JPH0688779A

JPH0688779A - 遺伝子センサー

Info

Publication number: JPH0688779A
Application number: JP4238607A
Authority: JP
Inventors: Hideichiro Yamaguchi; 秀一郎山口; Noboru Koyama; 昇小山
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1992-09-07
Filing date: 1992-09-07
Publication date: 1994-03-29
Anticipated expiration: 2017-07-02
Also published as: JP3296854B2

Abstract

(57)【要約】【構成】電気機械変換素子１と、少なくとも一部が検出
目的遺伝子と相補的塩基配列を有する該電気機械変換素
子１の電極３表面に固定化された第１のヌクレオチド鎖
５と、該第１のヌクレオチド鎖と相補結合している第２
のヌクレオチド鎖５'とを有する遺伝子センサーであっ
て、該第２のヌクレオチド鎖５'には検出目的遺伝子よ
りも大きな質量をもつ物質７が固定されてなる遺伝子セ
ンサ−である。【効果】本発明の遺伝子センサーは、検出目的遺伝子よ
りも大きな質量をもつ物質があらかじめ固定され、検出
目的遺伝子がこれと置換してセンサーに結合する質量減
少方式であるので、高感度で、非特異的物質の吸着から
の選択性が高い遺伝子センサーである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子検査および遺伝
子診断に用いられるバイオセンサーに関する。詳しく
は、簡易操作可能で迅速計測に使用する遺伝子センサー
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、遺伝子検査および遺伝子診断に
は、ドットブロット（Dot blot）法、インシテュ
ハイブリダイゼーション（in situ Hybridization）
法、サザンブロッティング（Southern blotting）法、
ＰＣＲ法、多形ＤＮＡマーカー法などが知られている。
ドットブロット法およびインシテュハイブリダイ
ゼーション法は、測定操作が簡単で操作時間が比較的短
いという特長があるが、検出感度が低い。サザンブロ
ッティング法は、検出感度が高いが、操作が煩雑で長時
間かかる。十分な感度を得るためにはＰＣＲ法、ＬＣＲ
法により被検査部位のＤＮＡを１０万〜１００万倍に増
幅することがなされている。ＰＣＲ法は極めて感度が高
いが、操作条件が複雑であるうえ、コンタミネーション
の虞れもある。また、何れの方法も検出にはアイソトー
プを用いるため管理区域を設ける必要があり、取り扱い
が煩雑で、集中管理された中央検査部での一括検査から
医療現場への、即時対応を目的とした分散化の流れにも
対応できない。また、廃棄処理の問題もある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな従来の放射線標識ＤＮＡ検査装置にあっては、時間
がかかる、放射線のため一般検査室では使用できないと
いった問題があった。このために、特に高感度でアイソ
トープを用いない遺伝子センサーの開発が渇望されてい
る。

【０００４】本発明は、このような従来のアイソトープ
を用いるＤＮＡセンサーの検出原理に関する問題点と、
高感度簡易迅速測定センサーがないという問題点に鑑み
てなされたものである。すなわち、修飾ヌクレオチド鎖
を固定化し、超高感度化した電気機械変換素子からなる
遺伝子センサーを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題は、電気機械変
換素子と、少なくとも一部が検出目的遺伝子と相補的塩
基配列を有する該電気機械変換素子の電極表面に固定さ
れた第１のヌクレオチド鎖と、該第１のヌクレオチド鎖
と相補結合している第２のヌクレオチド鎖とを有する遺
伝子センサーであって、該第２のヌクレオチド鎖には検
出目的遺伝子よりも大きな質量をもつ物質が固定されて
なる遺伝子センサ−によって解決される。

【０００６】また、上記電気機械変換素子が電気音響ト
ランスデューサーである遺伝子センサーによっても解決
される。また、上記電気機械変換素子が表面弾性波素子
である遺伝子センサーによっても解決される。また、上
記電気機械変換素子がバルク弾性波素子である遺伝子セ
ンサーによっても解決される。また、上記電気機械変換
素子が水晶発振子である遺伝子センサーによっても解決
される。なお、本発明において電気機械変換素子とは電
気−機械変換機能、あるいは電気−機械−光変換機能を
持つ素子である。

【０００７】また、上記物質の質量が０.０１ｐｇ〜１
ｎｇである遺伝子センサーによっても解決される。ま
た、上記物質の比重が１ｇ／ｃｍ³以上である遺伝子セ
ンサーによっても解決される。また、上記物質の直径が
0.01〜10μｍである遺伝子センサーによっても解決され
る。また、上記物質の材質が合成樹脂、磁性体、金属ま
たは金属酸化物のいずれかである遺伝子センサーによっ
ても解決される。また、上記物質の材質がポリスチレン
またはテフロンである遺伝子センサーによっても解決さ
れる。また、上記物質の材質が金または酸化チタンであ
る遺伝子センサーによっても解決される。また、上記物
質の材質がフェライトである遺伝子センサーによっても
解決される。

【０００８】さらに、上記物質が、タンパク質や検出目
的遺伝子以外の核酸等の非特異的吸着や粒子自体の凝集
が起こらないような吸着性の低い材質からなる遺伝子セ
ンサーによっても解決される。

【０００９】

【作用】本発明の遺伝子センサーは、検出目的の遺伝子
が該遺伝子と同配列を持つセンサーに結合された被修飾
ヌクレオチド鎖と相同交換するときに生ずる質量変化の
差を電気機械変換素子の振動の変化として高感度に計測
する。すなわち、置換される被修飾ヌクレオチド鎖に結
合した修飾物質の質量を検出目的遺伝子のそれより大き
く、好ましくは0.1〜１０ｐｇとしておくことで高感度
の遺伝子の検出同定が迅速に行うことができる。測定時
には遺伝子の相同置換の速度を速くするため、検出目的
遺伝子を含む被検液の温度を水の沸点まで上げてもよ
い。

【００１０】以下に本発明を詳細に説明する。電気機械
変換素子の電極表面に固定化されているヌクレオチド鎖
に相補結合している被修飾ヌクレオチド鎖が検出目的遺
伝子と相同交換すると、被修飾ヌクレオチド鎖に結合し
ている修飾物質も被修飾ヌクレオチド鎖とともに電極表
面から外れる。このとき［検出目的遺伝子−修飾物質−
被修飾ヌクレオチド鎖］だけの質量変化（＝ｘ）が生じ
る。修飾物質がない場合、［検出目的遺伝子−被修飾ヌ
クレオチド鎖］だけの質量変化（＝ｙ）となる。ここ
で、修飾物質の質量を検出目的遺伝子のそれより大きく
すれば化学変化（遺伝子相同交換反応）を引き金にして
質量変化を（ｘ／ｙ）倍増幅したことになる。

【００１１】検出目的遺伝子をヒト遺伝子のような巨大
ＤＮＡとし、分子量１０⁹と仮定しても、１分子当たり
の質量は（１０⁹／6.02×１０²³＝）１.７×１０^-15ｇ
である。一方、修飾物質に直径約１.１μｍのポリスチ
レン粒子を用いると、その質量は１ｐｇ以上になるの
で、質量変化は１０００倍以上にも増幅される。

【００１２】検出目的遺伝子を含む被検液中に存在する
検出目的遺伝子以外の核酸類やタンパク質類等の電極表
面への非特異的吸着によって質量の増加が起こる。従っ
て、修飾物質が結合したヌクレオチド鎖を用いない、す
なわち質量増加方式の遺伝子センサーでは、非特異的吸
着の質量の変化方向と同方向となるので検出目的遺伝子
と非特異的吸着物との選択性に劣るものとなる。これに
対し、本発明の遺伝子センサーは非特異的吸着物が電極
表面に吸着しても、検出目的遺伝子の結合による質量の
変化は減少方向であり非特異的吸着物とは逆であるので
選択性に優れた遺伝子センサーとなっている。

【００１３】以下、本発明を実施態様に基づいてより詳
細に説明する。本発明の遺伝子センサーに用いる電気機
械変換素子としては一般に広く用いられているものを適
宜利用することができる。すなわち、電気−機械変換機
能あるいは電気−機械−光変換機能を持つ素子であれば
良く、表面弾性波素子あるいはバルク弾性波素子のいず
れであっても使用することができる。表面弾性波素子と
しては、ＳＡＷデバイス等が挙げられ、バルク弾性波素
子としては、水晶発振子等が挙げられる。尚、ここでは
水晶発振子を例にとって図面を参照しつつ説明を続け
る。

【００１４】第１図は本発明にかかる遺伝子センサー１
０の模式図である。水晶発振子１は水晶板２とその側面
の電極３とを有する。この電極３の表面に検出目的遺伝
子の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有するヌクレ
オチド鎖５を固定化する。このときヌクレオチド鎖５と
相補的なヌクレオチド鎖５'（後で修飾物質７と結合す
る）とは相補結合してヌクレオチド対６を形成してい
る。ヌクレオチド鎖５を電極表面に固定化する際には
３'−末端、５'−末端、あるいは本発明の目的を阻害し
ない他の箇所の１箇所ないし数箇所で結合させることが
できるが、この部分での結合手段、あるいは後述するヌ
クレオチド鎖５'と修飾物質７との結合手段は本発明の
主たる要素ではなく、公知のあるいは今後生み出される
種々の手段を適用することができるが、ここでは操作の
容易な５'−末端を固定する態様に基づいて説明する。

【００１５】まず、電極３の表面にヌクレオチド鎖５の
５'−末端のリン酸基と反応性を有し、電極３にヌクレ
オチド鎖５を固定可能とするカップリング剤４を被覆す
る。カップリング剤４の具体例としてはシランカップリ
ング剤等が挙げられる。このカップリング剤の被覆はセ
ンサーの使用中に溶け出してヌクレトチド鎖５が遺伝子
センサー１０から外れてしまわないようなものでなけれ
ばならないが、例えば、カップリング剤をトルエン等
の溶媒で希釈液とし、これを電極３の表面に塗布し、乾
燥する方法、真空チャンバー内にカップリング剤の有
機溶媒溶液と水晶発振子とを入れ、減圧下で２時間ほど
吸着させた後、常圧下に戻してから乾燥させる方法、
スピンコーター装置を用いてカップリング剤薄膜を形成
した後、乾燥させる方法、がある。

【００１６】尚、理論上はカップリング剤４の電極３表
面における存在量は固定化されるヌクレオチド鎖５と同
じだけあればよいのではあるが、実際には単分子膜〜数
分子層が好ましい。これ以上の膜厚となるとヌクレオチ
ド鎖５のないサイトが多くなり、非特異物質の吸着影響
が大きくなるので好ましくない。

【００１７】このカップリング剤４が被覆された水晶発
振子１の電極３表面に、さらにヌクレオチド対６を結合
する。すなわち、ヌクレオチド対６を含む水溶液に水晶
発振子１を浸漬し、カルボジイミド存在下でヌクレオチ
ド鎖５の５'−末端のリン酸基とカップリング剤のＯＨ
基とを結合して、ヌクレオチド鎖５を電極３表面に固定
した。

【００１８】また、この様なヌクレオチド鎖５の長さは
検出目的遺伝子を認識できる程度であればよい。そし
て、ヌクレオチド鎖５、５'からなるヌクレオチド対６
は、例えばＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成
した後、耐熱性ポリメラーゼを用いたＰＣＲ装置によ
り、必要量（例えば１０万倍）まで増幅して使用する。

【００１９】上述のようにして電極３の表面にヌクレオ
チド鎖５との相補結合を介して固定化されたヌクレオチ
ド鎖５'にはポリスチレン等の修飾物質７が結合され
る。すなわち、一個あたり数個のメチロール基を導入し
たポリスチレン粒子を含む溶液をヌクレオチド対６が固
定された水晶発振子１に接触させた後、カルボジイミド
を加えてヌクレオチド鎖５'の５'−末端のリン酸基とポ
リスチレン粒子のメチロール基のＯＨとを結合させる。

【００２０】以上のようにして得られた本発明の遺伝子
センサー１０は、検出目的遺伝子を次のようにして検出
する（第２図参照）。すなわち、検出目的ＤＮＡを含む
被検液に遺伝子センサー１０を接触させ、検出目的遺伝
子１１が遺伝子センサーに結合しやすいよう、相補的結
合を形成している水素結合を弱めるために加熱して、例
えば９０℃以上とする。このようにすると、ヌクレトチ
ド対６および検出目的遺伝子１１の相補的結合が解離す
る。その後、徐々に温度を下げてアニールすることで修
飾物質７で修飾されたヌクレトチド鎖５'と検出目的遺
伝子１１が置換して水晶発振子１の電極３表面に検出目
的遺伝子１１が結合する。

【００２１】すると、電極３の質量が減少し、水晶発振
子１の発振周波数が上昇する。この周波数の上昇によっ
て被検液中の検出目的遺伝子１１の存在が確認される。
同時に電極３表面への非特異的物質の吸着も起こるが、
これらは発振周波数を低下させる方向に働くので本発明
の遺伝子センサー１０は非常に選択性の高いものとな
る。

【００２２】水晶発振子１の周波数の上昇は、例えば第
３図に示す測定システムによって検知され、表示あるい
は出力される。すなわち、発振回路２０によって与えら
れた電圧に基づいて水晶発振子１０が発振する。発振し
た周波数信号は発振回路２０で増幅して周波数カウンタ
ー３０により周波数を算出しＡ／Ｄ変換した後、パソコ
ンに信号を送り、検出前の発振周波数と検出後の発振周
波数とを比較し、周波数の上昇データより検出目的遺伝
子の存在を判定する。判定された結果は、ディスプレイ
装置５０あるいは出力装置６０へ送られ表示あるいは印
字出力される。さらに、本発明の遺伝子センサーは、発
振周波数の変化が、検出目的遺伝子の濃度に対応して変
化するので、遺伝子の定量的な検出も可能である。

【００２３】また、本発明の遺伝子センサー１０は、修
飾物質７として例えばフェライト等の磁性粒子を用いた
場合、修飾物質７結合被修飾ヌクレトチド鎖５'は使用
後、容易に回収することができ、遺伝子センサー１０の
材料として再生利用できる。

【００２４】

【実施例】

（実施例１）直径１２ｍｍ、厚さ０.３３４ｍｍの水晶
発振子（（株）明電舎製ＡＴカット水晶円板）の両面
には、発振励起用の直径５ｍｍの金円板電極が形成され
ている。トルエンを溶媒としてシランカップリング剤４
（γ−グリシドキシプロピルシラン、ＳＨ６０４０、東
レ・ダウコーニング・シリコーン（株））の希釈液を作
成し、この希釈液をマイクロシリンジにとって金電極の
表面に１μｌ塗布した後、乾燥することによって被覆し
た。

【００２５】この水晶発振子をＰＨ８.０の検出目的Ｄ
ＮＡの少なくとも一部分と同配列を持つヌクレオチド対
（本実施例においては試験例１で後述する方法によって
作成され用いられた検出目的ＤＮＡと同一のものをヌク
レオチド対として用いた）を含む溶液に浸漬し、カルボ
ジイミド存在下で、ヌクレオチド対の一方のヌクレオチ
ド鎖であるヌクレオチド鎖の５'−末端のリン酸基とシ
ランカップリング剤のＯＨ基とを結合して、水晶発振子
の電極表面に固定化した。

【００２６】次にヌクレオチド鎖と相補結合している反
対側のヌクレオチド鎖の５'−末端のリン酸基に、平均
質量が約１ｐｇであるポリスチレン微粒子（ポリサイエ
ンス社製ポリビーズ（マイクロスフェア）平均粒径１
μｍ）に該ポリスチレン微粒子１個あたり数個のメチロ
ール基を導入したものを含む溶液を接触させ、カルボジ
イミドを加えて該ポリスチレン微粒子に導入されたメチ
ロール基のＯＨ基を２４時間反応させることによって結
合した。これを洗浄することによって、ＤＮＡセンサー
とした。

【００２７】（試験例１）このようにして得られたＤＮ
Ａセンサーを用いて実際に被検液中のＤＮＡの存在を確
認する実験を行った。試料ＤＮＡは、ＤＮＡ／ＲＮＡ
SYNTHESIZERS 392型（Applied Biosystems Inc.社製）
のＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した後、耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ装置（ＣＩＴＵＳ社
製）により１０万倍に増幅した後使用した。

【００２８】実施例１で得られたＤＮＡセンサーを第３
図に示す測定システムに接続した。尚、周波数カウンタ
ー３０は横河ヒューレットパッカード社製ＹＨＰ−５３
３４を使用した。乾燥空気中で発振周波数を測定した結
果、5,001,906Ｈｚであった。この水晶発振子の基本発
振周波数は5,002,201Ｈｚであり、基本発振周波数より
２９５Ｈｚ低下している。

【００２９】また、このＤＮＡセンサーを試料ＤＮＡを
１×１０⁵分子含む被検液１００μｌに接触させて、溶
液温度を９３℃で１分間保持した後、ゆっくりと降温し
ながらアニールを行った。その後、被検液からＤＮＡセ
ンサーを取り出して洗浄し、乾燥空気中で発振周波数を
測定すると5,001,936Ｈｚであり、３０Ｈｚの周波数上
昇が観察された。

【００３０】ところで、基本発振周波数Ｆ₀は水晶板の
厚さｄで決まり、厚くなれば周波数は低下し、この関係
は次式で与えられる。Ｆ₀＝Ｎ／ｄ（Ｎ：振動定数、
本明細書中で使用したものは167kHz・cm）。このことは
水晶の表面に一定質量のものが被着して厚みが変わって
も同様に周波数が低下することを意味し、被着物質の質
量ｍと発振周波数のシフト値ΔＦとの関係は次式で与え
られる。ｍ＝-4.348・10^-7・A・ΔF/F₀ ² （Ａ：電極面
積）。実施例１のＤＮＡセンサーでは、基本発振周波数
Ｆ₀＝（167/334）＝５×１０³ｋＨｚ＝５ＭＨｚ、電極
面積Ａ＝(0.5/2)²×3.14＝０.１９６ｃｍ²となる。

【００３１】また、ＤＮＡセンサーに固定されたポリス
チレン微粒子結合ヌクレオチド鎖は、ｍ＝１×１０^-6ｇ
であり、上述の通りポリスチレン微粒子１個の質量は１
ｐｇであるから、１×１０⁶個であることがわかった。

【００３２】被検液中の試料ＤＮＡの測定によって得ら
れた周波数変化ΔＦ＝３０Hzからは、ｍ＝−１.０２×
１０^-7ｇであることがわかり、−１.０２×１０⁵個のポ
リスチレン微粒子結合ヌクレオチド鎖が外れたことがわ
かる。また、１００μｌ中の試料ＤＮＡの分子数を２×
１０⁵、５×１０⁴個としたときのΔＦはそれぞれ６１、
１４Ｈｚであり、ほぼ定量的な特性を示すことがわかっ
た。

【００３３】また、実施例１のＤＮＡセンサーの検出限
界は、通常の周波数測定では１Ｈｚの測定精度は容易に
得られるので、発振周波数を１Ｈｚだけ変化させられる
質量をこのセンサーの質量感度とすると、この場合は
３.４ｎｇ／Ｈｚとなり、これより１分子あたり１ｐｇ
の変化が起きるから、３４００分子であることがわかっ
た。

【００３４】（実施例２）基本発振周波数が９.９５Ｍ
Ｈｚである直径３ｍｍ金電極をもつ直径８ｍｍの水晶発
振子を用いた以外は実施例１と同様にしてＤＮＡセンサ
ーを作製した。本実施例では約３０６個からのＤＮＡ検
出が可能である。

【００３５】（実施例３）基本発振周波数２０ＭＨｚで
ある直径２ｍｍの金電極をもつ直径４ｍｍの水晶発振子
を用いた以外は実施例１と同様にしてＤＮＡセンサーを
作製した。本実施例では３４から個のＤＮＡ検出が可能
である。

【００３６】（実施例４）基本発振周波数５０ＭＨｚで
ある直径１ｍｍの金電極をもつ直径２ｍｍの水晶発振子
を用いた以外は実施例１と同様にしてＤＮＡセンサーを
作製した。本実施例では１個からのＤＮＡ検出が可能で
ある。

【００３７】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
の遺伝子センサーは、検出目的遺伝子よりも大きな質量
をもつ物質があらかじめ固定され、検出目的遺伝子がこ
れと置換してセンサーに結合する質量減少方式であるの
で、高感度で、非特異的物質の吸着からの選択性が高い
遺伝子センサーとなる。また本発明は、放射線標識や酵
素等を用いていないので取り扱いが簡単かつ、安全であ
る。また、操作が簡単である。従来法に比較して迅速測
定が可能である。本発明によれば、目的の遺伝子の一部
の配列が分かれば高感度で遺伝子を検出することが可能
であり、ＨＩＶウイルス、ＨＣＶウイルス等を遺伝子レ
ベルで検出することができ遺伝子レベルの病因の診断や
治療に貢献できる。

【００３８】また、本発明の検出部分は、再生可能なの
で、繰り返し使用して検査コストを低くできる。本発明
の遺伝子センサーを複数個配列して形成することで同時
に多種類検査ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の１実施例による遺伝子センサーの断
面構造を示す模式図である。第２図は、本発明の遺伝子
検出原理を説明する図である。第３図は、本発明の遺伝
子センサーを組み込んだ遺伝子検出システムの構成図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電気機械変換素子と、少なくとも一部が検
出目的遺伝子と相補的な塩基配列を有する該電気機械変
換素子の電極表面に固定された第１のヌクレオチド鎖
と、該第１のヌクレオチド鎖と相補結合している第２の
ヌクレオチド鎖とを有する遺伝子センサーであって、該
第２のヌクレオチド鎖には検出目的遺伝子よりも大きな
質量をもつ物質が固定されてなることを特徴とする遺伝
子センサ−。