JPH0686689A

JPH0686689A - 癌の診断方法

Info

Publication number: JPH0686689A
Application number: JP3111091A
Authority: JP
Inventors: Robert C Bast Jr; シー．バスト，ジュニアロバート; J Dirk Iglehart; ダークイグルハートジェイ．; Margaret A Deutsch; エイ．ドイッチマーガレット; Jeffrey C Pence; シー．ペンスジェフリー
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1990-04-16
Filing date: 1991-04-16
Publication date: 1994-03-29
Also published as: CA2040513A1; KR910018040A; AU7502791A; EP0454338A1

Abstract

(57)【要約】【目的】非脈管、細胞分泌物における非細胞成分に導入
された抗体で癌を診断する方法に関する。【構成】かかる或種の抗体はモノクローナル抗体Lu4B5
であり、同抗体はマウスを腺癌および大細胞肺癌患者か
ら採取した気管支の洗液から調製された純粋にしたムチ
ン含有フラクションで免疫することにより生成された。
Lu4B5 モノクローナル抗体は、初期肺癌を持たない患者
からの分泌物よりも、初期気管支原性癌を持つ患者の気
管支分泌物に著しくより頻繁に反応する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は癌を診断する方法に関
し、特に被検者または被検動物内の癌を検出すべく非脈
管分泌物中に包含された溶解性抗原の使用に関する。

【０００２】

【従来技術】肺の気管支原性癌は、依然としてアメリカ
合衆国における癌に起因する死の主要因である（Cancer
Facts and Figures 1980，New york, 1979，American
Cancer Society）。肺癌の最も効果的な治療は腫瘍の外
科的切除であるように思われる。不運なことに、診断時
に外科的に切除可能な腫瘍を持つ肺癌患者は半分にも満
たない。それ故、肺癌を診断するためのより迅速でかつ
正確な手段が必要である。

【０００３】1988年5月25日公開されたピーリンスレー
等のヨーロツパ特許出願番号268279号は、ムチンエピ
トープに対するモノクローナル抗体を作るハイブリド
ーマに関するものである。ムチンは純粋な乳汁または癌
患者の胸膜浸出液から得られる。乳汁は正常な、非癌提
供者（第5頁第26〜27行）から得られる。分泌物が癌患
者から収集されることは示唆されていない。気管支鏡検
査により得られる気管支の擦傷片に結合するムチンモノ
クローナル抗体の使用が示唆されている（第26頁の実施
例IXを参照）。

【０００４】1989年9月5日発行のジェーマッテス等の
アメリカ国特許第4,863,854号は、ムチン様抗原に対す
るモノクローナル抗体に関するものであり、当該抗体は
種々の癌を診断するために有用であることが示唆されて
いる。抗体は癌細胞系で免疫したマウスにより作り出さ
れた（第2欄第67〜68行）。抗体MT334は記載によれば、
卵巣、結腸、肺、膵臓、前立線、肝臓、および胆管から
の癌細胞系の細胞中で抗原に結合した（第6欄第51行〜
第7欄第4行）。抗原は細胞により分泌されるムチン様
分子であると示唆されている。凍結組織セクションにお
いて、抗体MT334 は記載によれば、結腸の腺のベース中
で粘液形成杯細胞の口径側に濃縮された抗原と結合する
（第7欄第5〜10行）。

【０００５】抗体MQ49は硫酸化ムチン様分子であるもの
と示唆された抗原に結合する。細胞系において、MQ49は
卵巣、腎臓、結腸、胸、肺、子宮、膵臓等の癌および奇
形癌の表面上で検出された（第7欄第39〜43行）。凍結
組織セクションにおいて、MQ49 は皮膚の汗腺、胃の粘
液腺、および結腸、膵臓、食道、尿管、胸等の上皮細胞
等を含む分泌上皮細胞中で検出された（第7欄第48〜53
行）。

【０００６】1988年7月14日発行のジェーテイラ−パパ
ディミトリィオ等のPCT特許出願、番号 WO 88/05054号
はヒト多形性上皮ムチン（HPEM）コア蛋白質に対する抗
体に関するものである。この抗体または小片は完全に処
理されたHPEMで分解しまたは実質的に反応しない。ムチ
ンコア蛋白質はヒト乳汁から分離された（21〜27頁参
照）。コア蛋白質に対する抗体は、特に結腸、肺、卵巣
および胸癌腫により説明されているごときHPEM コア蛋
白質と反応するものと言及されている（4頁参照）。

【０００７】1989年8月10日発行のアールセリアニおよ
びジェーピターソン等のPCT特許出願番号 WO 89/07268
号は、ヒト胸癌の表面上で抗原決定因子に結合するが正
常ヒト胸組織には結合しないモノクローナル抗体に関す
るものである。抗原は 400Kdを越える分子量を有する高
分子量ムチン様糖蛋白質複合体として特徴づけられる。
抗体は胸、卵巣、子宮内膜、肺および膵臓の腺癌細胞を
認識するものと述べている（3頁2〜4行）。

【０００８】1989年4月4日付エーリンナンのアメリカ
国特許4,818,682号は、癌患者の腸ムチン抗原を作り出
す細胞の存在を検出するための試験管診断法について開
示している。この方法は患者から得た血液、血清または
血しょうのサンプルを検査して、同サンプル中の小腸ム
チン抗原（SIMA）および／または大腸ムチン抗原（LIM
A）を検出することからなる。

【０００９】1990年3月6日付イーヘルストロム等のア
メリカ国特許4,906,562号は、ヒト非小細胞肺癌に関連
した糖脂質抗原に結合するモノクローナル抗体に関する
ものである。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】癌抗原に対するモノク
ローナル抗体が知られているー方、種々の異なるタイプ
の腫瘍も知られており、かつ癌の効果的な診断は依然そ
のままであることも知られている。本発明は、この分野
における我々の前進する研究に基づいている。

【００１１】本発明は癌、癌の診断、または癌の定位
（特に肺癌）を選別するユニークな方法として判断され
る。本発明は分泌物の非細胞の、化学成分の使用に関す
るもので、かかる成分は癌を発現する危険のある集団の
ためのマーカとして、または悪性腫瘍をかくまう嫌疑の
ある患者の癌を診断するマーカとして、抗体で免疫学的
に分析できる。さらに本発明は肺癌を発現する危険にあ
る患者のためのマーカとして、分泌物特に肺分泌物の非
細胞の化学成分に対する抗体を使用することに関する。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明の第１の特徴は、
モノクローナル抗体Lu4B5、モノクローナル抗体Lu4B5に
より結合された抗原（またはより好ましくはエピトー
プ）に結合するモノクローナル抗体、および同モノクロ
ーナル抗体の小片等からなる群から選ばれたモノクロー
ナル抗体にある。本発明の第２の特徴は、上記したごと
きモノクローナル抗体を作り出すことのできる細胞系に
ある。本発明の第３の特徴は癌の存在を検出する方法に
ある。当該方法は被検者からのサンプルを上記したごと
きモノクローナル抗体と、モノクローナル抗体に反応生
成物を形成することを許容する条件下で接触すること、
およびその後反応生成物の存在または不在を検出するこ
とからなる。当該方法は同質および異質（例えばサンド
イッチ）の両者の検定を含む好ましい検定を導く。な
お、本発明に係るモノクローナル抗体Lu4B5 を産生する
ハイブリドーマについては、ハイブリドーマLu4B5とし
てブタペスト条約の協定に基づいて1990年4月17日付け
でアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ameri
can Type Culture Collection ）に寄託され、ATCC 受
託番号 HB 10425が付与されている。

【００１３】本発明のこのような抗体は、被検者から粘
液分泌物を収集すること、その後収集された粘液分泌物
から形成された非細胞相を準備すること、その後非細胞
相に含まれる抗原に対する多数の抗体を生成すること、
その後この多数の抗体から抗体を選択することにより作
り出される。かかる選択された抗体は被検者の癌または
癌の危険を選択的に検出することが可能である。粘液分
泌物は好ましくはエアロ−消化管(aero-digestive trac
t)粘液分泌物であり、また好ましくは癌腫組織である。
最も好ましい粘液分泌物は肺癌を患う患者からの気道分
泌物である。収集された分泌物から調製された非細胞相
は好ましくはムチン含有物である。

【００１４】

【発明の作用・効果】本発明は、ある観点からすれば、
肺性分泌物の液体相の化学的非細胞成分を検出し、かつ
初期肺癌を持たない個々の者から初期気管支原性癌を持
つ患者を識別できるモノクローナル抗体（Lu4B5 ）を提
供する。当該抗体は粘液分泌物の非細胞化学成分に対し
て活発化された。

【００１５】免疫学的試薬を発現して上皮癌を診断する
という粘液分泌物の使用はユニークである。粘液非脈管
分泌物は他の体液から識別される。これらの体液は、幾
多の特殊でかつ幅広く受け入れられた定義により免疫学
的試薬を発現すべく使用された。（１）粘液分泌物は、内皮（腺）細胞、体腔を仕切る粘
膜により生成され、外部と通信するものである。（２）粘液分泌物の生成は、濾過液（中央神経系液）お
よび浸出液（内部体腔の血清浸出液、すなわち炎症また
は悪性腫瘍浸出液）に対比すると、粘膜の機能でありか
つ代謝エネルギーを要求する。（３）粘液分秘物は直接外部と通信する体腔の粘膜を湿
潤する外部液と考えられる。（４）粘液分秘物は蛋白質と同様主として高分子量ムチ
ンを含有し、同ムチンは他の物質（細胞、乳蛋白質、汚
物、便等）を外部へ運ぶ運搬手段を提供する。（５）粘液分秘物は粘膜に付着して、粘膜表面を毒性の
化学物質および微生体から保護すべく機能する。

【００１６】非脈管、非細胞粘液分秘物の明確な例は、
人のエアロ−消化管の分秘物（口腔−咽喉、咽頭、呼吸
樹、食道、胃および腸を含む）、胸の分秘物（胸管路お
よび腺房内の分秘物）、生殖−尿路の分秘物（膀胱、尿
管、腎臓、前立腺、膣、頸管、子宮）である。エアロ−
消化管分秘物は本発明を遂行する上で好ましく、気道分
秘物（例えば呼吸樹の分秘物）は特に好ましい。

【００１７】マトリックスを支持する固体に付着した L
u4B5抗体は肺の非脈管および非細胞の分秘物内で大きな
複合糖蛋白質（ムチン）を発見し、かつある細胞系によ
り生成した。 Lu4B5で結合するエピトープを有すること
により定義づけられた当該糖蛋白質は、人のエアロ−消
化管の部分を区画する正常な、非癌の、上皮細胞により
生成される（正常な結腸上皮細胞および初期気管支原性
癌を持つある種の人の気道の上皮細胞）。 Lu4B5に対す
る結合により発見されたムチンまたは糖蛋白質分子は、
分子サイズのエクスクルージョンカラム（Sephacryl S
400, Pharmacia, Inc ）に適用された肺の、集合され、
親液性化され、かつ再懸濁化された（非細胞）粘液分秘
物の化学成分の分離後の流出フラクションに含まれる。
原則的には、ポリクローナル、モノクローナルまたは再
結合抗体のいずれかの抗体の生成に結び付いたサイズ
エクスクルージョンクロマトグラフィによる非脈管お
よび非細胞粘液分秘物の化学的分離は、関連された癌、
異常なエピトープまたは糖蛋白質を確認するために使用
できる。これらのものは、ムチンまたは糖蛋白質を生成
する正常細胞の初期悪性腫瘍を産生する人を識別する。

【００１８】このような免疫学的試薬は、ムチンまたは
糖蛋白質を生成する細胞の初期上皮悪性腫瘍を持つ患
者、またはムチンまたは糖蛋白質を生成する上皮細胞の
悪性腫瘍を発現する危険の高い患者を確認するために、
その後標準的な免疫学的検定方式（放射線免疫検定方
法、免疫酵素検定方法）において使用される。それとし
て、本発明は分子（蛋白質、糖蛋白質、ムチン）の単離
に関する。当該分子は上皮細胞により生成され、当該分
子に対する抗体（ポリクローナル、モノクローナルまた
は再結合抗体）の生成に関連する上皮細胞により区画さ
れた体腔内の非脈管および非細胞粘液分秘物にこぼれ
る。当該分子は体腔を区画する上皮細胞の悪性腫瘍を持
つ患者、または体腔を区画する上皮細胞の悪性腫瘍を発
現する危険が高くかつこれらの粘液を分秘する人を確認
する。

【００１９】本発明の他の特徴は、免疫剤として粘液分
秘物の非細胞成分（前記で定義した）を使用して作られ
る抗体（ポリクローナル、モノクローナルまたは再結合
体）の生成にある。

【００２０】本発明のハイブリドーマおよび抗体はコー
レルおよびミルステインの技術手法により生成できる
［Kohler and Milstein, Nature 265, 495-97（1975
）］。例えば、非脈管分秘物はマウスに注射され、十
分な時間の経過後、マウスは犠牲にされ脾臓細胞が得ら
れる。脾臓細胞はハイブリドーマ細胞を生成するため
に、その後骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞とともに溶解
することにより、典型的にはポリエチレングリコール
中で不滅化される。ハイブリドーマ細胞はその後適宜
の培地で培養され、上澄は選別されて所望の特異性を持
つモノクローナル抗体となる。

【００２１】本発明の範囲に包含される抗体小片は例え
ば Fab, F(ab')₂ およびFv小片を含む。大腸菌中でモノ
クローナルFabを発生するための技術は、ダブルヒュー
ゼの次の文献「Generation of a Large Combinatorial
Library of the Immunoglobulin in Phage Lambda,245
Science 1275 (8 Dec.1989)］に記述されている。

【００２２】本発明の他の特徴は、抗体の源であるにも
かかわらずこれらの液体を分秘する粘膜の上皮悪性腫瘍
を持つことが疑われている患者の、非脈管粘液分秘物に
適用した試験に基づく抗体の使用にある。加うるに、本
発明で論じた抗体は無癌であることがわかった患者の非
脈管粘液分秘物を試験して、患者が癌の発現の危険にあ
るか否かを確定するために使用される。

【００２３】非脈管、非細胞粘液分秘物に適用される試
験の例は、これらの分秘物の液抽出物内で溶解する固体
支持物または分子に結合された非脈管または非細胞分秘
物の放射性免疫検定または酵素−結合抗体検定による蛋
白質、糖蛋白質、およびムチンの免疫学的検出を含む。
分子は非悪性腫瘍で、形態学的に正常な上皮細胞により
生成されるので、上皮悪性腫瘍を持つ患者の確認、また
は病理学的に定義された癌なくして、非脈管、非細胞分
秘物を生成する上皮細胞の悪性腫瘍の発現の大きな危険
にある患者の確認、にこれらの分子上のエピトープの検
出を適用することは可能である。

【００２４】本発明により遂行される検定は均質または
不均質検定である。均質検定方法において、験体は粘液
サンプル、気管支洗液、血清、尿およびその類似物のご
とき生物学的流体であり、または汚物を除去して溶解ま
たは浄化される組織である。免疫学的反応は通常特殊な
抗体（例えばLu4B5）、標識分析体（a labeled analyt
e）および重要なサンプル（the sample of interest）
を含む。標識から発生するシグナルは標識分析体に対す
る抗体の結合に基づいて、直接的または間接的に変更さ
れる。免疫学的反応および検出の両者は均質溶液で遂行
される。採用される免疫化学標識はフリーラジカル、放
射性同位元素、蛍光染料、酵素、バクテリオファージ、
補酵素等を含む。

【００２５】不均質検定方法において、試薬は通常験
体、本発明の抗体（例えばLu4B5 ）および検出し得るシ
グナルを生成するための手段である。験体は通常プレー
トまたはスライドのごとき支持体上に固定され、液層で
抗体と接触される。支持体はその後液層から分離され、
支持体層または液層のいずれかが検出すべきシグナルを
生成するための手段を採用して試験される。シグナルは
験体中の分析体の存在に関係する。検出し得るシグナル
を形成するための手段は放射性標識、蛍光体、酵素等の
使用を含む。不均質免疫検定法の例は放射免疫検定法、
免疫蛍光法、酵素−結合免疫検定法等である。下記の刊
行物を参照せよ。「酵素−免疫検定（Enzyme-Immunoass
ay,by Edward T. Maggio,CRC Press,Inc.,Boca Raton,F
l.,1980 ）」、アメリカ国特許第4,906,562号、第4,86
3,854号および第4,818,682 号。これらの記述は本明細
書に参考文献として組入れられる。

【００２６】上記したごときモノクローノル抗体は、標
識されたモノクローナル抗体および結合モノクローナル
抗体の両者ための源として役立つ単細胞系とともに、
「ツーサイト」または「サンドイッチ」検定に好都合に
使用される。かかる検定はアメリカ国特許第4,376,110
号に記述され、かかる記述は本明細書に参考文献として
組入れられる。

【００２７】本発明は上記した方法を遂行するための診
断キット（kit ）を含む。ー具体例においては、診断キ
ットは（ａ）本発明の抗体（例えばLu4B5 ）および
（ｂ）前記モノクローナル抗体のための特異な結合相手
と検出し得るシグナルを形成することができる標識との
配合体（conjugate ）からなる。試薬は緩衝剤および蛋
白質安定剤等、例えばポリサッカライドおよびその類似
物のごとき補助剤を含んでもよい。診断キットは必要に
より、シグナル形成システムの他のメンバー（標識はー
メンバーである）、試験において妨害の遠因を減少する
ための剤、制御剤、試験を導くための機器およびこれに
類似する物を含んでいてもよい。他の具体例において
は、診断キットは本発明の抗体（例えばLu4B5 ）と検出
し得るシグナルを形成することのできる標識との配合体
からなる。同キットにおいては上記したごとき補助剤が
存在されてもよい。

【００２８】本発明は次の実施例に基づき更に詳細に説
明される。これらの実施例は例示的なのもであり、本発
明の限定をなすものではない。

【００２９】

【実施例】

（実施例１）［気管支の洗液から供される液状試料の準備］気管支洗
液は４グループの患者から得た。この４グループの患者
は次の通りである。(1)肺を大細胞の腺癌に侵されてい
る患者；(2)肺を偏平細胞癌に侵されている患者；(3)ヘ
ビースモーカー（20年以上）である患者（癌はない）；
(4)非喫煙者。これらの被検者から常法（J.D.Iglehart
et al.,82 J. Thorac. Cardiovasc.Surg. 63(1981)参
照）に従い、20ミリリットルの中性塩溶液を注入、吸引
することにより、気管支の洗液が得られた。時には、試
料提供に協力してくれた患者に刺激剤を入れた温湿空気
を呼吸器に吸入することによって、気管支洗液の代わり
に喀たんを得た。これらの気管支洗液（または喀たん）
は４つの試料として集め、準備した試験管に入れた。続
いて、それぞれの試験管から１０ミリリットルの試料を
採り、燐酸緩衝溶液で希釈、セファクリールS400カラム
（Sephacryl S400 column ）にかけてカラムクロマトグ
ラフィーを行うことによって精製した。溶媒のみのフラ
クションに続き高分子のフラクションが分離でき、この
フラクションはモノクローナル抗体の産生と分離に用い
られた。

【００３０】（実施例２）［Lu4B5ハイブリドーマ細胞系の準備］Lu4B5ハイブリド
ーマ細胞系は、前記実施例１に示した、肺を大細胞の腺
癌に侵されたグループから得られる喀たんの試料を分
離、精製した高分子のフラクションで免疫したBalb/C二
十日鼠の脾細胞と、NS-1骨髄腫細胞を融合させたものか
ら発見された。その結果得られた抗体は二十日鼠を免疫
した肺癌の喀たんの試料に選択的に結合しつつスクリー
ンされた。一方、この抗体は実施例１で示した非喫煙者
グループから採取した喀たんの試料から得られる高分子
のフラクションと一致する特異的結合を持たない。この
スクリーニングはパンデックススクリーンマシン（Pa
ndex screen machine）（Baxter、Chicago、Illinois）を
用いて間接的蛍光抗体法分析（indirect immunofluores
cence assay ）をすることによって行われた。喫煙患者
から採取した喀たんの試料の高分子フラクションの反応
性についても分析された。その選択された抗体グループ
はパンデックススクリーンマシンを利用して蛍光抗体
法分析を行う際の標準として利用された。

【００３１】Lu4B5ハイブリドーマ細胞はNS-1骨髄腫細
胞をBalb/Cマウス脾細胞と４回融合させて得られる791
のクローンから産生された。その細胞系は IgG₁抗体の
産生に基づいて選択された。IgG₁抗体はマウスを免疫す
るために用いた高分子フラクションとは反応するが、非
喫煙者から採取した喀たんから得た高分子フラクション
とは反応しない。ヘビースモーカーから採取した喀たん
から得られる高分子フラクションとは中程度結合するこ
とがわかった。ハイブリドーマLu4B5はアメリカンタ
イプカルチャーコレクション（theAmerican Type C
ulture Collection, Rockvile, Maryland, 20852, USA
）にブタペスト協定に基づいて1990年4月17日に寄託さ
れ、それには寄託番号としてATTC No. HB 10425が付与
されている。

【００３２】（実施例３）［Lu4B5細胞系から得たLu4B5抗体の産生］選択された抗
体の数ミリグラムは初期の第一のBalb/Cマウスに Lu4B5
ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射をすることにより産生
された。このマウスの腹水液を採取して、P. Eyらの方
法（P.Ey et al.,Isolasion of pure IgG₁，IgG₂，and
IgG_2bimmunoglobulins from mouse using Protein A Se
pharose，15 Immunochemistry 429(1978) ）によるプロ
テインAカラムクロマトグラフィーにより抗体が分離さ
れた。

【００３３】（実施例４）［固定されたLu4B5抗体を用いた4B5抗原の部分的精製］
肺癌患者や食道癌患者から集めた大量の気管支洗液の試
料が抗原の源泉とされた。その抗原は大量の抗原を含む
ことがわかっている10の気管支洗液の集液からアンモニ
ウム塩沈澱（50-75%塩濃度）によって濃縮された。この
沈澱物は燐酸緩衝溶液（PBS）で調整された後、過剰の
塩を除去するため何回も透析を行って、PBSと分離して
濾過された。濃縮された抗原は更に 2.5×17cmのS400ゲ
ルを充填したカラム（Pharmacia, Piscataway, New Jer
sey ）を通過させることによって精製された。2ミリリ
ットルのサンプルをカラムから集め、わさび（hoarse-r
adish）の過酸化酵素（Kirkegaard & Perry Labs, Gait
hersburg, Maryland ）で標識したヤギの抗ネズミ抗体
を用いた間接的な抗原の検出法を利用して、エリサ法
（ELISA system）により分析した。

【００３４】4B5抗原を含むフラクションを集めてミリ
キュ（MilliQ）に抗して透析し、凍結乾燥して濃縮し
た。次いでこのフラクションは 4B5抗体と結合したアフ
ィゲル（Affi-gel）（Bio-Rad,Richmond,California ）
免疫親和性カラム上を通された。固形サポートに対する
抗体の結合は0.1Mの重炭酸ナトリウムを結合体の緩衝液
に用いてなされた。この方法によると 75%以上の効率で
結合体が得られた。このゲルは100mlの燐酸緩衝溶液で4
℃でpH 6.8に調節された。部分的に精製された抗体をカ
ラムに結合させた後、そのベッドを10容積の界面活性剤
（燐酸緩衝溶液中に0.2%のノニデットP-40を溶解）で洗
浄し、抗原とカラムに非特異的に結合している脂質を除
去した。更にカラムを燐酸緩衝溶液に0.5M溶解した溶液
10容量で洗浄し、イオン結合により抗原とカラムに特異
的に結合していない汚染菌を除去した。カラムはもう一
度100mlの燐酸緩衝溶液でpH 6.8に調整され、その後抗
体は1.0mlの水酸化アンモニウムと15%のエチレングリコ
ールでpH1.5に希釈された。親和性カラムから得られた
フラクションは氷酢酸によって中和された。こうして希
釈された溶液はミリキュ（MilliQ）に抗して濾過するこ
とにより溶媒を除去し、最終生産物として濃縮して凍結
乾燥された。

【００３５】（実施例５）［4B5抗原のSDS-PAGE］多数の気管支洗液が集められ
て、 4B5抗原を産生するために上記実施例４に述べた方
法で部分的に精製された。この精製された生産物は常法
であるSDS 、即ちポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PA
GE）にかけられた。この電気泳動法として特にLaemmli
（U．Laemmli, 227 Nature 680 (1970)）の手法を用い
る。このサンプルの緩衝液はスルフヒドリル基を有する
還元剤を用いて、あるいは用いないで流され、ゲル上に
置く前に30分間加熱された。この抗原は4%のポリアクリ
ルアミドを溶かしたゲルで電気泳動した。

【００３６】この抗原は25mMのトリス、192mMのグリシ
ン緩衝液、20%のメタノールからなるpH8.3の溶液中で電
気泳動（electroblotting）（100V,3h,4C）を行うこと
によってニトロセルロース（Schleicher and Schuell,
Keene, Now Hampshire）に移動された。タンパク質の検
出はABC-アルカリンフォスファターゼキット（ABC-
Alkaline Phosphatase Kit）（Vector Labs, Burlingam
e, California ）を用いて電気泳動することにより行わ
れた。簡単にいえば、ニトロセルロースにトリス緩衝塩
溶液（100mMのトリス，0.5MのNaCl，pH7.5）にトウィー
ン20を 0.1(V/V)%混ぜた溶液を含浸し、3%のゼラチンで
ブロック保持した。ブロック後にニトロセルロースを L
u4B5抗体に触れさせ、次いで抗体を30分間ビオチン化し
た。次にこのタンパク質をアビジンアルカリ燐酸化酵素
複合体で30分間処理した。黒い斑点の反応生成物はアル
カリ燐酸化酵素の基質（Vector Labs,Burlingame,Calif
ornia）として膜を培養する最終段階を行って生成され
た。それぞれの免疫沈降線（immunoblot）は少なくとも
一つの陰極性の軌跡を含んでおり、それはMPOC/21で免
疫ブロットされた。

【００３７】（実施例６）［凍結した組織の免疫組織化学的な分析］外科的に切除
した細胞はすぐに液体窒素により -70℃にして凍結さ
れ、使用する時点まで保存された。凍結された組織はＯ
ＣＴ化合物（Miles Laboratories,Erkhart, IL）に封埋
して細断するまで固定化しておく。凍結化された組織を
4-6ミクロンの大きさに-16℃で細断（AO Microtomecryo
stat,Buffalo,NY）し、0.5%のゼラチンと0.5%の重クロ
ム酸カリウム（それぞれ、Fisher Chemical, Fair Law
n, NJ; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）の上に載
せてスライドグラスに塗布した（Triangle Biomedical
Sciences, Durham, NC）。スライドグラスは一昼夜放置
して乾燥し、室温で10分間、アセトンで固定化（Mallin
ckrodt, Paris,KV）した後、0.01%のウシ血清アルブミ
ン（BSA; type IV, グロブリンを含まず, Sigma）を含
んでいる燐酸緩衝溶液（PBS）で3回洗浄した。そして、
PBSで希釈された 10%の正常なウシの血清（J. R. Scien
tifics, Ocala, FL）中で15分間、室温にて培養した。
更にこのスライドを過剰の血清を除去した後、拭き取っ
た。それからスライドは、上記実施例３で準備したモノ
クローナルIgG₁抗体Lu4B5（0.632mg/ml, 2%のPBS/BSA中
で1:1000に希釈）で60分間室温で培養した。

【００３８】非特異的免疫反応性を評価するために、同
様な対照スライドが精製したネズミIgG₁（0.359 mg/m
l、2%のPBS/BSA中で1:100に希釈；Coulter Immunology,
Hialcah, FL）で60分間室温で培養された。結合されて
いない抗体を除くために、スライドは 0.01%のPBS/BSA
中で3回洗浄された。次いでスライドはウマの抗ネズミ
ビオチン化されたIgG（horse anti-mouse biotinylated
IgG）（1.5mg/ml，2%のPBS/BSA中で 1:100に希釈；Vec
tor Laboratories, Burlington, CA）中で30分間室温で
培養された。結合されなかった抗体を除去するために、
スライドは 0.01%のPBS/BSA中で3回洗浄された。次いで
スライドはエリート溶液A及びB（Elite Solutions A an
d B）（Vectastain; Vector Laboratries ）中で製造業
者の指示書に従って室温で30分間培養された。スライド
は0.01%の PBS/BSA中で3回洗浄され、引き続いてジアミ
ノベンジジン溶液（diaminobenzidine solution ）（20
0ml のトリス塩酸（Tris-Hydrochloride）中で希釈され
た100mgの3',3-ジアミノベンジジンテトラヒドラクロ
ライド、pH 7.4；濾過により予め清浄され、使用直前に
2mlの 0.6%過酸化水素で活性化；Sigma）を使用して室
温で４分間処理（develop）された。スライドは20分間
水栓からの流水中で洗浄され、ジルズ３ヘマトキシリン
（Gills 3 hematoxylin）（Lerner Laboratories, Pitt
sburgh, PA）で対比染色された。スライドは余分の対比
染色剤を除くために水栓からの流水中で洗浄され、連続
した（75%,95%,95%,100%,100%）段階のエタノール（Aap
ar Chemical,Shelbyville, KY）により脱水された。ス
ライドはキシレン（Mallinckrodt）を2回替えてきれい
にされ、パーマウント（Permount）（Scientific Produ
cts, McGaw, IL ）カバーグラスで覆われた。

【００３９】これらのスライド実験は２名の研究者によ
って、互いに依存することなく評価された。ジアミノベ
ンジジン沈着の全般的な分布、強度、細胞質内における
局所化が記録された。免疫染色強度は０（反応が起きて
いないか、または対照スライドと比較して同程度の染色
強度）から＋＋＋＋（核を暗くする免疫染色）までの各
段階に分けられた。染色が陽性のスライドは＋または大
（greater）として評価された。代表的なスライドはニ
コンN-2000 SLRカメラ（Nikon, Garden City,NY）を組
み付けたオリンパスBH-2光学顕微鏡（Olympus Corporat
ion, Lake Success, NY）を用いて写真撮影された。

【００４０】（実施例７）［凍結した肺組織のモノクローナル抗体Lu4B5の免疫反
応性］初期の肺癌と肺癌に隣接する肺組織に対する Lu4
B5抗体の免疫反応性を評価するために、実施例６で説明
した免疫組織化学の手法により凍結した組織を分析し
た。そのデータを下記表１に示す。

【００４１】

【表１】 ──────────────────────────────────── 組織／部位発症した症例数／全体の症例数 ──────────────────────────────────── 腺癌／腫瘍１／４腺癌／気管支の縁１／３偏平細胞癌／腫瘍０／４偏平細胞癌／気管支の縁３／４正常肺／実質０／５正常肺／気管支０／２ ────────────────────────────────────

【００４２】Lu4B5抗体は免疫組織化学的に見ると、凍
結した組織の限られた部分において、非小癌細胞を有す
る肺癌の患者から外科的に得た気管支の縁に通常現れる
粘膜に重点的に結合して局所的に存在していることが判
った。また、ジアミノベンジジンは細胞の局所に沈着
し、それは粘液を分泌している杯細胞（Goblet cell ）
の基底核上に明らかに存在していることが判った。

【００４３】免疫反応性は、分泌する内腔のムチンや繊
毛にも見いだされた。更に気管支周囲の粘膜の下部にあ
る腺の病巣付近にも見いだされた。腫瘍細胞が免疫反応
性の物質を生産することは滅多にない。通常、細胞の免
疫反応性は腫瘍周辺の粘膜や気管支周囲の腺組織が最も
強く、腫瘍から離れるに従って同じ組織であっても免疫
反応性は明らかに低下している。肺癌のない患者から得
た肺の実質（肺胞の膜、肺細胞）や細気管支はLu4B5抗
体と反応することはない。

【００４４】（実施例８）［凍結した胸の組織におけるモノクローナル抗体Lu4B5
の免疫反応性］正常の胸、良性疾患の胸、悪性疾患の胸
について、 Lu4B5抗体の免疫反応性を実施例６に記載し
た免疫組織化学的な手法により調べた。そのデータを下
表２に示す。

【００４５】

【表２】 ──────────────────────────────────── 組織／部位発症した症例数／全体の症例数 ──────────────────────────────────── 正常０／２線維腺腫３／５癌／腫瘍細胞および／またはムチン１４／４１癌／癌と隣接する管の細胞および／またはムチン６／６癌／癌から離れた管の細胞および／またはムチン３／６ ────────────────────────────────────

【００４６】Lu4B5抗体は、肺癌患者の非小細胞の腫瘍
周辺領域に形態学的に通常現れる粘膜の分泌生産物を認
識するようである。尚、この生産物は新生の増殖性細胞
から分泌されることは滅多にない。胸の細胞についても
先と同様に、免疫反応性を調べた。このデータから、生
検試験した正常の細胞から採った管の組織（ductailstr
ucture）からは免疫反応性物質が生産されないことが
判る。これに対し、胸の癌細胞からは調べた症例の 30%
近くが、免疫反応性物質を生産している。腫瘍周辺領域
の管の組織では調べた全てに場合において、免疫反応性
物質を分泌していることが判る。しかしながら、幾分離
れた管の細胞においては、免疫反応性物質の産生頻度は
50%にまで減少した。更に、線維腺腫の症例においても
免疫反応性物質の生産が見られた。これらのデータは、
胸の症例の場合においても非小細胞の肺癌患者の症例の
場合と同様、 Lu4B5の反応性物質の似たパターンを示す
ことを示唆している。 Lu4B5抗体は、腫瘍周辺領域内の
正常の胸の管に分泌された生産物と反応し、またこの標
識は悪性に変換する前に、粘膜細胞内で前癌性の変化が
起きることを知らせるようである。 Lu4B5の免疫反応性
は、単に肺癌が悪性かどうかを確認することだけに限ら
れるものではない。

【００４７】（実施例９）［パラフィンに封埋した組織の免疫組織化学的分析］パ
ラフィンに封埋した組織を含有している取り付け枠をラ
イへルト−ユングヒストカット（Reichert-Jung Histoc
ut）（Heidelberg, West Germany）に載せた。組織部分
を4-6ミクロンに切断し、ヒストスティック（Histstic
k）（Dakopak, Santa Barbara, CA）に載置してスライ
ドグラス（Triangle Biomedical Sciences）を前被覆し
た。このスライドを56℃で60分間加熱し後、室温にまで
冷却し、続いてキシレンで3回、脱蝋した（Mallinckrod
t）。それから3回脱水エタノール（Aapar Chemical）で
処理してクリアにし、メタノールと過酸化水素水の混合
溶液（200mlのメタノールに3.3mlの 30%過酸化水素が含
まれている溶液；それぞれ Sigma, Mallinckrodt）30分
間、室温にて培養した。そして脱イオン水を入れて徐々
に平衡状態にし、10分間ほどすすぐ。それから3回、0.0
1%のウシ血清アルブミン（BSA;type IV, globulin-free
）を含有する燐酸緩衝溶液（PBS）で洗浄を行った。続
いてこのスライドを室温で20分間、PBSで希釈した20%の
標準ウマ血清（normal horse serum）（J. R. Scientif
ics）中で培養した。そして、過剰の血清を除去した
後、拭き取る。それからスライド上において、Lu4B5
（0.632mg/ml，2%のPBS/BSAで1:1000に希釈）を、モノ
クロナール抗体で90分間、室温で培養した。

【００４８】非特異的免疫反応性を評価するために、同
様な対照スライドが精製したネズミIgG₁（0.359 mg/m
l、2%のPBS/BSA中で1:100に希釈；Coulter）で90分間室
温で培養された。結合されていない抗体を除くために、
スライドは0.01%のPBS/BSA中で3回洗浄された。次いで
スライドはウマの抗ネズミビオチン化されたIgG（1.5mg
/ml、2%のPBS/BSA中で 1:100に希釈；Vector Laborator
ies）中で45分間室温で培養された。結合されなかった
抗体を除去するために、スライドは 0.01%のPBS/BSA中
で3回洗浄された。次いでスライドはエリート溶液A及び
B（Elite SolutionsA and B）（Vectastain; Vector La
boratries ）中で製造業者の指示書に従って室温で45分
間培養された。スライドは0.01%の PBS/BSA中で3回洗浄
され、引き続いてジアミノベンジジン溶液（diaminoben
zidine solution）（200mlのトリス塩酸（Tris-Hydroch
loride ）中で希釈された100mgの3',3-ジアミノベンジ
ジンテトラヒドラクロライド，pH 7.4；濾過により予
め清浄され、使用直前に 2mlの0.6%過酸化水素で活性
化；Sigma）を使用して室温で４分間処理（develop）さ
れた。スライドは20分間水栓からの流水中で洗浄され、
ジルズ３ヘマトキシリン（Lerner Laboratories ）で対
比染色された。スライドは余分の対比染色剤を除くため
に水栓からの流水中で洗浄され、連続した（75%,95%,95
%,100%,100% ）段階のエタノール（Aapar Chemical）に
より脱水された。スライドはキシレン（Mallinckrodt
）を2回替えてきれいにされ、パーマウント（Permoun
t）（Scientific Products ）カバーグラスで覆われ
た。

【００４９】これらのスライド実験は２名の研究者によ
って、互いに依存することなく評価された。ジアミノベ
ンジジン沈着の全般的な分布、強度、細胞質内における
局所化が記録された。免疫染色強度は０（反応が起きて
いないか、または対照スライドと比較して同程度の染色
強度）から＋＋＋＋（核を暗くする免疫染色）までの各
段階に分けられた。染色が陽性のスライドは＋または大
として評価された。代表的なスライドはニコンN-2000 S
LRカメラ（Nikon）を組み付けたオリンパスBH-2光学顕
微鏡（Olympus Corporation）を用いて写真撮影され
た。

【００５０】（実施例１０）［パラフィンに封埋した組織に封埋した肺組織におけ
る、モノクローナル抗体Lu4B5免疫反応性の免疫組織化
学的局所化］Lu4B5の免疫反応成分の免疫的局所化の実
験は実施例９に説明した免疫組織化学的手法によって行
われた。腫瘍部位は初期の肺癌の60症例の内57症例で、
外科的に気管支の縁を伴って得られた。その結果は下記
記載の表３に要約される。

【００５１】

【表３】 ──────────────────────────────────── 診断／部位発症した症例数／全体の症例数 ──────────────────────────────────── 非小細胞肺癌／腫瘍８／６０非小細胞肺癌／気管支の縁４１／５７肺に転移した癌／腫瘍０／２０肺に転移した癌／気管支の縁１／２０正常肺／実質０／４３正常肺／気管支１０／４３ ────────────────────────────────────

【００５２】Lu4B5の免疫反応性物質は、腫瘍周辺の副
分節の気管支や細気管支にある、形態学的には正常の気
管支の粘膜や粘膜下組織の腺構造に、 72%の頻度で突き
止められた。これに対し、新生の増殖性細胞では免疫反
応性物質の産生はほとんど見られない。免疫染色法を行
うと、繊毛の粘液層や口径だけでなく、杯細胞（goblet
cell）の細胞質の内部も染色されることが示された。
一般的に、免疫染色は腫瘍周辺領域から離れた部位では
相対的強度、範囲共に弱くなる。これに対し、転移した
癌の症例も正常の場合も、気管支粘膜や粘膜下組織の腺
の僅か 17%のみにしか免疫染色が示されなかった。免疫
染色は悪性症例に比較した場合、全体的強度が低く粘膜
の染色領域も小さかった。これらの所見は、免疫反応性
物質が気管気管支の分泌物の中に産生されている仮設を
立証するものであり、よって、気管支洗液や喀たんのど
ちらにも免疫反応性物質が見いだされるのである。その
上にこの免疫反応性物質は、大部分の肺癌患者、そして
肺癌になる可能性のある少なくとも何人かの患者に確認
されている。

【００５３】（実施例１１）［悪性の組織と正常の組織とのモノクローナル抗体Lu4B
5の免疫反応性］パラフィンに封埋した新生の増殖性細
胞組織、及び正常細胞組織の両方の組織（Xenetics, Ir
vine, CA）の多数の部位について、 Lu4B5抗体の免疫反
応性を実施例９で説明した免疫組織学的手法で評価し
た。そのデータを下記の表４に示す。

【００５４】

【表４】 ──────────────────────────────────── 組織型発症数／症例数 ──────────────────────────────────── 悪性腫瘍（Malignant）黒腫（melanoma）０／１０リンパ腫（lymphoma）０／８カルシノイド（carcinoid）０／９腺癌（adenocarcinoma）１／３０肉腫（sarcoma）０／１０結腸癌（colon carcinoma）４／３５未分化の癌（undifferentiated carcioma）０／８正常（Normal）精巣／卵巣（testis/ovary）０／９胃腸（gastrointestinal）２／９脾（spleen）０／９膵臓（pancreas）１／１０心臓（cardiac）０／９腎（renal）０／８肝（hepatic）０／１０肺（pulmonary）０／２副腎（adrenal）０／１０甲状腺（thyroid）０／１１結腸腺腫（colonic adenoma）０／３結腸（colon）１／１８ ────────────────────────────────────

【００５５】Lu4B5抗体は充実性の臓器と腫瘍組織との
間に僅かであるが交差反応性を有するようである。交差
反応性の大部分は胃腸管、特に結腸に局在して現れる。
結腸癌の４症例で免疫染色が認められ、その染色は腫瘍
の腺要素に顕著に局在して現れるようにみえた。腎杯の
染色は腺の管腔内に分泌された物質に沿って反応性があ
った。これと同様の染色は正常の結腸粘液の症例では 1
例にのみ現れ、小腸粘液の染色では 2例に認められてい
る。更に正常の膵臓管の症例の1例にLu4B5の反応性がは
っきりと認められた。けれども僅かに、 Lu4B5の交差反
応性は胃腸管の中の粘液を分泌している腺組織に限って
現れた。

【００５６】（実施例１２）［免疫ドロップ結合検定法］（Immunodrop Binding Assay）気管支洗液の検体は診断
のために気管支鏡検査を受けている患者から得た。全症
例において洗液は0.9%の塩化ナトリウムを約20ml注入す
ることにより得られた。サンプルは懸濁している細胞片
や残屑を除くために 2,000 rpmで遠心分離された。不純
物を除去した上澄みは冷凍され、使用するまで -70℃で
保存された。急速解凍の後、気管支洗液は30秒間攪拌さ
れ、10,000rpmで 60秒間遠心分離された。既知小量の上
澄み（0.10 ml）が被覆なしのガラススライド（Triangl
e Biomedical Sciences）上に置かれ、一晩中室温で空
気乾燥され、またはその代わりに37℃で60分間乾燥され
た。スライドは0.01%のウシ血清アルブミン（bovine se
rumalbumin ）（BSA；type IV，グロブリンを含まず，S
igma）を含む燐酸緩衝溶液（phosphate-buffered salin
e）（PBS）中で洗浄された。次いでスライドは15分間、
2%のPBS/BSAで希釈された5%の標準ウマ血清（normal ho
rse serum）（Coulter）中で予培養された。次いでスラ
イドは余分の血清が除去されて拭われた。スライドはモ
ノクローナルIgG₁抗体Lu4B5（0.632 mg/ml，2%のPBS/BS
A中で1:500に希釈）で60分間室温で培養された。

【００５７】非特異的結合を評価するために、同様な対
照スライドが精製したネズミIgG₁（0.359 mg/ml，2%のP
BS/BSA中で1:100に希釈；Coulter）で60分間室温で培養
された。結合されていない抗体を除くために、スライド
は 0.01%のPBS/BSA中で3回洗浄された。次いでスライド
はウマの抗ネズミビオチン化されたIgG（horse anti-mo
use biotinylated IgG）（1.5mg/ml，2%のPBS/BSA中で
1:100に希釈；VectorLaboratories）中で30分間室温で
培養された。スライドは 0.01%のPBS/BSA中で3回洗浄さ
れた。次いでスライドはエリート溶液A及びB（Elite So
lutions A andB）（Vectastain; Vector Laboratries
）中で製造業者の指示書に従って室温で30分間培養さ
れた。スライドは0.01%の PBS/BSA中で3回洗浄され、ジ
アミノベンジジン溶液（diaminobenzidine solution ）
（200ml のトリス塩酸(Tris-Hydrochloride)中で希釈さ
れた100mgの3',3-ジアミノベンジジンテトラヒドラク
ロライド、pH 7.4；濾過により予め清浄され、使用直前
に 2mlの0.6%過酸化水素水で活性化；Sigma）を使用し
て室温で4分間処理（develop）された。スライドは0.01
%のPBS/BSA中で3回洗浄され、ジルズ3ヘマトキシリン
（Gills 3 hematoxylin）（Lerner Laboratories）中で
室温で2分間対比染色された。次いでスライドは余分の
対比染色剤を除くために水栓からの流水中で洗浄され、
連続した（75%,95%,95%,100%,100%）段階のエタノール
（Aapar）により脱水された。スライドはキシレン（Mal
linckrodt ）を2回替えてきれいにされ、パーマウント
（Permount）（Scientific Products ）カバーグラスで
覆われた。

【００５８】スライドはサンプル内、特に固定されたム
チン形成物質の外縁で、ジアミノベンジジンの沈積が検
査された。陽性に染色されたスライドは同様な対照スラ
イドよりも強い免疫染色を示した。代表的スライドは上
部にニコンN-2000SLR カメラ（Nikon）を取り付けたオ
リンパスBH-2光学顕微鏡（Olympus Corporation）を使
用して写真撮影された。

【００５９】（実施例１３）［免疫ドロップ結合検定法による肺癌を有する患者の確
認］Lu4B5の抗原性物質のもっとも豊富な出所は、肺癌
患者の気管支内腔の腫瘍付近の領域内にあると考えられ
ている。この仮定は、免疫組織化学による新しく冷凍さ
れた組織及びパラフィンに封埋された（paraffin-embed
ded ）組織の両方における、 Lu4B5モノクローナル抗体
による免疫部位決定に基づいている。基礎的な検定法、
免疫ドロップ検定法は、気管支洗液検体から Lu4B5免疫
反応性を検出するための急速スクリーニング法として開
発された。この方法は上記実施例１２に記載されてい
る。データは表５に要約されている。

【００６０】

【表５】 ───────────────────────── 診断陽性症例数／検査症例数 ───────────────────────── 非小細胞肺癌３７／５７小細胞肺癌３／１３食道癌４／７肺に転移した癌３／１５良性肺疾患８／７８ ─────────────────────────

【００６１】免疫ドロップ結合検定法により、非小細胞
肺癌患者からの気管支洗液検体の65%中にLu4B5の免疫反
応性物質の産生が確認された。逆に転移性肺癌及び良性
肺疾患患者の気管支洗液では、それぞれわずか10%及び2
0%に免疫反応性物質が確認された。また、食道癌患者の
57%もLu4B5の免疫反応性物質を示した。これらのデータ
は、免疫ドロップ結合検定法で使用された Lu4B5モノク
ローナル抗体は非小細胞肺癌患者を特異的に確認するで
あろうことを示唆している。この免疫特異性は、ただ肺
癌に限定されるだけでなく、データに示された食道癌患
者にまで拡大されるかも知れない。

【００６２】（実施例１４）［気管・気管支ムチンの定量法］（Quantitation of Tracheobronchial Mucin）この定量
的比色沈降検定法はホワイトマン（Whiteman, P., Bioc
hem. J., 131:351-357, (1973)）により適用され、ホー
ル他（Hall, R., et al., Biochem. Soc. Trans., 8:7
2, (1980)）により部分修正され、気管支鏡検査で得ら
れた気管支洗液サンプル中の気管・気管支ムチン含有量
を定量的に評価するのに使用された。個々のサンプルは
30秒間攪拌されて1分間10,000rpmで遠心分離された。ム
チン標準試薬は牛の顎下のムチン（bovine submaxillar
y mucin）（type I; Sigma）の既成溶液1mg/ml から用
意された。

【００６３】既知小量（50マイクロリットル）の不純物
を除去した気管支洗液の上澄みと既知の標準試薬が1.5
mlのマイクロフュージチューブ（microfuge tube）に移
された。1 mlのアルシアンブルー試薬（50mMの酢酸ナト
リウム／50mMの塩化マグネシウムで希釈された0.1%W/V
のアルシアンブルー(Alcian Blue)8GX，pH 5.8；Sigm
a）が各サンプルに加えられた。サンプルは攪拌されて
室温で 2-4時間培養された。懸濁された青色沈降物は10
分間 10,000rpmでペレット化され上澄みは廃棄された。
ペレットは50mMの酢酸ナトリウム／50 mMの塩化マグネ
シウム溶液中で3回洗浄された。沈降物は1.0 mlのジメ
チルスルホキシド（dimethylsulfoxide）（DMSO;Fishe
r）中で再び懸濁された。サンプルは沈降物を更に分断
して可溶性を高めるために 3回連続した10秒間のバース
トで音波処理された。次いでサンプルは強く攪拌され
た。DMSOブランクは620nmで分光旋光計（Gilford Instr
uments, Model 260, Oberlin, OH）により解読された。
標準ムチン製剤が計測され、標準曲線が作られた。次い
で臨床サンプルのムチン含有量が標準曲線から決定され
た。１サンプル当たりの標準化された（50マイクログラ
ム）量の全ムチンが標準化された結合検定法で使用され
た。

【００６４】（実施例１５）［ニトロセルロースフィルタ免疫検定法］（Nitrocellulose Filter Immunoassay)気管支洗液の検
体は診断のために気管支鏡検査を受けている患者から得
た。全症例において洗液は0.9%の塩化ナトリウムを約20
ml注入することにより得られた。サンプルは懸濁してい
る細胞片や残屑を除くために 2,000 rpmで遠心分離され
た。不純物を除去した上澄みは冷凍され、使用するまで
-70℃で保存された。急速解凍の後、気管支洗液は30秒
間攪拌され、10,000rpmで 60秒間遠心分離された。0.45
ミクロンのニトロセルロース膜BA85（Schleicher and S
chuell）を予め設けた並列96凹部のドットブロットマニ
ホールド（dot blot manifolds）（Schleicher and Sch
uell, Keene, NH ）に、上記実施例１４に基づくアルシ
アンブルー比色沈降法（Alcian blue colorimetric pre
cipitation）により測定された１サンプル当たりムチン
50マイクログラムに相当する既知小量の上澄みが、 1凹
部当たり入れられた。配置されたサンプルはマニホール
ド内でブロワにより空気乾燥された。

【００６５】膜は0.3%の過酸化水素水（Sigma）100ml中
で30分間予培養された。次いで膜はTTBS（100mMのトリ
ス塩酸中に0.1%のトゥイーン(Tween) 20，0.5M のNaC
l，pH 7.5；Sigma ）中で30分間室温で培養された。引
き続いて膜はモノクローナルIgG₁抗体Lu4B5（0.632 mg/
ml、TTBS中で 1:500に希釈）で30分間室温で培養され
た。非特異的結合を評価するために、同様な対照スライ
ドが精製されたネズミIgG₁（0.359 mg/ml，TTBS中で1:1
00に希釈；Coulter ）で30分間室温で培養された。結合
されていない抗体を除くために、膜はTTBS中で 4回洗浄
された。次いで膜はウマの抗ネズミビオチン化されたIg
G（1.5mg/ml，TTBS中で 1:100に希釈；Coulter）中で30
分間室温で培養された。

【００６６】膜はTTBS中で4回洗浄され、次いで5ミリリ
ットルのTTBSで希釈されたエリート溶液A及びB（Vectas
tain; Vector Laboratries）中で30分間室温で培養され
た。膜はTTBS中で4回洗浄され、それから引き続いてジ
アミノベンジジン溶液（200mlのトリス塩酸中で希釈さ
れた100mg の3',3-ジアミノベンジジンテトラヒドラク
ロライド,pH 7.4；濾過により予め清浄され、使用直前
に2mlの0.6%過酸化水素水で活性化;Sigma）を使用して
室温で2-4分間処理（develop）された。膜はTTBS中で4
回洗浄されて空気乾燥された。

【００６７】免疫反応性はニトロセルロース膜上へのジ
アミノベンジジンの沈着により評価された。陽性の免疫
染色は０（免疫染色なしまたは対照免疫反応性と同等の
染色）から＋＋＋＋（強い免疫染色）まで記録された。

【００６８】（実施例１６）［ Lu4B5モノクローナル抗体を用いた標準化されたニト
ロセルロース免疫検定法による肺癌患者の確認］免疫ド
ロップ結合検定法が免疫反応性のために標準化されてい
ないムチンのサンプルを利用しているのに対し、ニトロ
セルロースフィルタ免疫検定法は検査されるサンプル当
たり当量の全ムチンを使用するよう工夫された。全ムチ
ンの計量及び標準化されたニトロセルロースフィルタ免
疫検定法の報告書は実施例１４及び１５に与えられてい
る。そのデータは表６に要約されている。

【００６９】

【表６】 ───────────────────────── 診断陽性症例数／検査症例数 ───────────────────────── 非小細胞肺癌３０／５７小細胞肺癌６／１３食道癌４／７肺に転移した癌３／１５良性肺疾患１２／７８ ─────────────────────────

【００７０】Lu4B5の免疫反応性物質は、非小細胞肺癌
患者から得られた気管支洗液の53%に確認された。またL
u4B5の免疫反応性物質は、小細胞肺癌患者からの洗液の
46%に確認された。食道癌及び肺に転移した癌の症例で
は Lu4B5の免疫反応性物質の検出頻度は、それぞれ57%
及び20%にとどまった。この免疫検定法での免疫特異性
は、良性肺疾患の症例においては5%だけ減少した。この
免疫検定法は、初期肺癌患者の確認については、感度及
び特異性が多少減少することが示された。しかしなが
ら、定量的に標準化されたニトロセルロースベースの放
射線免疫検定法のための基礎として有用である。

【００７１】（実施例１７）［ニトロセルロースベースの放射線免疫検定法］（Nitrocellulose-Based Radioimmunoassay）気管支洗
液の検体は診断のために気管支鏡検査を受けている患者
から得た。全症例において洗液は0.9%の塩化ナトリウム
を約20ml注入することにより得られた。サンプルは懸濁
している細胞片や残屑を除くために 2,000 rpmで遠心分
離された。不純物を除去した上澄みは冷凍され、使用す
るまで -70℃で保存された。急速解凍の後、気管支洗液
は30秒間攪拌され、10,000rpmで 60秒間遠心分離され
た。0.45ミクロンのニトロセルロース膜BA85（Schleich
er and Schuell）を予め設けた並列96凹部のドットブロ
ットマニホールド（Schleicher and Schuell）に、アル
シアンブルー比色沈降法により測定された 1サンプル当
たりムチン50マイクログラムに相当する既知小量の上澄
みが、 1凹部当たり入れられた。配置されたサンプルは
マニホールド内でブロワにより空気乾燥された。

【００７２】膜は0.1%のウシ血清アルブミン（BSA; typ
e IV,グロブリンを含まず；Sigma）を含むブロット溶液
（Blotto solution）（2%の脱脂粉乳，1%のトリトン(Tr
iton) X-100, 50mMのトリス塩酸, pH 7,5, 10mMのエチ
レンジアミン四酢酸; Sigma）中で60分間室温で連続し
て穏やかにかき混ぜながら予培養された。膜はブロット
溶液中で4回洗浄され、引き続いてモノクローナルIgG₁
抗体Lu4B5（0.632mg/ml、ブロット溶液中で 1:500に希
釈）で30分間室温で培養された。非特異的結合を評価す
るために、同様な対照スライドが精製されたネズミIgG₁
（1.0 mg/ml,ブロット溶液中で1:1400に希釈；Coulter
）で30分間室温で培養された。結合されていない抗体
を除くために、膜はブロット溶液中で 4回洗浄された。
次いで膜は羊の抗ネズミ［¹²⁵I］-標識F(ab')₂ Ig小片
（149 uCi/ml: New England Nuclear, Wilminton, DE）
10⁷ cpm／膜で60分間室温で培養された。膜はブロット
溶液中で 4回洗浄され、引き続いて空気乾燥された。個
々の円い範囲が膜から切断され、結合がガンマカウンテ
ィング（gamma counting）（Packard Instruments, Ste
rling, VA）により計量された。

【００７３】特異的結合は全部の結合（モノクローナル
抗体Lu4B5により結合されたcpmにより示される）から非
特異的結合（ネズミIgGにより結合されたcpm結合により
示される）を引くことにより決定された。

【００７４】（実施例１８）［ Lu4B5モノクローナル抗体を用いた標準化されたニト
ロセルロース放射線免疫検定法による初期肺癌患者の確
認］気管支洗液中の Lu4B5の免疫反応性物質の量的特異
的結合は、上記実施例１７に述べた標準化されたニトロ
セルロース放射線免疫検定法の配置を用いて評価され
た。データは下記表７及び８に要約されている。

【００７５】

【表７】 ───────────────────────── 診断陽性症例数／検査症例数 ───────────────────────── 非小細胞肺癌２６／４３小細胞肺癌６／９食道癌２／４肺に転移した癌１／１２良性肺疾患１５／７２ ─────────────────────────

【００７６】

【表８】 ───────────────────────────────── 診断 ─────────────────────────── 非小細胞小細胞肺に転移良性変量肺癌肺癌食道癌した癌肺疾患 ───────────────────────────────── 数４３９４１２７２年齢（中央値、 64.0 61.0 66.5 56.5 56.0 才）喫煙（中央値、 45.0 65.0 60.0 0.0 20.0 パック／年）ムチン（中央値、 0.35 0.36 1.37 0.24 0.38 mg／ml）ＲＩＡ（中央値、 686 651 700 220 217 cpm） ─────────────────────────────────

【００７７】標準化されたニトロセルロース放射線免疫
検定法を使用して、 Lu4B5の免疫反応性物質の一部は非
小細胞肺癌患者からの気管支洗液の61%に確認された。
更に、小細胞癌患者の67%はがLu4B5の免疫反応性物質を
産生した。これに対し、転移性肺癌または良性肺疾患患
者は、それぞれ 8%及び21%が気管支洗液検体中に免疫反
応性物質を分泌していた。これらの偽陽性患者は15例中
10例が相当な喫煙歴を有しており、他の一人の患者は職
業上既知の発癌物質に相当さらされており、何れの状況
も肺癌の発生の高い危険を伴うことが知られている。こ
れらのデータは、Lu4B5の免疫反応性物質は初期肺癌患者
の気管支分泌物中に、更に食道癌患者の分泌物中に、初
期に産生され検出可能であることを示唆している。標準
化されたニトロセルロース放射線免疫検定法は、気管支
洗液中にLu4B5の免疫反応性物質の一部を確認する感度
が高くまたかなり特異的な方法を提供する。

【００７８】（実施例１９）［二重決定基ニトロセルロースベースの放射線免疫検定
法］（Double-Determinant Nitrocellulose-based Radioimm
unoassay）ポスチレンの平底多凹部容器（flat bottom
wells）（Immulon 2 Removawell;Dynatech Laboratorie
s; Chantilly, VA）は、モノクローナルIgG₁抗体Lu4B5
（50mMのトリス塩酸7ml中に希釈された 0.632mg/mlの既
成溶液55.4マイクロリットル，pH 7,5，0.1%のtypeIV，
グロブリンを含まないウシ血清アルブミンを含む；BS
A；Sigma）、または精製されたネズミIgG₁（50mMのトリ
ス塩酸 7ml中に希釈された1.0mg/mlの既成溶液35.0マイ
クロリットル，pH 7.5/BSA 0.1%）1.0マイクログラム
で、一晩中4℃でプリコートされた。容器は脱イオン水
で2回洗浄され、50mMのトリス塩酸，pH 7.5，中に希釈
された1%のBSA 0.40mlで、60分間室温で上塗りされた。
次いで容器は脱イオン水で5回洗浄され、1凹部当たり50
マイクログラムのムチンが入れられ、室温で2時間また
はその代わりに4℃で一晩中培養された。結合されなか
った物質を除去するために、容器は再び脱イオン水で 5
回洗浄された。放射線標識された［¹²³I］-Lu4B5（190
uCi/mlの既成溶液の 1:200希釈溶液0.20ml）が各凹部に
加えられ、室温で 2時間培養された。容器は結合されな
かった放射線標識抗体を除去するために脱イオン水で 5
回洗浄された。次いで各凹部は分離され、結合がガンマ
カウンティング（Packard Instruments ）により計量さ
れた。

【００７９】特異的結合は全部の結合（モノクローナル
抗体Lu4B5により結合されたcpm結合により示される）か
ら非特異的結合（ネズミIgGにより結合されたcpm結合に
より示される）を引くことにより決定された。

【００８０】（実施例２０）［二重決定基放射線免疫検定法におけるモノクローナル
抗体Lu4B5 の免疫反応性］感度がよく特異性のある免疫
反応性を維持するためのモノクローナル抗体Lu4B5 の能
力は、実施例１９で記載したニトロセルロースベースの
二重決定基”サンドイッチ”放射線免疫検定法を使用し
て評価された。特異的結合はニトロセルロースベースの
免疫検定法により先に評価された免疫反応性と比較され
た。更に抗原滴定及び延長された培養の両者が評価され
た。結果は下記の表９に要約される。

【００８１】

【表９】 ───────────────────────────────── ニトロセルロースニトロセルロース二重決定基サンプル免疫検定法ＲＩＡ(cpm) ＲＩＡ(cpm) ───────────────────────────────── NSCLC-1 +++ 1555 4584 NSCLC-2 +++ 4380 2441 NSCLC-3 ++ 733 1938 NSCLC-4 ++ 3867 2056 NSCLC-5 + 123 2334 NSCLC-6 + ND 1577 SCLC-1 +++ 3534 2394 SCLC-1 (16hr) ND ND 789 SCLC-1 (1:2) ND ND 1326 SCLC-1 (1:4) ND ND 976 SCLC-1 (1:8) ND ND 595 SCLC-1 (1:16) ND ND 347 SCLC-1 (1:32) ND ND -126 SCLC-1 (1:64) ND ND -120 SCLC-1 (1:128) ND ND 32 ESOPH-1 +++ 1652 3573 BENIGN-1 0 59 -123 BENIGN-2 0 300 -257 BENIGN-3 0 303 295 BENIGN-4 0 87 127 BENIGN-5 0 130 -57 BENIGN-6 +++ 2858 2931 BENIGN-7 +++ 2116 2156 BENIGN-7 (16hr) ND ND 4293 BUFFER-1 0 201 -152 BUFFER-1 (16hr) ND ND 69 BUFFER-2 0 184 -462 BUFFER-2 (16hr) ND ND -36 ─────────────────────────────────

【００８２】モノクローナル抗体Lu4B5は、非小細胞肺
癌（NSCLC）の6症例、小細胞肺癌（SCLC）の1症例及び
二重決定基”サンドイッチ”放射線免疫検定法方式での
食道癌（ESOPH）の1症例からの気管支洗液と特異的に反
応した。更に、良性肺疾患の 5症例では、きわめて僅か
の特異的結合しか定量されなかった。偽陽性に反応して
いることが知られた 2つの良性症例では、二重決定基検
定法は依然として意味ありげな免疫反応性を示した。従
って、抗体Lu4B5 により認識された抗原は多様に表現さ
れる、すなわち”サンドイッチ”方式で結合が許容され
る抗原性基質ごとに、多様な相互反応的エピトープが存
在するようである。更に、従来の間接的、非サンドイッ
チ免疫検定法に比して、反応性の減少はないように見
え、この免疫反応性はこれらの従来の検定法と都合よく
互いに関連するようである。延長された培養は免疫反応
性を増大するようには見えない。最後に、免疫反応性は
抗原性物質（気管支洗液）が希釈されるにつれて順次直
線的に減少する。

【００８３】以上に述べた各実施例は本発明を説明する
もので、それを限定するものではない。本発明は特許請
求の範囲の記載により定義され、その均等物も含まれ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ジェイ．ダークイグルハートアメリカ合衆国ノースカロライナ州 27701 ダーラムワッツストリート 703 (72)発明者マーガレットエイ．ドイッチアメリカ合衆国ノースカロライナ州 27510 カーボロアパートメントＤＤ− ９ジョーンズフェリーロード 605 (72)発明者ジェフリーシー．ペンスアメリカ合衆国メリーランド州 20740 カレッジパークシタデルドライブ 7519

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】モノクローナル抗体Lu4B5、モノクローナ
ル抗体Lu4B5により結合された抗原に結合するモノクロ
ーナル抗体、およびモノクローナル抗体Lu4B5 により結
合された抗原に結合するモノクローナル抗体の小片から
なる群から選ばれたモノクローナル抗体。
【請求項２】モノクローナル抗体Lu4B5、モノクローナ
ル抗体Lu4B5により結合されたエピトープに結合するモ
ノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体Lu4B5 に
より結合されたエピトープに結合するモノクローナル抗
体の小片からなる群から選ばれた請求項１に記載のモノ
クローナル抗体。
【請求項３】請求項１に記載のモノクローナル抗体にお
いて、前記小片が Fab小片、F(ab')₂小片および Fv小片
からなる群から選ばれることを特徴とするモノクローナ
ル抗体。
【請求項４】検出可能なシグナルを形成することができ
る標識に接合する請求項１に記載のモノクローナル抗
体。
【請求項５】請求項４に記載のモノクローナル抗体にお
いて、前記標識がフリーラジカル、蛍光染料、酵素、放
射性同位元素、バクテリオファージ、および補酵素から
なる群から選ばれることを特徴とするモノクローナル抗
体。
【請求項６】請求項１に記載のモノクローナル抗体を生
成することができる細胞系。
【請求項７】細胞系がハイブリドーマ細胞系および大腸
菌細胞系からなる群から選ばれる請求項６に記載の細胞
系。
【請求項８】被検者から採取したサンプルを請求項１に
記載のモノクローナル抗体に、同モノクローナル抗体が
反応生成物を生成することを許容される条件下で接触さ
せること、および同反応生成物の存否を検出することか
らなる癌の存在を検出する方法。
【請求項９】請求項８に記載の検出方法において、前記
サンプルが粘液分泌物であることを特徴とする癌の存在
を検出する方法。
【請求項１０】請求項８に記載の検出方法において、前
記サンプルが気道の粘液分泌物およびエアロ−消化管の
分泌物からなる群から選ばれることを特徴とする癌の存
在を検出する方法。
【請求項１１】下記の事項からなる被検者の癌または癌
の危険を検出することができる抗体を生成する方法。被
検者の癌組織から粘液分泌物を収集すること；収集され
た粘液分泌物から生成された非細胞相を準備すること；
非細胞相に含まれた抗原に対する多数の抗体を生成する
こと；前記多数の抗体から被検者の癌または癌の危険を
選択的に検出することができる抗体を選択すること；
【請求項１２】請求項１１に記載の方法において、前記
多数の抗体を生成する工程が下記の工程からなることを
特徴とする方法。非細胞相を動物受容体に供給するこ
と；動物受容体から脾臓細胞を収集すること；収集され
た脾臓細胞を不滅の細胞と融合してハイブリドーマを生
成すること；被検者の癌および癌の危険を選択的に検出
することができる抗体を生成するハイブリドーマ細胞を
選択すること；
【請求項１３】請求項１１に記載の方法において、癌組
織が上皮組織であることを特徴とする方法。
【請求項１４】請求項１１に記載の方法において、粘液
分泌物が気道分泌物およびエアロ−消化管分泌物からな
る群から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項１５】請求項１１に記載の方法において、非細
胞相がムチン含有物であることを特徴とする方法。
【請求項１６】（ａ）請求項１に記載の抗体と、（ｂ）
同抗体のための特異的に結合する相手と検出可能なシグ
ナルを生成することができる標識との配合体からなるテ
ストキット。