JPH0686693A - 生体物質の測定方法 - Google Patents
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 臨床検査などの分野で使用され、血清、尿な
どの検体中の生体物質の新規な測定法を提供することを
目的とする。 【構成】 本発明は、酵素反応を用いて生体物質を測定
する方法であり、ピルビン酸脱水素酵素の存在下、ＮＡ
Ｄ+類をＮＡＤＨ類に還元する反応を用い、ＮＡＤＨ類
の生成量に基づいて生体物質を測定することからなる。
本発明の方法では、ＮＡＤＨ類の生成量に基づいて生体
物質を測定するので、測定限界が高く、また検体中の還
元物質などの影響を受けないという利点を有する。従っ
て、本発明によれば、生体物質を高精度且つ高範囲に測
定することができ、自動分析にも適用することができる
という効果を奏する。
どの検体中の生体物質の新規な測定法を提供することを
目的とする。 【構成】 本発明は、酵素反応を用いて生体物質を測定
する方法であり、ピルビン酸脱水素酵素の存在下、ＮＡ
Ｄ+類をＮＡＤＨ類に還元する反応を用い、ＮＡＤＨ類
の生成量に基づいて生体物質を測定することからなる。
本発明の方法では、ＮＡＤＨ類の生成量に基づいて生体
物質を測定するので、測定限界が高く、また検体中の還
元物質などの影響を受けないという利点を有する。従っ
て、本発明によれば、生体物質を高精度且つ高範囲に測
定することができ、自動分析にも適用することができる
という効果を奏する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生体物質の測定方法に関
する。より詳細には、臨床検査などの分野で用いられ、
血清、血漿、尿などの検体中の生体物質の測定（定量及
び活性測定）に関する。
する。より詳細には、臨床検査などの分野で用いられ、
血清、血漿、尿などの検体中の生体物質の測定（定量及
び活性測定）に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、臨床検査、生化学検査などの分野
においては、生体物質の定量や酵素活性の測定が頻繁に
行われており、この測定には反応特異性の高い酵素反応
を用いた方法が汎用されている。このような酵素反応を
用いた生体物質の測定法においては、例えば、測定対
象である生体物質が関与し且つ過酸化水素を生成する酵
素反応系を用い、生成した過酸化水素をパーオキシダー
ゼの存在下、発色性物質と反応させることにより発色さ
せ、その吸光度変化量に基づいて生体物質を測定する方
法；測定対象である生体物質が関与し且つＮＡＤＨ
（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）から
ＮＡＤ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド）を生成する酵素反応系を用い、ＮＡＤＨの吸光度減
少量に基づいて生体物質を測定する方法などが用いられ
ている。
においては、生体物質の定量や酵素活性の測定が頻繁に
行われており、この測定には反応特異性の高い酵素反応
を用いた方法が汎用されている。このような酵素反応を
用いた生体物質の測定法においては、例えば、測定対
象である生体物質が関与し且つ過酸化水素を生成する酵
素反応系を用い、生成した過酸化水素をパーオキシダー
ゼの存在下、発色性物質と反応させることにより発色さ
せ、その吸光度変化量に基づいて生体物質を測定する方
法；測定対象である生体物質が関与し且つＮＡＤＨ
（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）から
ＮＡＤ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド）を生成する酵素反応系を用い、ＮＡＤＨの吸光度減
少量に基づいて生体物質を測定する方法などが用いられ
ている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記の測定方法にお
いては、検体中に存在する還元性物質（例えば、尿酸、
アスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン等）や酸化
性物質などにより過酸化水素の分解などが生じやすく、
正確な値を与えない場合がある。一方、上記の方法に
おいては、十分量の基質（ＮＡＤＨ、補酵素等）を反応
系に添加することが困難なので定量限界が低く、また測
定波長における検体の吸収（濁り、溶血、黄疸等）によ
り測定できる範囲が狭くなるという問題がある。このよ
うな問題から、酵素反応による生体物質の測定に際して
は、ＮＡＤＨを生成する反応系を用い、生成するＮＡＤ
Ｈの吸光度の上昇に基づいて生体物質を測定する方法が
好適であり、自動分析にも適している。かかる観点か
ら、本発明者等は、ＮＡＤＨを生成する酵素反応であ
り、単独で又は他の酵素反応系と共役させることによ
り、生体物質の測定に広く利用できる酵素反応を鋭意検
討した結果、ピルビン酸脱水素酵素（E.C 1.2.4.1、以
下、ＰＤＨという）の存在下、ＮＡＤ+、チオ−ＮＡ
Ｄ+、３−アセチル−ＮＡＤ+などのＮＡＤ+類からその
還元体であるＮＡＤＨ類を生成する酵素反応が極めて有
用であり、かかる反応は生体物質の測定に普遍的に利用
できる酵素反応であることを見出して本発明を完成し
た。即ち、本発明は、ＮＡＤＨ類の生成量を測定するこ
とにより、簡便且つ高精度で生体物質を測定することが
できる方法を提供することを目的とする。
いては、検体中に存在する還元性物質（例えば、尿酸、
アスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン等）や酸化
性物質などにより過酸化水素の分解などが生じやすく、
正確な値を与えない場合がある。一方、上記の方法に
おいては、十分量の基質（ＮＡＤＨ、補酵素等）を反応
系に添加することが困難なので定量限界が低く、また測
定波長における検体の吸収（濁り、溶血、黄疸等）によ
り測定できる範囲が狭くなるという問題がある。このよ
うな問題から、酵素反応による生体物質の測定に際して
は、ＮＡＤＨを生成する反応系を用い、生成するＮＡＤ
Ｈの吸光度の上昇に基づいて生体物質を測定する方法が
好適であり、自動分析にも適している。かかる観点か
ら、本発明者等は、ＮＡＤＨを生成する酵素反応であ
り、単独で又は他の酵素反応系と共役させることによ
り、生体物質の測定に広く利用できる酵素反応を鋭意検
討した結果、ピルビン酸脱水素酵素（E.C 1.2.4.1、以
下、ＰＤＨという）の存在下、ＮＡＤ+、チオ−ＮＡ
Ｄ+、３−アセチル−ＮＡＤ+などのＮＡＤ+類からその
還元体であるＮＡＤＨ類を生成する酵素反応が極めて有
用であり、かかる反応は生体物質の測定に普遍的に利用
できる酵素反応であることを見出して本発明を完成し
た。即ち、本発明は、ＮＡＤＨ類の生成量を測定するこ
とにより、簡便且つ高精度で生体物質を測定することが
できる方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決すべく
なされた本発明の生体物質の測定方法は、酵素反応を用
いて生体物質を測定する方法であり、ＰＤＨの存在下、
ＮＡＤ+類をＮＡＤＨ類に還元する反応を用い、ＮＡＤ
Ｈ類の生成量に基づいて生体物質を測定することからな
り、また酵素反応を用いて生体物質を測定する方法であ
り、当該測定方法がピルビン酸又はＣｏＡとＮＡＤＨ類
を生成する酵素反応又はこの酵素反応を含む反応系から
なるとき、ＰＤＨの存在下、ＮＡＤ+類をＮＡＤＨ類に
還元する反応を、上記酵素反応又は酵素反応系と共役さ
せることにより、生成したピルビン酸又はＣｏＡを消費
すると共にＮＡＤＨ類の生成量を増加させ、ＮＡＤＨ類
の生成量に基づいて生体物質を測定することからなる。
本発明で用いられる、ＰＤＨの存在下、ＮＡＤ+類から
ＮＡＤＨ類を生成する酵素反応は下記酵素反応式１で示
される。 この酵素反応の基質であるピルビン酸、ＣｏＡ及びＮＡ
Ｄ+類はそれ自体が生体物質として測定の対象とされ、
また多くの生体物質は酵素反応によりこれらのいずれか
の物質に変換することができるので、当該酵素反応と上
記酵素反応式１で示される酵素反応を共役させることに
より、測定対象である生体物質をＮＡＤＨ類の生成量と
して測定することができる。酵素反応式１で示される酵
素反応において、ＮＡＤ+からＮＡＤＨを生成させる反
応は知られているが、酵素反応式１で示される酵素反応
を生体物質の測定に利用された例は知られていない。以
下、本発明をより詳細に説明する。
なされた本発明の生体物質の測定方法は、酵素反応を用
いて生体物質を測定する方法であり、ＰＤＨの存在下、
ＮＡＤ+類をＮＡＤＨ類に還元する反応を用い、ＮＡＤ
Ｈ類の生成量に基づいて生体物質を測定することからな
り、また酵素反応を用いて生体物質を測定する方法であ
り、当該測定方法がピルビン酸又はＣｏＡとＮＡＤＨ類
を生成する酵素反応又はこの酵素反応を含む反応系から
なるとき、ＰＤＨの存在下、ＮＡＤ+類をＮＡＤＨ類に
還元する反応を、上記酵素反応又は酵素反応系と共役さ
せることにより、生成したピルビン酸又はＣｏＡを消費
すると共にＮＡＤＨ類の生成量を増加させ、ＮＡＤＨ類
の生成量に基づいて生体物質を測定することからなる。
本発明で用いられる、ＰＤＨの存在下、ＮＡＤ+類から
ＮＡＤＨ類を生成する酵素反応は下記酵素反応式１で示
される。 この酵素反応の基質であるピルビン酸、ＣｏＡ及びＮＡ
Ｄ+類はそれ自体が生体物質として測定の対象とされ、
また多くの生体物質は酵素反応によりこれらのいずれか
の物質に変換することができるので、当該酵素反応と上
記酵素反応式１で示される酵素反応を共役させることに
より、測定対象である生体物質をＮＡＤＨ類の生成量と
して測定することができる。酵素反応式１で示される酵
素反応において、ＮＡＤ+からＮＡＤＨを生成させる反
応は知られているが、酵素反応式１で示される酵素反応
を生体物質の測定に利用された例は知られていない。以
下、本発明をより詳細に説明する。
【０００５】上記酵素反応式１で示される酵素反応に用
いられるＰＤＨは、原核細胞、真核細胞、高等植物細胞
などに広く生物界に分布する酵素であり、大腸菌、ブタ
心臓、ウシ腎臓などから分離されている。本発明におい
て、ＰＤＨの由来は特に限定されず、動物由来、細菌由
来などいずれのＰＤＨも用いることができ、好適には動
物由来のＰＤＨが用いられる。このＰＤＨが触媒する酵
素反応は、酵素反応式１に示されるように、ピルビン酸
の酸化的脱炭酸反応であり、この間にＮＡＤ+類は還元
されてＮＡＤＨ類が生成する。ここにおけるＮＡＤ+類
には、通常単にＮＡＤ+と称されるβ−ＮＡＤ+（本明細
書においても単にＮＡＤ+と記す）の他に、例えば、α
−ＮＡＤ+、チオ−ＮＡＤ+、３−アセチル−ＮＡＤ+、
デスオキシ−ＮＡＤ+、イソニコチン酸ヒドラジド−Ｎ
ＡＤ+、６−アミノ−ＮＡＤ+、１，Ｎ6−エテノ−ＮＡ
Ｄ+、デアミノ−ＮＡＤ+、デアミド−ＮＡＤ+、３−ピ
リジンアルデヒド−ＮＡＤ+、３−ピリジンアルデヒド
−デアミノ−ＮＡＤ+などが包含されるが、上記酵素反
応式１の酵素反応に基づいて還元体を生成するＮＡＤ+
アナログであればこれらに限定されるものではない。Ｎ
ＡＤＨ類は上記のＮＡＤ+類の還元型を意味する。ま
た、この酵素反応はチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）の存
在下に反応が進行するので、反応系にはＴＰＰを添加す
るのが好ましい。更に、ＰＤＨはＭｇ2+により活性化さ
れるので、反応系にはＭｇ2+を添加するのが好ましい。
上記酵素反応式１に示される酵素反応は、ピルビン酸、
ＣｏＡ及びＮＡＤ+類を基質とする反応であり、上記３
種の物質のいずれか２種を基質とすることにより他の物
質をＮＡＤＨ類の生成量に基づいて定量することができ
る。また、基質であるピルビン酸、ＣｏＡ及びＮＡＤ+
類を過剰に添加することにより、補欠分子族であるＴＰ
Ｐや活性化因子であるＭｇ2+をＮＡＤＨ類の生成量に基
づいて定量することができる。ＮＡＤＨ類の生成量は種
々の方法により測定することができるが、通常、簡便且
つ高精度で測定することができるので吸光度測定法によ
り行われる。測定波長はＮＡＤＨ類の種類により適宜選
択され、例えば、ＮＡＤＨ、３−アセチル−ＮＡＤＨ、
デアミノ−ＮＡＤＨなどの場合には３４０ｎｍ、チオ−
ＮＡＤＨの場合には４０５ｎｍの波長が選択される。Ｎ
ＡＤＨ類の生成量の測定法として、テトラゾリウム塩を
共存させてホルマザンに変換し、生成ホルマザンの呈色
度を測定する方法などを用いてもよい。
いられるＰＤＨは、原核細胞、真核細胞、高等植物細胞
などに広く生物界に分布する酵素であり、大腸菌、ブタ
心臓、ウシ腎臓などから分離されている。本発明におい
て、ＰＤＨの由来は特に限定されず、動物由来、細菌由
来などいずれのＰＤＨも用いることができ、好適には動
物由来のＰＤＨが用いられる。このＰＤＨが触媒する酵
素反応は、酵素反応式１に示されるように、ピルビン酸
の酸化的脱炭酸反応であり、この間にＮＡＤ+類は還元
されてＮＡＤＨ類が生成する。ここにおけるＮＡＤ+類
には、通常単にＮＡＤ+と称されるβ−ＮＡＤ+（本明細
書においても単にＮＡＤ+と記す）の他に、例えば、α
−ＮＡＤ+、チオ−ＮＡＤ+、３−アセチル−ＮＡＤ+、
デスオキシ−ＮＡＤ+、イソニコチン酸ヒドラジド−Ｎ
ＡＤ+、６−アミノ−ＮＡＤ+、１，Ｎ6−エテノ−ＮＡ
Ｄ+、デアミノ−ＮＡＤ+、デアミド−ＮＡＤ+、３−ピ
リジンアルデヒド−ＮＡＤ+、３−ピリジンアルデヒド
−デアミノ−ＮＡＤ+などが包含されるが、上記酵素反
応式１の酵素反応に基づいて還元体を生成するＮＡＤ+
アナログであればこれらに限定されるものではない。Ｎ
ＡＤＨ類は上記のＮＡＤ+類の還元型を意味する。ま
た、この酵素反応はチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）の存
在下に反応が進行するので、反応系にはＴＰＰを添加す
るのが好ましい。更に、ＰＤＨはＭｇ2+により活性化さ
れるので、反応系にはＭｇ2+を添加するのが好ましい。
上記酵素反応式１に示される酵素反応は、ピルビン酸、
ＣｏＡ及びＮＡＤ+類を基質とする反応であり、上記３
種の物質のいずれか２種を基質とすることにより他の物
質をＮＡＤＨ類の生成量に基づいて定量することができ
る。また、基質であるピルビン酸、ＣｏＡ及びＮＡＤ+
類を過剰に添加することにより、補欠分子族であるＴＰ
Ｐや活性化因子であるＭｇ2+をＮＡＤＨ類の生成量に基
づいて定量することができる。ＮＡＤＨ類の生成量は種
々の方法により測定することができるが、通常、簡便且
つ高精度で測定することができるので吸光度測定法によ
り行われる。測定波長はＮＡＤＨ類の種類により適宜選
択され、例えば、ＮＡＤＨ、３−アセチル−ＮＡＤＨ、
デアミノ−ＮＡＤＨなどの場合には３４０ｎｍ、チオ−
ＮＡＤＨの場合には４０５ｎｍの波長が選択される。Ｎ
ＡＤＨ類の生成量の測定法として、テトラゾリウム塩を
共存させてホルマザンに変換し、生成ホルマザンの呈色
度を測定する方法などを用いてもよい。
【０００６】前述のように、各種生体物質は種々の酵素
反応系を用いることにより、酵素反応式１の酵素反応の
基質であるピルビン酸、ＣｏＡ及びＮＡＤ+類に導くこ
とができる。従って、これらの酵素反応系と酵素反応式
１で示される酵素反応系を共役させることにより、各種
生体物質（基質、補欠分子族、活性化因子など）量又は
生体物質としての酵素の活性を、ＮＡＤＨ類の生成量と
して測定することができる。これらの例を挙げると、基
質としては、例えば、ＡＤＰ、尿素窒素、クレアチン、
クレアチニン、遊離脂肪酸、シアル酸、中性脂肪、リン
脂質、アミノ酸などが例示され、補欠分子族としては、
例えば、ＴＰＰ、ピリドキサルリン酸、テトラヒドロ葉
酸などが例示され、活性化因子としては、例えば、マグ
ネシウムイオン、カリウムイオン、マンガンイオン、カ
ルシウムイオン、ナトリウムイオン、クロルイオン、炭
酸水素イオンなどが例示され、酵素としては、例えば、
ピルベートキナーゼ（ＰＫ）、コリンエステラーゼ（Ｃ
ｈＥ）、クレアチンホスフェートキナーゼ（ＣＰＫ）、
マレートデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ラクテートデヒ
ドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アラニンアミノトランスフェ
ラーゼ（ＡＬＴ）又はアスパルテートアミノトランスフ
ェラーゼ（ＡＳＴ）などが例示される。これらの基質、
酵素などを用いた酵素反応であり、ピルビン酸、ＣｏＡ
又はＮＡＤ+類を生成する酵素反応の例を下記に示す。
なお、下記の酵素反応式中、酵素反応によりＡＤＰに導
いたものについては、以後、酵素反応式２によりピルビ
ン酸に導く。また、Ｐはリン酸残基を意味する。
反応系を用いることにより、酵素反応式１の酵素反応の
基質であるピルビン酸、ＣｏＡ及びＮＡＤ+類に導くこ
とができる。従って、これらの酵素反応系と酵素反応式
１で示される酵素反応系を共役させることにより、各種
生体物質（基質、補欠分子族、活性化因子など）量又は
生体物質としての酵素の活性を、ＮＡＤＨ類の生成量と
して測定することができる。これらの例を挙げると、基
質としては、例えば、ＡＤＰ、尿素窒素、クレアチン、
クレアチニン、遊離脂肪酸、シアル酸、中性脂肪、リン
脂質、アミノ酸などが例示され、補欠分子族としては、
例えば、ＴＰＰ、ピリドキサルリン酸、テトラヒドロ葉
酸などが例示され、活性化因子としては、例えば、マグ
ネシウムイオン、カリウムイオン、マンガンイオン、カ
ルシウムイオン、ナトリウムイオン、クロルイオン、炭
酸水素イオンなどが例示され、酵素としては、例えば、
ピルベートキナーゼ（ＰＫ）、コリンエステラーゼ（Ｃ
ｈＥ）、クレアチンホスフェートキナーゼ（ＣＰＫ）、
マレートデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ラクテートデヒ
ドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アラニンアミノトランスフェ
ラーゼ（ＡＬＴ）又はアスパルテートアミノトランスフ
ェラーゼ（ＡＳＴ）などが例示される。これらの基質、
酵素などを用いた酵素反応であり、ピルビン酸、ＣｏＡ
又はＮＡＤ+類を生成する酵素反応の例を下記に示す。
なお、下記の酵素反応式中、酵素反応によりＡＤＰに導
いたものについては、以後、酵素反応式２によりピルビ
ン酸に導く。また、Ｐはリン酸残基を意味する。
【０００７】
【化１】
【０００８】
【化２】
【０００９】
【化３】
【００１０】
【化４】
【００１１】
【化５】
【００１２】
【化６】
【００１３】
【化７】
【００１４】
【化８】
【００１５】
【化９】
【００１６】
【化１０】
【００１７】本発明において、酵素反応を用いて生体物
質を測定する方法が、ピルビン酸又はＣｏＡのいずれか
とＮＡＤＨ類を生成する酵素反応又はこの酵素反応を含
む反応系からなるとき、酵素反応式１で示される酵素反
応を、上記酵素反応又は酵素反応系と共役させることに
より、生成したピルビン酸又はＣｏＡを消費できると共
にＮＡＤＨ類の生成量を２倍とすることができる。この
方法によれば、生成したピルビン酸又はＣｏＡによる反
応阻害を回避することができ、また２倍のＮＡＤＨ類が
生成するので測定精度の向上が図れるという効果を奏す
る。
質を測定する方法が、ピルビン酸又はＣｏＡのいずれか
とＮＡＤＨ類を生成する酵素反応又はこの酵素反応を含
む反応系からなるとき、酵素反応式１で示される酵素反
応を、上記酵素反応又は酵素反応系と共役させることに
より、生成したピルビン酸又はＣｏＡを消費できると共
にＮＡＤＨ類の生成量を２倍とすることができる。この
方法によれば、生成したピルビン酸又はＣｏＡによる反
応阻害を回避することができ、また２倍のＮＡＤＨ類が
生成するので測定精度の向上が図れるという効果を奏す
る。
【００１８】以下、本発明の生体物質の測定方法（基質
などの定量及び酵素活性）を例をもって具体的に説明す
るが、本発明の方法はこれらに限定されるものではな
い。 １）酵素反応系により生成したピルビン酸及び／又は内
因性のピルビン酸を酵素反応式１の酵素反応によりＮＡ
ＤＨ類の増加量として測定する方法。 ピルビン酸の測定法としては、ＬＤＨを用いるＮＡＤＨ
の減少量測定法、パーオキシダーゼを用いた過酸化水素
法などが知られているが、本発明の方法は以下の点で優
れている。 ＮＡＤＨ類の増加量を測定するので定量限界が高い。 ＮＡＤＨ類の分子吸光係数が明確なため定量が容易で
ある。 ＮＡＤＨ類の生成系は、血清等の検体中の還元性物質
の影響を受けない。 ＮＡＤＨ類の発色は、他の色素（例えば、キノン色素
等）に比べて安定である。
などの定量及び酵素活性）を例をもって具体的に説明す
るが、本発明の方法はこれらに限定されるものではな
い。 １）酵素反応系により生成したピルビン酸及び／又は内
因性のピルビン酸を酵素反応式１の酵素反応によりＮＡ
ＤＨ類の増加量として測定する方法。 ピルビン酸の測定法としては、ＬＤＨを用いるＮＡＤＨ
の減少量測定法、パーオキシダーゼを用いた過酸化水素
法などが知られているが、本発明の方法は以下の点で優
れている。 ＮＡＤＨ類の増加量を測定するので定量限界が高い。 ＮＡＤＨ類の分子吸光係数が明確なため定量が容易で
ある。 ＮＡＤＨ類の生成系は、血清等の検体中の還元性物質
の影響を受けない。 ＮＡＤＨ類の発色は、他の色素（例えば、キノン色素
等）に比べて安定である。
【００１９】２）酵素反応系により生成したＣｏＡ及び
／又は内因性のＣｏＡを、酵素反応式１の酵素反応によ
りＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 ＣｏＡの測定法としては、ＤＴＮＢ等によりＳＨ基を測
定する方法が知られているが、本発明の方法はＣｏＡに
特異的であり、また従来法は検体中の蛋白質ＳＨ基やチ
オール系夾雑物質の影響を受けたが、本発明の方法はこ
の問題を回避できる。
／又は内因性のＣｏＡを、酵素反応式１の酵素反応によ
りＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 ＣｏＡの測定法としては、ＤＴＮＢ等によりＳＨ基を測
定する方法が知られているが、本発明の方法はＣｏＡに
特異的であり、また従来法は検体中の蛋白質ＳＨ基やチ
オール系夾雑物質の影響を受けたが、本発明の方法はこ
の問題を回避できる。
【００２０】３）酵素反応系により生成したＮＡＤ+類
及び／又は内因性のＮＡＤ+類を、酵素反応式１の酵素
反応によりＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 ＮＡＤ+類の測定法としては、種々の方法が知られてい
るが、本発明の方法によれば上記１）に記載した効果と
同じ効果が得られる。
及び／又は内因性のＮＡＤ+類を、酵素反応式１の酵素
反応によりＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 ＮＡＤ+類の測定法としては、種々の方法が知られてい
るが、本発明の方法によれば上記１）に記載した効果と
同じ効果が得られる。
【００２１】４）酵素反応式２の酵素反応と酵素反応式
１の酵素反応とを組合せ、酵素反応系により生成したＡ
ＤＰ及び／又は内因性のＡＤＰをＮＡＤＨ類の増加量と
して測定する方法。 ＡＤＰの測定法としては、ＰＫ、ＡＴＰ及びＰＥＰを併
用したＬＤＨ法又はＰＯＰ法などが知られているが、本
発明の方法によれば上記１）に記載した効果と同じ効果
が得られる。
１の酵素反応とを組合せ、酵素反応系により生成したＡ
ＤＰ及び／又は内因性のＡＤＰをＮＡＤＨ類の増加量と
して測定する方法。 ＡＤＰの測定法としては、ＰＫ、ＡＴＰ及びＰＥＰを併
用したＬＤＨ法又はＰＯＰ法などが知られているが、本
発明の方法によれば上記１）に記載した効果と同じ効果
が得られる。
【００２２】５）酵素反応式６又は７の酵素反応と、酵
素反応式２の酵素反応と、酵素反応式１の酵素反応とを
組合せ、検体中のクレアチン又はクレアチニンをＮＡＤ
Ｈ類の増加量として測定する方法。 クレアチン又はクレアチニンの測定法としては、Creati
nine amidohydrolase(C1)-Creatine amidinohydrolase
(C2)-Sarcosine oxidase(SOD)-POD系、C1-C2-SOD-Forma
ldehyde dehydrogenase(FDH)系などが広く用いられてい
るが、本発明の方法によれば、上記１）に記載した効果
に加え、従来法に比べて共役系の酵素反応数が少ないと
いう利点を有する。
素反応式２の酵素反応と、酵素反応式１の酵素反応とを
組合せ、検体中のクレアチン又はクレアチニンをＮＡＤ
Ｈ類の増加量として測定する方法。 クレアチン又はクレアチニンの測定法としては、Creati
nine amidohydrolase(C1)-Creatine amidinohydrolase
(C2)-Sarcosine oxidase(SOD)-POD系、C1-C2-SOD-Forma
ldehyde dehydrogenase(FDH)系などが広く用いられてい
るが、本発明の方法によれば、上記１）に記載した効果
に加え、従来法に比べて共役系の酵素反応数が少ないと
いう利点を有する。
【００２３】６）酵素反応式３の酵素反応と、酵素反応
式２の酵素反応と酵素反応式１の酵素反応とを組合せ、
検体中の尿素窒素をＮＡＤＨ類の増加量として測定する
方法。 尿素窒素の測定法としては、Glutamate dehydrogenase
(GLDH)-Urease法、PK-LDH-Urea amidolyase法などが知
られているが、本発明の方法によれば上記１）に記載し
た効果と同じ効果が得られ、更に検体中のアンモニアの
影響を受けることもない利点を有する。
式２の酵素反応と酵素反応式１の酵素反応とを組合せ、
検体中の尿素窒素をＮＡＤＨ類の増加量として測定する
方法。 尿素窒素の測定法としては、Glutamate dehydrogenase
(GLDH)-Urease法、PK-LDH-Urea amidolyase法などが知
られているが、本発明の方法によれば上記１）に記載し
た効果と同じ効果が得られ、更に検体中のアンモニアの
影響を受けることもない利点を有する。
【００２４】７）酵素反応式１３の酵素反応と、酵素反
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のシアル酸をＮＡ
ＤＨ類の増加量として測定する方法。 シアル酸の測定法としては、LDH法、Pyruvate oxidase
(POP)法、N-Acetyl-D-mannosamine dehydrogenase (AMD
H)法などが知られているが、本発明の方法によれば上記
１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のシアル酸をＮＡ
ＤＨ類の増加量として測定する方法。 シアル酸の測定法としては、LDH法、Pyruvate oxidase
(POP)法、N-Acetyl-D-mannosamine dehydrogenase (AMD
H)法などが知られているが、本発明の方法によれば上記
１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００２５】８）酵素反応式１４の酵素反応と、酵素反
応式２の酵素反応と、酵素反応式１の酵素反応とを組合
せ、検体中の中性脂肪をＮＡＤＨ類の増加量として測定
する方法。 中性脂肪の測定法としては、Lipoprotein lipase (LPL)
により生成するグリセロールを測定する方法に基づき、
Glycerol kinase (GK)-Glycerol-3-phosphateoxidase
(GPO)法、Glycerol oxidase (GOD)法、Glycerol dehydr
ogenase (GDH)法などが知られているが、本発明の方法
によれば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られ
る。
応式２の酵素反応と、酵素反応式１の酵素反応とを組合
せ、検体中の中性脂肪をＮＡＤＨ類の増加量として測定
する方法。 中性脂肪の測定法としては、Lipoprotein lipase (LPL)
により生成するグリセロールを測定する方法に基づき、
Glycerol kinase (GK)-Glycerol-3-phosphateoxidase
(GPO)法、Glycerol oxidase (GOD)法、Glycerol dehydr
ogenase (GDH)法などが知られているが、本発明の方法
によれば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られ
る。
【００２６】９）酵素反応式１２の酵素反応と、酵素反
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のＬＤＨの酵素活
性（乳酸からピルビン酸へ）をＮＡＤＨ類の増加量とし
て測定する方法。 現在用いられているＬＤＨの測定法は、ピルビン酸やＮ
ＡＤＨに対するＫｍが小さいために生成物阻害を受けや
すく、反応直線部分が短いので正確に測定するには初速
度を測定する必要がある。それに対し、本発明の方法で
は下記の点で優れる。 反応生成物であるピルビン酸が酵素反応式１の酵素反
応により消失するので、反応直線性が向上し、長時間域
での測定が可能となる。 １モルの乳酸から２モルのＮＡＤＨ類が生成するため
感度が２倍になり、低活性の検体（特に、ＬＤＨのアイ
ソザイム測定等）においても正確に測定することができ
る利点を有する。
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のＬＤＨの酵素活
性（乳酸からピルビン酸へ）をＮＡＤＨ類の増加量とし
て測定する方法。 現在用いられているＬＤＨの測定法は、ピルビン酸やＮ
ＡＤＨに対するＫｍが小さいために生成物阻害を受けや
すく、反応直線部分が短いので正確に測定するには初速
度を測定する必要がある。それに対し、本発明の方法で
は下記の点で優れる。 反応生成物であるピルビン酸が酵素反応式１の酵素反
応により消失するので、反応直線性が向上し、長時間域
での測定が可能となる。 １モルの乳酸から２モルのＮＡＤＨ類が生成するため
感度が２倍になり、低活性の検体（特に、ＬＤＨのアイ
ソザイム測定等）においても正確に測定することができ
る利点を有する。
【００２７】１０）酵素反応式１１の酵素反応と、酵素
反応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のＭＤＨの酵素
活性をＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 現在、アイソザイム測定（電気泳動等）などにより、心
筋梗塞や肝疾患の場合にＭＤＨが上昇することが知られ
ており臨床的に有用である。本発明の方法によれば、Ｎ
ＡＤＨ類の生成でＭＤＨ活性を測定することができ、ま
た上記と同様に反応直線性が向上すると共に２モルのＮ
ＡＤＨ類が生成するので、感度の向上が図れる。
反応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のＭＤＨの酵素
活性をＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 現在、アイソザイム測定（電気泳動等）などにより、心
筋梗塞や肝疾患の場合にＭＤＨが上昇することが知られ
ており臨床的に有用である。本発明の方法によれば、Ｎ
ＡＤＨ類の生成でＭＤＨ活性を測定することができ、ま
た上記と同様に反応直線性が向上すると共に２モルのＮ
ＡＤＨ類が生成するので、感度の向上が図れる。
【００２８】１１）酵素反応式８の酵素反応と、酵素反
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＬＴの酵素活
性をＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 現在使用されているＡＬＴの測定法は、ＡＬＴの作用に
より生成したピルビン酸を測定するＬＤＨ法やＰＯＰ法
であるが、本発明の方法によれば前記１）に記載した効
果と同じ効果が得られる。
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＬＴの酵素活
性をＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 現在使用されているＡＬＴの測定法は、ＡＬＴの作用に
より生成したピルビン酸を測定するＬＤＨ法やＰＯＰ法
であるが、本発明の方法によれば前記１）に記載した効
果と同じ効果が得られる。
【００２９】１２）酵素反応式９の酵素反応と、酵素反
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＳＴの酵素活
性をＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 現在使用されているＡＳＴの測定法は、ＡＳＴの作用に
より生成したオキサロ酢酸を測定するMDH法とOxaloacet
ate decarboxylase (OADC)-POP法であるが、本発明の方
法によれば前記１）に記載した効果と同じ効果が得られ
る。
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＳＴの酵素活
性をＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 現在使用されているＡＳＴの測定法は、ＡＳＴの作用に
より生成したオキサロ酢酸を測定するMDH法とOxaloacet
ate decarboxylase (OADC)-POP法であるが、本発明の方
法によれば前記１）に記載した効果と同じ効果が得られ
る。
【００３０】１３）酵素反応式１の酵素反応により、検
体中のマグネシウムイオンをＮＡＤＨ類の増加量として
測定する方法。 マグネシウムイオンの測定法としては、キシリジンブル
ー法、GK-G6PDH法などが知られているが、本発明の方法
による測定は共役系を必要としない点で優れるとともに
上記１）に記載した効果と同様な効果が得られる。
体中のマグネシウムイオンをＮＡＤＨ類の増加量として
測定する方法。 マグネシウムイオンの測定法としては、キシリジンブル
ー法、GK-G6PDH法などが知られているが、本発明の方法
による測定は共役系を必要としない点で優れるとともに
上記１）に記載した効果と同様な効果が得られる。
【００３１】１４）酵素反応式２の酵素反応と、酵素反
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のカリウムイオン
をＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 カリウムイオンの測定法としては炎光法、電極法等が知
られている。酵素反応式２の酵素反応は活性化因子とし
てカリウムイオンを必要とするので、酵素反応式１の酵
素反応と組合せることにより、検体中のカリウムイオン
を測定することができ、この方法によれば上記１）に記
載した効果と同様な効果が得られる。
応式１の酵素反応とを組合せ、検体中のカリウムイオン
をＮＡＤＨ類の増加量として測定する方法。 カリウムイオンの測定法としては炎光法、電極法等が知
られている。酵素反応式２の酵素反応は活性化因子とし
てカリウムイオンを必要とするので、酵素反応式１の酵
素反応と組合せることにより、検体中のカリウムイオン
を測定することができ、この方法によれば上記１）に記
載した効果と同様な効果が得られる。
【００３２】本発明において、酵素反応式１で示される
酵素反応の基質及びＰＤＨの使用量としては酵素反応が
円滑に進行する量であればよく、測定対象となる生体物
質の種類、検体中の含量、共役させる酵素反応の種類、
反応時間及び温度などにより適宜調整されるが、ＰＤＨ
の濃度は０．１〜１０単位／ｍｌ程度、好ましくは０．
３〜５単位／ｍｌ程度、より好ましくは０．５〜３単位
／ｍｌ程度とされる。ピルビン酸、ＣｏＡ及びＮＡＤ+
類の濃度は、これらが測定対象物質の酵素反応系から由
来するときは当然にその濃度となるが、基質として反応
系に添加する場合には、ピルビン酸の濃度は０．５〜１
０ｍＭ程度、好ましくは１〜５ｍＭ程度、ＣｏＡの濃度
は０．１〜１ｍＭ程度、好ましくは０．２〜０．５ｍＭ
程度、ＮＡＤ+類の濃度は１〜１０ｍＭ程度、好ましく
は２〜５ｍＭ程度とされる。また、ＴＰＰの濃度として
は、0.05〜１ｍＭ程度、好ましくは０．１〜０．５ｍＭ
程度とされ、Ｍｇ2+の濃度としては０．１〜５ｍＭ程
度、好ましくは０．５〜３ｍＭ程度とされる。
酵素反応の基質及びＰＤＨの使用量としては酵素反応が
円滑に進行する量であればよく、測定対象となる生体物
質の種類、検体中の含量、共役させる酵素反応の種類、
反応時間及び温度などにより適宜調整されるが、ＰＤＨ
の濃度は０．１〜１０単位／ｍｌ程度、好ましくは０．
３〜５単位／ｍｌ程度、より好ましくは０．５〜３単位
／ｍｌ程度とされる。ピルビン酸、ＣｏＡ及びＮＡＤ+
類の濃度は、これらが測定対象物質の酵素反応系から由
来するときは当然にその濃度となるが、基質として反応
系に添加する場合には、ピルビン酸の濃度は０．５〜１
０ｍＭ程度、好ましくは１〜５ｍＭ程度、ＣｏＡの濃度
は０．１〜１ｍＭ程度、好ましくは０．２〜０．５ｍＭ
程度、ＮＡＤ+類の濃度は１〜１０ｍＭ程度、好ましく
は２〜５ｍＭ程度とされる。また、ＴＰＰの濃度として
は、0.05〜１ｍＭ程度、好ましくは０．１〜０．５ｍＭ
程度とされ、Ｍｇ2+の濃度としては０．１〜５ｍＭ程
度、好ましくは０．５〜３ｍＭ程度とされる。
【００３３】本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及
ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ緩衝
液、リン酸緩衝液、モノ又はジエタノールアミン緩衝液
等）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定され
ず、エンドポイト法、レートアッセイ法などの適宜な手
法を用いることができる。なお、本発明の方法におい
て、検体中にＬＤＨが存在する場合には、ＬＤＨは測定
値に影響を与えるので、ＬＤＨの測定以外の場合には、
反応系にＬＤＨ阻害剤（例えば、オキサミン酸及びその
塩、蓚酸及びその塩等）を添加する必要がある。ＬＤＨ
阻害剤の添加量は、検体中のＬＤＨ含量などにより適宜
調整されるが、１０〜１００ｍＭ程度、好ましくは２０
〜５０ｍＭ程度とされる。測定対象である生体物質を含
有する検体としては、例えば、血清、血漿、尿、髄液な
どが例示される。
ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ緩衝
液、リン酸緩衝液、モノ又はジエタノールアミン緩衝液
等）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定され
ず、エンドポイト法、レートアッセイ法などの適宜な手
法を用いることができる。なお、本発明の方法におい
て、検体中にＬＤＨが存在する場合には、ＬＤＨは測定
値に影響を与えるので、ＬＤＨの測定以外の場合には、
反応系にＬＤＨ阻害剤（例えば、オキサミン酸及びその
塩、蓚酸及びその塩等）を添加する必要がある。ＬＤＨ
阻害剤の添加量は、検体中のＬＤＨ含量などにより適宜
調整されるが、１０〜１００ｍＭ程度、好ましくは２０
〜５０ｍＭ程度とされる。測定対象である生体物質を含
有する検体としては、例えば、血清、血漿、尿、髄液な
どが例示される。
【００３４】
【発明の効果】本発明の測定方法では、ＮＡＤＨ類の生
成量に基づいて生体物質を測定するので測定限界が高
く、また分子吸光係数が明確になっているＮＡＤＨ類を
測定するので、測定値の信頼性が高い。更に、本発明の
測定方法は、検体中の還元性物質などの影響を受けない
という利点を有する。従って、本発明によれば、生体物
質を簡便にして高精度で測定することができ、自動分析
にも容易に適用することができるという効果を奏する。
成量に基づいて生体物質を測定するので測定限界が高
く、また分子吸光係数が明確になっているＮＡＤＨ類を
測定するので、測定値の信頼性が高い。更に、本発明の
測定方法は、検体中の還元性物質などの影響を受けない
という利点を有する。従って、本発明によれば、生体物
質を簡便にして高精度で測定することができ、自動分析
にも容易に適用することができるという効果を奏する。
【００３５】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。なお、以下の実施例において、ＰＤＨはブタ
心臓由来を、ＰＫはブタ心臓由来を用いた。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。なお、以下の実施例において、ＰＤＨはブタ
心臓由来を、ＰＫはブタ心臓由来を用いた。
【００３６】実施例１ピルビン酸の定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの
吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１に示す
ようにピルビン酸が定量的に測定できた。
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの
吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１に示す
ようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００３７】実施例２ＡＤＰの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ 測定方法：ＡＤＰカリウムを約１３ｍＭの水溶液に調
製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成す
る。測定試薬１．０ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌを加
え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブ
ランクを対照に測定する。図２に示すようにＡＤＰが定
量的に測定できた。
製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成す
る。測定試薬１．０ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌを加
え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブ
ランクを対照に測定する。図２に示すようにＡＤＰが定
量的に測定できた。
【００３８】実施例３クレアチンの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＣＰＫ ２．０単位／ｍｌ（ウサギ筋肉由来） 測定方法：クレアチンを約１３ｍＭの水溶液に調製
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチンサンプル２０μｌを加
え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブ
ランクを対照に測定する。図３に示すようにクレアチン
が定量的に測定できた。
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチンサンプル２０μｌを加
え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブ
ランクを対照に測定する。図３に示すようにクレアチン
が定量的に測定できた。
【００３９】実施例４クレアチニンの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＣＰＫ ２．０単位／ｍｌ（ウサギ筋肉由来） クレアチニンアミドヒドロラーゼ(C1) １００ 単位／ｍｌ（微生物由来） 測定方法：クレアチニンを約１４ｍＭの水溶液に調製
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを
加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試
薬ブランクを対照に測定する。図４に示すようにクレア
ニチンが定量的に測定できた。
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを
加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試
薬ブランクを対照に測定する。図４に示すようにクレア
ニチンが定量的に測定できた。
【００４０】実施例５ＣｏＡの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 １００ ｍＭ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム ４．０ｍＭ 測定方法：ＣｏＡ−３リチウムを約１４ｍＭの水溶液
に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成
する。測定試薬１．０ｍｌにＣｏＡサンプル２０μｌを
加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試
薬ブランクを対照に測定する。図５に示すようにＣｏＡ
が定量的に測定できた。
に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成
する。測定試薬１．０ｍｌにＣｏＡサンプル２０μｌを
加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試
薬ブランクを対照に測定する。図５に示すようにＣｏＡ
が定量的に測定できた。
【００４１】実施例６ＮＡＤ+の定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 １００ ｍＭ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ−３リチウム ０．３ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム ４．０ｍＭ 測定方法：ＮＡＤ+を約１４ｍＭの水溶液に調製し、
精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。測定
試薬１．０ｍｌにＮＡＤ+サンプル２０μｌを加え３７
℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブラン
クを対照に測定する。図６に示すようにＮＡＤ+が定量
的に測定できた。
精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。測定
試薬１．０ｍｌにＮＡＤ+サンプル２０μｌを加え３７
℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブラン
クを対照に測定する。図６に示すようにＮＡＤ+が定量
的に測定できた。
【００４２】実施例７ＬＤＨの測定 測定試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．１５Ｍ ｐＨ８．０ 乳酸リチウム ３０ ｍＭ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ 対照試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．１５Ｍ ｐＨ８．０ 乳酸リチウム ３０ ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ 測定方法：測定試薬２．８ｍｌにヒト由来ＬＤＨ（Ｌ
Ｄ−１）２００μｌを加え、３７℃、３４０ｎｍの吸光
度変化を記録し、１分間当りの吸光度変化量を試薬ブラ
ンク対照に計算する。同様に、対照試薬２．８ｍｌにヒ
ト由来ＬＤＨ（ＬＤ−１）２００μｌを、加え３７℃、
３４０ｎｍの吸光度変化を記録し、１分間当り吸光度変
化量を試薬ブランク対照に計算する。各測定試薬での反
応経過を図７に示し、また１分間当りの吸光度変化量を
表１に示す。
Ｄ−１）２００μｌを加え、３７℃、３４０ｎｍの吸光
度変化を記録し、１分間当りの吸光度変化量を試薬ブラ
ンク対照に計算する。同様に、対照試薬２．８ｍｌにヒ
ト由来ＬＤＨ（ＬＤ−１）２００μｌを、加え３７℃、
３４０ｎｍの吸光度変化を記録し、１分間当り吸光度変
化量を試薬ブランク対照に計算する。各測定試薬での反
応経過を図７に示し、また１分間当りの吸光度変化量を
表１に示す。
【００４３】図７に示されるように、対照試薬での反応
においては直線部分が短く、その後、生成物（ピルビン
酸）阻害を受け反応が抑制される。それに対して、本発
明の測定方法においては、生成ピルビン酸の影響を回避
できるので直線部分が長く、また感度も高い。現在使用
されているＬＤＨ測定（乳酸→ピルビン酸)は対照試薬
のように初速度しか測定することができないが、ＰＤＨ
を共役させることにより長い範囲での測定が可能であり
感度が２倍に上昇する。ＬＤＨやＭＤＨのように、ＮＡ
Ｄ+又はＮＡＤＰ+を補酵素とし、反応系を共役させるこ
とによりピルビン酸又はＣｏＡ生成に導ける活性測定法
において、ＰＤＨを共役させることは、反応直線性の向
上と感度の上昇が得られ、低活性のものの測定に有利で
ある。
においては直線部分が短く、その後、生成物（ピルビン
酸）阻害を受け反応が抑制される。それに対して、本発
明の測定方法においては、生成ピルビン酸の影響を回避
できるので直線部分が長く、また感度も高い。現在使用
されているＬＤＨ測定（乳酸→ピルビン酸)は対照試薬
のように初速度しか測定することができないが、ＰＤＨ
を共役させることにより長い範囲での測定が可能であり
感度が２倍に上昇する。ＬＤＨやＭＤＨのように、ＮＡ
Ｄ+又はＮＡＤＰ+を補酵素とし、反応系を共役させるこ
とによりピルビン酸又はＣｏＡ生成に導ける活性測定法
において、ＰＤＨを共役させることは、反応直線性の向
上と感度の上昇が得られ、低活性のものの測定に有利で
ある。
【００４４】実施例８血中クレアチニンの測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＣＰＫ ２．０単位／ｍｌ（ウサギ筋肉由来） オキサミン酸カリウム ２５ ｍＭ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ Creatinine amidohydrolase １０００ 単位／ｍｌ 測定方法：血清５μｌに第１試薬３１５μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
クレアチニン標準液（５ｍｇ／ｄｌ）及び精製水につい
ても同様に測定し、その値を用いて血中クレアチニン濃
度を算出する。対照法としてJaffe法を用いた市販の試
薬を用いて、同じ検体を測定した。その結果を表２に示
す。表２に示されるようによい相関性(Y=1.007X-0.135)
を示した。
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
クレアチニン標準液（５ｍｇ／ｄｌ）及び精製水につい
ても同様に測定し、その値を用いて血中クレアチニン濃
度を算出する。対照法としてJaffe法を用いた市販の試
薬を用いて、同じ検体を測定した。その結果を表２に示
す。表２に示されるようによい相関性(Y=1.007X-0.135)
を示した。
【００４５】
【表２】
【００４６】実施例９血中尿素窒素の測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＫＣｌ １０ ｍＭ ＫａＨＣＯ3 ８．０ｍＭ オキサミン酸カリウム ２５ ｍＭ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ８．０ ウレアアミドリアーゼ ３０ 単位／ｍｌ 測定方法：血清３μｌに第１試薬３６０μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水について
も同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算
出する。対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた
市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。その結果を表
３に示す。表３に示されるようによい相関性(Y=1.007X-
1.309)を示した。
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水について
も同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算
出する。対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた
市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。その結果を表
３に示す。表３に示されるようによい相関性(Y=1.007X-
1.309)を示した。
【００４７】
【表３】
【００４８】実施例１０血中シアル酸の測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ Neuraminidase (ND) ２．０単位／ｍｌ オキサミン酸カリウム ２５ ｍＭ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ N-Acetylneuraminate aldolase (NAL) ２００単位／ｍｌ 測定方法：血清７μｌに第１試薬３１５μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
シアル酸標準液［Ｎ−アセチルノイラミン酸(NANA)１０
０ｍｇ／ｄｌ］及び精製水についても同様に測定し、そ
の値を用いて血中シアル酸濃度を算出する。対照法とし
てＮＤ−ＮＡＬ−ＬＤＨ法を用いた市販品を用いて、同
じ検体について測定した。その結果を表４に示す。表４
に示されるようによい相関性(Y=1.052X-2.753)を示し
た。
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
シアル酸標準液［Ｎ−アセチルノイラミン酸(NANA)１０
０ｍｇ／ｄｌ］及び精製水についても同様に測定し、そ
の値を用いて血中シアル酸濃度を算出する。対照法とし
てＮＤ−ＮＡＬ−ＬＤＨ法を用いた市販品を用いて、同
じ検体について測定した。その結果を表４に示す。表４
に示されるようによい相関性(Y=1.052X-2.753)を示し
た。
【００４９】
【表４】
【００５０】実施例１１血中中性脂肪の測定 測定試薬 第１試薬 リン酸緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＧＫ １．０単位／ｍｌ オキサミン酸カリウム ２５ ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０３％（Ｗ／Ｖ） 第２試薬 リン酸緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ リポプロテイン リパーゼ １５００ 単位／ｍｌ 測定方法：血清５μｌに第１試薬３６０μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
ＴＧ標準液（２００ｍｇ／ｄｌ）及び精製水についても
同様に測定し、その値を用いて血中中性脂肪濃度を算出
する。対照法としてＬＰＬ−ＧＫ−ＧＰＯ法を用いた市
販の試薬を用いて、同じ検体を測定した。その結果を表
５に示す。表５に示されるようによい相関性(Y=0.962X+
1.495)を示した。
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
ＴＧ標準液（２００ｍｇ／ｄｌ）及び精製水についても
同様に測定し、その値を用いて血中中性脂肪濃度を算出
する。対照法としてＬＰＬ−ＧＫ−ＧＰＯ法を用いた市
販の試薬を用いて、同じ検体を測定した。その結果を表
５に示す。表５に示されるようによい相関性(Y=0.962X+
1.495)を示した。
【００５１】
【表５】
【００５２】実施例１２血中ＬＤＨの測定 測定試薬 第１試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ Ｌ−Lactate ７５ ｍＭ ＴＰＰ ０．３ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ＰＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ 第２試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ ＮＡＤ+ ３０ ｍＭ 対照試薬 第１試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ Ｌ−Lactate ７５ ｍＭ 第２試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ ＮＡＤ+ ３０ ｍＭ 測定方法：血清８μｌに第１試薬３２０μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、第２試薬８０μｌを加え３７℃
で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３４０ｎ
ｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも操作
し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算
出する。対照試薬も同様に操作するが、第２試薬添加
後、３７℃で３０秒から２分までの反応直線部分（初速
度）の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出す
る。 その結果を表６に示す。表６に示されるようによ
い相関性(Y=2.092X-0.001)を示した。
３７℃、５分間加温後、第２試薬８０μｌを加え３７℃
で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３４０ｎ
ｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも操作
し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算
出する。対照試薬も同様に操作するが、第２試薬添加
後、３７℃で３０秒から２分までの反応直線部分（初速
度）の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出す
る。 その結果を表６に示す。表６に示されるようによ
い相関性(Y=2.092X-0.001)を示した。
【００５３】
【表６】
【００５４】実施例１３血中ＭＤＨの測定 測定試薬 第１試薬 モノエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ ＮＡＤ+ ７．０ｍＭ ＴＰＰ ０．３ｍＭ ＭｇＣｌ3 １．５ｍＭ ＰＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ オキサミン酸カリウム ３５ ｍＭ 第２試薬 モノエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ Ｌ−Malate ０．２Ｍ オキサロ酢酸脱炭酸酵素 ５０単位／ｍｌ 対照試薬 第１試薬 モノエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ ＮＡＤ+ ７．０ｍＭ 第２試薬 モノエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ Ｌ−Malate ０．２Ｍ 測定方法：血清１４μｌに第１試薬２８０μｌを加
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬７０μｌを加え
３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３
４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも
操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量
を算出する。対照試薬も同様に操作し、検体の１分間当
りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。その結果を
表７に示す。表７に示されるように、よい相関性(Y=2.0
04X)を示した。
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬７０μｌを加え
３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３
４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも
操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量
を算出する。対照試薬も同様に操作し、検体の１分間当
りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。その結果を
表７に示す。表７に示されるように、よい相関性(Y=2.0
04X)を示した。
【００５５】
【表７】
【００５６】実施例１４血中ＭＤＨ測定の再現性 測定試薬 実施例１２に同じ。 測定方法 実施例１２に同じ。同一検体について、１０回測定す
る。その結果を表８に示す。表８に示されるように、高
感度となることにより再現性もよくなる。
る。その結果を表８に示す。表８に示されるように、高
感度となることにより再現性もよくなる。
【００５７】
【表８】
【００５８】実施例１５血中ＡＬＴの測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１Ｍ ｐＨ７．５ オキサミン酸カリウム ３５ ｍＭ Ｌ−アラニン ３５０ ｍＭ ＮＡＤ+ ３．０ｍＭ ＴＰＰ ０．３ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ＰＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１Ｍ ｐＨ７．５ α−ケトグルタル酸 ５０ ｍＭ 測定方法：血清１５μｌに第１試薬３５０μｌを加
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加
え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水で
も操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化
量を算出する。また、ＮＡＤＨの見かけの分子吸光係数
を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＬＴ活性（ＩＵ
／Ｌ）を導く。対照法としてＬＤＨ法を用いた市販の試
薬を用いてＡＬＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。その結果
を表９に示す。表９に示されるようによい相関性(Y=0.9
57X+1.029)を示した。
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加
え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水で
も操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化
量を算出する。また、ＮＡＤＨの見かけの分子吸光係数
を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＬＴ活性（ＩＵ
／Ｌ）を導く。対照法としてＬＤＨ法を用いた市販の試
薬を用いてＡＬＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。その結果
を表９に示す。表９に示されるようによい相関性(Y=0.9
57X+1.029)を示した。
【００５９】
【表９】
【００６０】実施例１６血中ＡＳＴの測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１Ｍ ｐＨ７．８ オキサミン酸カリウム ３５ ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸 ２７０ ｍＭ ＮＡＤ+ ３．０ｍＭ ＴＰＰ ０．３ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ＰＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１Ｍ ｐＨ７．８ α−ケトグルタル酸 ５０ ｍＭ 測定方法：血清１５μｌに第１試薬３５０μｌを加
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加
え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水で
も操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化
量を算出する。また、ＮＡＤＨの見かけの分子吸光係数
を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＳＴ活性（ＩＵ
／Ｌ）を導く。対照法としてＭＤＨ法を用いた市販の試
薬を用いてＡＳＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。その結果
を表１０に示す。表１０に示されるようによい相関性(Y
=0.934X+0.847)を示した。
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加
え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水で
も操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化
量を算出する。また、ＮＡＤＨの見かけの分子吸光係数
を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＳＴ活性（ＩＵ
／Ｌ）を導く。対照法としてＭＤＨ法を用いた市販の試
薬を用いてＡＳＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。その結果
を表１０に示す。表１０に示されるようによい相関性(Y
=0.934X+0.847)を示した。
【００６１】
【表１０】
【００６２】実施例１７ピルビン酸の定量 （チオ−ＮＡＤ+を用いた例） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ チオ−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
１０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの
吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図８に示す
ようにピルビン酸が定量的に測定できた。
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
１０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの
吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図８に示す
ようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００６３】実施例１８チオ−ＮＡＤ+の定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 １００ ｍＭ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム ４．０ｍＭ 測定方法：チオ−ＮＡＤ+を約７ｍＭの水溶液に調製
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにチオ−ＮＡＤ+サンプル１０μｌ
を加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの吸光度
を、試薬ブランクを対照に測定する。図９に示すように
チオ−ＮＡＤ+が定量的に測定できた。
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにチオ−ＮＡＤ+サンプル１０μｌ
を加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの吸光度
を、試薬ブランクを対照に測定する。図９に示すように
チオ−ＮＡＤ+が定量的に測定できた。
【００６４】実施例１９血中尿素窒素の測定 （チオ−ＮＡＤ+を使用する方法） 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ チオ−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＫＣｌ １０ ｍＭ ＫａＨＣＯ3 ８．０ｍＭ オキサミン酸カリウム ２５ ｍＭ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ８．０ ウレアアミドリアーゼ ３０ 単位／ｍｌ 測定方法：血清５μｌに第１試薬３６０μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、４３６ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、４３６ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ1
とＡ2より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水について
も同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算
出する。対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた
市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。その結果を表
１１に示す。表１１に示されるようによい相関性(Y=1.0
06X-0.658)を示した。
３７℃、５分間加温後、４３６ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、４３６ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ1
とＡ2より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水について
も同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算
出する。対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた
市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。その結果を表
１１に示す。表１１に示されるようによい相関性(Y=1.0
06X-0.658)を示した。
【００６５】
【表１１】
【００６６】実施例２０ピルビン酸の定量 （３−アセチル−ＮＡＤ+を使用する
方法） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ３−アセチル−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、１０分間加温後の３４０ｎｍ
の吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１０に
示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
方法） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ ３−アセチル−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、１０分間加温後の３４０ｎｍ
の吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１０に
示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００６７】実施例２１ピルビン酸の定量 （デアミノ−ＮＡＤ+を使用する方
法） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ デアミノ−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、２０分間加温後の３４０ｎｍ
の吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１１に
示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
法） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．３ｍＭ デアミノ−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、２０分間加温後の３４０ｎｍ
の吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１１に
示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００６８】実施例２２マグネシウムイオンの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．５ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム ４．０ｍＭ 測定方法：塩化マグネシウムを約１０ｍＭの水溶液に
調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成す
る。測定試薬１．０ｍｌに上記塩化マグネシウムサンプ
ル１０μｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍ
における１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対
照に測定する。図１２に示すようにマグネシウムイオン
が定量的に測定できた。
調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成す
る。測定試薬１．０ｍｌに上記塩化マグネシウムサンプ
ル１０μｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍ
における１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対
照に測定する。図１２に示すようにマグネシウムイオン
が定量的に測定できた。
【００６９】実施例２３カリウムイオンの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡＤＰ ３．０ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．５ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＥＰ １．０ｍＭ ＰＫ ０．１単位／ｍｌ ＰＤＨ ０．５単位／ｍｌ 測定方法：塩化カリウムを約１０ｍＭの水溶液に調製
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記塩化カリウムサンプル１０μ
ｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍにおける
１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対照に測定
する。図１３に示すようにカリウムイオンが定量的に測
定できた。
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記塩化カリウムサンプル１０μ
ｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍにおける
１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対照に測定
する。図１３に示すようにカリウムイオンが定量的に測
定できた。
【００７０】実施例２４血中コリンエステラーゼの測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１ Ｍ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １２．５ ｍＭ ＣｏＡ・３リチウム ０．２ ｍＭ ＮＡＤ+ ３．０ ｍＭ ＰＤＨ １．０ 単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ５．０ 単位／ｍｌ ＡＴＰ １．２５ｍＭ ＫＣｌ ０．２ Ｍ システイン １５ ｍＭ コリンキナーゼ １ 単位／ｍｌ（酵母由来） オキサミン酸カリウム ２５ ｍＭ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ｏ−ヒドロキシベンゾイルコリン ５ ｍＭ 測定方法：検体４μｌに第１試薬２８０μｌを加え、
３７℃、５分間加温する。つぎに第２試薬７０μｌを加
え、３７℃で１分〜５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化量（Ａ）を求める。検体の代り
に精製水を用い、同様な操作を行い、１分間当りの３４
０ｎｍの吸光度変化量を（Ｂ）を求め、下式によりコリ
ンエステラーゼ活性値（Ｕ／Ｌ）を算出する。 ここで、検体としてコリンエステラーゼを高値に含む血
清を１／１０、１／５、２／５、３／５、４／５、５／
５に希釈して用い、検量線を作成した。その結果を図１
４に示す。図１４に示されるように良好な直線性に示し
た。次に、対照法として、ＤＭＢＴ（２，３−ジメトキ
シベンゾイルチオコリンヨーダイト）を用いた市販の試
薬を用いて、同じ検体についてコリンエステラーゼ活性
値（Ｕ／Ｌ）を求めた。その結果を表１２に示す。表１
２に示されるように、よい相関性［相関係数（ｒ）＝
０．９９１］を示した。
３７℃、５分間加温する。つぎに第２試薬７０μｌを加
え、３７℃で１分〜５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化量（Ａ）を求める。検体の代り
に精製水を用い、同様な操作を行い、１分間当りの３４
０ｎｍの吸光度変化量を（Ｂ）を求め、下式によりコリ
ンエステラーゼ活性値（Ｕ／Ｌ）を算出する。 ここで、検体としてコリンエステラーゼを高値に含む血
清を１／１０、１／５、２／５、３／５、４／５、５／
５に希釈して用い、検量線を作成した。その結果を図１
４に示す。図１４に示されるように良好な直線性に示し
た。次に、対照法として、ＤＭＢＴ（２，３−ジメトキ
シベンゾイルチオコリンヨーダイト）を用いた市販の試
薬を用いて、同じ検体についてコリンエステラーゼ活性
値（Ｕ／Ｌ）を求めた。その結果を表１２に示す。表１
２に示されるように、よい相関性［相関係数（ｒ）＝
０．９９１］を示した。
【００７１】
【表１２】
【図１】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量線
を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
【図２】本発明の方法によるＡＤＰの測定の検量線を示
す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
【図３】本発明の方法によるクレアチンの測定の検量線
を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
【図４】本発明の方法によるクレアチニンの測定の検量
線を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
線を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
【図５】本発明の方法によるＣｏＡの測定の検量線を示
す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使用）。
【図６】本発明の方法によるＮＡＤ+の測定の検量線を
示す図である。
示す図である。
【図７】本発明の方法及び従来法によるＬＤＨの測定例
を示す図である。
を示す図である。
【図８】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量線
を示す図である（ＮＡＤ+類としてチオ−ＮＡＤ+を使
用）。
を示す図である（ＮＡＤ+類としてチオ−ＮＡＤ+を使
用）。
【図９】本発明の方法によるチオ−ＮＡＤ+の測定の検
量線を示す図である。
量線を示す図である。
【図１０】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量
線を示す図である（ＮＡＤ+類として３−アセチル−Ｎ
ＡＤ+を使用）。
線を示す図である（ＮＡＤ+類として３−アセチル−Ｎ
ＡＤ+を使用）。
【図１１】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量
線を示す図である（ＮＡＤ+類としてデアミノ−ＮＡＤ+
を使用）。
線を示す図である（ＮＡＤ+類としてデアミノ−ＮＡＤ+
を使用）。
【図１２】本発明の方法によるマグネシウムイオンの測
定の検量線を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を
使用）。
定の検量線を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を
使用）。
【図１３】本発明の方法によるカリウムイオンの測定の
検量線を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使
用）。
検量線を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+を使
用）。
【図１４】本発明の方法による血中コリンエステラーゼ
活性の測定例を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+
を使用）。
活性の測定例を示す図である（ＮＡＤ+類としてＮＡＤ+
を使用）。
Claims (10)
- 【請求項１】 酵素反応を用いて生体物質を測定す
る方法において、ピルビン酸脱水素酵素の存在下、ＮＡ
Ｄ+類をＮＡＤＨ類に還元する反応を用い、ＮＡＤＨ類
の生成量に基づいて生体物質を測定することを特徴とす
る生体物質の測定方法。 - 【請求項２】 生体物質が、ピルビン酸、コエンザ
イムＡ（ＣｏＡ）又はＮＡＤ+類である請求項１記載の
生体物質の測定方法。 - 【請求項３】 生体物質が、ピルビン酸、ＣｏＡ又
はＮＡＤ+類を生成する酵素反応系の基質であり、当該
基質量を測定する請求項１記載の生体物質の測定方法。 - 【請求項４】 生体物質が、アデノシンジホスフェ
ート（ＡＤＰ）、尿素窒素、クレアチン、クレアチニ
ン、遊離脂肪酸、シアル酸、中性脂肪、リン脂質又はア
ミノ酸である請求項３記載の生体物質の測定方法。 - 【請求項５】 生体物質が、ピルビン酸、ＣｏＡ又
はＮＡＤ+類を生成する酵素反応系の酵素であり、当該
酵素の活性を測定する請求項１記載の生体物質の測定方
法。 - 【請求項６】 生体物質が、ピルベートキナーゼ
（ＰＫ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、クレアチン
ホスフェートキナーゼ（ＣＰＫ）、マレートデヒドロゲ
ナーゼ（ＭＤＨ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤ
Ｈ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）又
はアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）
である請求項５記載の生体物質の測定方法。 - 【請求項７】 生体物質が、ピルビン酸、ＣｏＡ又
はＮＡＤ+類を生成する酵素反応系の酵素の補欠分子族
又は活性化因子である請求項１記載の生体物質の測定
法。 - 【請求項８】 生体物質が、マグネシウムイオン、
カリウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、
ナトリウムイオン、クロルイオン又は炭酸水素イオンで
ある請求項７記載の生体物質の測定法。 - 【請求項９】 酵素反応を用いて生体物質を測定す
る方法において、当該方法がピルビン酸又はＣｏＡとＮ
ＡＤＨ類を生成する酵素反応又はこの酵素反応を含む反
応系からなるとき、ピルビン酸脱水素酵素の存在下、Ｎ
ＡＤ+類をＮＡＤＨ類に還元する反応を、上記酵素反応
又は酵素反応系と共役させることにより、生成したピル
ビン酸又はＣｏＡを消費すると共にＮＡＤＨ類生成量を
増加させ、ＮＡＤＨ類の生成量に基づいて生体物質を測
定することを特徴とする生体物質の測定方法。 - 【請求項１０】 測定対象である生体物質が、マレ
ートデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ラクテートデヒドロ
ゲナーゼ（ＬＤＨ）又はアラニンデヒドロゲナーゼであ
る請求項９記載の生体物質の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35951892A JPH0686693A (ja) | 1991-12-28 | 1992-12-26 | 生体物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35927391 | 1991-12-28 | ||
| JP3151992 | 1992-01-21 | ||
| JP21547092 | 1992-07-20 | ||
| JP3-359273 | 1992-07-20 | ||
| JP4-215470 | 1992-07-20 | ||
| JP4-31519 | 1992-07-20 | ||
| JP35951892A JPH0686693A (ja) | 1991-12-28 | 1992-12-26 | 生体物質の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0686693A true JPH0686693A (ja) | 1994-03-29 |
Family
ID=27459448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35951892A Pending JPH0686693A (ja) | 1991-12-28 | 1992-12-26 | 生体物質の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0686693A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011103825A (ja) * | 2009-11-19 | 2011-06-02 | Nitto Boseki Co Ltd | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット |
| CN103773833A (zh) * | 2013-12-19 | 2014-05-07 | 深圳市雷诺华科技实业有限公司 | 肌酐测定试剂 |
-
1992
- 1992-12-26 JP JP35951892A patent/JPH0686693A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011103825A (ja) * | 2009-11-19 | 2011-06-02 | Nitto Boseki Co Ltd | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット |
| CN103773833A (zh) * | 2013-12-19 | 2014-05-07 | 深圳市雷诺华科技实业有限公司 | 肌酐测定试剂 |
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