JPH0690632A - 矮性ペチュニアの作成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 実質的にrolC遺伝子産物またはサイトカイニ
ン- グルコシド グルコシダーゼをコードするDNA配列
をペチュニア細胞の染色体中に組み込み、得られた形質
転換細胞から植物体を再分化させることを特徴とする矮
性ペチュニア植物体の作成法、及び作成された矮性ペチ
ュニア植物体。 【効果】 遺伝子操作技術を用いて矮性ペチュニア植物
体を作出する方法が提供された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］

【０００２】

【産業上の利用分野】本発明は、形質転換ペチュニア(P
etunia hybrida)植物細胞ならびにこの植物細胞を再分
化させてなるペチュニア植物体に関する。さらに具体的
には本発明は、植物細胞染色体を改変してrolC遺伝子産
物を発現し得るようにした形質転換ペチュニア細胞およ
びその再分化産物であるペチュニア矮性品種植物体に関
する。

【０００３】

【従来の技術】植物に矮性形質を与えることは植物育種
上重要である。たとえばイネの育種にみられるように矮
性形質を導入することにより耐倒伏性が増し結果として
安定した収穫量の増加をもたらすことに成功したり、リ
ンゴにみられるように収穫を容易にできるようになった
りしてきた。とりわけ花卉類においては、剪定が簡略化
できるなどの栽培性の改良や、草丈が高く切り花のみに
用いられていた花卉を鉢花としても利用できるようにな
ることなど、矮性品種には多くの利点がある。

【０００４】したがって、ペチュニアの育種において
も、多くの品種で容易に矮性ペチュニアを作出できる技
術を開発し矮性ペチュニア品種を作出する事は、育種上
重要である。すでに矮性形質を持ったペチュニア品種は
存在するが、これを親に用いて従来の交配技術や細胞融
合技術で矮性形質のみを他の品種に導入し安定させるの
には、品種の組み合わせに依存した交配や融合に関わる
相性の良さ、矮性形質以外の望ましくない形質が導入さ
れることなど多くの問題があった。さらにその矮性形質
は劣性であり、矮性形質以外の望まざる形質を除くため
には何代にも渡る戻し交配を行わなければならず、容易
なことでは矮性形質のみを付与することができない。こ
のように、従来の交配や細胞融合技術を用いて種々のペ
チュニア品種に矮性形質を導入し矮性ペチュニアを作製
することは、非常に困難であった。

【０００５】一方、矮化剤（たとえばアンシミドール）
によるペチュニアの矮化も可能であることが知られてい
るが、矮化剤の投与のタイミング、矮化剤を周期的に投
与しなくてはいけないこと、品種に依存して投与量が変
動することなど、やはり多くの問題があった。近年の植
物遺伝子工学の発達により、遺伝子組換えの手法を用い
て植物に種々の有用形質を与えることが可能になりつつ
ある。遺伝子組換え手法は、交配によらず種々の品種に
所望の形質のみを与えることができるという利点を有し
ている。

【０００６】Agrobacterium rhizogenesは植物に毛根病
を引き起こすことが知られている土壌細菌であるが、こ
の細菌の感染により生じた毛状根より植物体を再生する
ことができる。再生した植物はrolシンドロームと呼ば
れる矮化も含めた一連の形態変化を示す。毛状根は、Ag
robacterium rhizogenes中に存在するRiプラスミドのT-
DNAと呼ばれる領域が植物細胞の染色体中に転移して発
現し、その結果細胞が形質転換されて生じる。このT-DN
A領域中にrolシンドロームを発現するrol遺伝子と呼ば
れる遺伝子群が存在する。そして、rol遺伝子の一つで
あるrolC遺伝子のみをタバコ・ジャガイモあるいはベラ
ドンナ植物中で発現させた場合、矮化も含めた一連の形
態変化を引き起こすことが報告されている（１、２、３
１）。しかしrolC遺伝子をペチュニアへ導入した例はな
く、この遺伝子産物がペチュニア植物にどの様な変化を
引き起こすかは知られていなかった。最近、rolC遺伝子
産物が配糖化されたサイトカイニン類よりグルコースを
切り離すグルコシダーゼ活性を有していることが示さ
れ、細胞中に含まれる不活性型のサイトカイニンを活性
型サイトカイニンに変換する機能を持つことが示唆され
た（３）。しかしペチュニア細胞中のサイトカイニン量
や配糖化サイトカイニン量に関しては知られておらず、
その量比を変化させた場合にペチュニア植物に対してど
の様な形態的変化を誘導できるか全く想像できない。す
なわち、rolC遺伝子産物がペチュニア植物の形態形成に
影響を与えることができるかどうかは知られておらず、
ましてやrolC遺伝子を用いてペチュニアの形態変化を誘
導しようとするときに、どの様なプロモーターを用いて
植物のどの部位でどの程度発現させれば望む形態変化を
誘導できるか、そのコントロールに関しては予測もでき
なかった。さらに、rolC遺伝子産物の発現はタバコにお
いては形質転換体を雄性不稔にすることが知られてお
り、後代へのrolC遺伝子の伝達を行うことが困難と考え
られた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記したよ
うな交配育種や細胞融合技術によらず、多くのペチュニ
ア品種に矮性形質を容易に導入する汎用技術を開発する
ことを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】

［発明の概要］本発明では、実質的にrolC遺伝子産物ま
たはサイトカイニン- グルコシド グルコシダーゼをコ
ードするDNA配列を、rolC遺伝子が本来持つプロモータ
ーとともに、あるいは他の種々のプロモーターと組み合
わせたキメラ遺伝子として、植物染色体中に導入し、そ
の遺伝情報の発現をコントロールすることによりペチュ
ニアに矮性形質を与える方法、およびそのような方法で
得られた矮性ペチュニア植物体が提供される。

【０００９】すなわち、本発明による矮性ペチュニア
は、実質的にrolC遺伝子産物またはサイトカイニン- グ
ルコシド グルコシダーゼをコードするDNA配列が、こ
のDNA配列がRNAに転写されかつ転写されたRNAが翻訳さ
れ得る状態で染色体中に組み込まれていることを特徴と
するものである。本発明ではペチュニア植物中でrolC遺
伝子産物またはサイトカイニン- グルコシド グルコシ
ダーゼを発現させその発現量を調節することにより、矮
化剤を用いずに矮性植物の作出が可能である。また従来
育種によらずに矮性ペチュニア品種を育成できるので、
前記したような戻し交配などの従来育種に依存した問題
点、品種間差等の問題点を解決することができる。さら
に、rolC遺伝子産物を発現させ矮化させたタバコにおい
ては花粉稔性が全く失われ、いわゆる雄性不稔植物とな
る場合があることが知られているが、本発明による矮性
ペチュニアは雄性不稔にはならず、自殖あるいは他殖に
より次世代の植物を得ることができた。しかも、それら
後代の植物の中には矮性形質を示すものも得られた。つ
まり、本発明によって与えられる矮性形質は、rolC遺伝
子産物またはサイトカイニン- グルコシド グルコシダ
ーゼをコードするDNA配列を組み込んだ形質転換当代の
ペチュニア植物ばかりでなく、次世代にも遺伝伝達され
る。さらに、本発明により与えられる矮性形質は優性で
あるので、交配により他品種に比較的容易に矮性形質を
導入することができ、本発明の形質転換ペチュニア植物
を交配技術による矮性ペチュニア品種育成の母本として
用いることも可能である。

【００１０】［発明の詳細な説明］ 1)rolC遺伝子産物をコードするDNA配列rol C遺伝子は、植物の毛根病病原菌Agrobacterium rhiz
ogenesが保持しているRiプラスミドと呼ばれる巨大プラ
スミドの、T-DNAと呼ばれる領域上に存在する遺伝子で
ある。Agrobacterium rhizogenesが植物に感染すると、
T-DNA領域は植物細胞の染色体中に転移される。T-DNA上
にはrolC遺伝子を含む一群のrol遺伝子群があり、これ
らの遺伝子が植物細胞中で発現することにより、毛根病
を引き起こす。毛根病で生じた毛状根から植物体を再生
できる場合があるが、再生した植物体はrolシンドロー
ムと呼ばれる矮化を含めた一連の形態変化を示す。rol
シンドロームを示す植物ではrolC遺伝子を含め複数のro
l遺伝子が発現しているが、タバコ・ジャガイモ・ベラ
ドンナにおいては、rolC遺伝子のみを発現させても矮化
などの形態変化が起きることが知られている（１、２、
３１）。

【００１１】Agrobacterium rhizogenes A4株(ATCC 430
57)由来のRiプラスミドについて、そのT-DNA領域の全塩
基配列が決定されており（４）、そこに見いだされた複
数のオープンリーディングフレームの中で、オープンリ
ーディングフレーム１２がrolC遺伝子に対応することが
知られている（３２）。このA4株rolC遺伝子にコードさ
れた180個のアミノ酸からなる遺伝子産物のアミノ酸配
列を配列番号：１に示す。Agrobacterium rhizogenesに
は種々の株があり、それぞれ異なるRiプラスミド、従っ
て異なるrolC遺伝子、を持っている。たとえば日本産Ag
robacteriumrhizogenes C8株(MAFF 02-10268)は感染し
た植物に毛根病およびrolシンドロームを引き起こす病
原菌であるが、この株より発明者らが単離したrolC遺伝
子は177個のアミノ酸からなる遺伝子産物をコードし、
前記A4株由来のrolC遺伝子との相同性は、アミノ酸で44
％、DNAで75％であった。

【００１２】本発明においては、これらの自然界に存在
する種々のrolC遺伝子産物のいずれを用いてもよい。さ
らに、これらにいろいろなアミノ酸置換、欠損、付加、
挿入が加わった変異rolC遺伝子産物であっても、矮性形
質を発現する生物活性を保持している限り、本発明に用
いることができる。本発明において「実質的にrolC遺伝
子産物をコードするDNA配列」という場合の「実質的
に」という用語は、自然界に存在するrolC遺伝子産物を
コードするDNA配列だけでなく、このような変異rolC遺
伝子産物をコードするDNA配列をも包含することを示
す。なおrolC遺伝子産物にはサイトカイニン−グルコシ
ド グルコシダーゼ活性があることが知られている
（３）。そして、矮性形質を発現する生物活性を有する
rolC遺伝子産物は、実質的にはサイトカイニン−グルコ
シド グルコシダーゼであると考えられる。

【００１３】本発明に用いることのできるrolC遺伝子産
物の例として配列番号：１に示したA4株由来のrolC遺伝
子産物を挙げることができるが、このポリペプチドに限
定されるものではないことは上記した通りである。 ま
た、一般にあるDNA配列があるアミノ酸配列を持つポリ
ペプチドをコードする場合、ひとつのアミノ酸に対応す
る遺伝コード（コドン）が複数存在するために、ひとつ
のアミノ酸配列に対応するDNA配列が複数個存在する
（縮重異性体）。本発明に用いるrolC遺伝子産物をコー
ドするDNA配列においても、それがコードするポリペプ
チドのアミノ酸配列を変化させない範囲において、任意
の遺伝コードを用いることができることはいうまでもな
い。

【００１４】このようなrolC遺伝子産物をコードするDN
A配列を取得するためには、たとえば自然界に存在するr
olC遺伝子を単離し、その構造遺伝子部分を用いること
ができる。rolC遺伝子は、たとえば前記したAgrobacter
ium rhizogenes A4株より単離しうるが、A4株以外のRi
プラスミドを持ったAgrobacterium rhizogenes、たとえ
ば日本産Agrobacterium rhizogenesから単離することも
できる。以下にA4株からrolC遺伝子をクローニングする
方法の概略を説明するが、他のAgrobacteriumurhizogen
esからのクローニングもこれに準じて行えることは、当
業者には明らかであろう。

【００１５】前記した通り、Agrobacterium rhizogenes
A4株のrolC遺伝子の塩基配列が公知であるので、rolC
遺伝子を取得するには以下に示すような種々の方法が考
えられる。 まずRiプラスミドを常法（５）にしたがって単離
し、制限酵素HindIIIおよびEcoRIを用いて消化して、プ
ロモーターを含むrolC遺伝子を持つ1858bpのDNA断片を
分離する。次いでこのDNA断片を、大腸菌のクローニン
グベクターであるpUC18、19（６）あるいはpBR328
（７）プラスミド等を制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消
化したベクターDNA断片とDNAリガーゼを用いて接続し、
大腸菌に形質転換してクローニングする。 rolC遺伝子の両端の塩基配列を持つオリゴDNAプラ
イマーを合成し、RiプラスミドまたはAgrobacterium rh
izogenes A4株由来の全DNAを鋳型としてPCR法によりrol
C遺伝子を増幅させ、そのDNA断片をクローニングベクタ
ー中にクローニングする（８）。 既知の塩基配列にしたがって全合成し、クローニン
グベクター中にクローニングする（９）。 またこのA4株由来のrolC遺伝子の塩基配列をプローブと
して、他株のrolC遺伝子をクローニングすることもでき
る。

【００１６】このような方法で得られたAgrobacterium
rhizogenes A4株由来のrolC遺伝子を含む1858bpのDNA断
片の塩基配列を配列番号：２に示す。このDNA配列中でr
olC遺伝子産物をコードする部分は、塩基番号876から塩
基番号1418までの543bpのDNA配列であり、このDNA配列
にコードされたポリペプチドは配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列を持つ。この543bpのDNA配列は本発明で用いる
ことのできるrolC遺伝子産物をコードするDNA配列の一
例であるが、本発明に用いることのできるDNA配列はこ
のものに限定されるわけではないことは、前記した通り
である。 2)rolC遺伝子産物の発現rol C遺伝子産物をコードするDNA配列が形質転換したペ
チュニア植物体中で発現するためには、少なくともこの
DNA配列がRNAに転写されることが必要である。植物細胞
の染色体中に外来遺伝子を組み込む場合、ある確率によ
って染色体上の被転写領域に組み込まれることが知られ
ている（３３）ので、rolC構造遺伝子をコードするDNA
配列を単独で組み込んで発現させることも可能である。
しかし、好ましくはあらかじめ適当なプロモーターおよ
びターミネーター配列を連結してから組み込むのがよ
い。

【００１７】この目的には自然界のrolC遺伝子が本来持
っているプロモーター・ターミネーターを用いてもよ
い。その場合には自然界から得られたrolC遺伝子からプ
ロモーター／構造遺伝子／ターミネーターを単離し、そ
のままあるいは必要に応じて一部改変して用いることが
できる。そのようなプロモーター・ターミネーターを含
むrolC遺伝子DNA配列としては、たとえば配列番号：２
に示した1858bpのDNA断片を挙げることができる。

【００１８】rolC遺伝子をコードするDNA配列を発現さ
せるためには、種々の外来プロモーター配列の下流にこ
のDNA配列を連結し、さらにその下流にターミネーター
配列を連結したキメラ遺伝子を構築してもよい。この場
合、プロモーターとしては、これまでに植物細胞中で機
能することが知られているあらゆるプロモーター、具体
的にはリブロース−1,5−2リン酸カルボキシラーゼ小サ
ブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（１
７）、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（１
８）、カリフラワーモザイクウイルス19S-RNAを生じる
プロモーター（１９）、等を用いることができるが、と
りわけカリフラワーモザイクウイルスの35S-RNAを生じ
るプロモーター（２０）を用いることが望ましい。ター
ミネーターとしても、これまでに植物細胞中で機能する
ことが知られているあらゆるターミネーターを使用する
ことができる。具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の
ターミネーター（２１）、オクトピン合成酵素遺伝子の
ターミネーター（２２）、等を利用することができる。 3)ペチュニアの形質転換 植物形質転換用ベクターとしてはAgrobacterium tumefa
ciensを介して形質転換するのに用いられるプラスミド
（以下Agrobacterium Vectorと略す）、具体的にはpLGV
neo1103（１０）、pBIN（１１）、pGA482（１２）、pMO
N505（１３）等を利用することができる。また、これら
Agrobacterium Vectorを用いなくとも、植物片へ直接DN
Aを打ち込んだり（１４）、植物プロトプラストを調製
しそれに直接DNAを導入し形質転換することもできる
（１５、１６）。

【００１９】遺伝子をペチュニア細胞中へ導入するに
は、Agrobacteriumを用いた形質転換法（たとえばリー
フディスク法（２３））、プロトプラストへの遺伝子導
入法（たとえばPEG法やエレクトロポレーション法（２
４、２５））、パーティクルガンを用いた方法（２６）
等を用いることができる。導入された遺伝子は植物細胞
中で発現し、また一部の遺伝子コピーは発現する能力を
保ったまま、染色体中へ組み込まれることが知られてい
る。

【００２０】ペチュニアのプロトプラストやリーフディ
スク等からは植物体の再分化が可能であり、形質転換し
たペチュニア組織あるいはペチュニア細胞よりペチュニ
ア植物を再生させることができることが知られている
（２３、２４）。 4)矮性ペチュニア植物体 本発明によれば、矮化剤を用いずに矮性ペチュニアを作
出することが可能であり、また従来の交配育種によらず
に種々のペチュニア品種に矮性形質を与えることができ
る。

【００２１】矮性とは、草丈がその植物の本来の草丈よ
りも低くなった形質をいう。その原因は節間長の短縮に
よる場合が多いが、希に節数の減少により矮化する場合
も見られる。たとえばある品種Ａに対してそれを改良し
た品種Ｂの草丈が有意に低ければ品種Ｂは矮性品種であ
るといえる。この際、草丈を比較する時期によって矮化
の程度が異なることがあり、生育の初期には矮性を示し
ていても、後期になるとほとんど通常の草丈になる場合
がある。本発明で矮性ペチュニアというときは、このよ
うな生育初期のみに矮性を示すものも含むが、生育全期
に渡って安定な矮性を示すものがより好ましい。

【００２２】本発明によれば、ペチュニア植物体中での
rolC遺伝子産物またはサイトカイニン‐グルコシド グ
ルコシダーゼの発現量・発現様式を調節することによ
り、得られる形質転換ペチュニア植物体の矮化の程度を
変えることができる。たとえばrolC遺伝子が本来持って
いるプロモーター（以下ネイティブプロモーターとい
う）を用いてrolC遺伝子産物を発現させた形質転換ペチ
ュニア植物体は、非形質転換体に比べて開花が２〜３週
間早まるとともに第一花着花時には有意な矮性形質を示
したが、生育後期になるとほとんど非形質転換体と草丈
の差がなくなった。これに対して、カリフラワーモザイ
クウィルスの35S-RNAを生じるプロモーター（以下35Sプ
ロモーターという）を用いてrolC遺伝子産物を発現させ
た形質転換ペチュニア植物体では、開花時期が早くなる
ことは観察されなかったが、生育後期に至るまで常に非
形質転換体に比べて顕著な矮化が見られた。さらに、35
SプロモーターとrolC構造遺伝子を含むキメラ遺伝子を
組み込んで得られた複数の形質転換ペチュニア植物体を
比較すると、矮化の程度とrolC遺伝子の発現量との間に
は有意な正の相関が見られた。

【００２３】ネイティブプロモーターは植物体では篩部
組織で特異的に発現すると報告されている（３４）のに
対し、35Sプロモーターには発現に組織特異性がなく、
植物の全身で強く発現することが知られている（２
０）。したがって上記の知見は、ペチュニアにおいて
は、より顕著な矮性植物を作出するためには組織非特異
的な高発現型プロモーター、特に好ましくは35Sプロモ
ーター、を用いるのが好ましいことを示している。タバ
コ・ジャガイモにおいてはネイティブ、35Sいずれのプ
ロモーターを用いても共に矮化すると報告されており、
このことはrolC遺伝子の発現によって矮性植物を作出し
ようとする場合、対象とする植物種ごとに、適した方法
が異なることを示している。発明者らは本発明により得
られた矮性ペチュニアを組織学的に調べ、矮化したペチ
ュニアにおいては、茎組織の細胞数が減るとともに個々
の細胞の大きさも減少していることを見いだしたが、こ
れらの知見はタバコやジャガイモについては従来知られ
ていなかったものである。さらに、35Sプロモーターを
用いてrolC遺伝子産物を発現させ矮化させたタバコにお
いては、花粉稔性が全く失われて雄性不稔となることが
知られているが、本発明による矮性ペチュニアは、ネイ
ティブ、35Sいずれのプロモーターを用いた場合にも、
稔性が減少するものの雄性不稔にはならず、自殖あるい
は他殖により次世代の植物を得ることができた。しか
も、それら後代の植物の中には矮性形質を示すものも得
られた。つまり、本発明によって与えられる矮性形質
は、rolC遺伝子産物をコードするDNA配列を組み込んだ
形質転換当代のペチュニア植物ばかりでなく、次世代に
も遺伝伝達される。さらに、本発明により与えられる矮
性形質は優性であるので、交配により他品種に比較的容
易に矮性形質を導入することができ、本発明の形質転換
ペチュニア植物を交配技術による矮性ペチュニア品種育
成の母本として用いることも可能である。発明者らは本
発明によって得られた矮性ペチュニアの花粉を調べ、前
記した稔性の減少は、花粉の発芽率の減少および花粉管
伸長の低下によるものであることを見いだした。また矮
性ペチュニアの後代の種子は休眠が浅く、通常の種子よ
りも発芽が約１日早いことを見いだした。これらの知見
もまた、タバコやジャガイモについては従来知られてい
なかったものである。

【００２４】以下、実施例としてペチュニア品種“ミッ
チェル”に、ネイティブプロモーターあるいは35Sプロ
モーターを用いてrolC遺伝子産物を発現させた例を示す
が、本発明はミッチェル以外のペチュニア品種にも同様
に適用できることは言うまでもない。

【００２５】

【実施例】

実施例 １ 植物導入用のrolC遺伝子の構築方法rol C遺伝子産物をネイティブプロモーターを用いて形質
転換ペチュニア植物体中で発現させるために、Agrobact
erium rhizogenes A4株のRiプラスミドから得られる185
8bpのHindIII/EcoRI DNA断片（配列番号：２）に含まれ
るrolC遺伝子を植物に導入するベクターpBI-rolCを構築
した。

【００２６】上記HindIII/EcoRI DNA断片（配列番号：
２）はAgrobacterium rhizogenes A4(ATCC 43057)より
取得できることは先に述べたが、実際に我々が用いたDN
A断片はフランス国立農業研究所(Institut National de
la Recherche Agronomique)のTepfer教授より分与して
頂いた。1858bp HindIII/EcoRI DNA断片は大腸菌クロー
ニングベクターpBR328のHindIII/EcoRIサイト間にクロ
ーニングされた状態（プラスミド名：pBR328-rolC）で
供試された。実験で用いた制限酵素・大腸菌由来のアル
カリフォスファターゼは東洋紡績社製を用い、その使用
法は使用説明書にある条件に従った。DNAの制限酵素に
よる消化では、断りの無い限りDNA ５μg、制限酵素25
単位を反応に用い、全反応溶液の中に占める最終の制限
酵素の容量が全体の1/10容以下になるように反応液量を
調節した。DNAの接続には宝酒造社製のライゲーション
キットを用い、その使用法は使用説明書にある設定条件
に従った。大腸菌HB101への形質転換は宝酒造社製のE.
coli HB101 Competent Cellsを用い、その使用法はその
使用説明書に従った。また、試薬は断りの無い限り和光
純薬社製のものを用いた。植物細胞への遺伝子導入には
クローンテック社製のGUS GENE FUSION SYSTEM キット
を用い、その使用法はキット中に含まれる使用説明書に
従った。その他の実験操作は、特に断らない限り、モレ
キュラー・クローニング（５）等に記載された一般的実
験操作法にしたがって行った。

【００２７】キット中に含まれるバイナリーベクタープ
ラスミドpBI121（１１）を改変し、植物細胞へのrolC遺
伝子の導入に用いた。その作製法について以下に述べ
る。pBI121をHindIIIで２時間消化後、反応溶液中に１M
NaClを最終濃度で150 mMになるように加えた後EcoRIを
加えてさらに２時間消化し、二重消化を行った（以下、
制限酵素HindIIIとEcoRIによる二重消化およびBclIとEc
oRIによる二重消化も同様に行った）。消化後フェノー
ル処理により酵素を除き、エタノール沈澱によりDNAを
回収した。回収したDNAを200 μlの50 mM トリス・塩酸
(pH 8.0)溶液中に懸濁し、大腸菌由来アルカリフォスフ
ァターゼ２単位を加え37℃で2時間処理を施し脱リン酸
化を行った（以下アルカリフォスファターゼ処理と略
す）。脱リン酸化されたDNAをフェノール処理後TE緩衝
液に懸濁した。

【００２８】一方pBR328-rolCを制限酵素HindIIIとEcoR
Iで消化し、低融点アガロースを用いたアガロースゲル
電気泳動によりrolC遺伝子を含む1858bpのHindIII／Eco
RIDNA断片をpBR328 DNA断片と分離した（以下DNA断片の
単離は同様の低融点アガロースを用いたアガロースゲル
電気泳動法で行った）。1858bpのDNA断片を切り出し、
等容のTE緩衝液を加え65℃で10分間加温した。これに等
容の飽和フェノール溶液を加えフェノール処理、エタノ
ール沈澱を行いDNAを回収した。

【００２９】このDNAと前述の脱リン酸化されたpBI121
断片を混合し、ライゲーションキットによりDNA断片同
士を結合（ライゲーション）させた。これらDNAを大腸
菌(HB101)へ形質転換し、カナマイシン(50μg/ml)を含
むLB培地（５）で耐性クローンを得た。この様にしてバ
イナリーベクター中にrolC遺伝子をクローニングした植
物導入用rolC遺伝子(pBI-rolC)を作製した（図１）。

【００３０】pBI-rolCを持つ大腸菌からアルカリ溶菌法
によりプラスミドDNAを抽出し、塩化セシウム密度勾配
超遠心で精製してpBI-rolC DNAを調製した（５）。調製
したDNAをエレクトロポレーション法によりAgrobacteri
um tumefaciense LBA4404へ導入した。アグロバクテリ
アを５mlのYEB培地（２７）で28℃、18〜22時間振とう
培養(90rpm)した。5000rpm、10分間の遠心分離により集
菌し、0.2mlの10％グリセロール溶液に縣濁した。この
菌縣濁液(100 μl)にpBI-rolC(500 ng)を加え、エレク
トロポレーション・キュベット(Bio-Rad社製 0.2 cmギ
ャップ)中で25μFのコンデンサーを用いて2.5 kVでエレ
クトロポレーションを行った。エレクトロポレーション
処理を施した菌を１mlのYEB培地に縣濁し28℃で１時間
加温し、カナマイシン(50 μg/ml)を含むYEB培地上にま
いた。28℃で48〜60時間培養後得られたコロニーを植物
形質転換用のLBA4404(pBI-rolC)として以下に用いた。 実施例２ 植物導入用35S-rolC遺伝子の構築rol C遺伝子産物を35Sプロモーターを用いて形質転換ペ
チュニア植物体中で発現させるために、35Sプロモータ
ー配列、rolC構造遺伝子、およびrolC遺伝子に由来する
ターミネーター配列とから成る植物導入用キメラ遺伝子
（以下35S-rolC遺伝子という）を構築した。

【００３１】35Sプロモーター配列としてはpBI121中に
あるものを用い、これをrolC構造遺伝子と接続した。す
なわち、rolC遺伝子産物のコーディング領域の3bp上流
（配列番号：２の塩基番号872の後ろ）を切断する制限
酵素HpaIでpBR328-rolCを消化し、フェノール処理、ア
ルカリフォスファターゼ処理を行った。再びフェノール
処理後DNAをエタノール沈澱により回収し、10 μlのTE
緩衝液に縣濁した。このDNA溶液に500 ngのBclIリンカ
ー（東洋紡）を加え、ライゲーションを行った後、常法
により大腸菌GM48に導入して形質転換して（５）、BclI
リンカーのはいった改変rolC遺伝子(pBR328-rolC/BclI
linker)を取得した。このプラスミドDNAを制限酵素BclI
とEcoRIで二重消化し、低融点アガロースゲル電気泳動
法を用いてrolCの構造遺伝子とターミネーターを含む99
4bpのDNA断片（プロモーターは含まない）を単離した。
一方pBI121を制限酵素BamHIとEcoRIで消化しフェノール
処理後、さらにアルカリフォスファターゼ処理を施し
た。フェノール処理とエタノール沈澱により回収された
DNAと先のDNA断片を混合し、ライゲーションした（図
２）。このDNAを大腸菌HB101へ形質転換し、カナマイシ
ン(50 μg/ml)を含むLB培地上にまき耐性クローンを得
た。この様にして植物導入用35S-rolC遺伝子(pBI35S-ro
lC)を作製した。pBI35S-rolCを実施例１で示した方法と
同様にしてAgrobacterium tumefaciense LBA4404に導入
し、植物形質転換用のLBA4404(pBI35S-rolC)を得た。 実施例３ ペチュニア細胞へのrolCおよび35S-rolC遺
伝子の導入 ペチュニア細胞へのrolCおよび35S-rolC遺伝子の導入は
リーフディスク法に従い行った。すなわち、温室で育成
したペチュニア品種“ミッチェル”の葉を50倍程度に希
釈した中性洗剤で軽く洗浄した後に、2.5％次亜塩素酸
ナトリウム溶液中に室温、15〜20分間浸漬し、最後に無
菌水で洗浄し滅菌した。この葉よりコルクボーラーを用
いて直径9 mmのリーフディスクを打ち抜き、16〜22時間
YEB培地で培養した形質転換用アグロバクテリア（実施
例１、２で得たLBA4404(pBI-rolC)またはLBA4404(pBI35
S-rolC)）の懸濁液中に30秒間浸漬した。余分な細菌懸
濁液を濾紙で除去した後、クラフォラン(500 μg/ml)
（Hoechst社製）を含むムラシゲ−スクッグの培地（以
下MS培地と略す）（２８）上で26℃、２日間培養後、さ
らにMS培地に１ ppmのベンジルアデニンと、0.1 ppmの
ナフタレン酢酸を含む茎葉分化培地にクラフォラン（同
上濃度）と硫酸カナマイシン(100 μg/ml)を加えた選択
培地上で２週間培養した。その後2週間ごとに同培地を
交換し、カナマイシン耐性の不定芽を得た。これら不定
芽をカナマイシン（同上濃度）を含むMS培地に移し、発
根させ形質転換体候補を選抜した。さらにカナマイシン
耐性を獲得した植物体を温室内で馴化・育成し下記の実
験に供した。 実施例４ 形質転換体の確認 カナマイシン耐性を獲得した植物体の葉より常法（１
５）を改変してDNAを抽出し、サザンブロット解析によ
り（２９）、導入遺伝子の確認を行った。

【００３２】乳鉢で十分に展開した葉約５gを10 mlの15
％ ショ糖、0.1％ β−メルカプトエタノール、50 mM E
DTA、250 mM NaCl、50 mM トリス・塩酸(pH 8.0)よりな
る緩衝液中で磨砕し、その磨砕液を3000×g ５分間遠心
し、沈澱を1.25 mlの15％ショ糖、50 mM EDTA、50 mM
トリス・塩酸(pH 8.0)よりなる緩衝液に懸濁した。懸濁
液に最終濃度0.1％ になるようにSDSを加え、65℃で10
分間加温した。室温に冷ました後、125 μlの５M 酢酸
カリウム溶液(pH 4.3)と混和し、氷上で１時間静置し
た。15000×g 15分間の遠心分離により上清を回収し、
2.5容のエタノールを加え生じたDNAをガラスキャピラリ
ー（アクアーキャップディスポーザブル・マイクロディ
スペンサー、Drummond社製）に巻き付け回収した。この
DNAを塩化セシウム密度勾配超遠心により精製した。

【００３３】精製されたDNAを制限酵素HindIIIとEcoRI
で消化し、各10 μgづつを1％アガロースゲル電気泳動
により分離した。ゲルを0.4 N NaOHに室温30分間浸漬し
DNAを変性させた後、サザン法により同NaOHを用いてナ
イロンフィルター（Gene Screen； DuPont社製）上へ吸
着させた。³²Pで標識したrolC遺伝子を含む1858bpのHin
dIII／EcoRI切断DNA断片をプローブとして、DuPont社の
標準プロトコルにしたがってハイブリダイゼーションを
行った。その結果を図３に示す。

【００３４】いずれの形質転換ペチュニア植物体も、ro
lC遺伝子あるいは35S-rolC遺伝子を5〜30コピー程度持
っていた。 実施例５ 導入されたrolCおよび35S-rolC遺伝子の発
現解析 形質転換体の葉を材料として、常法に従い全RNAを抽出
し（５）それよりさらにpolyA-RNAを調製した。得られ
たpolyA-RNAを用いてノーザンブロット解析（３０）を
行い、導入されたrolCおよび35S-rolC遺伝子の発現解析
を行った。

【００３５】乳鉢を用いて植物体の葉５gを液体窒素下
で粉砕し、グアニジンチオシアン酸法（５）にしたがっ
て全RNAを抽出した。得られたRNAを0.1％ SDSを含むTE
緩衝液400 μlに縣濁し、オリゴテックス-dT30（第一化
学製）を用いてpolyA-RNAを濃縮した（オリゴテックス-
dT30の使用法に関しては使用説明書に従った）。エタノ
ール沈澱によりpolyA-RNAを回収し、260 nmの吸光度を
測定し、RNA量を求めた。２μgのpolyA-RNAを常法にし
たがってグリオキサール変性させたた後1.5％アガロー
スゲル電気泳動により分離し、25 mM リン酸ナトリウム
溶液中でノーザンブロットを行いGene Screenナイロン
フィルター（前述）上に吸着させた。フィルターを90
℃、３時間加熱後、実施例４と同様にしてハイブリダイ
ゼーションを行った。得られたオートラジオグラム（図
４）上のシグナル強度をデンシトメーター(Pharmacia L
KB Biotechnology社製、LKB 2222-020 UltroScan XL La
ser Densitometer)を用いて測定し、相対強度を算出し
て相対発現強度とした。その結果rolCおよび35S-rolC遺
伝子が組み込まれた形質転換ペチュニア中でrolC遺伝子
のmRNAを検出することができ、またクローン間で発現量
に差が見られることを観察した（表１）。

【００３６】

【表１】 形質転換ペチュニアの矮化とrolC mRNAの相
対量 ───────────────────────── ペチュニア 矮性(%) mRNA相対量(%) ───────────────────────── 非形質転換体 100 ND （ND：分析せず） pBI121 形質転換体 85 ND 35S-rolC形質転換体 クローン 11-2 80 100 クローン 12-2 62 730 クローン 34-1 47 1390 クローン 43-1 57 1154rol C形質転換体 クローン 11-2 84 1005 クローン 32-1 80 ND ───────────────────────── 矮性：生育後期における、非形質転換体の草丈を100と
したときの相対値 mRNA量：35S-rolC 11-2の値を100としたときの相対値 実施例６ 形態的変化の観察 同時期に馴化した形質転換体および非形質転換体を育成
した後に植物体の形態を観察し、その草丈、葉の長径と
短径、花の直径・長さを測定した。

【００３７】rolCおよび35S-rolC遺伝子が組み込まれ発
現しているペチュニア植物では、側芽の伸長が非形質転
換体に比較して旺盛で、花数が増加することが観察され
た。これらの形質転換植物は矮性を示したが、矮化の程
度は異なっていた。すなわち、rolC遺伝子が組み込まれ
発現しているペチュニア（以下rolC植物と略す）は、生
育初期には非形質転換植物に比べて生育が遅く矮化して
いたが、花が咲きそろった時期に比較すると顕著な矮性
を示さなかったのに対し、35S-rolC遺伝子が組み込まれ
発現しているペチュニア（以下35S-rolC植物と略す）は
顕著な矮性を示すことを観察した（表１）。しかも35S-
rolC遺伝子の発現量の多いペチュニアにおいて矮化の程
度も大きくなり、発現量と矮化の程度は相関を示した
（表１）。

【００３８】また、rolCおよび35S-rolC植物の葉を観察
したところ、rolC植物において顕著な波打ち状態が観察
されたが、35S-rolC植物においては観察されなかった
（図５）。このことは、適当なプロモーターとrolC遺伝
子を組み合わせることにより矮性の程度ばかりでなく、
そのほかの形態（たとえば葉の波打ち）もコントロール
できることを示唆するものである。なおタバコにおいて
はrolCおよび35S-rolC遺伝子を組み込んだタバコ植物の
葉は非形質転換体に比べてやや細長くはなるが、波打つ
ことはないと報告されており（１）、rolCの発現に対す
る反応が植物によって異なることを示している。

【００３９】さらに、花の形態に関しても変化を認め
た。すなわち、花の直径はrolCおよび35S-rolC植物にお
いて小型化したが、花の長さは非形質転換体と変わらな
いことを観察した（図６）。またrolC植物においては花
弁も波打ち状になっていることが観察された。タバコに
おいては花全体の小型化が見られると報告されている
が、ペチュニアでは直径のみの小型化に留まっていた。 実施例７ 形質転換体の稔性の検定 各形質転換体を人工的に自家受粉させ、そのカプセル当
たりの種子の生重量を測定し、非形質転換体と比較して
稔性の指標とした。その結果rolCおよび35S-rolC遺伝子
が組み込まれた形質転換体の稔性は減少することを観察
した。しかし、タバコで観察されたような雄性不稔には
ならなかった（表２）。このことは、タバコの場合とは
異なり、rolC遺伝子を用いた矮性ペチュニアの育種にお
いてはこの優性矮性形質を後代へ遺伝的に伝達させるこ
とを示す。さらに、この矮性形質は交配により多品種へ
容易に導入することが可能であり、育種上の利用価値は
大きい。

【００４０】

【表２】 形質転換ペチュニアの矮化と種子生産量 ───────────────────────────── ペチュニア 矮性(%) 種子生産量(mg/カプセル) ───────────────────────────── 非形質転換体 100 43.1 pBI121 形質転換体 85 35.8 35S-rolC形質転換体 クローン 11-2 80 14.6 クローン 12-2 62 7.1 クローン 13-1 58 16.1 クローン 34-1 47 3.6 クローン 41-3 102 40.9 クローン 43-1 57 4.9rol C形質転換体 クローン 11-2 84 5.7 クローン 13-1 72 20.7 クローン 33-1 81 32.7 ───────────────────────────── 矮性：生育後期における、非形質転換体の草丈を100と
したときの相対値 種子生産量：１クローンにつき数個体ずつ自家受粉さ
せ、得られた種子カプセル中の種子重量を20個以上のカ
プセルについて測定し、平均値を求めた。

【００４１】矮化の程度と稔性の減少の程度には相関が
無かった。さらに、これら得られた種子を播種したとこ
ろ非形質転換体より得た種子と同様の発芽率で発芽する
ことを確認した。３つの独立に得られた35S-rolC植物に
ついて、自殖第１代植物をおのおの５個体ずつ任意に選
択し育成したところ、親形質転換体と同様もしくはそれ
以上の矮性を示した（表３）。なお表３において矮性を
示さない自殖第１代個体は、35S-rolC遺伝子の分離によ
るものだと考えられる。また矮性形質が優性遺伝するこ
とも確認した。

【００４２】

【表３】 形質転換ペチュニア自殖第１代の矮性 非形質転換体の草丈の平均値を100としたときの相対値 ［参考文献］ (1)T. Schmulling et al.; EMBO J. 7:2621 (1988) (2)M. Fladung; Plant Breeding 104:295 (1990) (3)J.J. Estruch et al.; EMBO J. 10:2889 (1991) (4)J.L .Slightom et al.; J. Biol. Chem. 261:108 (1
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(1989)

【００４３】

【発明の効果】本発明により、遺伝子操作技術を用いて
矮性ペチュニア植物体を作出する方法が提供された。こ
れにより矮化剤を用いずに矮性ペチュニアを作出するこ
とが可能となり、また従来の交配育種によらずに種々の
ペチュニア品種に矮性形質を与えることができるように
なった。

【００４４】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：180 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：アグロバクテリウム・リゾジェンス (Agrobact
erium rhizogenes) 株名：A4 配列 Met Ala Glu Asp Asp Leu Cys Ser Leu Phe Phe Lys Leu Lys Val Glu 1 5 10 15 Asp Val Thr Ser Ser Asp Glu Leu Ala Arg His Met Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Asn Glu Arg Lys Pro Leu Ile Glu Pro Gly Glu Asn Gln Ser Met Asp 35 40 45 Ile Asp Glu Glu Gly Gly Ser Val Gly His Gly Leu Leu Tyr Leu Tyr 50 55 60 Val Asp Cys Pro Thr Met Met Leu Cys Phe Tyr Gly Gly Ser Leu Pro 65 70 75 80 Tyr Asn Trp Met Gln Gly Ala Leu Leu Thr Asn Leu Pro Pro Tyr Gln 85 90 95 His Asp Val Thr Leu Asp Glu Val Asn Arg Gly Leu Arg Gln Ala Ser 100 105 110 Gly Phe Phe Gly Tyr Ala Asp Pro Met Arg Ser Ala Tyr Phe Ala Ala 115 120 125 Phe Ser Phe Pro Gly Arg Val Ile Lys Leu Asn Glu Gln Met Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Thr Lys Gly Lys Cys Leu Thr Phe Asp Leu Tyr Ala Ser Thr 145 150 155 160 Gln Leu Arg Phe Glu Pro Gly Glu Leu Val Arg His Gly Glu Cys Lys 165 170 175 Phe Ala Ile Gly 180

【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：1858 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (plasmid DNA) 起源： 生物名：アグロバクテリウム・リゾジェンス (Agrobact
erium rhizogenes) 株名：A4 配列の特徴： 特徴を表す記号： CDS 存在位置： 876..1418 位置を決定した方法： P 配列 AGCTTAAAGT TGGCCCGCTA TTGGATTTCG CGAAAGCGGC ATTGGCAAAC GTGAAGATTG 60 CTGCATTCAA GATACTTTTT CTATTTTCTG GTTAAGATGT AAAGTATTGC CACAATCATA 120 TTAATTACTA ACATTGTATA TGTAATATAG TGCGGAAATT ATCTATGCCA AAATGATGTA 180 TTAATAATAG CAATAATAAT ATGTGTTAAT CTTTTTCAAT CGGGAATACG TTTAAGCGAT 240 TATCGTGTTG AATAAATTAT TCCAAAAGGA AATACATGGT TTTGGAGAAC CTGCTATAGA 300 TATATGCCAA ATTTACACTA GTTTAGTGGG TGCAAAACTA TTATCTCTGT TTCTGAGTTT 360 AATAAAAAAT AAATAAGCAG GGCGAATAGC AGTTAGCCTA AGAAGGAATG GTGGCCATGT 420 ACGTGCTTTT AAGAGACCCT ATAATAAATT GCCAGCTGTG TTGCTTTGGT GCCGACAGGC 480 CTAACGTGGG GTTTAGCTTG ACAAAGTAGC GCCTTTCCGC AGCATAAATA AAGGTAGGCG 540 GGTGCGTCCC ATTATTAAAG GAAAAAGCAA AAGCTGAGAT TCCATAGACC ACAAACCACC 600 ATTATTGGAG GACAGAACCT ATTCCCTCAC GTGGGTCGCT AGCTTTAAAC CTAATAAGTA 660 AAAACAATTA AAAGCAGGCA GGTGTCCCTT CTATATTCGC ACAACGAGGC GACGTGGAGC 720 ATCGACAGCC GCATCCATTA ATTAATAAAT TTGTGGACCT ATACCTAACT CAAATATTTT 780 TATTATTTGC TCCAATACGC TAAGAGCTCT GGATTATAAA TAGTTTGGAT GCTTCGAGTT 840 ATGGGTACAA GCAACCTGTT TCCTACTTTG TTAACATGGC TGAAGACGAC CTGTGTTCTC 900 TCTTTTTCAA GCTCAAAGTG GAGGATGTGA CAAGCAGCGA TGAGCTAGCT AGACACATGA 960 AGAACGCCTC AAATGAGCGT AAACCCTTGA TCGAGCCGGG TGAGAATCAA TCGATGGATA 1020 TTGACGAAGA AGGAGGGTCG GTGGGCCACG GGCTGCTGTA CCTCTACGTC GACTGCCCGA 1080 CGATGATGCT CTGCTTCTAT GGAGGGTCCT TGCCTTACAA TTGGATGCAA GGCGCACTCC 1140 TCACCAACCT TCCCCCGTAC CAGCATGATG TGACTCTCGA TGAGGTCAAT AGAGGGCTCA 1200 GGCAAGCATC AGGTTTTTTC GGTTACGCGG ATCCTATGCG GAGCGCCTAC TTCGCTGCAT 1260 TTTCTTTCCC TGGGCGTGTC ATCAAGCTGA ATGAGCAGAT GGAGCTAACT TCGACAAAGG 1320 GAAAGTGTCT GACATTCGAC CTCTATGCCA GCACCCAGCT TAGGTTCGAA CCTGGTGAGT 1380 TGGTGAGGCA TGGCGAGTGC AAGTTTGCAA TCGGCTAATG GTTAGTCGAT GGGCTGACGA 1440 GTTTGATGTC AGGAGAAGCT GAGTGTGTCA CTTGTTTCCC TTTAAGAAGT ATTAATGTAA 1500 TAAAAATCAA GATCTGGTTT AATAACTGGA TACTTGATTT CATCGCGCTT TTTTTGAATA 1560 AATGTTTGTT GTCTTGACTT TAAGATATCC TTTGAAATTT GCGTTATTCG TATTTCGCTT 1620 TTGGTTATTT CCAAAAGACT TTGCTCAGTA AGATCAAACG TTTGTATTTC TCCGGGCCAC 1680 AATATTTGAC CTATATGCAC TGGCCCACGC GCCGCAATAG ATGAAAATTG CCAAAATTAG 1740 CTATCGGTCT TCTGAAAAGA AGGGCCGACA TGTTTTCATA GACCATGCAA AGTCATACTA 1800 CCTGAAACTG ATAAATAACG ACAAAGAAAG TAGCCTATTT AAAAGTCGCT ATAGCATG 1858

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターpBI-rolCの構築方法を説明する図
である。

【図２】発現ベクターpBI35S-rolCの構築方法を説明す
る図である。

【図３】形質転換ペチュニア植物体のサザンブロット解
析の結果を示す図である。レーン１〜３にはそれぞれペ
チュニア・ハプロイドゲノム当たり５、10、50コピーに
相当する遺伝子コピー数マーカー、レーンＮ、Ｔ１、Ｔ
２はそれぞれ非形質転換体、35S-rolC形質転換体11-2、
35S-rolC形質転換体12-2から抽出したDNAがのせられて
いる。

【図４】形質転換ペチュニア植物体のノーザンブロット
解析の結果を示す図である。レーンＣには非形質転換体
から抽出したmRNA、レーン１〜３には異なる３つの35S-
rolC形質転換体から抽出したmRNA、レーン４〜６には異
なる３つのrolC形質転換体から抽出したmRNAがそれぞれ
のっている。レーン５のrolC植物32-1 mRNAからはプロ
ーブとハイブリダイズするバンドが検出されなかった。

【図５】左から順に、非形質転換体、35S-rolC植物12ー
2、rolC植物11ー2の葉の形態を示す図である。

【図６】左から順に、非形質転換体、35S-rolC植物12ー
2、rolC植物11ー2の花の形態を示す図である。なお、図
３、及び図４は電気泳動図であり、図５及び図６は生物
の形態を示す写真である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年１０月１５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】 発現ベクターpBI-rolCの構築方法を説明する
図である。

【図２】 発現ベクターpBI35S-rolCの構築方法を説明
する図である。

【図３】 形質転換ペチュニア植物体のサザンブロット
解析の結果を示す電気泳動の写真である。レーン１〜３
にはそれぞれペチュニア・ハプロイドゲノム当たり５、
10、50コピーに相当する遺伝子コピー数マーカー、レー
ンＮ，Ｔ１、Ｔ２はそれぞれ非形質転換体、35S-rolC形
質転換体11-2、35S-rolC形質転換体12-2から抽出したDN
Aがのせられている。

【図４】 形質転換ペチュニア植物体のノーザンブロッ
ト解析の結果を示す電気泳動の写真である。レーンＣに
は非形質転換体から抽出したmRNA、レーン１〜３には異
なる３つの35S-rolC形質転換体から抽出したmRNA、レー
ン４〜６には異なる３つのrolC形質転換体から抽出した
mRNAがそれぞれのっている。レーン５のrolC植物32-1 m
RNAからはプローブとハイブリダイズするバンドが検出
されなかった。

【図５】 左から順に、非形質転換体、35S-rolC植物12
-2、rolC植物11-2の葉の形態を示す写真である。

【図６】 左から順に、非形質転換体、35S-rolC植物12
-2、rolC植物11-2の花の形態を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/83

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】実質的にrolC遺伝子産物またはサイトカイ
   ニン- グルコシド グルコシダーゼをコードするDNA配
   列をペチュニア細胞の染色体中に組み込み、得られた形
   質転換細胞から植物体を再分化させることを特徴とする
   矮性ペチュニア植物体の作成法。
2. 【請求項２】ペチュニア細胞の染色体中に組み込まれ
   る、実質的にrolC遺伝子産物またはサイトカイニン- グ
   ルコシド グルコシダーゼをコードするDNA配列が、カ
   リフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターの下流に
   連結されていることを特徴とする、請求項１記載の矮性
   ペチュニア植物体作成法。
3. 【請求項３】実質的にrolC遺伝子産物またはサイトカイ
   ニン- グルコシド グルコシダーゼをコードするDNA配
   列が、染色体中に組み込まれ発現していることを特徴と
   する矮性ペチュニア植物体。
4. 【請求項４】染色体中に組み込まれ発現している、実質
   的にrolC遺伝子産物またはサイトカイニン- グルコシド
   グルコシダーゼをコードするDNA配列が、カリフラワ
   ーモザイクウィルス35Sプロモーターの下流に連結され
   ていることを特徴とする、請求項３記載の矮性ペチュニ
   ア植物体。