JPH0690754A - スペーサーを介してメディエータで修飾した酵素及びそれを用いたセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 メディエータと酵素を共有結合させてなる修
飾酵素、該修飾酵素を含む溶液成分と、作用電極、対向
電極及び参照電極からなる電極系とからなるセンサー、
及び該修飾酵素を電極成分とした酵素修飾電極、対向電
極及び参照電極からなる電極系からなるセンサー。 【効果】 酵素−メディエータ複合体、基質を含む溶液
系にて、またスクリーン印刷法にて作製した電極系に
て、（１）本来の“メディエータ”を併用しない系が組
める、（２）反応は可逆的であり、安定した応答が得ら
れる、（３）応答の感度が高い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】化学物質を測定することは、医
療、工業プロセス、環境などをはじめとする広い範囲の
分野で行なわれている。これらの分野には種々の化学物
質が存在しており、各種の化学物質を測定するために、
さまざまな物理・化学装置が駆使されており、これらを
より迅速、簡単かつ直接測定できる方法や装置が強く要
望されている。しかしながら、化学物質は単独で存在す
ることはなく、たいてい何種類もの物質が混在してい
る。このような系から、特定の化学物質を選択し、これ
を測定するためには、これらを識別する材料や試薬が必
要である。例えば生体触媒である酵素は、生体内の反応
を選択的に進めている。酵素は触媒機能と同時に分子認
識能を有している。従って、この酵素を用いることによ
って特定の化学物質を識別し、その化学物質の濃度を測
定することができるのである。

【０００２】本発明は、各種分野において用いられる測
定センサーとして有用であるだけではなく、臨床検査の
分野においても、種々の微量な生体試料中の特定成分に
ついて試料液を迅速かつ簡易に定量することのできる酵
素センサーに関するものである。

【０００３】

【従来の技術】各種化合物の測定において、酵素の高い
基質選択性を利用した酵素センサーの有用性が認められ
ており、殊にグルコースなどの定量分析においては、既
に実用化がなされている。現在実用化されている酵素セ
ンサーは、測定物質に対して高い基質特異性を有する酵
素を基材に固定化し、試料中の目的物質に触媒作用を司
る酵素が作用することにより、生成する水素イオン量又
は消費される酸素量を水素イオン電極又は酸素電極によ
り電気化学的に各々検出することにより定量している。
従って、このタイプの酵素センサーで利用できる酵素と
しては、反応により酸素を消費するか又は水素イオンを
生成する酸化酵素、いわゆるデヒドロゲナーゼのみ限定
されることになる。

【０００４】例えば、脱水素酵素を膜中に包括固定化し
隔膜酸素電極上に装着しセンサーを構成できる。この脱
水素の作用で基質が脱水素されるので、酵素膜に密着さ
せてある酸素電極で電流値の変化から基質の濃度を測定
することができる。また、この酸素電極の代わりに水素
イオン電極でこれを測定しても同様に基質濃度を求める
ことができる。

【０００５】これらの電極反応は電気化学 (酸化還元)
的メカニズムに基づく。基質の種類によっては、酵素と
基質が容易に反応しない系もあり、メディエータ、補酵
素を必要とする場合もある。さまざまな系に関して研究
が進められている。例えば、人工のメディエータを電極
表面に薄膜状に塗布し、更にその上を半透膜で皮膜する
方法も提案されている (EP78636B1)。また、難水溶性の
メディエータを電極剤中に含有させたり (Agric. Biol.
Chem., 52, 1557(1988)) 、水溶性の高いメディエータ
の場合には、電極に予めメディエータを含有させた後、
イオン性高分子と酵素からなる混合物を電極表面に薄膜
として形成させることにより、電解液中にメディエータ
が溶出しないようにする方法 (Agric. Biol. Chem.,52,
3187(1988)) が提案されている。

【０００６】しかしながら、いずれの場合にも電極の調
製が煩雑であり、酵素はメディエータを含有させた後の
電極表面に薄膜を形成するように用いられている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、従来の
酵素修飾電極は調製方法が煩雑で測定機器として品質管
理された製品を量産するには困難な作業を必要とし、し
かも何回も繰り返して使用する際に電極自体の寿命が短
い上に、利用できる酵素が制限されるなど、種々問題が
あった。そこで電極表面を段階的にメディエータ薄膜
層、酵素薄膜層及び半透膜層で順次被膜する方法が従来
からとられてきたが、電極の調製が煩雑であるという問
題点を有していた。

【０００８】そこで、これらの煩雑な方法に代えて、予
めスペーサーを介してメディエータを酵素と共有結合し
て形成された複合体を調製しておき、これを溶液成分と
し、共存する基質成分を作用電極、対向電極、参照電極
を組み合わせてなる電極系にて、試料液との反応に際し
て基質濃度変化を電気化学的に検知し、基質濃度を測定
することができるセンサーシステムを確立した。

【０００９】上記測定系では、可搬性以外にも簡便性、
即時性などに難点があるので我々の有する印刷技術を用
いて上記電極をコンパクトに作製すべく研究を行なっ
た。即ち、スペーサーを介してメディエータを酵素に共
有結合した複合体を電極成分とした酵素修飾電極を作用
電極とし、上記と同様に対向電極、参照電極と組み合わ
せてなる電極系にて試料液との反応に際して基質濃度変
化を電気化学的に電流値もしくは電位値を検知し、基質
濃度を測定することができるセンサーを確立した。ここ
で酵素修飾電極は、上記複合体 (メディエータ‐スペー
サー‐酵素) にグラファイト、カーボンペースト等のよ
うな通常の電極に利用されている導電体と適当なビヒク
ルを添加することにより均一組成物とし、この均一組成
物を電極基材 (例えばカーボン電極) として導電性を示
さない基材の表面にパターン化スクリーン印刷 (被覆)
するという簡便な方法による製法をとった。更に各種の
酵素についても検討を加え、酵素修飾電極の製造方法を
確立し、その酵素修飾電極を内蔵する優れた性能のセン
サーを提供することを目的として種々の研究を重ねた結
果、本発明を完成した。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の第１は、スペ−
サ−を介してメディエータとデヒドロゲナーゼを共有結
合させてなる修飾酵素である。本発明で用いるデヒドロ
ゲナーゼとしては、例えばフルクトースデビトロゲナー
ゼが挙げられる。かかるデヒドロゲナーゼとしては、好
ましくはデヒドロゲナーゼがアルコールデヒドロゲナー
ゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデビドロ
ゲナーゼ、グルタミン酸デビドロゲナーゼ、コレステロ
ールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナー
ゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼが挙げられる。

【００１１】また、メディエータとしては、例えばフェ
ロセン、フェロセン誘導体、ｐ−ベンゾキノン、フェリ
シアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート、２，
６−ジクロロフェノールインドフェノール、ＰＱＱ、Ｆ
ＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰが挙げられるが、特にフェロセ
ン、フェロセン誘導体が好ましい。かかるフェロセン誘
導体としては、例えば１，1'−ジメチルフェロセン、フ
ェロセン酢酸、ヒドロキシエチルフェロセン、１，1'−
ビス（ヒドロキシメチル）フェロセン、フェロセンモノ
カルボン酸、フェロセン１，1'−ジカルボン酸、クロロ
フェロセン、メチルトリメチルアミノフェロセンが挙げ
られる。

【００１２】酵素とメディエータとの組合せとしては、
特にフルクトースデヒドロゲナーゼとフェロセン又はフ
ェロセン誘導体との組合せが好ましい。本発明の修飾酵
素は、スペーサーを介してメディエータと酵素を共有結
合させることを特徴とする。スペーサーとしてはイソプ
レン、ブタジエン、アセチレン及びこれらの誘導体並び
に各々のコポリマー等が挙げられる。

【００１３】しかし、スペーサーとしては、酵素の化学
修飾の必要上次式で示されるジヒドラジト化合物が使用
され特に好ましいのはｎ＝４のアジピルジヒドラジトで
ある。

【００１４】

【化２】

【００１５】本発明の第２は、前記本発明の修飾酵素を
含む溶液成分と、作用電極、対向電極及び参照電極から
なる電極系とからなるセンサーであり、本発明の第３
は、前記本発明の修飾酵素を電極成分とした酵素修飾電
極、対向電極及び参照電極からなる電極系からなるセン
サーである。本発明の第３である前記センサーとして
は、電極系が絶縁性基板上にスクリーン印刷で形成され
たカーボンを主体とする材料からなるセンサーが好まし
い。

【００１６】以下、酵素とメディエータおよびスペーサ
ーとの好ましい組合せであるフラクトースデヒドロゲナ
ーゼ（以下「ＦＤＨ」という。）とフェロセン又はフェ
ロセン誘導体及びスペーサーとしてヒドラジドの組合せ
を例にとり、本発明を更に詳細に説明する。 この組合
せでは、下記の２点が重要である。 １. フェロセン又はフェロセン誘導体によるＦＤＨの化
学修飾。

【００１７】２. フルクトースセンサー電極を用いる環
境のpHコントロール。 ＦＤＨは以下の反応を触媒する。：

【００１８】

【化３】

【００１９】一方、フェロセンなどのメディエータは、
上式のアクセプターに置き代わって以下のように酸化還
元試薬として働く。

【００２０】

【化４】

【００２１】バイオセンサーとして用いる際、酸化還元
試薬 (過酸化水素や他のメディエータ) というものは、
酵素のＦＡＤＨサイトと電極の間の反応を往復し、酵素
から電極への測定が充分できる位の電流を生ずる程度の
電子を伝達を行なう。また、フェロセンは過酸化水素と
比べて以下に示す利点がある。 １) 溶液中の酸素濃度は変わりやすいにもかかわらず、
フェロセン濃度は容易にコントロール可能である。 ２) フェロセンは過酸化水素と比べて低い電極電位でも
測定可能である。そのため、フェロセンを用いたバイオ
センサーでは、過酸化水素を用いた場合に比べて、類似
した電位で還元されるアスコルビン酸などの化合物から
の妨害に対して測定中に受ける影響が少ない。

【００２２】フェロセンは電極炭素へ吸着により固定化
できる。また、水に対して低い可溶性を示すために、電
極からそんなに早く溶けはしないが、多少のロスは避け
られない。更に、その固定化フェロセンへデヒドロゲナ
ーゼを接触させようというアプローチもあることはあ
る。しかしながら、もしデヒドロゲナーゼの炭素鎖（な
お、この炭素鎖は酵素より枝分かれしたアルキル鎖、糖
鎖、アミノ酸の側鎖などである。）へフェロセンが結合
できれば、その酵素活性は、蛋白質 (酵素) の活性部位
付近にフェロセンを結合させてその酵素反応を妨害して
しまう場合よりも影響が少なくて済む。酵素の炭素鎖に
フェロセンが結合していれば、そのフェロセンは酵素の
ＦＡＤＨ反応部位と電極の間の反応を担うであろう。更
に充分 (もしくは過剰) な量のフェロセン分子が酵素及
びその酵素の持つ炭素鎖に結合 (修飾) できれば、逆に
その触媒能としての影響を与えることなく、また酵素の
ＦＡＤＨサイトと電極間の反応を往復することなく、酵
素自身が持つＦＡＤＨ反応部位から酵素の様々な異なる
部位に結合した数個のフェロセン分子あるいは電極へ、
電子の受け渡しが直接可能となろう。いわば、“導電性
酵素”を作製することができた。このメディエータ修飾
酵素を作製するに至った過程及び該修飾酵素自体が、本
発明の中心たる要点である。

【００２３】更に、実際の測定系にて予めスペーサーを
介してメディエータをＦＤＨと共有結合して形成した複
合体を基質 (フルクトース）と反応させると、その複合
体が“導電性酵素”であることから、基質濃度に応じて
溶液系の電導度が大きく変わることが観測された。特に
ＦＤＨはＰＱＱ型酵素であり補酵素（ＮＡＤＨ）に直接
酵素反応が依存しない為に前記の現象を得るのには特に
好ましい酵素であった。この系をそのまま用い、更にカ
ーボンペーストを加え、スクリーン印刷法により電極パ
ターンを、ある基材 (プラスチックなど) 上に印刷す
る。このチップを使い捨て型バイオセンサーのアタッチ
メントとした。更に、機械本体 (リーダー) と該アタッ
チメントをセットでセンサーシステムとして構築した。

【００２４】

【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。

【００２５】

【実施例１】 酵素の炭素鎖のみに修飾したフェロセン−ＦＤＨの調製
（図１（Ａ）） （１）過ヨウ素酸ナトリウムによりＦＤＨの炭素鎖を酸
化した。ＦＤＨ (100mg)を0.１Ｍ、pH6.０のリン酸緩衝
液 (１ml) に溶かし、20mM過ヨウ素酸ナトリウム (予め
上記の緩衝液で溶かしておく) と混合した。酸化は、４
℃にて１時間で進み、続いてエチレングリコール (100
μl)を加えて反応を停止させた。その後、更に４℃、30
分してから、pH 6.0、0.1 Ｍリン酸緩衝液を４回交換し
ながら反応混合物を48時間以上かけて透析した。 （２）クロスリンキング試薬：アジピルジヒドラジドの
酸化炭素鎖への結合。

【００２６】アジピルジヒドラジド (100mg 乾燥粉末)
を酸化したＦＤＨの透析の済んだ液に溶かし、その溶液
を室温暗所にて一晩放置し反応させた。過剰のアジピル
ジヒドラジドを除くために、pH 6.0、0.1 Ｍリン酸緩衝
液を４回交換しながら反応混合物を透析した。 （３）酵素の炭素鎖に結合した未反応ヒドラジド基とフ
ェロセンカルボキシアルデヒドとの反応。

【００２７】フェロセンカルボキシアルデヒド (濃度１
mg／ml、pH 6.0、0.1 Ｍリン酸緩衝液２ml) をアジピル
ヒドラジド溶液 (２ml) に混合し、４℃暗所にて一晩反
応させた。シアノボロハイドライドナトリウムを10mMの
終濃度になるように混合し、１時間反応させ、そして、
pH 6.0、0.1 Ｍリン酸緩衝液を４回交換し、反応混合物
を透析して、過剰のフェロセンカルボキシアルデヒドを
除いた。

【００２８】

【実施例２】 酵素の炭素鎖と酵素自身の両方に修飾したフェロセン−
ＦＤＨの調製（図１（Ｂ）） 二段階修飾酵素を調製するために下記の２手法を試みた
(方法Ａ、方法Ｂ) 。 方法Ａ 方法Ａは、Y.DeganiとA.Heller (J. Physical Chemistr
y, 91, 1285-1289(1987))による手法を参考にした。本
方法では、フェロセンカルボン酸と蛋白質自身の遊離ア
ミノ基をカルボジイミド法にて反応させることにより、
ＦＤＨ自身にフェロセンが結合される。２段階の修飾酵
素 (即ち蛋白質本体とその蛋白質炭素鎖の両方にフェロ
センを結合する) を得るために、実施例１と同様にして
炭素鎖の一部にアジピルジヒドラジドを初めに結合す
る。そして、フェロセンカルボン酸を蛋白質本体のアミ
ノ基と蛋白質炭素鎖の遊離ヒドラジド基の両方と反応さ
せる。 （１）実施例１（１）と同様にして過ヨウ素酸ナトリウ
ムでＦＤＨの炭素鎖を酸化した。 （２）実施例１（２）と同様にしてアジピルジヒドラジ
ドを酸化したＦＤＨに反応させた。 （３）蛋白質本体と蛋白質炭素鎖ヒドラジド基の両方の
アミノ基をフェロセンカルボン酸と反応させた。反応が
進むように、蛋白質をほどいてアミノ基を露出させるた
めに、反応混合物に尿素を混合した。尿素 (810mg)、水
溶性カルボジイミド (１−エチル−３−［３−ジメチル
アミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド；100m
g)とフェロセンカルボン酸 (80mg) をpH 7.3、0.15Ｍ
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタ
ンスルホン酸（以下「HEPES」という。）緩衝液 (４ml)
中でソニケーションし、pH 7.2ないし7.3 に再び合わ
せた。このpHでフェロセンカルボン酸を飽和させた。ア
ジピルヒドラジド溶液 (２ml)を加え、必要に応じてpH
を確認、調整し、反応物を０℃暗所にて一晩放置した。
過剰量の試薬は、pH 6.0、0.1 Ｍリン酸緩衝液を４回透
析交換して除いた。 方法Ｂ 方法Ｂでは、蛋白質側鎖の酸化した炭素鎖のアルデヒド
基 (-CHO) と蛋白質本体の遊離カルボキシル基 (-COOH)
の両方にアジピルジヒドラジドを反応させた。そしてフ
ェロセンアルデヒドは結合したヒドラジドと反応させ
た。 （１）実施例（１）と同様にして過ヨウ素酸ナトリウム
でＦＤＨ炭素鎖の一部を酸化した。 （２）カルボジイミド存在下で酸化ＦＤＨにアジピルジ
ヒドラジドを反応させた。 0.5Ｍアジピルジヒドラジ
ド、pH５に調整 (２ml) 、９mg塩化ナトリウム、酸化し
た酵素溶液 (２ml) と１Ｍ水溶性カルボジイミド (１m
l) および３Ｍ尿素を全て混ぜてpHを５に調整した。室
温暗所にて４時間放置して反応が進む：30分おきにpHを
５に調整した。４時間後、反応液をpH 6.0、0.1 Ｍリン
酸緩衝液で４回透析交換した。 （３）フェロセンカルボキシアルデヒドとの反応 ＦＤＨヒドラジド溶液 (2.５ml) を 0.4mg／mlフェロセ
ンカルボキシアルデヒド (2.5ml)と混ぜ、暗所４℃にて
４時間反応させた。終濃度0.１mMになるようにシアノボ
ロハイドライドナトリウムを加え、そしてpH 6.0、0.1
Ｍリン酸緩衝液で４回反応液を透析した。

【００２９】また、方法ＡおよびＢによって最終的に得
られたフェロセン−ＦＤＨの電気化学的応答から判断し
て、両法に大差はないことが確認された。

【００３０】

【実施例３】 酵素自身のみに修飾したフェロセン−ＦＤＨ（図１
（Ｃ）） 既に、“課題を解決するための手段”の項で言及した
が、上記修飾部位による違い (実施例１及び２ )と比較
参考するために、酵素自身のみにメディエータを修飾し
たフェロセン−ＦＤＨも調製した。作製方法は実施例２
の方法Ａに準じているが、フェロセンカルボン酸と蛋白
質自身の遊離アミノ基がカルボジイミド法にて反応する
ことにより、ＦＤＨ自身にフェロセンが結合できる。

【００３１】蛋白質本体のアミノ基をフェロセンカルボ
ン酸と反応させた。反応が進むように、蛋白質をほどい
てアミノ基を露出させるために、反応混合物に尿素を混
合した。尿素 (810mg)、水溶性カルボジイミド (100mg)
とフェロセンカルボン酸 (80mg) をpH 7.3、0.15Ｍ HEP
ES緩衝液 (４ml) 中でソニケーションし、pH 7.2ないし
7.3 に再び合わせた。このpHでフェロセンカルボン酸を
飽和させた。アジピルヒドラジド溶液 (２ml) を加え、
必要に応じてpHを確認、調整し、反応物を０℃暗所にて
一晩放置した。過剰量の試薬は、pH 6.0、0.1 Ｍリン酸
緩衝液を４回透析交換して除いた。

【００３２】〔比較例１〕 酵素を修飾せずにメディエータと基質を混在させた系 実施例１〜３の有意性を明らかにするため、これらの系
において用いたフェロセン修飾酵素に代えて、修飾しな
いＦＤＨを用いた。更に、メディエータとしてフェロセ
ンを混在させて下記の電気化学的評価に供した。

【００３３】各測定系のＦＤＨ及びフェロセンの濃度な
どの条件をなるべく同一に揃える目的で、実施例１記載
の試薬処方を参考にし、以下のように調製した。 条件 ＦＤＨ（非修飾） 100mg フェロセン 1mg リン酸緩衝液（pH 6.0、0.1 Ｍ） 30ml カタラーゼ（実施例４参照） 3mg フルクトース（存在又は不在） 10mM 又は０mM 本測定系（比較例１）にて、応答が極めて低く観測され
た。この理由としては、メディエータたるフェロセン分
子が溶液中に均一に存在しており、ＦＤＨと酸化還元反
応に寄与するフェロセン分子の数がかなり少ないことが
考えられる。これに対して実施例１〜３の各系ではフェ
ロセン分子がＦＤＨの表面又は周辺に局在化しているの
で本測定系と比べてフェロセン分子が相当効率的に酸化
還元反応に寄与しているために、これらの差異が認めら
れたものと考えられる。

【００３４】

【実施例４】 修飾ＦＤＨの評価 金作用電極 (直径１mm) 、プラチナ対向電極、Ag／AgCl
参照電極を用いたサイクリックボルタモメトリでフェロ
セン修飾ＦＤＨを評価した。使用前に酸化アルミニウム
(0.075μｍ) で作用電極を研磨した。北斗電子ポテンシ
オシュタット／ガルバノシュタットモデル HAB-151とグ
ラフテックWX1200記録計で測定を行なった。

【００３５】修飾酵素溶液は実施例１〜３に従い、希釈
することなく用いた。過酸化水素の妨害を避けるため
に、終濃度で 0.1mg／mlのカタラーゼを加えた。最初
に、酵素のサイクリックボルタモグラムをフルクトース
不在下で測定した。そして最終濃度で10mMになるように
フルクトース溶液を加えてから、全く同一条件でサイク
リックボルタモグラムを再び計った。また酸素の影響を
除くため、窒素によるバブリングを充分に行なった。

【００３６】実施例１、実施例２（方法Ａ）及び実施例
３で得られたフェロセン修飾ＦＤＨを用いた場合のサイ
クリックボルタモグラムを測定したところ基質（フルク
トース）を加えることにより導電率の向上がみられた。

【００３７】

【実施例５】 スクリーン印刷法による電極を用いた測定系 大日本印刷（株）により、特開平3-28199 号「体液成分
検査用試験片」で代表されるような臨床検査材料が開発
されている。その他のものとしては、特開昭60-178356
号「体液検査体」、特開昭60-238763 号「体液検査
体」、特開昭61-247967 号「ブドウ糖検出用検査体及び
その製造方法」、特開昭61-284661 号「ブドウ糖検出用
検査体」及び特開昭62-263468 号「ブドウ糖検出用イン
キ組成物および検査体」がある。これらの発明のあるも
のは、酵素を複数種類含む組成物をインキとし、スクリ
ーン印刷法による尿検査紙の製造法に関して詳細に言及
している。その応用として、呈色指示薬など以下の過程
で必要としない成分を除く代わりに、導電性成分を混ぜ
るなどして表１に示すような新しいインキ処方を開発し
た。他の印刷手段としては、グラビア印刷、ディスペン
サーによる塗布、ダイコートの使用が可能である。

【００３８】

【表１】

【００３９】スクリーン印刷法は既存の技術であり、ス
クリーンはテトロン、120 メッシュ、150 μm （膜厚）
の版を作製（（株）ミノグループ）し、通常の条件で印
刷を行なった（特開昭61-284661号参照）。印刷後、直
ちに乾燥（60℃、５分）し、次いで、この印刷物を断裁
し、電極（チップ）として電気化学的測定に供した。印
刷パターンは、図２に示した（パターンＡ、パターン
Ｂ）。

【００４０】パターンＡは、図２よりインキＡ（修飾酵
素入り）により形成される一電極チップであり、同様に
パターンＢは、インキＡ（修飾酵素入り）を作用電極、
インキＢ（酵素なし）を対向電極とする二電極チップで
ある。初めに一電極系で測定を行なった。即ち、測定系
は、既述の３電極方式であるが、該金作用電極に代えて
一電極チップを装填し、表２に示す電流値を得た。更
に、作用電極、対向電極を有する二電極チップ単独での
測定も同様に行なった。資料溶液は、フラクトース水溶
液、0mM 、5mM 、10mMの３水準を測定点とした。印刷、
乾燥後の電極パターンのサイズは、幅 3mm、長さ30mm、
厚さ100 μm であり、接点を取り出さない側から約20mm
を試料に浸して測定を行なった。

【００４１】

【表２】

【００４２】表２では、修飾酵素として実施例２（方法
Ａ）で得られたフェロセン修飾ＦＤＨを用いた。また、
測定した電流値は、電位値が＋450mV の時の作用電極、
対向電極間を流れる電流値である。また、印刷インキに
含まれる酵素量を容易に制御できるのでセンサーのダイ
ナミックレンジ及び感度も自由に選ぶことができる。二
電極系（パターンＢ）にて、ポータブルのフルクトース
スセンサーを作製できることが確かめられたので、実用
モデルとして、使い捨て型の前記のチップ（電極）をペ
ンタイプ（デジタル表示）の先端に装填するシステムを
も考案することができた。図３にペンタイプの実用モデ
ルを示す。

【００４３】

【発明の効果】本発明において、酵素とメディエータを
共有結合させることにより両者を物理的に強固に固定化
することが可能になった。これは、通常のセンサーや電
極系、電気化学系に極めて効率的に酵素を反応させるこ
とが可能となっただけでなく、反応系外へメディエータ
の漏出を防ぐことができる。すなわち従来のセンサーは
メディエーター（毒性の強いものが多い）が溶出すると
いう理由で体内での使用を禁じられいたが、本発明によ
り体内での使用が可能となった上に、既述のように酵素
表面に導電性を付与したので酸素が存在しない環境下で
の利用も容易に行なうことができるなど、さまざまな分
野において極めて有用である。さらに酵素表面をメディ
エータで充分にの修飾をおこなうことのできる本方法
は、従来のセンサーよりも高い感度を示す。

【００４４】以上より、酵素ーメディエータ複合体、基
質を含む溶液系をスクリーン印刷法にて作製した電極系
で、（１）本来の“メディエータ”を併用にないです
む、（２）メディエータの漏出がないので例えばin viv
o での使用が可能である、（３）応答の感度が高い、
（４）反応は可逆的であり、安定した応答が得られる、
（５）不安定な酵素に化学修飾を施しているので溶媒な
どの変性要因に対して抵抗性を得た、（６）スクリーン
版など、刷版を工夫することによりさまざまな微細かつ
複雑な印刷パターンが設計できる、等の効果が認められ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】フェロセン−ＦＤＨの模式図。

【図２】電極チップの印刷パターンを示す図である。

【図３】ペンタイプの実用モデルを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/32 6807−4Ｂ 1/54 6807−4Ｂ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 メディエータとデヒドロゲナーゼとをス
   ペーサーを介して共有結合させてなる修飾酵素。
2. 【請求項２】 デヒドロゲナーゼがアルコールデヒドロ
   ゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロ
   ールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、
   グルコースデヒドロゲナーゼ、フラクトースデヒドロゲ
   ナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ及びグリセロー
   ルデヒドロゲナーゼからなる群から選ばれるものである
   請求項１記載の修飾酵素。
3. 【請求項３】 スペーサーが次式のジヒドラジド化合物
   である請求項１又は２記載の修飾酵素。 【化１】
4. 【請求項４】 メディエータがフェロセン又はフェロセ
   ン誘導体、ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体、キ
   ノン又はその誘導体である請求項１記載の修飾酵素。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の修
   飾酵素を含む溶液成分と、作用電極、対向電極及び参照
   電極からなる電極系からなるセンサー。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の修
   飾酵素を電極成分とした酵素修飾電極、対向電極及び参
   照電極からなる電極系からなるセンサー。
7. 【請求項７】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の修
   飾酵素を電極成分とした修飾酵素固定化電極、対向電極
   及び参照電極からなる電極系からなるセンサー。
8. 【請求項８】 電極系が絶縁性基板上にスクリーン印刷
   で形成されたカーボンを主体とする材料からなる請求項
   ６記載のセンサー。