JPH0690202B2 - クレアチンキナーゼ活性測定用試薬およびそれを用いる測定方法 - Google Patents
クレアチンキナーゼ活性測定用試薬およびそれを用いる測定方法Info
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- JPH0690202B2 JPH0690202B2 JP63086163A JP8616388A JPH0690202B2 JP H0690202 B2 JPH0690202 B2 JP H0690202B2 JP 63086163 A JP63086163 A JP 63086163A JP 8616388 A JP8616388 A JP 8616388A JP H0690202 B2 JPH0690202 B2 JP H0690202B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生体液中のクレアチンキナーゼ（以下CKと略
記する。）測定用試薬およびそれを用いる測定方法に関
するものである。
記する。）測定用試薬およびそれを用いる測定方法に関
するものである。
（従来の技術） 生体液中、とくに血清中のCK活性の測定は筋疾患の診断
に有用で、なかでも心筋梗塞の診断において重要で日常
的に測定されている。CKには２つのサブユニットの組合
せにより、３つのアインザイムが存在することが知られ
ており、それらは各々CK−MM、CK−MB、CK−BBであり、
CK−MMは主に骨格筋や心筋などの筋肉に、CK−MBは心筋
に、CK−BBは主に脳及び腎などの臓器に存在している。
この中、CK−MBは心筋に特異的に存在するので、その特
異的測定は心筋梗塞の診断において特に有用なマーカー
であることが明らかにされている。
に有用で、なかでも心筋梗塞の診断において重要で日常
的に測定されている。CKには２つのサブユニットの組合
せにより、３つのアインザイムが存在することが知られ
ており、それらは各々CK−MM、CK−MB、CK−BBであり、
CK−MMは主に骨格筋や心筋などの筋肉に、CK−MBは心筋
に、CK−BBは主に脳及び腎などの臓器に存在している。
この中、CK−MBは心筋に特異的に存在するので、その特
異的測定は心筋梗塞の診断において特に有用なマーカー
であることが明らかにされている。
従っれ、CK−BMを特異的に測定する試薬がいくつか提案
されている。その中で免疫阻害法が最もよく用いられて
いる。すなわち、CK−MMおよびMB中のＭサブユニットを
特異的に阻害する抗体を加えて完全に阻害し、残ったＢ
サブユニットの活性を測定する方法（特公昭56−19239
号公報、特公昭58−20274号公報参照）である。さらに
本発明者らは上記の方法において、阻害抗体にモノクロ
ーナル抗体を用いることを提案することにより、さらに
改善を行った（特願昭61−191899号参照）。CK−MBの測
定は心筋梗塞に特異的で有用だが、その測定値が正常値
域を超えるのは10時間後と言われ（例えばウー（Wu）
ら、クリニカルケミストリー（Clin.Chem.）33巻,358頁
（1987年））、さらに短時間に測定できる方法が望まれ
ていた。最近、心臓や骨格筋などから心筋梗塞や筋疾患
により血中に逸脱したCK−MMおよびMB中のＭサブユニッ
トは血漿中のカルボキシペプチダーゼＮによる分解をう
けてＭ′サブユニットに修飾されていくことが明らかに
された（例えばジョージ（George）ら、ジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリー（J.Biol.Chem.）,295巻,2
667頁（1987年）参照）。すなわちCK−MMはMM3（組織
型,MM）からMM2（ハイブリッド型,MM′）を経てMM1（血
清型,M′Ｍ′）と変化して行く（Ｍ′は修飾されたサブ
ユニットを示す。）。さらに平常時はMM3/MM1の値が0.3
前後であるのに対し、心筋梗塞の場合は発作後３〜６時
間でMM3/MM1の値が上昇して２前後の値を示すことが明
らかになった（例えば、ハシモト（Hashimoto）ら、サ
ーキュレーション（Circulation）71巻,363頁（1985
年）参照）。すなわち、このMM3/MM1の値を測定するこ
とにより心筋梗塞の早期診断が可能である。このこと
は、心筋梗塞に対する有効な治療方法である冠動脈内血
栓溶解療法が発症後いかに早期に行うことにより成否が
決まるといわれている（磯部ら、最近医学42巻1418頁
（1987年）参照）ことからも意義深い。さらに再発作の
早期発見も容易になる。
されている。その中で免疫阻害法が最もよく用いられて
いる。すなわち、CK−MMおよびMB中のＭサブユニットを
特異的に阻害する抗体を加えて完全に阻害し、残ったＢ
サブユニットの活性を測定する方法（特公昭56−19239
号公報、特公昭58−20274号公報参照）である。さらに
本発明者らは上記の方法において、阻害抗体にモノクロ
ーナル抗体を用いることを提案することにより、さらに
改善を行った（特願昭61−191899号参照）。CK−MBの測
定は心筋梗塞に特異的で有用だが、その測定値が正常値
域を超えるのは10時間後と言われ（例えばウー（Wu）
ら、クリニカルケミストリー（Clin.Chem.）33巻,358頁
（1987年））、さらに短時間に測定できる方法が望まれ
ていた。最近、心臓や骨格筋などから心筋梗塞や筋疾患
により血中に逸脱したCK−MMおよびMB中のＭサブユニッ
トは血漿中のカルボキシペプチダーゼＮによる分解をう
けてＭ′サブユニットに修飾されていくことが明らかに
された（例えばジョージ（George）ら、ジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリー（J.Biol.Chem.）,295巻,2
667頁（1987年）参照）。すなわちCK−MMはMM3（組織
型,MM）からMM2（ハイブリッド型,MM′）を経てMM1（血
清型,M′Ｍ′）と変化して行く（Ｍ′は修飾されたサブ
ユニットを示す。）。さらに平常時はMM3/MM1の値が0.3
前後であるのに対し、心筋梗塞の場合は発作後３〜６時
間でMM3/MM1の値が上昇して２前後の値を示すことが明
らかになった（例えば、ハシモト（Hashimoto）ら、サ
ーキュレーション（Circulation）71巻,363頁（1985
年）参照）。すなわち、このMM3/MM1の値を測定するこ
とにより心筋梗塞の早期診断が可能である。このこと
は、心筋梗塞に対する有効な治療方法である冠動脈内血
栓溶解療法が発症後いかに早期に行うことにより成否が
決まるといわれている（磯部ら、最近医学42巻1418頁
（1987年）参照）ことからも意義深い。さらに再発作の
早期発見も容易になる。
（発明が解決しようとする課題） このMM3/MM1の測定方法としては現在、電気泳動法によ
る分離後活性測定、クロマトフォーカシング法、等電点
電気泳動法など、煩雑で、時間のかかる方法で行われて
いる。MM3/MM1の測定は上記にのべたように早期に診断
できてこそ意義深くこれらの方法では実用には困難な方
法であり、簡便で短時間で心筋梗塞を診断できる試薬お
よび方法が強く望まれていた。
る分離後活性測定、クロマトフォーカシング法、等電点
電気泳動法など、煩雑で、時間のかかる方法で行われて
いる。MM3/MM1の測定は上記にのべたように早期に診断
できてこそ意義深くこれらの方法では実用には困難な方
法であり、簡便で短時間で心筋梗塞を診断できる試薬お
よび方法が強く望まれていた。
（課題を解決するための手段） 本発明者らはこのような問題点を解決すべく鋭意研究を
重ねた結果、Ｍサブユニットのみを阻害し、Ｍ′サブユ
ニットは阻害しない抗体を用いた免疫阻害法で測定する
阻害率を心筋梗塞診断のマーカーとすることにより心筋
梗塞を簡便かつ短時間に診断できることを見い出し、本
発明を完成した。
重ねた結果、Ｍサブユニットのみを阻害し、Ｍ′サブユ
ニットは阻害しない抗体を用いた免疫阻害法で測定する
阻害率を心筋梗塞診断のマーカーとすることにより心筋
梗塞を簡便かつ短時間に診断できることを見い出し、本
発明を完成した。
すなわち、本発明は抗体を含有するCK測定用試薬におい
て、抗体がCK−Ｍサブユニットを阻害し、かつCK−Ｍ′
サブユニットを阻害しない抗体であることを特徴とする
CK活性測定用試薬、および抗体を含有するCK測定用試薬
でCK活性を測定するに際し、請求項１記載のCK測定用試
薬を用いて生体液中のCKに対する阻害率を測定すること
を特徴とするCK活性の測定方法を要旨とするものであ
る。
て、抗体がCK−Ｍサブユニットを阻害し、かつCK−Ｍ′
サブユニットを阻害しない抗体であることを特徴とする
CK活性測定用試薬、および抗体を含有するCK測定用試薬
でCK活性を測定するに際し、請求項１記載のCK測定用試
薬を用いて生体液中のCKに対する阻害率を測定すること
を特徴とするCK活性の測定方法を要旨とするものであ
る。
本発明に用いられる抗体はポリクローナル、モノクロー
ナル抗体に関係なく使用しうる。好ましくはモノクロー
ナル抗体が用いられる。その理化学的性質の一例を示
す。
ナル抗体に関係なく使用しうる。好ましくはモノクロー
ナル抗体が用いられる。その理化学的性質の一例を示
す。
（１）作用 CKに作用しして抗原抗体反応を生じ、CK−Ｍサブユニッ
ト活性を阻害する。
ト活性を阻害する。
（２）反応特異性 CK−Ｍサブユニットのうち、本来のＭサブユニットを阻
害し、修飾されたＭ′サブユニットを阻害しない。
害し、修飾されたＭ′サブユニットを阻害しない。
（３）至適pH ６〜９ （４）安定pH範囲 ３〜11 （５）力価の測定方法 阻害率測定によって検出されうる希釈倍率によって測定
する。
する。
（６）作用適温の範囲 ０〜40℃ （７）失活の条件 100℃、30分の加熱で失活する。
（８）分子量 130,000〜210,000 本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、抗CK−
Ｍ活性阻害モノクローナル抗体産生能を有するハイブリ
ドーマ細胞株を得る。このハイブリドーマ細胞株として
は、例えば、次の細胞学的性質を示す細胞株があげられ
る。
Ｍ活性阻害モノクローナル抗体産生能を有するハイブリ
ドーマ細胞株を得る。このハイブリドーマ細胞株として
は、例えば、次の細胞学的性質を示す細胞株があげられ
る。
（１）由 来 抗CK−Ｍ抗体産生リンパ球とミエローマ細胞との融合に
より創製した融合細胞である。
より創製した融合細胞である。
（２）形 態 ミエローマ細胞とほぼ同様の形態を示す。例えば、大き
さは10〜20μｍである。
さは10〜20μｍである。
（３）機 能 単一の抗原決定基を認識する抗CK−Ｍ活性阻害モノクロ
ーナル抗体を定常的に生産する。
ーナル抗体を定常的に生産する。
（４）増殖性 ミエローマ細胞とほぼ同様の増殖性を示す。すなわち、
72時間で約10倍に増殖する。
72時間で約10倍に増殖する。
（５）保存性 −120℃以下で極めて容易に長期間保存可能である。
（６）最適増殖条件 温度37℃、pH7.2 （７）増殖範囲 温度32〜42℃、pH6.5〜7.8で増殖可能である。
この様な細胞株を得るには、例えば特願昭61−191899号
に記された方法により抗CK−Ｍ活性阻害モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを得て、さらにそのモノ
クローナル抗体が同様の測定方法でＭ′サブユニットを
阻害しないハイブリドーマを選択すればよい。
に記された方法により抗CK−Ｍ活性阻害モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを得て、さらにそのモノ
クローナル抗体が同様の測定方法でＭ′サブユニットを
阻害しないハイブリドーマを選択すればよい。
以上の方法によりCK−MM3を阻害し、かつCK−MM1を阻害
しない抗体を産生するハイブリドーマが得られる。この
方法に従って創製したハイブリドーマの１種をCKH−５
と命名し、昭和63年１月26日に通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託の手続を行い、微工研菌寄第
9839号（FERM P−9839）として受け入れられた。このCK
H−５は、−120℃以下でほぼ永久的に凍結保存が可能で
あって、たえず頒布可能な状態に置かれている。
しない抗体を産生するハイブリドーマが得られる。この
方法に従って創製したハイブリドーマの１種をCKH−５
と命名し、昭和63年１月26日に通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託の手続を行い、微工研菌寄第
9839号（FERM P−9839）として受け入れられた。このCK
H−５は、−120℃以下でほぼ永久的に凍結保存が可能で
あって、たえず頒布可能な状態に置かれている。
次に、この様なハイブリドーマを培養して、その培養液
等から抗体を得ればよい。その方法は通常用いられる方
法（例えば特願昭61−191899号参照）を用いればよい。
また得られた抗体は、そのままでも、さらに、ペプシ
ン、パパインなどのタンパク分解酵素で処理して、Fa
b、Fab′、Ｆ（ab′）２のフラグメントの形で用いるこ
ともできる。
等から抗体を得ればよい。その方法は通常用いられる方
法（例えば特願昭61−191899号参照）を用いればよい。
また得られた抗体は、そのままでも、さらに、ペプシ
ン、パパインなどのタンパク分解酵素で処理して、Fa
b、Fab′、Ｆ（ab′）２のフラグメントの形で用いるこ
ともできる。
次に、本発明のCK定量用試薬および測定方法は、例え
ば、特公昭56−19239号、特公昭58−20274号、特願昭61
−191899号の方法に従えばよい。すなわち、例えば以下
の方法で行う。まず、グルコキナーゼ（以下、Clckと略
記する。）、またはヘキソキナーゼ（以下、HKと略記す
る。）を0.1〜40ユニット/ml、グルコース−６−リン酸
脱水素酵素（以下、G6PDHと略記する。）を0.1〜40ユニ
ット/ml、Ｍサブユニット阻害性抗体（以下、Abと略記
する。）を0.001〜5mg/ml、アデノシンジリン酸（以
下、ADPと略記する。）を0.1〜20mM、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以下、NAD+と略記する。）また
はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以
下、NADP+と略記する。）を0.05〜20mM、グルコースを
１〜200mM、アデノシンモノリン酸（以下、AMPと略記す
る。）を0.2〜20mM、ジアデノシン五リン酸（以下、Ap5
Aと略記する。）を0.001〜0.1mM、Ｎ−アセチルシステ
イン（以下、NACと略記する。）またはその他のチオー
ル化合物を0.5〜50mM、マグネシウム塩類（例えば、酢
酸マグネシウム）を0.5〜30mM、アジ化ナトリウムを0.5
〜50mM、エチレンジアミン四酢酸（以下、EDTAと略記す
る。）を0.1〜20mM、緩衝液（pH6.7）５〜500mMよりな
る第一試薬を調製い、次にクレアチンリン酸（以下、Cr
Pと略記する）を２〜70mM、アジ化ナトリウム0.5〜50m
M、緩衝液５〜500mMよりなる第二試薬を調製すればよ
い。また、より好ましくは、第一試薬中のGlckまたはHK
を0.2〜20ユニット/ml、G6PDHを0.2〜20ユニット/ml、A
bを0.005〜2mg/ml、ADPを0.2〜10mM、NAD+またはNADP+
を0.1〜10mM、グルコースを２〜100mM、AMPを0.5〜15m
M、Ap5Aを0.002〜0.050mM、NACを２〜30mM、マグネシウ
ム塩類を２〜15mM、アジ化ナトリウムを１〜30mM、EDTA
を0.2〜10mM、緩衝液（pH6.7）を10〜250mMとなるよう
に、さらに第二試薬中のCrPを５〜40mM、アジ化ナトリ
ウムを１〜30mM、緩衝液を10〜250mMとなるように調製
すればよい。
ば、特公昭56−19239号、特公昭58−20274号、特願昭61
−191899号の方法に従えばよい。すなわち、例えば以下
の方法で行う。まず、グルコキナーゼ（以下、Clckと略
記する。）、またはヘキソキナーゼ（以下、HKと略記す
る。）を0.1〜40ユニット/ml、グルコース−６−リン酸
脱水素酵素（以下、G6PDHと略記する。）を0.1〜40ユニ
ット/ml、Ｍサブユニット阻害性抗体（以下、Abと略記
する。）を0.001〜5mg/ml、アデノシンジリン酸（以
下、ADPと略記する。）を0.1〜20mM、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以下、NAD+と略記する。）また
はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以
下、NADP+と略記する。）を0.05〜20mM、グルコースを
１〜200mM、アデノシンモノリン酸（以下、AMPと略記す
る。）を0.2〜20mM、ジアデノシン五リン酸（以下、Ap5
Aと略記する。）を0.001〜0.1mM、Ｎ−アセチルシステ
イン（以下、NACと略記する。）またはその他のチオー
ル化合物を0.5〜50mM、マグネシウム塩類（例えば、酢
酸マグネシウム）を0.5〜30mM、アジ化ナトリウムを0.5
〜50mM、エチレンジアミン四酢酸（以下、EDTAと略記す
る。）を0.1〜20mM、緩衝液（pH6.7）５〜500mMよりな
る第一試薬を調製い、次にクレアチンリン酸（以下、Cr
Pと略記する）を２〜70mM、アジ化ナトリウム0.5〜50m
M、緩衝液５〜500mMよりなる第二試薬を調製すればよ
い。また、より好ましくは、第一試薬中のGlckまたはHK
を0.2〜20ユニット/ml、G6PDHを0.2〜20ユニット/ml、A
bを0.005〜2mg/ml、ADPを0.2〜10mM、NAD+またはNADP+
を0.1〜10mM、グルコースを２〜100mM、AMPを0.5〜15m
M、Ap5Aを0.002〜0.050mM、NACを２〜30mM、マグネシウ
ム塩類を２〜15mM、アジ化ナトリウムを１〜30mM、EDTA
を0.2〜10mM、緩衝液（pH6.7）を10〜250mMとなるよう
に、さらに第二試薬中のCrPを５〜40mM、アジ化ナトリ
ウムを１〜30mM、緩衝液を10〜250mMとなるように調製
すればよい。
測定方法としては、例えば、まず、第一試薬0.5mlとCK
を含む酵素液（または血清）0.001〜0.02mlを混合し、2
5〜37℃の一定温で５〜10分間保温した後、第二試薬0.1
25mlを添加し、セル室を同じ温度に保った分光計にて34
0nmの吸光度変化により残存CK活性を測定する。次に対
照として、抗体を含有しない第一試薬に同量の酵素液
（または血清）を混合して以下同様に測定する。残存CK
活性と対照CK活性から以下の式で阻害率を求めることが
できる。
を含む酵素液（または血清）0.001〜0.02mlを混合し、2
5〜37℃の一定温で５〜10分間保温した後、第二試薬0.1
25mlを添加し、セル室を同じ温度に保った分光計にて34
0nmの吸光度変化により残存CK活性を測定する。次に対
照として、抗体を含有しない第一試薬に同量の酵素液
（または血清）を混合して以下同様に測定する。残存CK
活性と対照CK活性から以下の式で阻害率を求めることが
できる。
（作用） 本発明に用いられる抗体はCK−Ｍサブユニットを阻害
し、CK−Ｍ′サブユニットを阻害しない。心筋梗塞で心
臓から逸脱したCKはそのＭサブユニットが血中のカルボ
キシペプチダーゼで修飾を受ける。すなわちCK−MM（MM
3）はMM′（MM2）を経てＭ′Ｍ′（MM1）へと、またCK
−MB（MB2）はＭ′Ｂ（MB1）へと各々経時的に変化して
行く。ゆえに心臓からの逸脱直後にはＭサブユニットの
修飾が進んでいないので本発明による阻害率は高くな
り、その後修飾が進むにつれて低下する。このことから
本発明の試薬で阻害率を測定することにより心筋梗塞の
早期診断や発症時刻の推定ができる。
し、CK−Ｍ′サブユニットを阻害しない。心筋梗塞で心
臓から逸脱したCKはそのＭサブユニットが血中のカルボ
キシペプチダーゼで修飾を受ける。すなわちCK−MM（MM
3）はMM′（MM2）を経てＭ′Ｍ′（MM1）へと、またCK
−MB（MB2）はＭ′Ｂ（MB1）へと各々経時的に変化して
行く。ゆえに心臓からの逸脱直後にはＭサブユニットの
修飾が進んでいないので本発明による阻害率は高くな
り、その後修飾が進むにつれて低下する。このことから
本発明の試薬で阻害率を測定することにより心筋梗塞の
早期診断や発症時刻の推定ができる。
（実施例） 本発明を実施例により具体的に説明する。本発明はこれ
ら実施例に限定されない。
ら実施例に限定されない。
参考例１ ８週令のマウスBalb/c（日本クレアより入手。）に、50
μｇのブタCK−MMを完全フロイントアジュバンド（半井
化学より入手。）と1:1に混合乳化し、腹腔内に投与
し、３週間後に50μｇのブタCK−MMを静注して追加免疫
し、マウスミエローマX63・６・５・３と、オイ（Oi,V.
T.）らの方法（セレクティッド メソッズインセルラー
イムノロジー（Selected Methods in Cellular Immunol
ogy）,351頁、フリーマンアンドカンパニー（W.H.Freem
an and CO.）1980年）に従って融合し、96穴中54穴でハ
イブリドーマの生育がみられたので、その上澄液をCK活
性測定用試薬（参考例２）に添加して、各々CK−MM3お
よびCK−MM1に対して阻害率を測定し、CK−MM3には阻害
を示し、かつMM1を阻害しない抗体を産生している穴の
株を選択して限界希釈法にてクローニングを行い、モノ
クローンのハイブリドーマCKH−５を得た。このCKH−５
は、前記した細胞学的性質によく一致した。
μｇのブタCK−MMを完全フロイントアジュバンド（半井
化学より入手。）と1:1に混合乳化し、腹腔内に投与
し、３週間後に50μｇのブタCK−MMを静注して追加免疫
し、マウスミエローマX63・６・５・３と、オイ（Oi,V.
T.）らの方法（セレクティッド メソッズインセルラー
イムノロジー（Selected Methods in Cellular Immunol
ogy）,351頁、フリーマンアンドカンパニー（W.H.Freem
an and CO.）1980年）に従って融合し、96穴中54穴でハ
イブリドーマの生育がみられたので、その上澄液をCK活
性測定用試薬（参考例２）に添加して、各々CK−MM3お
よびCK−MM1に対して阻害率を測定し、CK−MM3には阻害
を示し、かつMM1を阻害しない抗体を産生している穴の
株を選択して限界希釈法にてクローニングを行い、モノ
クローンのハイブリドーマCKH−５を得た。このCKH−５
は、前記した細胞学的性質によく一致した。
こうして得たハイブリドーマCKH−５を、10％牛胎児血
清を含むRPM11640培地で培養し、細胞温度２×106個/ml
となった培養物300mlを遠心分離で上澄液を集め、50％
飽和硫安分画により粗抗体画分を分離し、透析後、プロ
テインＡセファロース（pH8.0）に吸着させ、pH4.0のク
エン酸緩衝液で溶出して、モノクローナル抗体（以下、
この抗体をCKA−５と略記する。）3.2mgを得た。
清を含むRPM11640培地で培養し、細胞温度２×106個/ml
となった培養物300mlを遠心分離で上澄液を集め、50％
飽和硫安分画により粗抗体画分を分離し、透析後、プロ
テインＡセファロース（pH8.0）に吸着させ、pH4.0のク
エン酸緩衝液で溶出して、モノクローナル抗体（以下、
この抗体をCKA−５と略記する。）3.2mgを得た。
参考例２ 以下に示すCK活性測定用試薬系に添加して、クロマトフ
ォーカシング法により分離した血清中のCK−MM3、MM2お
よびMM1に対する阻害率を策定した。
ォーカシング法により分離した血清中のCK−MM3、MM2お
よびMM1に対する阻害率を策定した。
まず、バチルス・ステアローサモフィルス由来のGlcK
（生化学工業より市販。）1.4ユニット/ml、ロイコノス
トック メセンテロイデス由来のG6PDH（オリエンタル
酵母工業社より購入。）1.2ユニット/ml、ADP1.2mM、NA
DP0.75mM、グルコース25mM、AMP6.25mM、Ap5A12.5μ
Ｍ、Ｎ−アセチルシステイン12.5mM、酢酸マグネシウム
12.5mM、アジ化ナトリウム10mM、EDTA2.5mM、イミダゾ
ール−酢酸緩衝液（pH6.7）150mMよりなる第一試薬を調
整し、次いで、CP100mM、アジ化ナトリウム10mM、トリ
ス−酢酸緩衝液（pH8.5）25mMよりなる第二試薬を調製
した。
（生化学工業より市販。）1.4ユニット/ml、ロイコノス
トック メセンテロイデス由来のG6PDH（オリエンタル
酵母工業社より購入。）1.2ユニット/ml、ADP1.2mM、NA
DP0.75mM、グルコース25mM、AMP6.25mM、Ap5A12.5μ
Ｍ、Ｎ−アセチルシステイン12.5mM、酢酸マグネシウム
12.5mM、アジ化ナトリウム10mM、EDTA2.5mM、イミダゾ
ール−酢酸緩衝液（pH6.7）150mMよりなる第一試薬を調
整し、次いで、CP100mM、アジ化ナトリウム10mM、トリ
ス−酢酸緩衝液（pH8.5）25mMよりなる第二試薬を調製
した。
上記の第一試薬に抗CK−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体
CKA−５ 0.5mgを添加し、その0.5mlにCK−MM3、MM2又
はMM1を加えて光路長1cmのセルに入れ、15分間インキュ
ベートし、次いで、第二試薬0.125mlを加えて、セル室
を同じく30℃の恒温に保った分光光度計にて、340nmの
吸光度変化より残存CK活性を測定した。対照として、抗
体を含まない第一試薬に同量のCK−MM3、MM2又はMM1を
加えて、以下同様に測定した。
CKA−５ 0.5mgを添加し、その0.5mlにCK−MM3、MM2又
はMM1を加えて光路長1cmのセルに入れ、15分間インキュ
ベートし、次いで、第二試薬0.125mlを加えて、セル室
を同じく30℃の恒温に保った分光光度計にて、340nmの
吸光度変化より残存CK活性を測定した。対照として、抗
体を含まない第一試薬に同量のCK−MM3、MM2又はMM1を
加えて、以下同様に測定した。
その結果を表１に示す。
表１に示したように、CKA−５は組織型であるCK−MM3を
よく阻害し、血清型のMM1は阻害せず、ハイブリッド型
のMM2を約半分阻害することから、未修飾のＭサブユニ
ットを阻害し、分解を受けたＭ′サブユニットを阻害せ
ず、前記した理化学的性質によく一致した抗体であっ
た。
よく阻害し、血清型のMM1は阻害せず、ハイブリッド型
のMM2を約半分阻害することから、未修飾のＭサブユニ
ットを阻害し、分解を受けたＭ′サブユニットを阻害せ
ず、前記した理化学的性質によく一致した抗体であっ
た。
（参考例3,比較例１） 生の血漿に心筋から精製したCK−MM（800U/）を添加
して、37℃でインキュベートして経時的なCKA−５によ
る阻害率を実施例１に記した方法で測定した。なお比較
例として市販されているCK−MM阻害抗体を含有するCK−
MB用キット（ベーリンガーマンハイム社）を用いて阻害
率を測定した。その結果を表２に示す。
して、37℃でインキュベートして経時的なCKA−５によ
る阻害率を実施例１に記した方法で測定した。なお比較
例として市販されているCK−MM阻害抗体を含有するCK−
MB用キット（ベーリンガーマンハイム社）を用いて阻害
率を測定した。その結果を表２に示す。
精製CK−MM（MM3）が血漿中のカルボキシペプチダーゼ
Ｎによって、修飾をうけてMM2、MM1と変化するに従っ
て、CKA−５による阻害は経時的に減少し、６時間後に
は全く阻害せずアイソフォームの変化とよく対応した。
一方、比較例として測定した、CK−MM阻害抗体を含有す
るキットでは、阻害率は６時間後も変化せず、アイソフ
ォームの変化をとらえることはできなかった。
Ｎによって、修飾をうけてMM2、MM1と変化するに従っ
て、CKA−５による阻害は経時的に減少し、６時間後に
は全く阻害せずアイソフォームの変化とよく対応した。
一方、比較例として測定した、CK−MM阻害抗体を含有す
るキットでは、阻害率は６時間後も変化せず、アイソフ
ォームの変化をとらえることはできなかった。
（実施例１、比較例２） 心筋梗塞の発作を起こした患者の血清総CK活性、おびCK
A−５による阻害率を実施例１の方法で経時的に測定し
た。なお比較例としてCK−MB活性を、CK−MM阻害抗体を
含有するCK−MB測定キット（ベーリンガーマンハイム）
で測定した。その結果を第１図と第２図に示したが、CK
A−５による阻害率は発作後約６時間でピークを示した
のに対し、従来から、心筋梗塞の診断に用いられてい
る。CK−MBは12時間後に初めて正常値の範囲（28U/以
下、および総CK活性の６％以下）を超えた。これらのこ
とからCKA−５による阻害率測定は、心筋梗塞の早期診
断に非常に有用であることが明らかであった。
A−５による阻害率を実施例１の方法で経時的に測定し
た。なお比較例としてCK−MB活性を、CK−MM阻害抗体を
含有するCK−MB測定キット（ベーリンガーマンハイム）
で測定した。その結果を第１図と第２図に示したが、CK
A−５による阻害率は発作後約６時間でピークを示した
のに対し、従来から、心筋梗塞の診断に用いられてい
る。CK−MBは12時間後に初めて正常値の範囲（28U/以
下、および総CK活性の６％以下）を超えた。これらのこ
とからCKA−５による阻害率測定は、心筋梗塞の早期診
断に非常に有用であることが明らかであった。
（発明の効果） 本発明のCK測定用試薬、およびそれを用いて阻害率を測
定するCK活性の測定方法は、Ｍサブユニットの変化（ア
イソフォーム）を簡便かつ短時間に測定することができ
るので、心筋梗塞の早期診断が可能となる。
定するCK活性の測定方法は、Ｍサブユニットの変化（ア
イソフォーム）を簡便かつ短時間に測定することができ
るので、心筋梗塞の早期診断が可能となる。
第１図は、心筋梗塞の発作後の時間経過とCKA−５によ
る阻害率との関係を示している。 第２図は、参考例として心筋梗塞の発作後の時間経過と
総CK活性（Ａ）およびCK−MB活性（Ｂ）値との関係を示
している。
る阻害率との関係を示している。 第２図は、参考例として心筋梗塞の発作後の時間経過と
総CK活性（Ａ）およびCK−MB活性（Ｂ）値との関係を示
している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 永来 美保子 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 坪田 博幸 千葉県八千代市大和田新田1144番地 株式 会社ヤトロン八千代工場内
Claims (2)
- 【請求項１】抗体を含有するクレアチンキナーゼ測定用
試薬において、抗体がクレアチンキナーゼ−Ｍサブユニ
ットを阻害し、かつクレアチンキナーゼ−Ｍ′サブユニ
ットを阻害しない抗体であることを特徴とするクレアチ
ンキナーゼ活性測定用試薬。 - 【請求項２】抗体を含有するクレアチンキナーゼ活性測
定用試薬でクレアチンキナーゼ活性を測定するに際に、
請求項１記載のクレアチンキナーゼ活性測定用試薬を用
いて、生体液中のクレアチンキナーゼに対する阻害率を
測定することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性の測
定方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63086163A JPH0690202B2 (ja) | 1988-04-06 | 1988-04-06 | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬およびそれを用いる測定方法 |
| KR1019890004557A KR0125934B1 (ko) | 1988-04-06 | 1989-04-06 | 크레아틴 키나제 활성 측정용시약 및 그의 측정방법 |
| EP89303413A EP0339814B1 (en) | 1988-04-06 | 1989-04-06 | Reagent for measuring creatine kinase activity and measuring method thereof |
| DE89303413T DE68909995T2 (de) | 1988-04-06 | 1989-04-06 | Reagenz zur Bestimmung von Kreatinkinase und Messverfahren dafür. |
| US08/138,076 US5804394A (en) | 1988-04-06 | 1993-10-20 | Reagent for measuring creatine kinase activity and measuring method thereof |
| US08/916,262 US5968756A (en) | 1988-04-06 | 1997-08-22 | Reagent for measuring creatine kinase activity and measuring method thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63086163A JPH0690202B2 (ja) | 1988-04-06 | 1988-04-06 | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬およびそれを用いる測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01257266A JPH01257266A (ja) | 1989-10-13 |
| JPH0690202B2 true JPH0690202B2 (ja) | 1994-11-14 |
Family
ID=13879078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63086163A Expired - Fee Related JPH0690202B2 (ja) | 1988-04-06 | 1988-04-06 | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬およびそれを用いる測定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0339814B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0690202B2 (ja) |
| KR (1) | KR0125934B1 (ja) |
| DE (1) | DE68909995T2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5382515A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Creative kinase-MB immunoassay for myocardial infarction and reagents |
| US4900662A (en) * | 1987-07-21 | 1990-02-13 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | CK-MM myocardial infarction immunoassay |
| US5382522A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Immunoassay for creatine kinase-MB and creatine kinase-BB isoforms and reagents |
| JPH0765988B2 (ja) * | 1990-01-09 | 1995-07-19 | 和光純薬工業株式会社 | 微量成分の分別測定方法 |
| EP0467782A1 (en) * | 1990-07-18 | 1992-01-22 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Myocardial infarction immunoassay |
| AU5890394A (en) * | 1993-02-03 | 1994-08-29 | Steven Andrew Jennings | Blends of glycine derivatives and sugars |
| ES2173168T3 (es) * | 1993-12-20 | 2002-10-16 | Iatron Lab | Reactivo para ensayar la creatinaquinasa. |
| ES2180632T3 (es) * | 1994-05-06 | 2003-02-16 | Beckman Coulter Inc | Activador de tiol estable en un liquido. |
| JPH09304393A (ja) * | 1996-05-15 | 1997-11-28 | Ind Technol Res Inst | 急性心筋梗塞診断キット |
| AU6309598A (en) * | 1997-03-12 | 1998-09-29 | Yamasa Corporation | Method for detecting vasculopathy |
| US7049333B2 (en) | 2002-06-04 | 2006-05-23 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Substituted thiophenes: compositions, processes of making, and uses in disease treatment and diagnosis |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS6188899A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Unitika Ltd | クレアチンキナ−ゼ定量用試薬 |
| US4810639A (en) * | 1985-12-20 | 1989-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassay for CK-MB using bound and soluble antibodies |
-
1988
- 1988-04-06 JP JP63086163A patent/JPH0690202B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-04-06 KR KR1019890004557A patent/KR0125934B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-06 EP EP89303413A patent/EP0339814B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-06 DE DE89303413T patent/DE68909995T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0339814A1 (en) | 1989-11-02 |
| DE68909995D1 (de) | 1993-11-25 |
| DE68909995T2 (de) | 1994-02-10 |
| JPH01257266A (ja) | 1989-10-13 |
| KR890016385A (ko) | 1989-11-29 |
| KR0125934B1 (ko) | 1997-12-24 |
| EP0339814B1 (en) | 1993-10-20 |
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