JPH0686676A - ウイルスの複製を防止する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 肝炎ウイルスゲノムのポリメラーゼ遺伝子領
域に相補的なアンチセンスＲＮＡをコード化するＤＮＡ
を細胞中に導入することによってその細胞内での肝炎ウ
イルスの複製を阻害する方法、並びに該方法に利用され
る組換えＤＮＡ分子、ベクター及び形質転換細胞を提供
する。 【効果】 上記方法により、肝炎ウイルスに感染した細
胞中での肝炎ウイルスの複製が阻害されるので、本発明
は肝炎ウイルス感染症の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はウイルス性疾患の予防お
よび治療に関する。

【０００２】

【従来の技術とその課題】ウイルス感染の結果はウイル
スと宿主の両方のいくつかの因子に依存する。病理発生
に影響を及ぼすこれらの因子には感染性ウイルス粒子の
数、感受性細胞へのそれらの経路、ウイルスの増殖速度
および蔓延速度、細胞機能に対するそのウイルスの効
果、細胞損傷に対する宿主の二次的応答、およびその宿
主の免疫学的および非特異的防御が含まれる。一般にウ
イルス感染の効果には急性の臨床的疾患、無症候性感
染、様々な癌の誘発、および慢性の進行性神経系障害が
含まれる。１細胞で生産されたウイルス粒子は他の細胞
に侵入することができ、それによって蔓延する感染をも
たらすので、ウイルスは強力な感染性の病原物質であ
る。ウイルスは侵入した細胞に重要な機能的変化を引き
起こし、これがしばしばその細胞を死に至らしめる。

【０００３】ウイルス感染は現在も世界中で主要な医学
的課題となっている。例えば急性および慢性の肝炎ウイ
ルス感染およびその続発症は主要な課題の一つである。
実際、世界中でおそらく４億人の人々が現在Ｂ型肝炎ウ
イルスに感染している。この設定下では、急性および劇
症肝炎、ならびにこのウイルスの慢性キャリアー(保有
者)のままである個体における硬変、慢性活動性肝炎お
よび肝細胞癌腫の最終的な発生を含む慢性肝臓疾患の危
険が高い。

【０００４】ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)の劇的な効
果はウイルス性疾患の結果のもう１つの例である。現在
米国ではＡＩＤＳの診断例が２７７００例以上あり、米
国公衆衛生局は１９９１年の終わりまでに１７９０００
人以上がこの疾患に罹るであろうと予測している。した
がって、ＨＩＶ用の診断手段やワクチンの開発を目指し
て活発な医学的研究が行われている。ＡＩＤＳと肝炎は
ウイルス感染が引き起こす様々な疾患の２例に過ぎな
い。

【０００５】現在、ウイルスの複製を停止させ他の細胞
へのウイルスの蔓延を防止するための方法が求められて
いる。しかしながら、この目的の達成にはかなりの困難
が伴う。主な課題の１つは宿主細胞を傷つけることなく
ウイルスを抑制するという課題である。ウイルス増殖の
細胞遺伝子に対する依存性が弁別的な攻撃点を制限して
いる。最も大きいウイルスでさえ、ウイルス自身が有す
る生化学的反応であって宿主の細胞との関連で独自性の
あるものはかなり少ない。さらに、ウイルス感染が明ら
かになるのは大量のウイルス増殖と細胞変化が起こった
後に限られる。したがってほとんどの一般的制御法は予
防である。治療はほとんどの場合、その損傷が後に修復
されるという条件下でいくらかの未感染細胞の殺傷が許
容され得る状況に限られる。

【０００６】抗ウイルス療法のもう１つの重要な限界は
耐性突然変異体の出現である。それらの選択を避けるた
めには、細菌に関して有効な原理(妥当な投与量、複数
薬剤治療および明確に示されない限り治療を避けるこ
と)をウイルスにも同等に適用することができる。した
がって、ウイルス感染の危険な性質および感染性ウイル
スの性質が提供する障害ゆえに、ウイルスの複製を制御
する方法が差し迫って必要とされている。ＲＮＡウイル
スおよびＤＮＡウイルスに適用可能な方法は広範囲にわ
たる適用可能性を有するであろう。

【０００７】Ｂ型肝炎ウイルスの複製機序についての記
述は、Seegerら,Science 232:477-484(1986)；Khudyako
vら,FEBS Letters 243:115-118(1989)；Willら,J.of Vi
rol.61:904-911(1987);Hirschら,Nature 344:552-555(1
990)に認めることができる。また、レトロウイルスおよ
びレトロウイルス組込みについては、Varmus,H.,Scienc
e 240:1427-1435(1988)；Grandgenettら,Cell 60:3-4(1
990)に議論されている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】ウイルスのポリメラーゼ
遺伝子の特定の領域に少なくとも１つの突然変異を導入
することによって、ウイルスポリメラーゼを含有するウ
イルスの複製の完全かつ不可逆的な停止が達成される。
この突然変異型遺伝子または突然変異型遺伝子産物(Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質)をそのウイルスに供給
することによって欠陥のある複製をもたらすことができ
る。この方法はウイルス性疾患の予防と治療に有効であ
る。本発明の方法によって、ポリメラーゼ遺伝子産物を
複製に利用するＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを
共に抑制することができる。

【０００９】添付の図面について説明する。図１ ：Ｈｕｈ７肝癌細胞中で突然変異型ＨＢＶゲノム５
-１５が効率的に転写される。 １０％ＦＢＳを補足したＭＥＭ培地中でＨｕｈ７細胞(N
akabayashi,H.ら,Cancer Res.42:3858-3863(1982))を生
育させた。約９０％全面成長に達した時に、リン酸カル
シウム法(Chen,C.ら,Mol Cell.Biol.7:2745-2752(198
7))を用いて、この細胞をクローン化ＤＮＡ(２０μｇ／
１００mmディッシュ)でトランスフェクトした。使用し
たＨＢＶ ＤＮＡは不完全ゲノム１-８(陰性対照：表Ｉ
を参照のこと)、“野生型"ａｄｗの頭-尾型二量体および
突然変異型ウイルスゲノム５-１５の頭-尾型二量体であ
る。トランスフェクションの４８時間後、グアニジンイ
ソチオシアネート法(Sambrook,J.ら,Molecular clonin
g：A laboratory manual,第2版,Cold Spring Harbor,N
Y,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))を用い
て全ＲＮＡを細胞から調製し、ホルムアルドヒド１.２
５％アガロースゲル電気泳動によって分画し、Nytran膜
(Schleicher & Schuell,Keene,NH)に移し、ニックトラ
ンスレーションによって３２Ｐラベルした全長ＨＢＶ
ＤＮＡプローブとハイブリッド形成(ハイブリダイズ)さ
せた。オートラジオグラフィー暴露を−８０℃で１２時
間行った。

【００１０】図２：突然変異型ＨＢＶゲノム５-１５は
複製欠損性である。 図１の説明で記述したようにＨｕｈ７細胞を生育させ、
これをトランスフェクトした。トランスフェクションの
５日後に細胞培養培地を集め、ＮＰ４０中で細胞を溶解
した(Hirsch,R.ら,Virology 167:136-142(1988))。この
細胞溶解液を５００００ｘｇ(２０℃)で３０分間遠心分
離した。投入(インプット)ＤＮＡを消化するために、上
清にＤＮａｓｅ Ｉ(１μg／ml；Worthington)を加え
た。この溶液をショ糖クッション(３０％ショ糖、２０m
M Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、１００mM ＮａＣｌ、
０.１％ ２-メルカプトエタノール、０.１％ウシ血清ア
ルブミン)に重層し、１７８０００ｘｇ(４℃)で１２時
間遠心分離した。２０mM Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８)、１
０mM ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳの存在下でプロテイナーゼ
Ｋ(５００μg／ml)を用いてペレットを５５℃で３時間
消化した。フェノール抽出の後、核酸をエタノールで沈
殿させた。凍結乾燥の後、沈殿物を１０mM Ｔｒｉｓ-Ｈ
Ｃｌ(ｐＨ７.４)、１mM ＥＤＴＡ、１μｇ ＤＮＡａｓ
ｅ非含有ＲＮａｓｅ Ａ／mlに溶解し、１.２５％アガロ
ースゲル電気泳動で分画し、Nytran膜に移し、ニックト
ランスレーションで３２Ｐラベルした全長ＨＢＶ ＤＮ
Ａプローブにハイブリダイズさせた。１００mmディッシ
ュ１枚から得られる細胞質ＤＮＡを各レーンに適用し
た。オートラジオグラフィー暴露を−８０℃で４時間行
った。

【００１１】図３：ＨＢＶ突然変異体５-１５の複製欠
損性の原因となるＤＮＡ配列はヌクレオチド位置２６０
６(Ａｐａ１)と２８２３(ＢｓｔＥII)の間に位置する。 “野生型"ａｄｗの頭-尾型二量体(ａｄｗ ＨＴＤ、ｐＧ
ＥＭ-７のＥｃｏＲＩ部位中にクローニングしたもの)を
ＡａｔII(１４１９)およびＤｒａＩ(２１８６)断片とし
てサブクローニングすることにより、複製能を有する先
端欠失型構築物ａｄｗ Ｒ９を得た。ａｄｗ Ｒ９と突然
変異型ＨＢＶゲノム５-１５の特定の領域を交換するこ
とにより、表示のサブクローンを得た。黒く塗り潰した
領域はａｄｗ Ｒ９中へのＨＢＶ５-１５挿入を表す。こ
れらの構築物の複製能力を図２の説明に記述したように
して分析した。

【００１２】図４：ヌクレオチド２７９８はＨＢＶ Ｄ
ＮＡの複製能力にとって極めて重要である。 図１の説明に記述してようにＨｕｈ７細胞を生育させ、
これをトランスフェクトした。感染の５日後に細胞培養
培地を集め、細胞をＮＰ４０中で溶解した(Hirschら,Vi
rology 167:136-142(1988))。培地を５００００ｘｇ(２
０℃)で３０分間遠心分離した。その上清を１０mM Ｍｇ
Ｃｌ₂にした。インプットＤＮＡを消化するためにＤＮ
ａｓｅ Ｉ(１μｇ／ml；Worthington)を添加した後、そ
の溶液をショ糖クッションに重層し、図２の説明に記述
したように処理した。１００mmディッシュ１枚から得ら
れる細胞培養培地(１０ml)に相当する量を各レーンに適
用した。オートラジオグラフィー暴露を−８０℃で１２
時間行った。複製性ＨＢＶＤＮＡに関して陰性を示す細
胞培養培地はすべてそれぞれの細胞溶解液調製物中でも
陰性であった(非開示データ)。各構築物の構造とＤＮＡ
配列をそれぞれ図３および表２に示す。

【００１３】ウイルスの複製を停止させるための方法お
よび組成物を提供する。本法にはポリメラーゼ反応の開
始に必要な欠陥タンパク質が関与する。この必須タンパ
ク質をコード化するポリメラーゼ遺伝子領域に特定の変
化を導入することができる。この突然変異はそのウイル
スの複製の完全かつ不可逆的な停止をもたらす。さら
に、この欠陥タンパク質をウイルスに供給することによ
り、正常なウイルス複製を中断させることができる。

【００１４】ポリメラーゼ遺伝子のある領域中に突然変
異を導入または挿入することによって、欠陥タンパク質
の生産がもたらされる。この欠陥タンパク質は複製のた
めのプライマーとして作用するのでウイルスの複製にと
って必須であるとの仮説を立てているが、これに限定さ
れるわけではない。しかし、この欠陥タンパク質はＲＮ
ＡおよびＤＮＡポリメラーゼによる転写をプライムする
ことができない。あるいは、この欠陥タンパク質がプレ
ゲノムＲＮＡの包膜化を許さないのかもしれない(Hirsc
hら,Nature 344:552-555(1990))。本抑制法にはウイル
ス複製の他の側面も関与し得るので、その特許性は提案
されるいかなる機構にも属さないことを注記しておく。

【００１５】ウイルス複製の詳細な細部はウイルス間で
異なるものの、その機構のある側面は共通している。例
えば、レトロウイルスについて最初に記述されたＲＮＡ
依存性ＤＮＡ合成は、現在では他の様々な設定下におけ
る遺伝情報の転移の手段であろうと認識されている。こ
れには肝炎ウイルスおよびカリフラワーモザイクウイル
スの複製が含まれる。一本鎖ＲＮＡ鋳型から二本鎖ＤＮ
Ａを合成するためには、ＲＮＡ鋳型から第１ＤＮＡ鎖を
合成してその第１ＤＮＡ鎖から第２ＤＮＡ鎖を合成する
ための酵素、これらの２本の鎖のそれぞれについてのプ
ライマー、および第２ＤＮＡ鎖の合成を可能にすべく逆
転写後にＲＮＡ鋳型を除去するための手段が必要であ
る。

【００１６】本発明の目的のために、ウイルス複製にお
けるポリメラーゼ遺伝子産物の役割に注目する。ポリメ
ラーゼ遺伝子中に特定の変化を導入することによって、
そのウイルスの複製を効果的に停止させることができ
る。したがってＲＮＡウイルスとＤＮＡウイルスの両
方、具体的にはＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼのため
に転写をプライムするべくポリメラーゼ遺伝子産物を利
用するウイルスに、本法を適用することができる。本発
明の方法の対象となるウイルスには、肝炎ウイルスなど
のヘパドナウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイル
ス、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、オルトミク
ソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ペ
スチウイルス、フラビウイルス、ＨＩＶなどのレトロウ
イルスが含まれる。

【００１７】本法にはポリメラーゼ遺伝子のある領域へ
の突然変異の導入が含まれる。“突然変異の導入"とは遺
伝子中のヌクレオチドの置換、欠失、または付加(好ま
しくは置換)を意味する。突然変異を挿入するための領
域を数種の方法で同定することができる。様々なウイル
ス株のポリメラーゼ遺伝子またはポリメラーゼ遺伝子産
物間で保存されているアミノ酸位置を比較することによ
って、この領域を同定することができる。例えば種々の
ＨＢＶ株のポリメラーゼ遺伝子を比較したところ、アミ
ノ酸位置１６４が高度に保存されていることがわかった
(表１を参照のこと)。残基１６４に対応するヌクレオチ
ド２７９８に単一の点突然変異を導入したところ、ウイ
ルスの複製を中断させる欠陥タンパク質が生産された。

【００１８】この方法で、他のウイルスのポリメラーゼ
遺伝子領域を重要なアミノ酸位置について精査すること
ができる。これらの位置に突然変異を挿入し、得られた
遺伝子産物をウイルス複製に対する効果について試験す
ることができる。もう１つの方法は、ＲＮＡウイルスお
よびＤＮＡウイルスのポリメラーゼ遺伝子中に無作為に
突然変異を導入することである。次いで、このような変
化によって得られたタンパク質をウイルスＤＮＡ複製に
対するそれらの効果について試験する。

【００１９】Ｂ型肝炎ウイルスを用いた研究から、ウイ
ルス複製の停止機構にはプレゲノムＲＮＡの包膜化に必
要なタンパク質あるいはポリメラーゼ反応の開始に必要
な結合性タンパク質の不完全な(欠陥のある)産出が関与
すると思われる。このタンパク質は、ＨＢＶを含むすべ
てのヘパドナウイルスの複製生活環において重要な段階
であるＤＮＡの(−)鎖の逆転写のためのプライマーとし
て機能する。このことは、ポリメラーゼ反応の開始に必
要なこのタンパク質中に突然変異を導入することによっ
てウイルスの複製を抑制し得ることを示している。ヘパ
ドナウイルスの場合、これには、プレゲノムＲＮＡの包
膜化および(−)鎖ＤＮＡの逆転写に必要なタンパク質中
に突然変異を導入することが含まれる。

【００２０】レトロウイルスの場合、逆転写酵素に付随
するＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレ
アーゼ活性であるリボヌクレアーゼＨ(ＲＮａｓｅ Ｈ)
によってポリプリン領域から生産されるウイルスＲＮＡ
オリゴマーによって第２鎖合成がプライムされる。リボ
ヌクレアーゼＨはレトロウイルスポリメラーゼ遺伝子の
タンパク質産物である。したがって、部位特異的突然変
異誘発法によってＲＮａｓｅ Ｈ遺伝子領域に突然変異
を誘発し、次いでウイルス複製に対するその欠陥タンパ
ク質産物の効果を試験することができる。

【００２１】突然変異誘発処理の方法は当該技術分野で
よく知られている。とりわけ部位特異的突然変異誘発法
を用いれば、標的タンパク質中のほとんどすべてのアミ
ノ酸位置を意のままに操作することができる。Smith,
M.,Ann.Rev.Genet.19:423(1985)(この文献は本明細書の
一部を構成する)を参照のこと。また、“PCR Technolog
y"(Stockton Press,New York(1989))の61-70頁のHiguch
i,R.,“Using PCR to Engineer DNA"をも参照のこと。

【００２２】ポリメラーゼ遺伝子中に突然変異を挿入す
るもう１つの手段は、ポリメラーゼ遺伝子の核酸断片を
構築することである。核酸合成法は知られている。一般
的事項については“Synthesis and Applications of DN
A and RNA"(Narang,S.編,Academic Press(1987))および
この本に引用されている文献を参照のこと。したがっ
て、そのウイルスの核酸配列あるいは少なくともそのウ
イルスのポリメラーゼ遺伝子の核酸配列がわかっている
場合には、合成構築物を作成することができる。この合
成構築物は天然の配列と比較して特定の部位に突然変異
または変化を含有するであろう。次に、発現したタンパ
ク質をウイルス複製に対するその効果について試験する
ことができる。

【００２３】数種のウイルスゲノムのヌクレオチド配列
が公表されている。例えば、ＨＩＶのヌクレオチド配列
はRatnerら,Nature 313:277-284(1985)に認められる。
肝炎ウイルスのヌクレオチド配列はOkamotoら,J.Gen.Vi
rol.69:2575-2583(1988)に認めることができ、ジェンバ
ンク(Genbank)を通して利用できる。

【００２４】同定した標的ポリメラーゼ遺伝子領域の突
然変異誘発処理後、ウイルスの複製に対するその突然変
異の効果を試験することができる。ウイルスの複製は、
複製産物またはウイルス転写物の存在を決定することに
よって検定できる。この方法で、細胞溶解液と細胞培養
培地をウイルス転写物、タンパク質、および複製型ウイ
ルスＤＮＡの存在について分析することができる。ウイ
ルスに特異的な転写物を検出するために、固相放射線免
疫検定法を用いて、ウイルスがコード化しているタンパ
ク質を細胞溶解液および培養培地の両方で同定すること
ができる。具体的には、突然変異型ウイルスで細胞をト
ランスフェクトした後、細胞質ＤＮＡのサザンブロット
ハイブリッド形成を用いて、突然変異型ウイルスゲノム
の複製能力を評価することができる。詳細については実
験項を参照のこと。またハイブリッド形成の詳細につい
ては“Nucleic Acid Hybridization.A Practical Appro
ach"(IRL Press,Washington,DC(1985))にも認められ
る。

【００２５】特定の突然変異型タンパク質が同定された
ら、それを用いていくつかの方法でウイルスの複製を停
止させることができる。この突然変異をＤＮＡ、ＲＮＡ
あるいはタンパク質レベルで供給することができる。

【００２６】欠陥タンパク質との接触はウイルスの複製
を中断させるので、欠損性の複製を達成するためにこの
タンパク質を投与することができる。より魅力的な方法
は、ウイルスに感染した宿主細胞あるいはウイルス感染
に対して感受性の宿主細胞中でこのタンパク質を発現さ
せることである。この方法として、その宿主細胞を形質
転換することができるベクター中に突然変異したポリメ
ラーゼ遺伝子またはポリメラーゼ遺伝子領域を入れるこ
とができる。組織特異的もしくは普遍的に発現させるの
に適したプロモーターの下流にこの遺伝子を置く。肝炎
の場合、ウイルスＤＮＡを肝炎特異的プロモーターの下
流に置くことによって肝炎中で発現させる。他のウイル
スについては、構成的プロモーターを使用することがで
きる。

【００２７】宿主細胞中で発現させる場合、突然変異型
遺伝子を発現ベクター中に機能的に連結し、これを宿主
細胞中に導入することにより、その細胞による欠陥タン
パク質の発現を可能にすることができる。適当な調節領
域を伴う遺伝子を適切な配向と読み枠で提供することに
よって発現が可能になる。遺伝子構築法は当該技術分野
で知られている。具体的には、“Molecular Cloning,A L
aboratory Manual"(Sambrookら編,Cold Spring Harbor
Laboratory,第2版,Cold Spring Harbor,NY(1989))を参
照のこと。

【００２８】極めて多様な転写および翻訳調節配列を使
用することができる。調節シグナルが高レベルに発現す
る特定の遺伝子に付随しているアデノウイルス、ウシパ
ピローマウイルス、シミアンウイルスなどのウイルス供
給源からこれらのシグナルを誘導することができる。あ
るいは、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどの哺乳類
発現産物のプロモーターを使用することもできる。

【００２９】真核宿主における突然変異型ウイルスＤＮ
Ａの発現には真核性調節領域の使用が要求される。一般
にこのような領域にはＲＮＡ合成の開始を指示するに足
るプロモーター領域が含まれる。代表的なプロモーター
にはマウス・メタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター
(Hammer,D.ら,J.Mol.Appl.Gen.1:273-288(1982))、ヘル
ペスウイルスのＴｋプロモーター(McKnight,S.,Cell 3
1:355-365(1982))、ＳＶ４０初期プロモーター(Benoist
ら,Nature 290:304-310(1981))などが含まれる。他の有
用なプロモーターにはアルブミン、アルファ・フェトプ
ロテイン、アルファ・アンチトリプシン、レチノール結
合性タンパク質などの肝臓特異的プロモーターが含まれ
る(Fang,X.J.ら,Hepatology 10:781-787(1989))。

【００３０】望ましい突然変異型ウイルスＤＮＡおよび
機能的に連結されたプロモーターを受容細胞中に、直線
分子あるいはより好ましくは閉環共有結合環状分子でも
あり得る非複製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子として導入する
ことができる。このような分子は自律的に複製すること
ができないので、目的のレセプター分子の発現は導入さ
れた配列の一時的発現を介して起こり得る。あるいは、
所望により、導入した配列の宿主染色体への組込みを介
して永続的な発現も起こり得る。

【００３１】導入される配列を、受容宿主中で自律的に
複製することができるプラスミドまたはウイルスベクタ
ー中に組込むこともできる。ｃＤＮＡ発現ベクターには
Okayama,H.,Mol.Cell.Biol.3:280(1983)などに記述され
ているものが含まれる。ウイルスベクターにはＷＯ８９
／０７１３６およびその引用文献に開示されているレト
ロウイルスベクター(特に肝細胞中での発現用)が含まれ
る。

【００３２】この方法では、特定の突然変異をコード化
している対応する核酸配列またはその一部分をウイルス
性疾患に罹っている宿主の細胞中に導入する。その核酸
配列の発現はそのウイルスの複製を妨害するタンパク質
をもたらす。

【００３３】ウイルスの複製を破壊するもう１つの手段
は、宿主細胞にアンチセンスＲＮＡを提供することであ
る。アンチセンスＲＮＡをウイルスに提供することもま
た、複製を妨害する。アンチセンス調節については、Ro
senbergら,Nature 313:703-706(1985)；Preissら,Natur
e 313:27-32(1985)；Melton,Proc.Natl.Acd.Sci.USA82:
144-148(1985)；Kimら,Cell 42:129-138(1985)；Izant
ら,Science 229:345-352(1985)に記述されている。アン
チセンスＲＮＡを供給することにより、天然に存在する
ＲＮＡの作用が減少する。したがってアンチセンス調節
は、転写されるＤＮＡ配列がそのウイルスの目的のポリ
メラーゼ遺伝子またはポリメラーゼ遺伝子領域に対して
少なくとも部分的には相補的であるような遺伝子からな
るＤＮＡ配列を細胞中に導入することによって達成され
得る。上述のように、導入されるＤＮＡはその宿主細胞
によって認識される転写開始領域の転写制御下にあるで
あろう。導入されたＤＮＡの転写はウイルスのＲＮＡと
相補的なアンチセンスＲＮＡの複数コピーをもたらし、
そして天然に存在するＲＮＡの作用の減少をもたらすで
あろう。さらに、特定のウイルス遺伝子領域をまたぐリ
ボザイムも治療剤として機能し得る(Sarver,N.ら,Scien
ce 247:1222-1225(1990))。

【００３４】突然変異型ウイルスゲノムを構築し、それ
を用いて宿主細胞をトランスフェクトおよび感染させ得
ることも理解される。この突然変異型ウイルスは欠陥タ
ンパク質を発現させることができる。したがって、この
細胞はウイルスの攻撃を効果的に撃退することができ
る。宿主が既に非改変型のウイルスに感染している場合
には、欠陥タンパク質を発現する突然変異型ウイルスに
宿主を感染させることにより、非改変型ウイルスの複製
の停止を導くことができる。

【００３５】本発明の方法はウイルス感染に対処するた
めだけでなく、ウイルス感染を予防するためにも利用で
きる。ウイルス感染を予防したり、あるいは宿主にウイ
ルスが侵入した途端にそのウイルスを撃退するために、
欠陥タンパク質または欠陥タンパク質をコード化する核
酸を含有するベクターからなる組成物を投与することが
できる。

【００３６】複製を抑制するために欠陥ポリメラーゼタ
ンパク質を使用することを総論的に議論しているが、欠
陥タンパク質がそれ自身のウイルスに特異的であること
は理解される。すなわち、Ｂ型肝炎ウイルスポリメラー
ゼ遺伝子中の突然変異はＢ型肝炎ウイルスの複製を抑制
もしくは停止させる欠陥タンパク質をもたらすであろ
う。

【００３７】上述のように、本発明の組成物および方法
を用いることにより、極めて多様なＲＮＡウイルスおよ
びＤＮＡウイルスのウイルス複製を停止させることがで
きる。

【００３８】本発明の一態様として、肝炎ウイルス、具
体的にはＢ型肝炎ウイルスの複製を停止させるために本
発明の方法および組成物を利用する。部位特異的突然変
異誘発法により、少なくとも１つの突然変異をこのウイ
ルスのゲノム中に挿入することができる。ヌクレオチド
２６０６付近からヌクレオチド２８２３付近までの範
囲、一般的にはヌクレオチド２７００付近からヌクレオ
チド２９００付近の範囲、好ましくはヌクレオチド２７
９８付近にあるヌクレオチド位置にこの突然変異を導入
することができる。位置２７９８に突然変異を挿入する
場合、その突然変異はＡからＣあるいはＴからＣへの変
化を伴うであろう。この特定の突然変異はThrまたはSer
からProへの対応するアミノ酸変化をもたらすであろう
(表１を参照のこと)。これによって得られる突然変異
は、Ｂ型肝炎ウイルスの複製を完全かつ不可逆的に停止
させる。

【００３９】ＨＢＶ複製を停止させるためには、次い
で、突然変異を有するＤＮＡ種が逆転写酵素反応におけ
る欠陥３.５プレゲノムＲＮＡをプライムするために用
いられる。あるいは、欠陥タンパク質をコード化するウ
イルスＤＮＡの特定の断片を肝臓特異的プロモーターの
制御下で宿主細胞に供給することができる。さらに、肝
臓特異的プロモーターによって駆動される突然変異を含
有するヒトＨＢＶゲノムを、野生型肝炎ウイルスの複製
の停止を導く感染性の妨害ウイルス粒子を生産するよう
に構築することができる。

【００４０】もう１つの態様として、ＨＩＶ複製を抑制
することができる。つまり、このウイルスのゲノム中に
少なくとも１つの突然変異を挿入する。この突然変異を
ＨＩＶポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド領域中に導入
する。一般的には、ヌクレオチド１２００付近からヌク
レオチド５５００付近までの範囲、より一般的にはヌク
レオチド１５００付近からヌクレオチド４７００付近ま
での範囲にあるヌクレオチド位置に突然変異を導入す
る。得られた突然変異を、本明細書に開示する方法を用
いて、ウイルスの複製に対する効果について調べるであ
ろう。

【００４１】ウイルス複製停止の機構にはプレゲノムＲ
ＮＡの包膜化に必要なタンパク質あるいはポリメラーゼ
反応の開始に必要な結合性タンパク質の不完全な(欠陥
のある)産生が関与すると考えられる。このタンパク質
は(−)鎖ＤＮＡの逆転写のためのプライマーとして機能
する。しかしこのウイルス複製の抑制が、ポリメラーゼ
遺伝子内に突然変異を挿入すること以外には、本明細書
に開示する特定の方法に依存しないことは理解される。
したがって、実際には他の機構あるいは別個の機構がウ
イルス複製の停止に関与していることもあり得る。

【００４２】以下の実施例は例示のために提供するので
あって、限定を意図するものではない。

【００４３】

【実施例】実施例１ ＨＢＶ感染に対して血清学的に免疫性である個体の肝臓
中のエピソームＨＢＶＤＮＡが過去に同定されている(B
lum,H.E.ら,Liver 8:307-316(1988))。この個体の肝臓
から得たウイルスゲノムのクローニング、微細構造分
析、および生物学的特性化が行われた。クローン化した
ゲノムは、最も密接に関連する血清型ａｄｗ２の感染性
ＨＢＶ(B.N.Fields,R.Jaenisch及びC.F.Fox編,“Animal
virus genetics"(Academic Press Inc.,New York(198
0))中57-70頁のValenzuela,P.ら,“The nucleotide seq
uence of the hepatitis B viral genome and the iden
tification of the major viral genes")と比較して４
８塩基変化を示した。これらの突然変異のうちの１つは
ウイルスゲノムの前核(pre-core)領域の末端に終止コド
ンを作っており、これが肝炎Ｂ ｅ抗原(ＨＢｅＡｇ)の
形成を妨げていた。Ｈｕｈ７肝癌細胞中へのトランスフ
ェクションによるこのクローン化ＤＮＡの機能分析は、
ウイルスＤＮＡ複製を遮断する欠陥を除き、すべての主
要なウイルス転写物、ウイルス核およびエンベロープタ
ンパク質の合成能力を示した。ＤＮＡ合成に関するこの
欠陥の遺伝的根拠が、スレオニンまたはセリンのプロリ
ンによる置換をもたらす位置２７９８の一つのミスセン
ス突然変異であることがわかった。この発見はこのポリ
メラーゼ遺伝子領域の(おそらく末端タンパク質かある
いはプレゲノムＲＮＡの包膜化に必要なタンパク質をコ
ード化するという)ウイルスの生活環における重要な役
割を示唆すると共に、ウイルスの複製を停止させるため
の特定の治療戦略を示唆している。

【００４４】この患者の肝臓中のエピソームＨＢＶ Ｄ
ＮＡの微細構造を明らかにするため、３対のＨＢＶ特異
的プライマー(表１)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(Ｐ
ＣＲ)によって全肝臓ＤＮＡからウイルスゲノムを増幅
した。増幅したウイルスＤＮＡ断片をｐＧＥＭ-７中に
クローン化することにより、予期される３種の重複ＨＢ
Ｖクローン１-８、２-１３および３-１(表１)を得た。
これらのクローンを用いてＨＢＶ ＤＮＡ分子を再構築
し、ｐＧＥＭ-７中にクローン化することにより、全長
ＨＢＶゲノム５-１５を得た。これらのクローンの直接
配列決定を行うことにより、ＨＢＶゲノム５-１５の完
全なヌクレオチド配列を決定した(データはGenbankに提
出した)。このゲノムは３２２１塩基の長さを有し、既
知のＨＢＶ ＤＮＡと同一の遺伝的構成である。公表さ
れたＤＮＡ配列との比較により、ＨＢｓＡｇサブタイプ
ａｄｗ２(B.N.Fields,R.Jaenisch及びC.F.Fox編,“Anim
al virusgenetics"(Academic Press Inc.,New York(198
0))中57-70頁のValenzuela,P.ら,“The nucleotide seq
uence of the hepatitis B viral genome and the iden
tification of the major viral genes")と最も密接な
相同性を有することが明らかになった。このサブタイプ
と比較したところ、ＨＢＶ５-１５中に合計６３個の突
然変異が検出され、そのうち４８個はアミノ酸置換をも
たらすものであった。ＰＣＲ増幅によって誘発された突
然変異を排除するために、別個のＰＣＲ増幅産物のクロ
ーニングと配列決定を行うことにより、アミノ酸変化を
導く突然変異を確認した。突然変異はすべての読み取り
枠中に同定され、この突然変異体を除けば異なるＨＢＶ
ＤＮＡと他のヘパドナウイルスの間で最も高度な相同
性を示す領域(参考文献３およびGenbankから入手できる
データ)であるプレＣ／Ｃ領域中に最も高い頻度(１００
０塩基あたり２６塩基)で同定された。これらの突然変
異はプレＣ読み枠の末端に枠内終止コドンをもたらし、
それゆえに肝炎Ｂ ｅ抗原(ＨＢｅＡｇ)への前駆体であ
るプレＣ／Ｃタンパク質をコード化することができなく
なったのである。プレＣ読み枠の末端の終止コドンは患
者の肝細胞性癌腫中に組み込まれたウイルスＤＮＡ中に
は認められず(非開示データ)、このことはこの突然変異
が感染性ウイルス中に存在したのではなく、むしろウイ
ルスＤＮＡの組込み後、非腫瘍性の肝臓におけるウイル
ス複製の進行中に起こったことを示唆している。

【００４５】上述した構造上の特徴からこのウイルスの
生物学に関して直接的な結論を引き出すことができなか
ったので、この突然変異ウイルスゲノムの機能的な能力
をインビトロで分析した。Ｈｕｈ７肝癌細胞(Nakabayas
hi,H.ら,Cancer Res.42:3858-3863(1982))のトランスフ
ェクション後、細胞溶解液および細胞培養培地をウイル
ス転写物、タンパク質および複製型ウイルスＤＮＡの存
在について分析した。図１に示すように、ＨＢＶ特異的
プローブとのハイブリッド形成実験によって、頭-尾型
(ＨＴＤ)ａｄｗ(“野生型")でトランスフェクションし
た細胞およびＨＴＤ５-１５(“突然変異型")でトランス
フェクションした細胞の両方に、それぞれ２.２および
３.６kb長の２つの主要な転写物が存在することが明ら
かになった。トランスフェクションしなかった細胞(非
開示データ)中、あるいは不完全ＨＢＶクローン１-８
(表Ｉ)でトランスフェクションした細胞中にはウイルス
転写物が存在しなかった。メッセージのレベルはＨＴＤ
５-１５でトランスフェクションした細胞中よりＨＴＤ
ａｄｗでトランスフェクションした細胞中のほうが高か
ったが、２.２kbサブゲノムメッセージに対する３.６kb
プレゲノムメッセージの比率は極めて類似しているよう
である。これらの発見は突然変異型ウイルスゲノムがす
べての主要なＨＢＶ転写物を合成する能力を有すること
を示している。

【００４６】ＨＢＶがコード化しているタンパク質を、
細胞溶解液および培養培地の両方で、固相放射線免疫検
定法によって同定した。ＨＴＤ ａｄｗでトランスフェ
クションしたＨｕｈ７細胞およびＨＴＤ ５-１５でトラ
ンスフェクションしたＨｕｈ７細胞は共にかなりの量の
ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃ／ｅＡｇを培地中に分泌し、一
方、不完全クローンＨＢＶ １-８でトランスフェクシン
した細胞はウイルス抗原を生産しない(非開示データ)。
位置１８９９の終止コドン突然変異から予期されるよう
に、代謝的ラベル化および免疫沈降研究により、ＨＴＤ
５-１５でトランスフェクションした細胞が大きいプレ
Ｃ／Ｃタンパク質とその小さいプロセシングされた生成
物(通常ＨＢｅＡｇとして細胞培養培地中に分泌される)
を合成する能力を有さないことが明らかになった(非開
示データ)。

【００４７】突然変異型ゲノム５-１５の複製能力を評
価するために、トランスフェクション後のＨｈｕ７細胞
から単離した細胞質ＤＮＡのサザンブロットハイブリッ
ド形成によってＨＢＶ ＤＮＡ種を分析した。図２に示
すように、複製性のＨＢＶ ＤＮＡ種がＨＴＤ ａｄｗで
トランスフェクションした細胞中にのみ検出され、不完
全クローンＨＢＶ １-８(陰性対照)またはＨＴＤ ５-１
５でトランスフェクションした細胞中にはウイルスＤＮ
Ａが存在しなかった。ＨＴＤ ａｄｗでトランスフェク
ションした細胞中のウイルスＤＮＡ配列は一本鎖で部分
的に二本鎖の複製型中間体ならびに完全な弛緩環状分子
である(Blum,H.E.ら,Virology 139:87-96(1984))。

【００４８】ＨＴＤ ａｄｗまたはＨＴＤ ５-１５でト
ランスフェクションされた細胞の細胞溶解液および培養
培地中のウイルス抗原およびＤＮＡ種を、ＣｓＣｌ密度
勾配遠心分離した後、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃ／ｅＡｇ
ならびにＨＢＶ ＤＮＡ配列について個々の分画を分析
することによってさらに特徴づけた。ＨＴＤ ａｄｗで
トランスフェクションした細胞中ではウイルスＤＮＡが
ＨＢｃ／ｅＡｇ(核粒子)に結合しており、培養培地中で
はＨＢｓＡｇ(ウイルス粒子)およびＨＢｃ／ｅＡｇ(核
粒子)に結合している。予想どおり、ＨＴＤ ５-１５で
トランスフェクションしたＨｕｈ７細胞から得られる細
胞溶解液または培養培地のＣｓＣｌ分画中では、ＨＢｓ
ＡｇおよびＨＢｃＡｇについては陽性であったものの、
ウイルスＤＮＡ種は検出不能であった。これらの発見
は、Ｈｕｈ７細胞はウイルス複製を支持するが、突然変
異型ＨＢＶゲノム５-１５はこの系中で複製できないと
いうことを立証している。

【００４９】先端欠失型複製可能ａｄｗＨＴＤ構築物ａ
ｄｗ Ｒ９中にこの突然変異型ウイルスゲノムの特定の
領域をサブクローニングすることにより、この複製欠損
性の分子的根拠を決定した(図３)。特定のＤＮＡ断片を
交換し、クローニングし、Ｈｕｈ７肝癌細胞をトランス
フェクションすることにより、複製欠損性の原因である
突然変異の位置を突然変異型ウイルスゲノムマッピング
の位置２６０６(Ａｐａ１)と２８２３(ＢｓｔＥII；図
３および図４)の間の領域に特定することができた。突
然変異型ウイルスゲノムはこの領域内でａｄｗ２(B.N.F
ields,R.Jaenisch及びC.F.Fox編,“Animal virus genet
ics"(Academic Press Inc.,New York(1980))中57-70頁
のValenzuela,P.ら,“The nucleotide sequence of the
hepatitis B viral genome and the identification o
f the major viral genes")と比較してミスセンス突然
変異を２つだけ有する(ヌクレオチド位置２７９８およ
び２８２０)。ａｄｗ Ｒ９またはＲ９ ＲＢ ５-１５(図
３)の部位特異的突然変異誘発処理と上記２７９８また
は２８２０突然変異のいずれかを保持するプライマーに
よって、ＰＣＲ増幅で４種のクローンを作成した(表
３)：位置２７９８にＡからＣへの突然変異を有するａ
ｄｗ Ｒ９(クローン２-６)、位置２８２０にＧからＣへ
の突然変異を有するａｄｗ Ｒ９(クローン５-３)、位置
２７９８にＣからＡへの突然変異を有するＡｖａ Ｉａ
(クローン６-６)、および位置２８２０にＣからＧへの
突然変異を有するＡｖａ Ｉａ(クローン３-３)。Ｈｕｈ
７肝癌細胞をこれらのクローンでトランスフェクション
した後、クローンａｄｗ Ｒ９の位置２７９８における
ＡからＣへの突然変異がウイルスＤＮＡを複製欠損型に
し、一方、同じ位置におけるＡｖａ １ａのＣからＡへ
の突然変異が複製能力を回復させることを立証すること
ができた(図４)。対照的に、位置２８２０における突然
変異は親構築物(クローン３-３およびクローン６-６)の
複製能力や複製欠損性に影響を与えなかった。これらの
発見は、ウイルスゲノムの位置２７９８におけるＡから
Ｃへの突然変異(これはThrからProへの置換を導く)が上
記患者の肝臓から単離されたこの突然変異型ウイルスゲ
ノムの複製欠損の分子的根拠であることを明確に立証し
ている。

【００５０】ヘパドナウイルスポリメラーゼの構造およ
びハイドロパシー比較分析（Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ，Ｙ．
Ｅ．ら,FEBS Letters 243:115-118(1989))ならびに実験
的研究(Bosch,V.ら,Virology 166:474-485(1988)；Bart
enschlager,R.ら,EMBO J.7:4185-4192(1988)；Schlich
t,H.-J.ら,Cell 56:85-92(1989))は、ウイルスポリメラ
ーゼ遺伝子の５'プライム領域が“末端タンパク質"(Ｔ
Ｐ)をコード化していることを示唆している。このタン
パク質は(−)鎖ＤＮＡの５'末端に結合し、おそらくヘ
パドナウイルスの複製戦略の中心的な特徴である逆転写
のプライマーとして機能すると思われる(Seeger,C.ら,S
cience 232:477-484(1986)；Will,H.ら,J.Virol.61:904
-911(1987))。カモＢ型肝炎ウイルスポリメラーゼ遺伝
子の突然変異分析は、この遺伝子の５'領域への枠内挿
入が活性ポリメラーゼの生産を実際に除去することを立
証した(Schlicht,H.-J.ら,Cell 56:85-92(1989))。この
データは、ポリメラーゼ遺伝子のＴＰ領域がウイルスの
複製に重要であることを強く示唆している。さらに、プ
レゲノムＲＮＡのパッケージング(ゲノム詰め込み)には
機能的に無傷のポリメラーゼ遺伝子が必要であると思わ
れる。この解釈と合致して、筆者らの突然変異体中のヌ
クレオチド位置２７９８に同定された突然変異、あるい
は“野生型"ウイルスの突然変異誘発処理によって作成
した突然変異は、ウイルスの複製を停止させる。この突
然変異の意義は、公表されたＨＢＶ ＤＮＡ配列(Okamot
oら,J.Gen.Virol.69:2575-2583(1988))およびGenbankを
通して利用できる配列との比較によって示されるよう
に、ポリメラーゼ遺伝子産物の位置１６４のアミノ酸が
すべてのＨＢＶ株において高度に保存されている(１１
／１４Thr、３／１４Ser)という事実によって強調され
る。この停止の機構はおそらくＴＰまたはゲノムＲＮＡ
の包膜化に関与するタンパク質のThrまたはSerからPro
への置換による立体配座の変化を介して媒介されると思
われる。これらのタンパク質の機能に対するこのポリメ
ラーゼ遺伝子領域の寄与を明確にするための研究が現在
行われている。

【００５１】野生型ＨＢＶ ＤＮＡおよび突然変異型Ｈ
ＢＶ ＤＮＡによるＨｕｈ７肝癌細胞の同時トランスフ
ェクションは、この突然変異体が野生型ＨＢＶの複製を
停止させる能力を有することを立証した。表４を参照の
こと。ＨＢＶおよび非関連ＤＮＡをＨｕｈ７細胞のトラ
ンスフェクションに使用した場合、ＨＢＶウイルスＤＮ
Ａと全細胞ＤＮＡとのハイブリッド形成実験によって立
証されるように、肝炎ウイルスの複製は妨害されなかっ
た。突然変異型ウイルスＤＮＡと同時トランスフェクシ
ョンした細胞中にはウイルスＤＮＡが検出されず、この
ことはこの突然変異体が野生型肝炎ウイルスの複製を停
止させ得ることを示している。

【００５２】非突然変異型ウイルスの複製を停止させる
という突然変異型ウイルスの能力は重要な含意を有す
る。ウイルスに感染している個体または宿主において、
この突然変異型ウイルスは感染細胞におけるウイルスの
複製を停止させることができ、ウイルスが他の細胞に蔓
延することを防止することができる。

【表１】

【００５３】表 ２：患者の肝臓から得たＨＢＶ ＤＮ
ＡのＰＣＲ増幅とクローニングに用いたＨＢＶ特異的オ
リゴヌクレオチドプライマーの位置と配列 ウイルス性肝炎の経歴を有する７３才の白人男性から転
移性肝細胞性癌腫(ＨＣＣ)が提供された。放射線免疫検
定法で決定したところ、ＨＢＶ血清学はＨＢｓＡｇおよ
び抗ＨＢｃ ＩｇＭに関して陰性であり、抗ＨＢｃ Ｉｇ
Ｇ、抗ＨＢｅおよび抗ＨＢｓに関して陽性であった(Abb
ott,North Chicago,IL)。スポット・ブロット・ハイブ
リッド形成によれば、血清中にＨＢＶ ＤＮＡは検出さ
れなかった。検屍解剖で得た肝臓およびＨＣＣ組織を、
使用するまで−８０℃で保存した。Ｔａｑポリメラーゼ
ならびに５'および３'末端に制限酵素部位を保持するプ
ライマー(表２)を用いて肝臓ＤＮＡを増幅した。Saiki
ら(Saiki,R.ら,Science 239:487-4491(1988))に従って
ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行った。簡単に述べる
と、ＤＮＡ ５０ng、Ｔａｑポリメラーゼ(Perkin-Elmer
Cetus)２.５単位、各ｄＮＴＰ ２００μM、各プライマ
ー １μM、５０ml／l ＫＣｌ、１０mM Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ
(ｐＨ８.３)、１.５mM ＭｇＣｌ₂、および０.０１％(wt
／vol)ゼラチンを含有する５０μl反応体積中で標的配
列を増幅した。プログラマブルＤＮＡサーマルサイクラ
ー(Perkin-Elmer Cetus)中で４０サイクルこの反応を行
った。試料を１.５分間９４℃に加熱し(ＤＮＡの変
性)、１.５分間５０℃に冷却し(プライマーとのハイブ
リッド形成)、７２℃で３分間インキュベートした(ポリ
メラーゼ反応)。ＰＣＲ後、鎖の合成を完結させ、適当
な制限エンドヌクレアーゼによる切断を保証するため
に、クレノーポリメラーゼ５単位を添加した。このＰＣ
Ｒ混合物をエチジウムブロミドの存在下１.２５％アガ
ロースゲルで分画した。標的配列を含有するバンドを取
り出し、ガラスビーズ(Geneclean,Bio 101 Inc.,La Jol
la,CA)によってＤＮＡを単離した。精製した断片をｐＧ
ＥＭ-７Ｚｆ(＋)(Promega)中に連結し、ＤＨ５αＦ'細
胞(BRL)中にクローン化した。クローン化したＤＮＡを
標準的なプラスミド調製法によって調製した。３種のク
ローン１-８、２-１３および３-１(表２)を用いて完全
なサイズのウイルスゲノム(クローン５-１５)を再構築
した。トランスフェクション実験のために、ＨＢＶ Ｄ
ＮＡＨＢｓＡｇサブタイプａｄｗ(“野生型")の頭-尾型
二量体とＨＢＶ ＤＮＡ ５-１５の頭-尾型二量体をｐＧ
ＥＭ-７Ｚｆ(＋)中に再構築し、上述のようにクローン
化した。Ｇｅｍ Ｓｅｑ ＲＴ系(Promega)またはＴ７ポ
リメラーゼ系(Pharmacia)を用いて記述されているよう
にして(Mierendorf,R.C.ら,Meth.Enzymol.152:556-562
(1987))、ＤＮＡ配列分析を行った。

【表２】

【００５４】表 ３：インビトロで突然変異誘発処理し
たＨＢＶ ＤＮＡクローンおよびそれらの親構築物のＤ
ＮＡ配列 ２３１２から２３３３までの領域にまたがる属プライマ
ー(ＣＣ-２２)と、位置２７９８におけるＴからＧへの
突然変異(ＡＴＣ-４０)または位置２８２０におけるＣ
からＧへの突然変異(ＡＣＣ-４０)のいずれかを保持す
る２８３３から２７９４までの領域にまたがるプライマ
ーを用いて、クローンａｄｗ Ｒ９およびＲ９ ５-１５
(図３参照)をＰＣＲで増幅した(表１参照)。増幅した断
片をアガロースゲル電気泳動およびGeneclean(Bio 101
Inc.,La Jolla,CA)で精製した。ＡｐａＩおよびＢｓｔ
ＥIIで消化した後、その断片をａｄｗ Ｒ９(図３参照)
中にクローニングすることにより、期待通り単一の点突
然変異を保持する４種のクローン２-６、３-３、５-３
および６-６を得た。

【表３】

【００５５】表 ４：突然変異型ＨＢＶとの同時トラン
スフェクション Ｈｕｈ７細胞を、１)野生型ＨＢＶおよび非関連ＤＮ
Ａ、ならびに２)野生型ＨＢＶおよび変異型ＨＢＶ ＤＮ
Ａで同時トランスフェクションした。同時トランスフェ
クションに使用した非関連ＤＮＡはネオマイシン耐性保
持ベクターである。 同時トランスフェクション後、全
細胞ＤＮＡを抽出し、次いでラベルしたＨＢＶ ＤＮＡ
とハイブリッド形成させることにより、ウイルスの複製
を決定した。抽出後、全細胞ＤＮＡをＤＮａｓｅおよび
ＲＮａｓｅで消化し、次いでショ糖混合物中で遠心分離
した。このショ糖勾配からウイルスＤＮＡを取り出し、
ゲル電気泳動にかけた。電気泳動後、ＤＮＡをニトロセ
ルロースに移し、ラベルしたウイルスＤＮＡで処理し
た。得られたオートラジオグラフは、野生型ＨＢＶおよ
び非関連ＤＮＡで同時トランスフェクションした細胞中
にウイルスＤＮＡが存在することを示した。野生型ＨＢ
Ｖおよび突然変異型ＨＢＶ ＤＮＡでトランスフェクシ
ョンした細胞中にはウイルスＤＮＡが検出されなかっ
た。

【表４】 同時トランスフェクション 複 製 １．野生型ＨＢＶおよび非関連ＤＮＡ ＋ ２．野生型ＨＢＶおよび突然変異型ＤＮＡ − ＋はウイルスＤＮＡとのハイブリッド形成によって立証
されたＨＢＶの複製を示す。 −は複製が検出されなかったことを示す。

【００５６】実施例２：アンチセンスオリゴデオキシヌ
クレオチドによるＢ型肝炎ウイルス，の阻害 ＨＢＶ遺伝子の発現と複製に対するアンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチドの効果を分析した。ＨＢＶ-ＤＮ
Ａによるヒト肝癌細胞のトランスフェクション(Blumら,
J.Virol. 682:1836-42(1991))(対照)は、Ｂ型肝炎表面
抗原(ＨＢsＡｇ)とＢ型肝炎ｅ抗原(ＨＢeＡｇ)の合成と
分泌をもたらした。ＨＢＶ-ＤＮＡとアンチセンス極性
のオリゴデオキシヌクレオチド(ＡＴＣ-４０：下記参
照)との同時トランスフェクションはＨＢsＡｇとＨＢe
Ａｇの合成を完全に遮断すると共にＨＢＶの複製をも完
全に遮断した(図５)。センス極性の同じオリゴデオキシ
ヌクレオチド(ＧＡＴ-４０)はウイルス抗原の生産また
は複製に対して効果を有さなかった。

【００５７】これらのデータは、ＨＢＶ-特異的アンチ
センスオリゴデオキシヌクレオチドがウイルス遺伝子の
発現と複製を遮断できることを示している。

【００５８】オリゴヌクレオチド調製 １．ａｄｗ ２８３３-２７９４(２７９８ ５-１５ ＴからＧへの突然変異) ＡＴＣ-４０ 5' ATATGGTGAC CCGCAAAATG ATGCGCTACG TGTGGGTTCC 3' ２．ａｄｗ ２８３３-２７９４(２８２０ ５-１５ ＣからＧへの突然変異) ＡＣＣ-４０ 5' ATATGGTGAC CCGGAAAATG ATGCGCTACG TGTGGTTTCC 3'

【表５】 Ａ₂₆₀ Ａ₂₈₀ Ａ_260/280 ng／μl μg合計 ATC-40 0.132 0.084 1.57 2.64 1.32 ACC-40 0.259 0.149 1.67 5.18 2.59

【００５９】なお、本明細書で言及したすべての特許出
願および刊行物は本発明が関連する技術分野の当業者の
技術水準を示している。すべての刊行物と特許出願は本
明細書の一部を構成する旨を特に個別に示したかの如く
に本明細書の一部を構成する。また、明瞭な理解を目的
として明示および例示のために上述の発明をいくらか詳
細に記述したが、添付の請求の範囲の範囲内でいくらか
の改変および修飾を行い得ることは明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 突然変異型ＨＢＶゲノム５-１５がＨｕｈ７
肝癌細胞中で転写されることを示すノーザンブロット。

【図２】 突然変異型ＨＢＶゲノム５-１５が複製欠損
性であることを示すサザンブロット。

【図３】 突然変異型ＨＢＶゲノムの構造を表す模式
図。

【図４】 ヌクレオチド２７９８がＨＢＶ ＤＮＡの複
製にとって重要であることを示すサザンブロット。

【図５】 アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドＡ
ＴＣ-４０によるＢ型肝炎ウイルスの複製阻害を表すグ
ラフ。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/51 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ツァニヤング・リアング アメリカ合衆国02146マサチューセッツ州 ブルックリン、ポンド・アベニュー・シィ ー77番 ナンバー805 (72)発明者 イーザン・ガラン アメリカ合衆国02146マサチューセッツ州 ブルックリン、スターンズ・ロード20番 アパートメント・ナンバー30 (72)発明者 ジャック・アール・ワンズ アメリカ合衆国02168マサチューセッツ州 ワーバン、バリック・ロード210番

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞における肝炎ウイルスの複製を阻害
   する方法であって、該肝炎ウイルスのウイルスゲノムの
   ポリメラーゼ遺伝子領域に対して相補的なアンチセンス
   ＲＮＡ(ａＲＮＡ)をコード化するＤＮＡを該細胞に導入
   することからなる方法。
2. 【請求項２】 該肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスであ
   る請求項１の方法。
3. 【請求項３】 該ポリメラーゼ遺伝子に対する該ａＲＮ
   Ａをコード化するＤＮＡが細胞特異的プロモーターによ
   って制御される請求項１の方法。
4. 【請求項４】 該細胞が肝組織細胞である請求項１の方
   法。
5. 【請求項５】 ウイルスポリメラーゼ蛋白質に相補的な
   アンチセンスＲＮＡ(ａＲＮＡ)をコード化する組換えＤ
   ＮＡ分子であって、該ａＲＮＡの発現によって該分子の
   宿主細胞におけるウイルスの複製が阻害され得ることを
   特徴とする組換えＤＮＡ分子。
6. 【請求項６】 請求項５のＤＮＡ分子を含有するベクタ
   ー。
7. 【請求項７】 請求項６のベクターによって形質転換さ
   れた宿主細胞。
8. 【請求項８】 動物の肝炎ウイルス感染症を治療する方
   法であって、該肝炎ウイルスのウイルスゲノムのポリメ
   ラーゼ領域に相補的なアンチセンスＲＮＡをコード化す
   るＤＮＡで形質転換された細胞を該動物に与えることか
   らなる方法。
9. 【請求項９】 該ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである請
   求項８の方法。