGCTTGAGTA AAGCTTCATT GGTTGGTTGA ATGGGAAACG TACTCCTAGA 540 TCCTTAGCAT TCTTGAACGT TCGGATTGGT ATGTTGTCAA CAAAGAATAC GATCTGGTAC 600 ATGTTCCAAA GGATTGAGTA AGTGTGATAA GCCTTAGAAG GATCAAACCA GAGATAGATT 660 CGTTGTTCTC TGTTTCCCTT TCCTCCTGTG AATACATTTG TCTGTAATAT AGCTGGTTGT 720 CCTGTTCTGT TTCCAAGGAA CTCAAAGTCT ATCTCGTCAT GCTCATTGTT GGTAGATGAT 780 AGATAGAAAG CTGTGACAAC TCCGGCTGTG TCACCAGCTG GAAGCTTTAT GTGCATACTA 840 AAATGTCCAA ACAAATATGA CCCCTTTGAT TGAAATCCTG TGCCAGTGTA TTTGTCGAGG 900 ATAAGCTGAA GTTCGGAACC GCCATTGAAC TGTTTCTGGT GGTCAAAAGC CCAAGTTGGG 960 ACGTAGTTAC GACCAAATGG TACATCAATG GCCTTGCGTG GAGGAATAGC CATTACCATT 1020 GTTGAAGAAA CCATTAGAAA GAGAGCCATG AGAGCCCATG GAGATGAAGA AACAGTCATG 1080 GGTGGGTTTA TTATATGATG ATGATAGTCT CCAAGCTATC CTGGATCTGA CAGCTGACTG 1140 GACTCCAGCA GAGAGAGAGA TGCTAAGGAA CAAAGTCCCA GTTACTGGCT TAAAGACTCC 1200 TTTTAGGGAT GGTTTGTTAA AGCATGTCGC TGAAGATGTC CCTGAAACTC GCAAAGGATG 1260 GTTTAGAGCG CAGAGGCTAC AAGGAAGCGG TTTCTTGAAC GCAGTCGATG AAGTGGTCAT 1320
【０１２０】配列番号：4 配列の長さ：1128 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源： 生物名：トマト(Lycopersicon esculentum) 配列： GAGACATGAA AGGCCTGGCA TGAGATACAT AATATCCTCA TGACTCCACC AATAATGATA 60 CACTCAAAAA GAATTAGGGA AATACAGCTC AATTAAAAGC ACTTTGTTTT AAGGATCATT 120 AAAATACTCA CACATAAAGC ATATTAAGTT TTTTTTCTTC ATAAAGTCCC TCTTAATTTT 180 GATTATGATT TTAAATATCT CTGTCCTTAG TGCACTCTGG TGGTGGAACA GGGTACCTCG 240 CTTTATCAGT GCAATAGTTA TAAACAGTGT ATTTTTGACG AACCCAACGA AGTCTCCTAT 300 ACTGTAATGC ATCTAAATCT TGGAAGGCCT TTTGATCCCA CCATTTCATG CCTTTAGTGT 360 TACAAACTTG GACTTCTTGT GGCGTGGCAG CTTCACATCC ATCCACGTGG AACGATGTGT 420 ATGACGCGGT GAATGGGGCG TTGGCCCAAT TGGTTTTCTC AAGCCCACCT CTTGTGGCCC 480 AATCATCTGC GTCCCATAGA CTCGAGTATA TCTTCATGGG CTGATTGAAT GGAAATTTCA 540 CACCAAGATC TTTCGAATTT TTGAATGCTC TAATTGGAAC GTCGTCCACA AAGATCACAA 600 TGAGGTATGT ATTCCAAAGA ACAGAATAAG AATGGTAGCC CTTGGTTGGA TCAAACCAAA 660 GATATATTCT CTGTTCTCTG TTTCCTTTTC CTCCTGTGAA TACATTTGTC TGCAATATGT 720 ATGGCTGCCC AGTTCTGTTC CCCAAAAATT CAAAATCTAT CTCATCGTGC TCTGCATTAT 780 TCGATGACAG GTAAAATGCA GTGACAACAC CAGCTGAGTC TCCACCAACA AGCCTCATTT 840 TCATACTGAA ATGCCCAAAC AGATATGATT TCTTTGACTG AAATCCAGCT CCTGAAGATC 900 TGTCGAGAAT AAGATCAGTA GTGGTACCAC CATTGAGGAA CTTAATATGG TGACTAGCCC 960 AACTTGGCTC ATAGTTTTTC CAAAAGGGCA CATCTACTGG CCTTCTAGGA TACCCACAAA 1020 ATACAACAAG TGACAAATTA ATCAAAACAA TACTAAATAA AACTCCTTTT ATGATACCCA 1080 TGGTGAGAAA AACAAATCCA ATCAGAGACC AGTGTTTGTG TATTTTTC 1128
【０１２１】配列番号：5 配列の長さ：872 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源： 生物名：コムギ (Triticum aestivum) 配列： AGCGGTCGTG GTCGGTGCAG TAGTTGTAGA TGGTGTGCTC CTTCCTGACC CAGGCGAGGC 60 GGCGGTACTG CGCGGCGTCC AGGTCCTGGA ACTCGGGCTG GTCCCACCAG CGGGCGCCCT 120 GGGTGGCGCA GAACTTGGCC TCCGCGGACG CCTCGCAGCC GTCGACGTGG AAGCCCCGGT 180 AGGAGGCGAC GAAGGGCGCC TTGGACCAGT CCGTCTTCTC CCGCCCGCCC CGGGTCGCCC 240 AGTCGTCCGC GTTCCACAGG CTGGAGTAGA GCTTCATGGG CTGGTCGAAC GGGTACCGCA 300 CCCCGAGGTC CTTGCTGTTC TTGAACACCC GGATCGGCGT GTCGTCCACG AAGAACGCGA 360 TCATGTAGAG GTTCCAGAGG ACGGAGTAGG AGTGGTAGTC CTTGGTTGGG TCGAACCAGA 420 GGTAGATCCT CTGCTCCCGG TCGCCCTTGC CGCCGGAGAA CACGTTGGTC TGCAGGATGT 480 ACGGCTGCCC CGTCCTGTTC CCCAAGAACT CGAAGTCGAT CTCGTCGTGC TCCGAGTTCT 540 GTGACGACAG GTAGAAGGCG GTGACGGTGC CGGCGGAGTC GCCGCCGACG AGCTTGATGT 600 GCATGCTGAA GTGGCCGAAG AGGTAGGAGC CCCGGGTCTG GAAGCCCGTG CCGGTGGTCT 660 TGTCCAGGGA CAGCTGCACC TCCCGCCCGC CGTTCACGTA GTGGATGTGG TCCTGCGCCC 720 ACGTCGGCAC GTAGTTCTTG TCGAACGGCA CGTCCACCGG CTTCCGGGGC GCTGCCGCCA 780 CGCCGCGTAG CAGCACCGCC GCCACCACGG CGAGGAGGGC CCCCGCGGTC GCCTTCATTT 840 CGCCGGCCGG CCTCTCTTCC TCCTTCTCTG TT 872
【０１２２】配列番号：6 配列の長さ：1133 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源：生物名：ビグナ アンギュラリス(Vigna angular
is) 配列： UUUUUUUUUU AACCAGUAUA AACUAGUAGU AUUACUAGUA UAUUGAUUCA GAGUGAAACA 60 GAAUUACAGA UACAAAUUAA GGCACAGAGC CAUAUCUGGU ACAUAGCCAA ACAGUAGCAG 120 CAAUAAAUGA UGAUAUGAUU AUCAACAAUA CAGGAAGCAA UAGCAAGCUC AAAUGAAAUC 180 UGUAUCAGCA CUUAGGUGGG AACUUUAUGG GAGUGUGAUA UUGAAAAUAA UGAGGCCUUA 240 AAGUAUAGGU UAAAAUGAUU AAAUGUCACG GUCUCUGGUG CACUCUGGAG GGACUUGAGA 300 GUAGCGUUUG CGAUCAGUGC AGUAGUUGUA GAUGGUGUAU UUGUUGCGUA CCCAAGCCAG 360 UUUUUGCCAC UGAGCAGCAU CAAGGUCACG AAACUCUGGU UGAUCCCACC ACCUCUUGCC 420 UUGUGUGUCA CAGAACUUGG CAUUCACUGA GGCCUCACAC CCAUCAAUGU GGAAGCCCUU 480 GUAAGAGGCU AUGAAGGGGG CUUUGGACCA AUCUGUUUUC UCCAAACCAC CCCUUGUAGC 540 CCAGUCAUCU GCAUUCCACA AACUGUUGUA UAUUUUCAUU GGUUGAUUGA AGGGGAACUU 600 CACUCCCAAG UCAUUGCUGU UCUUGAACAC CCUUAUUGGG UAGUCAUCCA CAUAGAAUAC 660 AAUCUGGUAC AUGUUCCAUA GCACUGAAUA UCUGUGGUAU UGAGUCGUAG GGUCAAACCA 720 GAGGUAGAUU CUCUGCUCUC UGUCACCUUU GCCUCCGGUG AACACAUUUG UUUGUAAAAU 780 GUAUGGUUGC CCAGUUCUGU UUCCCAAGAA CUCGAAGUCU AUUUCAUCAU GUUCUGCGUU 840 UGUGGACGAU AAAUAGAAAG CAGUGACUGU GCCAGCUGAA UCACCAGGAA CCAAUUUUAU 900 GUACAUGCUG AAGUGACCAA ACAAGUAUGA CCCUUUGGAC UGGAAUCCAG UACCAGUGUA 960 CUUAUCGAGA UGAAGCUGAA UCUCAGAACC UCCAUUGAGA UAUUUGAUAU GAUCAAAGGC 1020 CCAAGUAGGC ACAUAGUUUC UGCCAAAUGG UACAUCAAUU GGAGUUCUUG GGUUGGCAGC 1080 GAAAGAAGCA GAAGCCAGUG AUAACAGAAU CAGACAAGUC CACAAAGAAG AAC 1133
【０１２３】配列番号：7 配列の長さ：957 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源： 生物名：ダイズ(Glycine max) 配列： UGAAAAGAGA AGCAACAAUA AUAAAGUGAA UGAGAAAUUU AAAUAUCACG GACUAAAAUA 60 UCUAUUCACU CGAAAUUUAA AUGUCACGGU CUCUUUUGCA CUCAGGAGGA GAGAUAUGAG 120 GAUAGCGUUU AGUGUCAGUG CAGUAGUUGU AGAUGGUGUA UUUCUGGCGC ACCCAUCUGA 180 GCCUACGCCA CUGGGCGGCG UCAAGGUCAC GGAACUCAGG CUGGUCCCAC CACCUCUUGC 240 CCUGCGUGUC GCAGAACUUG GCGUUCACCG AAGCCUCGCA CCCGUCGAUG UGAAACCCCU 300 UGUACGCUGC UAUGAAGGGU GCUUUCGACC AAUCCGUUUU CUCCAAACCA CCCCUCGUUG 360 CCCAGUCAUC AGCGUUCCAC AAACUGUUGU AGAUCUUCAU UGGCUGGUCG AAUGGGAAUU 420 UCACUCCCAA GUCCUUGCUG UUCUUGAACA CCCUGAUUGG CACCUCGUCC ACAAAGAACA 480 CAAUCUGAUA CAAGUUCCAG AGAAUGGAGU AUCUGUGGUA UUCUUUCGUG GGAUCAAACC 540 AGAGAUAGAU UCUUUGCUCU CUAUCACCCU UGCCUCCGGU GAACACAUUU GUUUGCAGAA 600 UGUAAGGUUG UCCUGUUCUG UUCCCCAAGA ACUCAAAGUC UAUCUCAUCA UGCUCCGCGU 660 UUUGGGAAGA UAAAUAGAAA GCAGUGACUG UGCCAGCAGA AUCUCCAGGA ACCAUCUUUA 720 UGUACAUGCU GAAGUGACCA AACAAGUAAG ACCCUUUGGA CUGGAAGCCA GUACCAGUGU 780 ACUUGUCAAG AUGAAGCUGA AUGUCAGAAC CACCAUUGAA AUAUUUGAUG UGAUCAAAGG 840 CCCAUGUGGG CACGUAGUUU CGGCCAAAUU GUACAUCCAC UGGCCUGCGU GGGUUGGCAC 900 AGAGUGCUGC AGAGGCCAGU GAUGCCAAAA UCACACACAC CGUCCACACA GAAAAAA 957
【０１２４】配列番号：8 配列の長さ：1320 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源： 生物名：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) 配列： UUUUUUUUUU UUUUUUAUGA AAAUACAUAG CUAAUCAAUA CAUAUAUGAA UUAUAACAUG 60 UAAUUUUAGG CCCAAAUAUA GCAUAAACAU CAUGGGCCAA CAAACAAUAC AUAUAUCAAU 120 CUCUUGAACA AGCAUAAUUC AAAUAAUAAU GAUAGCAUAA AUUCAUUAAA ACCCUCAAGA 180 GUAGUAACUU AUGCGUCUCU GUCCCUUUUA CAUUCAGCUG GCAUAACCGG GAACCUAGUC 240 CGGUCGGUAC AGUAGUUGUA GAUGGUCCAC UUCAUACGAA CCCAUUUGAG ACGACGCCAU 300 UGUUCAGCGU CAAGGUCACG GAACUCUUUC UGAUCCCACC ACAUGCGGCC UUGUGUGGCA 360 CAGUACUUGG CUUCCACAGA AGCUUGGCAA CCAUCUAUGU GGAAUCCUUU GUAAGAUGCA 420 ACGAAAGGUG CAUUGGCCCA AUUGGUCUUC UCUAAACCGC CUCUCGUGGC CCAAUCAUCC 480 GCGUUCCAAA GGCUUGAGUA AAGCUUCAUU GGUUGGUUGA AUGGGAAACG UACUCCUAGA 540 UCCUUAGCAU UCUUGAACGU UCGGAUUGGU AUGUUGUCAA CAAAGAAUAC GAUCUGGUAC 600 AUGUUCCAAA GGAUUGAGUA AGUGUGAUAA GCCUUAGAAG GAUCAAACCA GAGAUAGAUU 660 CGUUGUUCUC UGUUUCCCUU UCCUCCUGUG AAUACAUUUG UCUGUAAUAU AGCUGGUUGU 720 CCUGUUCUGU UUCCAAGGAA CUCAAAGUCU AUCUCGUCAU GCUCAUUGUU GGUAGAUGAU 780 AGAUAGAAAG CUGUGACAAC UCCGGCUGUG UCACCAGCUG GAAGCUUUAU GUGCAUACUA 840 AAAUGUCCAA ACAAAUAUGA CCCCUUUGAU UGAAAUCCUG UGCCAGUGUA UUUGUCGAGG 900 AUAAGCUGAA GUUCGGAACC GCCAUUGAAC UGUUUCUGGU GGUCAAAAGC CCAAGUUGGG 960 ACGUAGUUAC GACCAAAUGG UACAUCAAUG GCCUUGCGUG GAGGAAUAGC CAUUACCAUU 1020 GUUGAAGAAA CCAUUAGAAA GAGAGCCAUG AGAGCCCAUG GAGAUGAAGA AACAGUCAUG 1080 GGUGGGUUUA UUAUAUGAUG AUGAUAGUCU CCAAGCUAUC CUGGAUCUGA CAGCUGACUG 1140 GACUCCAGCA GAGAGAGAGA UGCUAAGGAA CAAAGUCCCA GUUACUGGCU UAAAGACUCC 1200 UUUUAGGGAU GGUUUGUUAA AGCAUGUCGC UGAAGAUGUC CCUGAAACUC GCAAAGGAUG 1260 GUUUAGAGCG CAGAGGCUAC AAGGAAGCGG UUUCUUGAAC GCAGUCGAUG AAGUGGUCAU 1320
【０１２５】配列番号：9 配列の長さ：1128 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源： 生物名：トマト(Lycopersicon esculentum) 配列： GAGACAUGAA AGGCCUGGCA UGAGAUACAU AAUAUCCUCA UGACUCCACC AAUAAUGAUA 60 CACUCAAAAA GAAUUAGGGA AAUACAGCUC AAUUAAAAGC ACUUUGUUUU AAGGAUCAUU 120 AAAAUACUCA CACAUAAAGC AUAUUAAGUU UUUUUUCUUC AUAAAGUCCC UCUUAAUUUU 180 GAUUAUGAUU UUAAAUAUCU CUGUCCUUAG UGCACUCUGG UGGUGGAACA GGGUACCUCG 240 CUUUAUCAGU GCAAUAGUUA UAAACAGUGU AUUUUUGACG AACCCAACGA AGUCUCCUAU 300 ACUGUAAUGC AUCUAAAUCU UGGAAGGCCU UUUGAUCCCA CCAUUUCAUG CCUUUAGUGU 360 UACAAACUUG GACUUCUUGU GGCGUGGCAG CUUCACAUCC AUCCACGUGG AACGAUGUGU 420 AUGACGCGGU GAAUGGGGCG UUGGCCCAAU UGGUUUUCUC AAGCCCACCU CUUGUGGCCC 480 AAUCAUCUGC GUCCCAUAGA CUCGAGUAUA UCUUCAUGGG CUGAUUGAAU GGAAAUUUCA 540 CACCAAGAUC UUUCGAAUUU UUGAAUGCUC UAAUUGGAAC GUCGUCCACA AAGAUCACAA 600 UGAGGUAUGU AUUCCAAAGA ACAGAAUAAG AAUGGUAGCC CUUGGUUGGA UCAAACCAAA 660 GAUAUAUUCU CUGUUCUCUG UUUCCUUUUC CUCCUGUGAA UACAUUUGUC UGCAAUAUGU 720 AUGGCUGCCC AGUUCUGUUC CCCAAAAAUU CAAAAUCUAU CUCAUCGUGC UCUGCAUUAU 780 UCGAUGACAG GUAAAAUGCA GUGACAACAC CAGCUGAGUC UCCACCAACA AGCCUCAUUU 840 UCAUACUGAA AUGCCCAAAC AGAUAUGAUU UCUUUGACUG AAAUCCAGCU CCUGAAGAUC 900 UGUCGAGAAU AAGAUCAGUA GUGGUACCAC CAUUGAGGAA CUUAAUAUGG UGACUAGCCC 960 AACUUGGCUC AUAGUUUUUC CAAAAGGGCA CAUCUACUGG CCUUCUAGGA UACCCACAAA 1020 AUACAACAAG UGACAAAUUA AUCAAAACAA UACUAAAUAA AACUCCUUUU AUGAUACCCA 1080 UGGUGAGAAA AACAAAUCCA AUCAGAGACC AGUGUUUGUG UAUUUUUC 1128
【０１２６】配列番号：10 配列の長さ：872 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源： 生物名：コムギ (Triticum aestivum) 配列： AGCGGUCGUG GUCGGUGCAG UAGUUGUAGA UGGUGUGCUC CUUCCUGACC CAGGCGAGGC 60 GGCGGUACUG CGCGGCGUCC AGGUCCUGGA ACUCGGGCUG GUCCCACCAG CGGGCGCCCU 120 GGGUGGCGCA GAACUUGGCC UCCGCGGACG CCUCGCAGCC GUCGACGUGG AAGCCCCGGU 180 AGGAGGCGAC GAAGGGCGCC UUGGACCAGU CCGUCUUCUC CCGCCCGCCC CGGGUCGCCC 240 AGUCGUCCGC GUUCCACAGG CUGGAGUAGA GCUUCAUGGG CUGGUCGAAC GGGUACCGCA 300 CCCCGAGGUC CUUGCUGUUC UUGAACACCC GGAUCGGCGU GUCGUCCACG AAGAACGCGA 360 UCAUGUAGAG GUUCCAGAGG ACGGAGUAGG AGUGGUAGUC CUUGGUUGGG UCGAACCAGA 420 GGUAGAUCCU CUGCUCCCGG UCGCCCUUGC CGCCGGAGAA CACGUUGGUC UGCAGGAUGU 480 ACGGCUGCCC CGUCCUGUUC CCCAAGAACU CGAAGUCGAU CUCGUCGUGC UCCGAGUUCU 540 GUGACGACAG GUAGAAGGCG GUGACGGUGC CGGCGGAGUC GCCGCCGACG AGCUUGAUGU 600 GCAUGCUGAA GUGGCCGAAG AGGUAGGAGC CCCGGGUCUG GAAGCCCGUG CCGGUGGUCU 660 UGUCCAGGGA CAGCUGCACC UCCCGCCCGC CGUUCACGUA GUGGAUGUGG UCCUGCGCCC 720 ACGUCGGCAC GUAGUUCUUG UCGAACGGCA CGUCCACCGG CUUCCGGGGC GCUGCCGCCA 780 CGCCGCGUAG CAGCACCGCC GCCACCACGG CGAGGAGGGC CCCCGCGGUC GCCUUCAUUU 840 CGCCGGCCGG CCUCUCUUCC UCCUUCUCUG UU 872
【０１２７】配列番号：11 配列の長さ：30 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端部分フラグメント 起源： 生物名：ビグナ アンギュラリス(Vigna angularis) 配列： Ala Asn Pro Arg Thr Pro Ile Asp Val Pro Phe Gly Arg Asn Tyr 1 5 10 15 Val Pro Thr Trp Ala Phe Asp His Ile Lys Tyr Leu Asn Gly Gly 20 25 30
【０１２８】配列番号：12 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATCGAYGTGC CGTTYGGGMG NAAYTAYGT 29
【０１２９】配列番号：13 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCGACGTGGG CGTTYGAYCA YATHAARTA 29
【０１３０】配列番号：14 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTTTTCCCAG TCACGACTTT TTTTTTTTTT TTTTTTT 37
【０１３１】配列番号：15 配列の長さ：1133 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源：生物名：ビグナ アンギュラリス(Vigna angular
is) 配列： GTTCTTCTTT GTGGACTTGT CTGATTCTGT TATCACTGGC TTCTGCTTCT TTCGCTGCCA 60 ACCCAAGAAC TCCAATTGAT GTACCATTTG GCAGAAACTA TGTGCCTACT TGGGCCTTTG 120 ATCATATCAA ATATCTCAAT GGAGGTTCTG AGATTCAGCT TCATCTCGAT AAGTACACTG 180 GTACTGGATT CCAGTCCAAA GGGTCATACT TGTTTGGTCA CTTCAGCATG TACATAAAAT 240 TGGTTCCTGG TGATTCAGCT GGCACAGTCA CTGCTTTCTA TTTATCGTCC ACAAACGCAG 300 AACATGATGA AATAGACTTC GAGTTCTTGG GAAACAGAAC TGGGCAACCA TACATTTTAC 360 AAACAAATGT GTTCACCGGA GGCAAAGGTG ACAGAGAGCA GAGAATCTAC CTCTGGTTTG 420 ACCCTACGAC TCAATACCAC AGATATTCAG TGCTATGGAA CATGTACCAG ATTGTATTCT 480 ATGTGGATGA CTACCCAATA AGGGTGTTCA AGAACAGCAA TGACTTGGGA GTGAAGTTCC 540 CCTTCAATCA ACCAATGAAA ATATACAACA GTTTGTGGAA TGCAGATGAC TGGGCTACAA 600 GGGGTGGTTT GGAGAAAACA GATTGGTCCA AAGCCCCCTT CATAGCCTCT TACAAGGGCT 660 TCCACATTGA TGGGTGTGAG GCCTCAGTGA ATGCCAAGTT CTGTGACACA CAAGGCAAGA 720 GGTGGTGGGA TCAACCAGAG TTTCGTGACC TTGATGCTGC TCAGTGGCAA AAACTGGCTT 780 GGGTACGCAA CAAATACACC ATCTACAACT ACTGCACTGA TCGCAAACGC TACTCTCAAG 840 TCCCTCCAGA GTGCACCAGA GACCGTGACA TTTAATCATT TTAACCTATA CTTTAAGGCC 900 TCATTATTTT CAATATCACA CTCCCATAAA GTTCCCACCT AAGTGCTGAT ACAGATTTCA 960 TTTGAGCTTG CTATTGCTTC CTGTATTGTT GATAATCATA TCATCATTTA TTGCTGCTAC 1020 TGTTTGGCTA TGTACCAGAT ATGGCTCTGT GCCTTAATTT GTATCTGTAA TTCTGTTTCA 1080 CTCTGAATCA ATATACTAGT AATACTACTA GTTTATACTG GTTAAAAAAA AAA 1133
【０１３２】配列番号：16 配列の長さ：957 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ダイズ(Glycine max) 配列： TTTTTTCTGT GTGGACGGTG TGTGTGATTT TGGCATCACT GGCCTCTGCA GCACTCTGTG 60 CCAACCCACG CAGGCCAGTG GATGTACAAT TTGGCCGAAA CTACGTGCCC ACATGGGCCT 120 TTGATCACAT CAAATATTTC AATGGTGGTT CTGACATTCA GCTTCATCTT GACAAGTACA 180 CTGGTACTGG CTTCCAGTCC AAAGGGTCTT ACTTGTTTGG TCACTTCAGC ATGTACATAA 240 AGATGGTTCC TGGAGATTCT GCTGGCACAG TCACTGCTTT CTATTTATCT TCCCAAAACG 300 CGGAGCATGA TGAGATAGAC TTTGAGTTCT TGGGGAACAG AACAGGACAA CCTTACATTC 360 TGCAAACAAA TGTGTTCACC GGAGGCAAGG GTGATAGAGA GCAAAGAATC TATCTCTGGT 420 TTGATCCCAC GAAAGAATAC CACAGATACT CCATTCTCTG GAACTTGTAT CAGATTGTGT 480 TCTTTGTGGA CGAGGTGCCA ATCAGGGTGT TCAAGAACAG CAAGGACTTG GGAGTGAAAT 540 TCCCATTCGA CCAGCCAATG AAGATCTACA ACAGTTTGTG GAACGCTGAT GACTGGGCAA 600 CGAGGGGTGG TTTGGAGAAA ACGGATTGGT CGAAAGCACC CTTCATAGCA GCGTACAAGG 660 GGTTTCACAT CGACGGGTGC GAGGCTTCGG TGAACGCCAA GTTCTGCGAC ACGCAGGGCA 720 AGAGGTGGTG GGACCAGCCT GAGTTCCGTG ACCTTGACGC CGCCCAGTGG CGTAGGCTCA 780 GATGGGTGCG CCAGAAATAC ACCATCTACA ACTACTGCAC TGACACTAAA CGCTATCCTC 840 ATATCTCTCC TCCTGAGTGC AAAAGAGACC GTGACATTTA AATTTCGAGT GAATAGATAT 900 TTTAGTCCGT GATATTTAAA TTTCTCATTC ACTTTATTAT TGTTGCTTCT CTTTTCA 957
【０１３３】配列番号：17 配列の長さ：1320 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) 配列： ATGACCACTT CATCGACTGC GTTCAAGAAA CCGCTTCCTT GTAGCCTCTG CGCTCTAAAC 60 CATCCTTTGC GAGTTTCAGG GACATCTTCA GCGACATGCT TTAACAAACC ATCCCTAAAA 120 GGAGTCTTTA AGCCAGTAAC TGGGACTTTG TTCCTTAGCA TCTCTCTCTC TGCTGGAGTC 180 CAGTCAGCTG TCAGATCCAG GATAGCTTGG AGACTATCAT CATCATATAA TAAACCCACC 240 CATGACTGTT TCTTCATCTC CATGGGCTCT CATGGCTCTC TTTCTAATGG TTTCTTCAAC 300 AATGGTAATG GCTATTCCTC CACGCAAGGC CATTGATGTA CCATTTGGTC GTAACTACGT 360 CCCAACTTGG GCTTTTGACC ACCAGAAACA GTTCAATGGC GGTTCCGAAC TTCAGCTTAT 420 CCTCGACAAA TACACTGGCA CAGGATTTCA ATCAAAGGGG TCATATTTGT TTGGACATTT 480 TAGTATGCAC ATAAAGCTTC CAGCTGGTGA CACAGCCGGA GTTGTCACAG CTTTCTATCT 540 ATCATCTACC AACAATGAGC ATGACGAGAT AGACTTTGAG TTCCTTGGAA ACAGAACAGG 600 ACAACCAGCT ATATTACAGA CAAATGTATT CACAGGAGGA AAGGGAAACA GAGAACAACG 660 AATCTATCTC TGGTTTGATC CTTCTAAGGC TTATCACACT TACTCAATCC TTTGGAACAT 720 GTACCAGATC GTATTCTTTG TTGACAACAT ACCAATCCGA ACGTTCAAGA ATGCTAAGGA 780 TCTAGGAGTA CGTTTCCCAT TCAACCAACC AATGAAGCTT TACTCAAGCC TTTGGAACGC 840 GGATGATTGG GCCACGAGAG GCGGTTTAGA GAAGACCAAT TGGGCCAATG CACCTTTCGT 900 TGCATCTTAC AAAGGATTCC ACATAGATGG TTGCCAAGCT TCTGTGGAAG CCAAGTACTG 960 TGCCACACAA GGCCGCATGT GGTGGGATCA GAAAGAGTTC CGTGACCTTG ACGCTGAACA 1020 ATGGCGTCGT CTCAAATGGG TTCGTATGAA GTGGACCATC TACAACTACT GTACCGACCG 1080 GACTAGGTTC CCGGTTATGC CAGCTGAATG TAAAAGGGAC AGAGACGCAT AAGTTACTAC 1140 TCTTGAGGGT TTTAATGAAT TTATGCTATC ATTATTATTT GAATTATGCT TGTTCAAGAG 1200 ATTGATATAT GTATTGTTTG TTGGCCCATG ATGTTTATGC TATATTTGGG CCTAAAATTA 1260 CATGTTATAA TTCATATATG TATTGATTAG CTATGTATTT TCATAAAAAA AAAAAAAAAA 1320
【０１３４】配列番号：18 配列の長さ：1128 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：トマト(Lycopersicon esculentum) 配列： GAAAAATACA CAAACACTGG TCTCTGATTG GATTTGTTTT TCTCACCATG GGTATCATAA 60 AAGGAGTTTT ATTTAGTATT GTTTTGATTA ATTTGTCACT TGTTGTATTT TGTGGGTATC 120 CTAGAAGGCC AGTAGATGTG CCCTTTTGGA AAAACTATGA GCCAAGTTGG GCTAGTCACC 180 ATATTAAGTT CCTCAATGGT GGTACCACTA CTGATCTTAT TCTCGACAGA TCTTCAGGAG 240 CTGGATTTCA GTCAAAGAAA TCATATCTGT TTGGGCATTT CAGTATGAAA ATGAGGCTTG 300 TTGGTGGAGA CTCAGCTGGT GTTGTCACTG CATTTTACCT GTCATCGAAT AATGCAGAGC 360 ACGATGAGAT AGATTTTGAA TTTTTGGGGA ACAGAACTGG GCAGCCATAC ATATTGCAGA 420 CAAATGTATT CACAGGAGGA AAAGGAAACA GAGAACAGAG AATATATCTT TGGTTTGATC 480 CAACCAAGGG CTACCATTCT TATTCTGTTC TTTGGAATAC ATACCTCATT GTGATCTTTG 540 TGGACGACGT TCCAATTAGA GCATTCAAAA ATTCGAAAGA TCTTGGTGTG AAATTTCCAT 600 TCAATCAGCC CATGAAGATA TACTCGAGTC TATGGGACGC AGATGATTGG GCCACAAGAG 660 GTGGGCTTGA GAAAACCAAT TGGGCCAACG CCCCATTCAC CGCGTCATAC ACATCGTTCC 720 ACGTGGATGG ATGTGAAGCT GCCACGCCAC AAGAAGTCCA AGTTTGTAAC ACTAAAGGCA 780 TGAAATGGTG GGATCAAAAG GCCTTCCAAG ATTTAGATGC ATTACAGTAT AGGAGACTTC 840 GTTGGGTTCG TCAAAAATAC ACTGTTTATA ACTATTGCAC TGATAAAGCG AGGTACCCTG 900 TTCCACCACC AGAGTGCACT AAGGACAGAG ATATTTAAAA TCATAATCAA AATTAAGAGG 960 GACTTTATGA AGAAAAAAAA CTTAATATGC TTTATGTGTG AGTATTTTAA TGATCCTTAA 1020 AACAAAGTGC TTTTAATTGA GCTGTATTTC CCTAATTCTT TTTGAGTGTA TCATTATTGG 1080 TGGAGTCATG AGGATATTAT GTATCTCATG CCAGGCCTTT CATGTCTC 1128
【０１３５】配列番号：19 配列の長さ：872 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：コムギ (Triticum aestivum) 配列： AACAGAGAAG GAGGAAGAGA GGCCGGCCGG CGAAATGAAG GCGACCGCGG GGGCCCTCCT 60 CGCCGTGGTG GCGGCGGTGC TGCTACGCGG CGTGGCGGCA GCGCCCCGGA AGCCGGTGGA 120 CGTGCCGTTC GACAAGAACT ACGTGCCGAC GTGGGCGCAG GACCACATCC ACTACGTGAA 180 CGGCGGGCGG GAGGTGCAGC TGTCCCTGGA CAAGACCACC GGCACGGGCT TCCAGACCCG 240 GGGCTCCTAC CTCTTCGGCC ACTTCAGCAT GCACATCAAG CTCGTCGGCG GCGACTCCGC 300 CGGCACCGTC ACCGCCTTCT ACCTGTCGTC ACAGAACTCG GAGCACGACG AGATCGACTT 360 CGAGTTCTTG GGGAACAGGA CGGGGCAGCC GTACATCCTG CAGACCAACG TGTTCTCCGG 420 CGGCAAGGGC GACCGGGAGC AGAGGATCTA CCTCTGGTTC GACCCAACCA AGGACTACCA 480 CTCCTACTCC GTCCTCTGGA ACCTCTACAT GATCGCGTTC TTCGTGGACG ACACGCCGAT 540 CCGGGTGTTC AAGAACAGCA AGGACCTCGG GGTGCGGTAC CCGTTCGACC AGCCCATGAA 600 GCTCTACTCC AGCCTGTGGA ACGCGGACGA CTGGGCGACC CGGGGCGGGC GGGAGAAGAC 660 GGACTGGTCC AAGGCGCCCT TCGTCGCCTC CTACCGGGGC TTCCACGTCG ACGGCTGCGA 720 GGCGTCCGCG GAGGCCAAGT TCTGCGCCAC CCAGGGCGCC CGCTGGTGGG ACCAGCCCGA 780 GTTCCAGGAC CTGGACGCCG CGCAGTACCG CCGCCTCGCC TGGGTCAGGA AGGAGCACAC 840 CATCTACAAC TACTGCACCG ACCACGACCG CT 872
【０１３６】配列番号：20 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTATTCTAGA CATGTAATTT TAGGCCC 27
【０１３７】配列番号：21 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGCTGAGCTC TTTCTAATGG TTTCTTC 27
【０１３８】配列番号：22 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGCTTCTAGA TTTCTAATGG TTTCTTC 27
【０１３９】配列番号：23 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGCTGAGCTC CATGTAATTT TAGGCCC 27
【０１４０】配列番号：24 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTTTCTAGAC CATGGGTATC ATAAAAGGAG 30
【０１４１】配列番号：25 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTGGAGCTCA TTTTAAATAT CTCTGTCCTT 30
【０１４２】配列番号：26 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTTGAGCTCC CATGGGTATC ATAAAAGGAG 30
【０１４３】配列番号：27 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTGTCTAGAA TTTTAAATAT CTCTGTCCTT 30
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺
伝子断片の一例の制限酵素地図を示す図である。
【図２】本発明のエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺
伝子断片の一例の制限酵素地図を示す図である。
【図３】本発明のエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺
伝子断片の一例の制限酵素地図を示す図である。
【図４】本発明のエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺
伝子断片の一例の制限酵素地図を示す図である。
【図５】本発明のエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺
伝子断片の一例の制限酵素地図を示す図である。
【図６】エンド型ＸＧ転移酵素によるＸＧ分子の転移酵
素反応をＰＡＤにより測定した際のクロマトグラフを示
す図である。
【図７】エンド型ＸＧ転移酵素によるＸＧ分子の転移酵
素の反応を蛍光光度計を用いて測定した際のグラフを示
す図である。
【図８】エンド型ＸＧ転移酵素の活性と基質の分子量の
関係を示す図である。
【図９】エンド型ＸＧ転移酵素と変性したエンド型ＸＧ
転移酵素をＸＧと反応させた際の反応生成物のプロトン
ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１０】エンド型ＸＧ転移酵素によるＸＧ７−ＰＡの
細胞壁への転移反応を蛍光光度計を用いて測定した際の
グラフを示す図である。
【図１１】ビグナ アンギュラリスのエンド型ＸＧ転移
酵素の活性とｐＨの関係を示す図である。
【図１２】ビグナ アンギュラリスのエンド型ＸＧ転移
酵素の活性と温度の関係を示す図である。
【図１３】ビグナ アンギュラリスのエンド型ＸＧ転移
酵素の反応の生成物をＰＡＤにより測定したクロマトグ
ラフを示す図である。
【図１４】プラスミドpVX110の構築工程を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/82 Ｃ１２Ｐ 19/18 7432−4Ｂ (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 エンド型キシログルカン転移酵素遺伝
    子。
  2. 【請求項２】 図面の図１〜図５に示す制限酵素地図で
    それぞれ表される請求項１に記載のエンド型キシログル
    カン転移酵素遺伝子。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の遺伝子にハイブリダイ
    ズ可能なエンド型キシログルカン転移酵素遺伝子。
  4. 【請求項４】 請求項２又は請求項３に記載の遺伝子又
    はその一部をプローブとして用いることを特徴とするエ
    ンド型キシログルカン転移酵素遺伝子のクローニング方
    法。
  5. 【請求項５】 エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子
    のアンチセンスＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 配列表の配列番号１〜５でそれぞれ表さ
    れる請求項５に記載のアンチセンスＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載のアンチセンスＤＮＡが
    少なくとも１５塩基以上の配列より成るアンチセンスＤ
    ＮＡ。
  8. 【請求項８】 エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子
    のアンチセンスＲＮＡ。
  9. 【請求項９】 配列表の配列番号６〜１０でそれぞれ表
    される請求項８に記載のアンチセンスＲＮＡ。
  10. 【請求項１０】 請求項８に記載のアンチセンスＲＮＡ
    が少なくとも１５塩基以上の配列より成るアンチセンス
    ＲＮＡ。
  11. 【請求項１１】 エンド型キシログルカン転移酵素遺伝
    子より得られる少なくとも１５塩基対からなるＤＮＡ配
    列を、転写によりエンド型キシログルカン転移酵素遺伝
    子のアンチセンスＲＮＡが生成するように、細胞内で作
    用しうるプロモーターに連結したことを特徴とするアン
    チセンスＲＮＡ生成用カセット。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のアンチセンスＲＮ
    Ａ生成用カセットを生物体に導入することを特徴とする
    エンド型キシログルカン転移酵素の発現の制御方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のアンチセンスＲＮ
    Ａ生成用カセットを植物体に導入し、エンド型キシログ
    ルカン転移酵素の発現を制御することを特徴とする植物
    体の形態の制御方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載のアンチセンスＲＮ
    Ａ生成用カセットを導入した植物体。
  15. 【請求項１５】 エンド型キシログルカン転移酵素が発
    現されるようにエンド型キシログルカン転移酵素遺伝子
    を細胞内で作用しうるプロモーターに連結したことを特
    徴とするエンド型キシログルカン転移酵素発現用カセッ
    ト。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載のエンド型キシログ
    ルカン転移酵素発現用カセットを生物体に導入すること
    を特徴とするエンド型キシログルカン転移酵素の発現方
    法。
  17. 【請求項１７】 請求項１５に記載のエンド型キシログ
    ルカン転移酵素発現用カセットを植物体に導入すること
    を特徴とする植物体の形態の制御方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１５に記載のエンド型キシログ
    ルカン転移酵素発現用カセットを導入した植物体。
  19. 【請求項１９】 請求項１に記載のエンド型キシログル
    カン転移酵素遺伝子を導入して形質転換した生物又は細
    胞を培養し、該培養物からエンド型キシログルカン転移
    酵素を採取することを特徴とするエンド型キシログルカ
    ン転移酵素の製造方法。
  20. 【請求項２０】 エンド型キシログルカン転移酵素。
  21. 【請求項２１】 下記の理化学的性質を有する、エンド
    型キシログルカン転移酵素。 （１）作 用：キシログルカン分子内のＤ−グルコース
    間の結合を切断して、生じたキシログルカン分子断片の
    還元末端を他のキシログルカン分子の非還元末端のＤ−
    グルコースに結合する。 （２）基質特異性：キシログルカンに対して特異的に作
    用する。 （３）至適ｐＨ：至適ｐＨはｐＨ5.８付近である。 （４）至適温度：至適温度は３０℃付近である。 （５）分子量：分子量は約３3,０００である（ＳＤＳ−
    ポリアクリルアミドゲル電気泳動）。
  22. 【請求項２２】 エンド型キシログルカン転移酵素を用
    いて、キシログルカン分子内のＤ−グルコース間の結合
    を切断して、生じたキシログルカン分子断片の還元末端
    を他のキシログルカン分子の非還元末端のＤ−グルコー
    スに結合させることを特徴とするキシログルカン分子の
    転移方法。
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