JPH0690161B2 - 溶液もしくは分散液中の被検体の濃度測定方法及び装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は食品化学における微生物もしくはそれらの生成
物の濃度測定に利用される、被検体の濃度測定方法とそ
の装置に関する。

各種微生物の培養は、微生物の大量増殖自体を目的とす
るもの、微生物の生成物を得ることを目的とする等の目
的によって行われているが、培養工程中に微生物または
それらの生成物の濃度を知ることは、培養の管理上栄養
供給の管理や溶液中の許容濃度を管理する上で重要な問
題である。

従来これらの濃度を知るために、槽より一部の溶液を取
り出して種々の方法で濃度測定していたが近年培養の効
率化のため、連続的かつ経時的でさらにインラインでの
無菌的測定が行なえる方法と装置が望まれている。

（従来の技術） 微生物の濃度を測定する方法は、菌体の乾燥重量を求め
る方法、比濁測定法、菌体数測定法等の基本的測定法か
ら、光学的測定法、反応測定法、電気化学的測定法など
が提案されている。

基本的測定法は測定時間がかかることや、労力を多大に
必要とすること等の問題から、後記したようなインライ
ンでの機器計測的な方法が提案されてきた。

投光器と受光器がセンサーに組み込まれた光学的装置
による測定方法。

実開昭62-16457号のものは、受光量の変化を受光器で電
気量の変化に転換し演算処理して被検体の濃度を測定す
る装置で、被検体の流れを妨害せず小型で、かつ高温高
圧下でも使用可能である。

特開昭51-49787号のものは、培養基中で微生物等が光学
繊維を介して光の透過量を測定することで濃度を測定す
るとともに、紫外線を通して壁面付着する微生物を殺す
ようにしたものである。また、光学繊維を容器内に収納
して開閉蓋を取付け他の光や泡の影響を防止した手段で
ある。

反応測定方法 特開昭62-64934号のものは、電極表面に抗体を固定化し
た水晶振動子バイオセンサーを作成し、微生物の検知及
び濃度の測定を行う手段である。

特開昭50-36198号のものは、プローブに微生物又は酵素
を被覆させた感温装置にして、微生物または酵素の基質
である分子の濃度を測定する手段である。

電気化学的測定法 特開昭60-135754号のものは、溶媒が流れる通路におけ
る作用極配置部分と対極配置部分の太さが可変で、両極
間で発生する電気量の変化により被測定物の濃度を測定
する手段である。

特開昭59-81551号のものは、生細胞が電極に直接接触す
ると電流が発生することから、細胞懸濁液に一対の電極
を設け、周期的電位を印加して生起する電流値を測定
し、その細胞数を測定する手段である。

特開昭61-48755号のものは、基準濃度培養液中の一対の
電極と培養液流路の一対の電極を含む交流ブリッジ回路
の不平衡出力を位相検波する位相検波回路とを具備した
培養液の電気伝導度を測定することによって、培養液の
濃度を最適に保つ手段である。

（従来技術の問題点） 従来実施されてきた基本的測定法は測定時間や労力に無
駄が多く、かつ被検体の汚染防止上から密閉系培養機器
では利用できるものが少ない。

滅菌処理される密閉系培養機器ではインラインでの計測
が実施されるが、従来技術に記載した光学的測定機器で
は、センサーへの微生物の付着を完全に防止することが
できず、特に光の発光及び受光器面に付着が進行すると
光量に影響がでて測定能力が低下することを避けられな
いうえ、培地に色がある場合や培養時間の経過とともに
色がつきだす場合なども光の透過に影響を与えるし、ま
た培養槽に設けられた液面窓や照明等による外光が発光
器の光量に影響を与え、測定誤差の原因となることもあ
る。

さらに培地の粘度が高い場合などは、受光器・発光器部
分の特異的構造から発光・受光表面に培地がまとわりつ
き、常に変化している培地の状態が正確につかめないこ
とや、培地や菌体の高濃度部分では測定誤差が大きくな
り利用できないという問題がある。

反応測定機器では、センサー表面の固定化担体の破壊や
微生物、酵素等の剥離を防止するため、高温高圧処理に
よる滅菌が不可能であるとともに、機器の振動なども避
ける必要がある。また、センサーに固定化した抗体によ
って結合された微生物は生産に利用されず無駄である
し、センサーの再使用には洗浄と抗体固定化などのセン
サー能力復帰操作が必要となる。

さらに本機器では反応体の反応もしくは反応による触媒
作用を必要とする酵素・微生物に利用がかぎられるとと
もに、菌体が高濃度になると触媒作用に限界があり、測
定範囲も限られてしまうという問題がある。

電気化学的測定機器の問題としては、電極へ酵素、微生
物等が付着すると電気障害が生じ測定誤差の原因となる
ことや、電極を洗浄後で洗浄する場合、洗浄液の種類は
腐食等の問題から限定され、装置に装着したままで洗浄
すると洗浄剤が制約されて機器の洗浄不良の原因とな
り、滅菌維持による洗浄をして長時間の培養を行うシス
テムには適しない。

このように従来技術にはそれぞれ独特の問題があるが、
共通する問題として、培地に気泡が生じることは培養工
程において避けられないことであるが、この気泡がセン
サーに付着することによって検知能力を低下させたり測
定を阻害したりする。特に電極を用いるものは、気泡が
電極に付着することによって電食の原因となることもあ
る。

本発明は以上の従来技術の問題点を解決するべく金属細
線加熱法を用いた、微生物などの濃度を測定する方法と
装置を提供するものである。

（課題を解決するための手段） しかして、本発明は以下のごとく構成するものである。

溶液もしくは分散液中に発熱可能な素子を内蔵する発熱
センサーを設置して、該センサーを発熱させたときの発
熱センサーの温度、もくはそのときの発熱センサーの温
度と溶液もしくは分散液の温度との差を測定することに
より、溶液もしくは分散液中の被検体の濃度を測定する
方法であって、このとき発熱センサーは一定電流もしく
は一定の発熱量になるよう、電流を制御することで発熱
させ、測定中における発熱している該センサーの温度も
しくは該センサーの温度と溶液もしくは分散液の温度と
の差の変化に追従した溶液もしくは分散液中の被検体の
濃度を測定する方法である。

さらに、培養槽内における流体の乱流などによる測定障
害を避けるため、溶液もしくは分散液の循環ラインを構
成し、該循環ライン内に加熱センサーを配置することを
特徴とする方法である。

なお、循環ラインの液流速は一定流速であることが望ま
しく、流速を測定して測定値の補正をしないかぎりは、
0.01〜1.0m/sの範囲で行なうことによって広域における
濃度測定が可能であるが、感度を高く要求されるときは
低流速で、ノイズを小さく要求される時は高流速でとい
うように、流速を多段階に変化させて測定する方法を用
いてもよい。

さらにこの方法を実現するには、溶液もしくは分散液槽
から分岐して一定流速に制御されるポンプを介して前記
槽に戻る溶液もしくは分散液の循環ラインを構成し、前
記槽内もしくは前記循環ライン内において溶液もしくは
分散液の温度を測定するセンサーと前記循環ライン内に
設けた発熱センサーを発熱させたときの該センサーの温
度を測定することにより、溶液もしくは分散液中の被検
体の濃度を測定する装置であって、特には溶液もしくは
分散液中の被検体の濃度の変化とともに変化するセンサ
ーの感度やノイズの状況にあわせて、感度を高く要求さ
れるときは低流速で、ノイズを小さく要求されるときは
高流速でというように、流速を多段階に制御する溶液も
しくは分散液中の被検体の濃度を測定する装置である。

（作用） 本発明は流体のみかけの粘性変化を測定する金属細線加
熱法を用いて、流体内の微生物や微生物の生産物の濃度
を測定しようとするものであって、本出願人が先に出願
した特開昭62-185146号「流体の状態の計測方法」によ
れば、流体の状態変化は、流体のみかけの粘性変化によ
り知りえるが、培養における生産物や菌体の濃度は濃度
の上昇とともに、みかけの粘性が変化することにより同
じく知ることができる。

例えば熱の伝達状況を表す熱伝達率αは下式で与えられ
る。

α＝Q/S（θ_s−θ∞） Q:発熱量 S:センサー表面積 θ_s：センサー表面温度 θ∞：流体温度 すなわち、結局は発熱体と流体の温度差と菌体の温度と
は特定の関係がある。

従って、結果的に流体の温度変化が小さく、発熱量が一
定とみなせる時は発熱体の温度もしくは発熱体と流体の
温度差を経時的に計測し、その変化を計測することで流
体の濃度と関連させ、濃度を測定することが可能とな
る。また、流体の温度が大きく変化する時で、発熱セン
サーが電流で制御されるときは、 Ｑ＝Ｒ・i² から、抵抗Ｒが温度変化により変化して発熱量が変化
し、熱伝達率が流体の温度変化のみで変化してしまうた
め、電流ｉを発熱量が一定となるよう制御して発熱体の
温度をモニターすればよい。

ちなみに、上記センサーの表面温度（θ_s）の測定方法
は本出願人が先に出願した特願昭62-51520号（特開昭63
-217261号公報）を利用し、発熱センサー温度（θ_w）か
ら容易に算出することができる。こうして知りえた熱伝
達率と溶液もしくは分散液中の被検体の濃度とが相関す
る関係において、熱伝達率の変化から濃度変化を数値的
に測定することができ、上式よりセンサー表面温度と流
体温度の差の変化を計測することとなるが、センサー表
面温度は発熱体の温度から算出されることから、発熱体
の温度変化もしくは発熱体の温度と流体の温度との差の
変化と、濃度の相関を見ればよいこととなる。

（実施例） 以下本発明の実施例を説明する。

第１図はこの発明の方法を実施する濃度測定装置の構成
説明図である。図に於いて、微生物等の分散液（１）を
攪拌羽根（３）を装着した容器（２）の中に入れ、配管
（４）を通じてポンプ（５）で一定流速で循環させる。
循環ラインで、流体の温度を計測するセンサー（６）と
発熱センサー（７）を配管（４）中に配置し、発熱セン
サー（７）の温度と流体温度との差を計測する。

（８）は電流源、（９）は電圧計、（10）は制御装置で
あり、これらはGPIB〔ゼネラルインターフェースバス〕
（11）で連絡されている。（12）は各センサー（６）
（７）と電流源（８）及び電圧計（９）を結ぶリード線
である。

循環ラインにおいて一定流速で循環させるのは、コンピ
ューター等でポンプ（５）の出力を制御することにより
容易に行われる。

溶液もしくは分散液の流速は一般に0.01〜1.0m/sが測定
上、広範囲の濃度流体に対処できる巾であるが、流体濃
度が非常に低い時や逆に高い時は、流速を前記以外の巾
においても多段階に制御することで測定は可能である。

ここにおいて流速は段階的に変更するのであって、無段
階的ではない。これは、加熱センサー周囲流速が測定中
は一定であることが望ましいからである。

配管（４）内において発熱センサー（７）の設置形態は
垂直でもよいし水平でもよく、また精度よく温度測定す
るためには各センサー（６）（７）は白金抵抗体で構成
されたものを用いるのが好ましいが、精度よく温度が測
定されればその手段は問わない。

そして各センサー（６）（７）に印加した電圧Ｖと電流
ｉを計測して、その抵抗値Ｒを調べ、センサーの温度θ
_wを関係式 θ＝（R/R_o−１）／α R_o:0℃におけるセンサーの抵抗値 α：電気抵抗の温度係数 を用いて求める。

各センサー（６）（７）には安定した電流を通電するよ
うにし、流体温度を測るセンサー（６）には、発熱を生
じぬよう微少電流を供給する。

以上のようにして行った実験例を以下に示す。

先ず乳酸桿菌菌体の濃度を測定結果を示す。容器（２）
内で乳酸桿菌を所定菌体濃度になるように水に分散し、
分散液（１）の液温を35℃とした。攪拌羽根（３）を用
い回転数250rpmで菌体を均一に分散しつつ、ポンプ
（５）で流速0.3m/sになるよう分散液（４）をラインに
循環させた。この時、発熱センサー（７）には0.3Aの直
流電流を供給し、発熱センサー（７）内部の白金線温度
（θ_w）と液体温度（θ∞）の温度差（θ_w−θ∞）を計
測した。この温度差と菌体濃度との関係を第２図に示
す。この図より、乾燥重量で０〜25g/lの領域でその温
度差から容易に菌体濃度が予測されることがわかる。

なお、センサー表面温度（θ_s）と流体の温度（θ∞）
の差（θ_s−θ∞）でも同じ結果を得られるが、この時
の（θ_s）は作用で記載したように、本出願人の先の出
願特願昭62-51520号によって算出し、（θ_s−θ∞）と
濃度との相関を取って利用すれば良い。

実施例では、発熱体温度（θ_w）と流体温度（θ∞）の
差（θ_w−θ∞）と濃度との相関を示すものである。

次に酵母菌体の濃度の測定結果を示す。

酵母を所定濃度になるように水に分散し、分散液（１）
を25℃とした。攪拌条件を250rpmとし、均一分散させつ
つポンプ（５）で0.5m/sになるよう分散液（１）を循環
させた。発熱サンサー（７）には0.5Aの直流電流を流し
発熱した。この時の発熱サンサー（７）内部の白金線温
度（θ_w）と液体温度（θ∞）との温度差（θ_w−θ∞）
を計測した。この温度と酵母菌体濃度との関係を第３図
に示す。この図より酵母菌体濃度は、乾燥重量160g/lも
の高濃度領域でもこの温度差から容易に精度よく測定で
きることが判明した。

以上のように、微生物の濃度もしくは微生物の生産物の
濃度を測定する時の電流制御範囲は、0.3〜0.9Aが本実
験では適当であった。しかし、センサーの設計によりこ
の値は変化し一定のものではない。また実験例では温度
差と菌体濃度の例をあげたが、溶液もしくは分散液の温
度が一定である時は、発熱センサー（７）の温度のみを
計測してもよいし、また発熱センサー（７）の温度と分
散液（１）の温度から熱伝達率αを計算し、この熱伝達
率の変化を計測して濃度と関連ずけてもよいこととな
る。

また濃度を測定するとき、本発明の測定方法では循環ラ
インの溶液もしくは分散液の流速を低くすると感度があ
がるがノイズが多くなり、逆に流速を高くするとノイズ
は少ないが感度が鈍るという傾向があるため、感度を高
く要求されるときは流速を高く、ノイズを少なくしたい
ときは流速を低くするというように、流速を多段階に制
御して測定することによって、巾の広い濃度領域におけ
る測定を可能とすることができる。

またこの制御を付加させることによって、多種類の溶液
もしくは分散液の測定に応用することができ、従来のご
とく色々の測定機器を測定目的にあわせて選択するとい
うわずらわしさを解消することができる。

（発明の効果） 本発明によれば、以下の効果を奏することができる。

・ライン洗浄が可能で無菌維持による洗浄や長時間の培
養などが可能である。

・手洗い洗浄等をしてもセンサーを損傷することがな
い。

・高温高圧での滅菌処理が可能である。すなわち培養ラ
インの無菌化を容易に実現できる。

・溶液もしくは分散液の色や濃度に影響されずに測定が
可能で、長時間にわたって菌体濃度の管理が可能にな
る。従って培養システムの管理が容易になる。

・センサー表面の仕上げ加工が容易で、微生物の付着を
極力小さくできる。また、溶媒もしくは分散液の泡発生
による影響も小さくなる。

・菌体の高濃度領域においても計測が可能。

・メンテナンスが容易である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の説明図 第２、３図は温度差と濃度の関係を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−84145（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】溶液もしくは分散液中に発熱可能な素子を
   内蔵するセンサーを設け、該センサーを一定電流、もし
   くは一定の発熱量となるよう電流を制御して発熱させた
   ときの発熱センサーの温度、もしくはそのときの発熱セ
   ンサーの温度と溶液もしくは分散液の温度との差を測定
   することにより、溶液もしくは分散液中の被検体の濃度
   を測定する方法。
2. 【請求項２】溶液もしくは分散液中の被検体が微生物も
   しくは微生物の生産物であることを特徴とする、請求項
   （１）に記載の溶液もしくは分散液中の被検体の濃度を
   測定する方法。
3. 【請求項３】溶液もしくは分散液の循環ラインを構成
   し、該循環ライン内に発熱センサーを配置すると共に、
   循環ラインの流速が0.01〜1.0m/sであることを特徴とす
   る請求項（１）〜（２）いずれかに記載の溶液もしくは
   分散液中の被検体の濃度を測定する方法。
4. 【請求項４】溶液もしくは分散液槽から分岐して一定流
   速に制御されるポンプを介して前記槽に戻る溶液もしく
   は分散液の循環ラインを構成し、前記槽内もしくは前記
   循環ライン内において溶液もしくは分散液の温度を測定
   するセンサーと、前記循環ライン内に設けた発熱センサ
   ーを発熱させたときの該センサーの温度を測定すること
   により溶液もしくは分散液中の被検体の濃度を測定する
   装置。
5. 【請求項５】溶液もしくは分散液を循環するとき測定感
   度を高く要求されるときは低流速で、ノイズを少なく要
   求される時は高流速でというように、溶液もしくは分散
   液の流速を多段階に制御することを特徴とした請求項
   （４）に記載の溶液もしくは分散液中の被検体の濃度を
   測定する装置。