JPH0690766A - アブラナのホスホエノールピルビン酸 カルボキシラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列表の配列番号１に示すゲノムＤＮＡの配
列によって規定されるアブラナのホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ遺伝子。 【効果】 該遺伝子を発現させることによってあるいは
逆にそれを制御することによって、タンパク質含量の高
いあるいは油脂含量の高いアブラナその他の植物を効率
的に育種できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物の貯蔵物質の生合
成を制御している因子の一つである、ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ（以下、ＰＥＰＣａｓｅと略
す）の遺伝子に関するものである。該酵素と、蛋白質含
量、脂肪含量との間にはそれぞれ正及び負の相関性があ
るところから、この遺伝子を発現させれば、蛋白質含量
の高いアブラナその他の植物を生産することができ、一
方この遺伝子の発現をアンチセンス遺伝子などによって
抑制すれば、アブラナその他の植物での脂肪の生産増大
が図られる。また、本発明に係るプロモーター配列を利
用すれば、ＰＥＰＣａｓｅのみならず他の物質の分泌発
現を促進することができるので、本発明を利用すれば所
望する性質を有するアブラナその他各種植物の育種をき
わめて効率的に行うことができる。

【０００２】

【従来の技術】ＰＥＰＣａｓｅは、様々な生物において
存在が確認され、多様な役割を果たしていることが知ら
れている。この酵素は、Ｍｇ²+イオンを必要とし、ホス
ホエノールピルビン酸に炭酸イオンから由来する炭素鎖
の付加を行ない、オキサロ酢酸とリン酸を生成する反応
を触媒する。この酵素は、高等植物、酵母、細菌では見
つかっているが、動物には存在しない。なお、これと似
た反応を行なう酵素として、ピルビン酸カルボキシラー
ゼが存在し、これは動物において、重要な働きを行なっ
ていることが知られている。これらの酵素は、ともにＴ
ＣＡサイクルに必要なオキサロ酢酸の補充に働いている
ものと考えられている。また、高等植物においては、根
におけるｐＨスタット、窒素代謝におけるイオンバラン
サーとしての働きなども提唱されている（Ｃ．Ｓ．Ａｎ
ｄｒｅｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２１
３，１−８（１９８７））。

【０００３】高等植物の中でも、Ｃ４型あるいはＣＡＭ
型といわれる光合成を行なう植物では、大気中のＣＯ₂
は、葉肉細胞中に局在するＰＥＰＣａｓｅによって固定
され、生成したオキサロ酢酸は、還元されてリンゴ酸に
なる。このため、Ｃ４型の植物であるトウモロコシなど
では、ＰＥＰＣａｓｅに関する多数の研究がある。Ｃ３
型植物においても、これら光合成に関わる一連の酵素群
が存在していることは分かっているが、Ｃ３型植物とＣ
４型植物でのＰＥＰＣａｓｅの違いなどについては、あ
まり研究が進んでいない。

【０００４】これまでに、Ｃ４型のＰＥＰＣａｓｅは、
トウモロコシ、ソルガムなどで遺伝子のクローニングと
その解析が進んでいる（Ｋ．Ｉｚｕｉ ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４，１６１５−１
６２８（１９８６）；Ｍ．Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８１，５９３
−５９８（１９８９）；Ｒ．Ｌ．Ｈｕｄｓｐｅｔｈ ＆
Ｊ．Ｗ．Ｇｒｕｌａ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１２，５７９−５８９（１９８９）；Ｃ．Ｃｒｅ
ｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９９，８７−９４
（１９９１））。また、Ｃ３型の植物では、イネ、タバ
コで遺伝子の解析が進められている（Ｎ．Ｋｏｉｚｕｍ
ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
１７，５３５−５４０（１９９１））。さらに、両者の
中間型であるＣＡＭ型植物についても、いくつかの研究
が知られている（Ｊ．Ｃ．Ｃｕｓｈｍａｎ ＆ Ｈ．
Ｊ．Ｂｏｈｎｅｒｔ，Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１７，６７４３−６７４６（１９８９））。これ
らの研究の目標は、光合成型の違いによる酵素の生化学
的研究等に限られてきた。

【０００５】グルコースからいくつかの酵素反応を経て
ビルピン酸あるいはホスホエノールビルピン酸にいたる
解糖系と、アセチルＣｏＡとオキサロ酢酸の縮合によっ
て生成するクエン酸が一連の酵素反応でオキサロ酢酸に
戻るまでのＴＣＡサイクルは、ビルピン酸デヒドロゲナ
ーゼあるいはＰＥＰＣａｓｅを介してつながっている。
前者の反応は、ビルピン酸からアセチルＣｏＡを経由し
てクエン酸を生成し、後者は、ホスホエノールビルピン
酸から直接、オキサロ酢酸を生成する。ＴＣＡサイクル
に入った代謝物は、最終的にはエネルギーとして消費さ
れるか、アミノ酸合成系へつながり、さらにはタンパク
質となる。一方、アセチルＣｏＡは脂肪酸合成系の出発
点でもある。すなわち、解糖系からＴＣＡサイクルへ移
行する段階が、脂肪酸合成とタンパク質合成の分岐点で
もある。

【０００６】ＰＥＰＣａｓｅ活性が相対的に強い場合、
アセチルＣｏＡの生成量が相対的に低下し、その分、脂
肪酸合成が抑えられ、タンパク質合成が促進されること
が予測される。実際に、ダイズにおける貯蔵タンパク質
含量とＰＥＰＣａｓｅ活性との相関関係が調べられ、こ
の予測を裏づける結果が得られている（Ｔ．Ｓｕｇｉｍ
ｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，５３，８８５−８８７（１９８９））。そこで、
植物のＰＥＰＣａｓｅ活性を人為的に操作することによ
って、脂肪酸合成とタンパク質合成の比率（分配の割
合）を変えられるかどうかに興味が持たれるところであ
る。

【０００７】アブラナ、ダイズは、作物として非常に有
用である。ダイズの場合、そのタンパク質含量の増大
が、逆にアブラナでは油脂の含量の増大が、育種的に重
要な課題である。しかしながら、従来の育種法では、こ
のような形質の改良には、長い年月と多大な労力を要す
る。そこで、分子育種的手法による形質の改良が待たれ
ていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】人口の増大にともな
い、食糧の増産は世界的な急務であるが、作付面積の拡
大は森林等の自然破壊につながり好ましくない。この様
な条件下で食糧増産を図る為には個々の植物自体を増大
ないしは肥大化する方法のほか、植物における特定の成
分濃度を特に高める方法が考えられる。

【０００９】本発明は後者の考えに立ち、しかもこれを
遺伝子工学の手法を利用して解決しようとするものであ
る。特に蛋白質と脂肪の増産という観点からそれに関す
る遺伝子をクローニングする事を目的とし、もって所望
する植物を育種することを究極の目的とするものであ
る。

【００１０】本発明者らは、アブラナの分子育種を目標
に、光合成で作り出される炭水化物が、貯蔵物質の脂肪
酸あるいはタンパク質に変換される際の分岐点に存在す
る酵素であるＰＥＰＣａｓｅの精製とその遺伝子の単離
および構造解析を試み、アブラナから、ＰＥＰＣａｓｅ
遺伝子の単離を行ない、さらに研究を進め、本発明を完
成するに至った。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために行なわれたものであって、本発明者らは、
植物種子、葉、培養細胞における蛋白質の含量の増大あ
るいは脂肪生産の増大を図る手段として、アブラナから
ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子のクローニングを計画し、アブラ
ナ登熟期の種子からｃＤＮＡをクローニングするのに成
功し、さらに各方面から研究の結果アブラナＰＥＰＣａ
ｓｅ遺伝子の構造を決定することに成功し、ついに本発
明の完成に至った。以下本発明について詳細に説明す
る。

【００１２】本発明を実施するには、先ずアブラナ種子
からＰＥＰＣａｓｅを分離精製する必要がある。それに
は酵素の精製に用いられる情報が適宜利用され、例えば
アブラナ種子を破砕した後、緩衝液に懸濁し、その上清
の硫安分画画分についてカラムクロマトグラフィーなど
既知の方法に従って精製する。

【００１３】この様にしてアブラナ種子からＰＥＰＣａ
ｓｅを均一にまで精製した後、それを用いてウサギに対
する抗体を作製した。次に、アブラナの登熟期の種子か
らポリＡ ＲＮＡを調製して、これを鋳型にしてｃＤＮ
Ａを合成した。このｃＤＮＡをλファージベクターλｇ
ｔ１１に組み込みｃＤＮＡライブラリーを得た。このラ
イブラリーをさらに大腸菌Ｙ１０８８株を用いて増幅さ
せてからスクリーニングを行った。

【００１４】スクリーニングは、さきに作製したウサギ
抗体を用いて行なったところ、この抗体に特異的に結合
する蛋白質を生産するλファージが６つ得られた。これ
らがＰＥＰＣａｓｅ遺伝子を有するものであるものを確
認するために、これらのλファージが生産する蛋白質に
結合する抗体を精製して、これを用いてウエスタン分析
を行なった。この結果、いずれの抗体もＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動で分離したアブラナ種子蛋白質から
ＰＥＰＣａｓｅのみを特異的に選択したことからＰＥＰ
Ｃａｓｅ遺伝子を含むことを確認した。

【００１５】そこでこれらのλファージからλＤＮＡを
調製して、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断してからｃＤＮＡ
部分を回収して、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔｐＫＳ＋にサブクローニングした。これらの物理的
地図を作製したところ、４つは１ｋｂ以下の短い挿入断
片しか含まれていなかったが、２つは３ｋｂぐらいの挿
入断片を含んでいた。これらの中でもっとも長いｃＤＮ
Ａであるものを選択し、ｐＲＰＣ１と名付けた。この塩
基配列を決定してＰＥＰＣａｓｅのｃＤＮＡの塩基配列
を得るのに成功した。

【００１６】次に、このｃＤＮＡをプローブとしてλＥ
ＭＢＬ３をベクターとするアブラナゲノムライブラリー
より、このｃＤＮＡとハイブリダイズするクローンをス
クリーニングした。その結果、１５個のクローンが得ら
れた。これらのクローンのλＤＮＡを精製し、挿入断片
の物理的地図を作製し、これらが９つの部位に由来する
ことが確認された。これらのクローンのうち４種のラム
ダファージクローン、λＰＥ３、λＰＥ１５、λＰＥ１
０５、λＰＥ１９は、サザン分析ならびに塩基配列分析
の結果、互いに若干異なる配列からなるアブラナのＰＥ
ＰＣａｓｅ遺伝子を含むことが明らかとなった。

【００１７】本発明は、これらのゲノムＤＮＡ断片につ
いて、さらに研究を行なった結果、ついに完成されたも
のである。すなわち本発明は、アブラナのＰＥＰＣａｓ
ｅ遺伝子に関するものである。当該遺伝子は、ラムダフ
ァージベクターに組み込まれており、アブラナ植物体よ
り抽出したゲノムＤＮＡから構築されたライブラリーに
由来する。当該遺伝子は、アブラナＰＥＰＣａｓｅの酵
素タンパク質をコードするＤＮＡ配列と、その上流域に
存在し、遺伝子の植物体内での発現制御に関与するプロ
モーター配列とを含む。なお、このように、本発明に係
る遺伝子はラムダファージに組込まれているので、この
ファージを工業技術院微生物工業技術研究所に対して寄
託の申請を行ったが、微工研が行う特許出願に係る微生
物の寄託等に関する規程実施要領の規定により、その寄
託は受理されなかった。

【００１８】本発明のアブラナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の
配列は既に報告のある、トウモロコシ、マツバギク、ラ
ン藻、大腸菌から単離されているＰＥＰＣａｓｅ遺伝子
と相同性が認められたが、同一ではなかった。

【００１９】以下に本発明を実施例に基づき詳細に説明
する。操作の手順は特に記述しない限りＣｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）
に記載されている方法に従った。

【００２０】

【実施例】

【００２１】

【（１）アブラナＰＥＰＣａｓｅの精製】アブラナ登熟
種子（５００ｇ）を粉砕して２リットルの０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６．８、２５ｍＭ塩化マグネシウムを含
む）を加えて良く混合し、その上清を遠心分離によって
回収した。この上清から３０％から５０％の硫酸アンモ
ニウム（硫安）画分を得た。この硫安沈澱物を０．１Ｍ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５、３０％硫安を含む）に溶解
した後、同じ緩衝液を用いてブチルトヨパールカラム
（５×５０ｃｍ）に供してＰＥＰＣａｓｅ活性を溶出し
た。この画分を透析した後、ＤＥＡＥトヨパールカラム
（５×５０ｃｍ）に供した。このカラムよりＰＥＰＣａ
ｓｅ活性を塩化ナトリウム濃度勾配により溶出した。こ
の画分を硫安沈澱させたのち、セファロースＣＬ６Ｂ
（２×９０ｃｍ）を用いてゲル濾過を行なった。この画
分をハイドロキシアパタイトカラム（１×２０ｃｍ）に
供し、５ｍＭから１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．
８）にて溶出した。この様にして均一に精製されたＰＥ
ＰＣａｓｅを得た。

【００２２】

【（２）アブラナＰＥＰＣａｓｅに対する抗体の作製】
以上の方法で得られたアブラナＰＥＰＣａｓｅの１ｍｇ
を２．５ｍｌのアジュバンドと良く混合した後、ウサギ
の表皮に注射した。６０日後に再度同じウサギに同様に
してアブラナＰＥＰＣａｓｅを注射して抗体価を高め
た。この後さらに、６０日たってからこのウサギから血
液を採取し、等量の５０ｍＭクエン酸ナトリウムを加え
てその上清を抗体として用いた。

【００２３】

【（３）アブラナ登熟種子からのポリＡ ＲＮＡの調
製】登熟期のアブラナ種子をすぐさま液体窒素に投入し
て凍結し、使用まで−１３５度で保存した。このアブラ
ナ種子（５０ｇ）を液体窒素の存在下で乳鉢を用いて粉
末状になるまで破砕した。これに２００ｍｌの抽出緩衝
液（２０ｍＭのバナジルコンプレックス、２％ＳＤＳ、
トリス塩酸（ｐＨ８．０））を加えて、すぐさま５００
×ｇで遠心してその上清を回収した。この上清に等量の
フェノール−トリス（ｐＨ８．０）を加えて、約１０分
間攪拌した後２００×ｇで遠心してその上清を回収し
た。この上清に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．５）及び２倍量のエタノールを加えて−２０℃で
３０分間置いた。これを２０００×ｇで遠心して核酸の
沈澱を集めた。これを５ｍｌのトリス緩衝液に溶解した
後、等量のフェノール−トリスを加えて１０分間攪拌し
た。この上清を遠心で回収して、このフェノール抽出の
操作を５回繰り返した。得られた上清をエタノールで沈
澱させ、このＲＮＡを蒸留水に溶解し、ＲＮＡ濃度が１
ｍｇ／ｍｌ、塩化リチウム濃度が２Ｍになるようにした
後、氷上で８時間静置した。これを２０００×ｇで遠心
して沈澱を回収した。このＲＮＡ沈澱を蒸留水に溶解し
た。ポリＡＲＮＡの調製はオリゴｄＴスピンカラム（フ
ァルマシア社製）を用いてこのカラムの使用説明書に従
って行なった。１００μｇのポリＡ ＲＮＡを得ること
ができた。

【００２４】

【（４）ｃＤＮＡライブラリーの作製】上記の方法で得
たポリＡ ＲＮＡを５μｇ用い、ｃＤＮＡ合成キット
（ファルマシア社製）を用い、このキットの説明書にし
たがってｃＤＮＡを合成した。このキットによるｃＤＮ
Ａ合成では合成されたｃＤＮＡの両末端にＥｃｏＲＩア
ダプターをライゲーションキット（宝酒造社製）を用い
てその説明書にしたがって連結反応を行なった。この様
にして得られたλＤＮＡをパッケージングキット（スト
ラタジーン社製）を用いてそのキットの説明書にしたが
ってファージ粒子を再構成させ、ｃＤＮＡライブラリー
とした。このライブラリーをスクリーニングする前に、
このライブラリーに含まれる全てのファージを大腸菌Ｙ
１０８８株に感染させ、これを４２℃で寒天培地上に培
養して、６時間後に出現したファージプラークからファ
ージをＳＭ溶液を用いて回収した。この回収液にクロロ
ホルムを少量加えて４℃で保存した。以下のスクリーニ
ングではこのファージ液をｃＤＮＡライブラリーとして
用いた。

【００２５】

【（５）ｃＤＮＡのスクリーニング】以上のようにして
得られたｃＤＮＡライブラリーに含まれるファージ液の
一部を大腸菌（Ｙ１０９０株）と混合して３７℃で１５
分間培養することによってファージを大腸菌に感染させ
た。これを５０℃で溶解した１０ｍｌの軟寒天と混合し
てからＬＢ寒天培地（直径１５ｃｍのシャーレ）に重層
させ、軟寒天を固めた。この際一枚のシャーレ当り１０
万個のプラークが生じるように大腸菌とファージの量を
調節した。この様にして調製した１０枚のシャーレを３
時間４２℃で培養後１０ｍＭのＩＰＴＧ溶液をしみこま
せてから乾燥しておいたニトロセルロースフィルターを
寒天培地上にかぶらせさらに３時間３７℃で培養を行な
った。その後、これらのフィルターを注意深く寒天培地
から剥し、１％のＢＳＡ溶液に１６時間浸した。ＰＥＰ
Ｃａｓｅのウサギ抗体（０．１ｍｌ）を１００ｍｌのＢ
ＳＡ溶液に加えて混合した後、この溶液に先のフィルタ
ーを浸して緩く揺すりながら室温で１時間抗体と反応さ
せた。発色反応はアルカリフォスファターゼを用いる２
次抗体法のキット（プロメガ社、ピコブルー）をその説
明書にしたがって行なった。フィルター上に現われた６
個の紫色のスポットの位置をそのフィルターが由来する
寒天培地と照らし合わせて対応する位置のファージを１
ｍｌのＳＭ溶液に回収した。これらの６種のファージ液
には目的以外のファージが多数混入しているので、今度
はシャーレ当り約１００のファージのプラークが生じる
ように寒天培地に撒いて同様にしてそれぞれのファージ
液から紫色のスポットを与えるファージのプラークを回
収した（２次スクリーニング）。さらに同様にして３次
スクリーニングを行ない、最終的に６個のファージを得
た。

【００２６】

【（６）塩基配列の決定】この様にして得られた６種の
ファージからＧｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒの方法（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，６７３７（１９
８７））にしたがって、λＤＮＡをそれぞれ調製した。
このλＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化してから既に
ＥｃｏＲＩで消化して末端をアルカリフォスファターゼ
処理を施したプラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ｐＫＳ＋（ストラタジーン社製）とライゲーションキ
ット（宝酒造社製）の説明書にしたがって連結した。こ
れを用いて大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株）を形質転換し
た。得られたコロニーからプラスミドを調製して各種の
制限酵素で消化してそれぞれの物理的地図を作成した。
これらを比較して、２種のほぼ全長と思われるｃＤＮＡ
を見いだした。これらをｐＲＰＣ１及びｐＲＰＣ１６と
名付けた。これらは類似した物理的地図を示すが、ｐＲ
ＰＣ１の方がおよそ０．１ｋｂ長かった。そこで、ｐＲ
ＰＣ１の塩基配列を決定するために、挿入断片をｐＵＣ
１１８にサブクローニングした。これらをプロメガ社の
イレース・ベース・キットを用いてその説明書にしたが
ってデレーションクローンを作成した。これらのクロー
ンから一本鎖ＤＮＡを調製して、ジデオキシ法により塩
基配列を決定した。この結果、ｐＲＰＣ１には翻訳開始
点が含まれていたので、全長のｃＤＮＡインサートを有
することが明らかとなった（配列表）。

【００２７】

【（７）アブラナのゲノムＤＮＡの調製とゲノムライブ
ラリーの構築】アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃｓ ｎａｐｕ
ｓ）のゲノムＤＮＡは、ＲｏｇｅｒｓとＢｅｎｄｉｃｈ
の方法（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５，６９
（１９８５））に従って調製した。得られたＤＮＡを制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩで限定分解し、さらにショ糖密度勾
配遠心分離を行なって、１０ｋｂ以上のＤＮＡ断片を得
た。これをＢａｍＨＩで切断したλＥＭＢＬ３ファージ
ベクターのアームと連結後、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケー
ジングキット（ストラタジーン社製、ＧＩＧＡＰＡＣＫ
Ｇｏｌｄ）を用いて、パッケージングを行ない、大腸
菌ＬＥ３９２株に感染させることによって、多数の組換
えλファージを得た。これをアブラナのゲノムＤＮＡラ
イブラリーとした。ライブラリーの大きさは１．９×１
０⁶であった。

【００２８】

【（８）アブラナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子のゲノムクロー
ンの単離】前記アブラナのゲノムライブラリーの中の１
００．０００個のプラークを対象に、前述のアブラナＰ
ＥＰＣａｓｅのｃＤＮＡ（ｐＲＰＣ１）をプローブとし
て用いて、アブラナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子のスクリーニ
ングを行なった。この結果、１５個の陽性を示すゲノム
クローンが得られた。これらゲノムクローンのＤＮＡを
調製し、挿入断片の大きさを調査した。また、それぞれ
のゲノムクローンのＤＮＡに対して、アブラナＰＥＰＣ
ａｓｅのｃＤＮＡをプローブとするサザン分析を行な
い、ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子を含むかどうかの検定を行な
った。アブラナＰＥＰＣａｓｅのｃＤＮＡの５′端部分
（下記の表１５〜表２３に示される配列表の配列番号２
に示すｃＤＮＡの塩基配列の１６１番目から８７０番目
までの塩基配列に対応する）、あるいは３′端部分（同
配列表の配列番号２に示すｃＤＮＡの塩基配列の１０３
７番目から１６４８番目までの塩基配列に対応する）を
プローブとしたサザン分析を行なった。その結果、λＰ
Ｅ３、λＰＥ１５、λＰＥ１０５、λＰＥ１９の４つの
ゲノムクローンは、両方のプローブともに強くハイブリ
ダイズした。このことから、４つのゲノムクローンには
アブラナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子が含まれることが示唆さ
れた。なお、これらのプローブはｃＤＮＡを用いてＰＣ
Ｒによって調製した。

【００２９】

【表１５】

【００３０】

【表１６】

【００３１】

【表１７】

【００３２】

【表１８】

【００３３】

【表１９】

【００３４】

【表２０】

【００３５】

【表２１】

【００３６】

【表２２】

【００３７】

【表２３】

【００３８】

【（９）アブラナのゲノムクローンの物理的地図の作成
とサブクローニング】λＰＥ３、λＰＥ１５、λＰＥ１
０５、λＰＥ１９の４つのアブラナのゲノムクローンそ
れぞれについて、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＸｈｏＩを用いて、物理的地図を作成した（図
１）。さらに、アブラナＰＥＰＣａｓｅのｃＤＮＡをプ
ローブするサザン分析を行なって、それぞれのクローン
において、アブラナのＰＥＰＣａｓｅ遺伝子を含むと考
えられるＤＮＡ断片を特定し、それらをプラスミドＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐＳＫ＋にサブクローニングした。

【００３９】

【（１０）アブラナのゲノムクローンの塩基配列の決
定】λＰＥ３、λＰＥ１５、λＰＥ１０５、λＰＥ１９
の４つのアブラナのゲノムクローンに由来するサブクロ
ーンを対象に、挿入断片の塩基配列の決定を試みた。

【００４０】まず、デレーションキット（宝酒造社製）
を用いて、挿入断片を段階的に欠失させた一連のデレー
ションクローンの作成を行なった。この操作で得られた
デレーションクローンを用いて塩基配列の決定を行なっ
た。

【００４１】得られた塩基配列を、前述のｃＤＮＡと比
較したところ、λＰＥ３の塩基配列が対応した。しかし
他のいずれのクローンにも相同性がみられた。従って、
これらがすべてアブラナのＰＥＰＣａｓｅ遺伝子である
ことが確認された。しかし、４クローンの塩基配列は同
一ではなかったので、それらは互いに異なるＰＥＰＣａ
ｓｅ酵素タンパク質をコードする遺伝子であるものと考
えられた。

【００４２】これらの内、λＰＥ３クローンに含まれる
アブラナのＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の全領域の塩基配列を
決定した（下記の表１〜表１４に示される配列表の配列
番号１にその結果を示す）。

【００４３】

【表１】

【００４４】

【表２】

【００４５】

【表３】

【００４６】

【表４】

【００４７】

【表５】

【００４８】

【表６】

【００４９】

【表７】

【００５０】

【表８】

【００５１】

【表９】

【００５２】

【表１０】

【００５３】

【表１１】

【００５４】

【表１２】

【００５５】

【表１３】

【００５６】

【表１４】

【００５７】前述のＰＥＰＣａｓｅのｃＤＮＡとの比較
を行なった結果、λＰＥ３クローンのＰＥＰＣａｓｅ遺
伝子は、いくつかのイントロンによってＰＥＰＣａｓｅ
酵素タンパク質のコード域が分断された構造を有するこ
とが明らかとなった。しかし、この遺伝子ではエキソン
７と８が融合していた。

【００５８】また、他のλＰＥ１５、λＰＥ１０５、λ
ＰＥ１９の３つのゲノムクローンに含まれるアブラナＰ
ＥＰＣａｓｅ遺伝子についても、同様に大部分の塩基配
列を決定し、比較を行なった。その結果、それぞれのア
ブラナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子は、塩基配列レベルで高い
相同性がみられた。エキソン、イントロン構造は図に示
すようにクローンによって異なり、λＰＥ１５とλＰＥ
１０５ではエキソン３と４が融合し、また、エキソン７
と８の間にイントロンが存在していた。一方、λＰＥ１
９にはイントロン３および７が存在し、トウモロコシの
遺伝子と類似のエキソン、イントロン構造を有してい
た。それぞれのエキソンの長さはすべてのクローンの間
で差はみられなかった（図２）。なお、λＰＥ１５はＮ
−末端領域の配列が欠如していることが判明した。

【００５９】また、アミノ酸配列レベルでは８０％を越
える相同性がみられたので、実質的に同じ酵素蛋白質を
コードしているものと考えられた。図３〜図８に１例と
してλＰＥ１０５のエキソン２以下の塩基配列とそれに
コードされているアミノ酸配列を示す。したがって、こ
れらのクローンにのっているＰＥＰＣａｓｅ遺伝子は、
λＰＥ３クローンとは若干異なっているものの、等しく
ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子であることが明らかとなった。

【００６０】また、図９及び図１０、図１１（図９にお
ける１文字表示を３文字表示にしたもの）には、それぞ
れのクローンにコードされているエキソン１０に対応す
る部分のアミノ酸配列の比較を示す。エキソン１０は蛋
白質のカルボキシル末端に相当する。一般に同じ機能を
有する蛋白間でもカルボキシル末端での配列は保存され
ていないことが多いが、このＰＥＰＣａｓｅの場合、こ
の部分においても非常によく保存されていた。

【００６１】

【（１１）プロモーター配列の単離】λＰＥ３ゲノムク
ローンのアブラナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子は、ＰＥＰＣａ
ｓｅ酵素タンパク質をコードする領域の上流に、植物体
内での遺伝子の発現を制御するプロモーター配列を有す
る。このプロモーター配列は、制限酵素ＢｇｌIIとＮｃ
ｏＩでλＰＥ３クローンのＤＮＡを切断することによ
り、約９００塩基のＤＮＡ断片として単離される。その
約９００塩基のＤＮＡ断片のみをプラスミドＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ｐＳＫ＋にサブクローニングして、プロモ
ーター配列のクローンを取得した。

【００６２】

【（１２）ＰＥＰＣａｓｅの発現の制御】アブラナＰＥ
ＰＣａｓｅ遺伝子の酵素タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａ配列を用いて、アンチセンスＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の
構築を行なった。このＤＮＡ配列をバイナリーベクター
ｐＢ１１２１（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７（１９
８７））のＳｍａＩサイトに挿入し、ＰＥＰＣａｓｅ酵
素タンパク質をコードするｍＲＮＡと相補的な転写物Ｒ
ＮＡを合成し得るものを選択し、アンチセンスＰＥＰＣ
ａｓｅ遺伝子（ｐＢＰＡ３）とした（図１２）。

【００６３】さらに、このアンチセンスＰＥＰＣａｓｅ
遺伝子を導入した形質転換タバコを、アグロバクテリウ
ムを介した遺伝子導入法（Ｒ．Ｂ．Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８
５））によって作成した。形質転換タバコは、ＰＥＰＣ
ａｓｅの活性が低下し、アンチセンスＰＥＰＣａｓｅ遺
伝子によって、ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の発現が抑制され
ていることを示した。

【００６４】

【発明の効果】本発明によって得られたアブラナのＰＥ
ＰＣａｓｅ遺伝子は、アブラナの当該酵素タンパク質の
全領域をコードしている。従って、この遺伝子をそのま
ま、あるいはカリフラワーモザイクウイルス由来のプロ
モーターなどと結合することによってつくられた人工的
な遺伝子の発現系を用いて、電気的穿孔法あるいはアグ
ロバクテリウムを利用した方法などによって、イネ、タ
バコなどの植物に導入することが可能である。その結果
得られる形質転換植物体において、ＰＥＰＣａｓｅの酵
素活性を増大させることが可能である。

【００６５】また、配列表に示すアブラナから得られた
ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の全部あるいはその一部のＤＮＡ
配列を用いて、ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子に対するアンチセ
ンス遺伝子の構築が可能である。これを植物細胞に導入
することによってＰＥＰＣａｓｅ活性を抑えることが可
能である。

【００６６】前述したように、ＰＥＰＣａｓｅは、グル
コースからホスホエノールビルピン酸に至る解糖系と、
生物が大量にエネルギーを得ているＴＣＡサイクルとを
つなぐ反応を触媒している。ＴＣＡサイクルに入った代
謝物は、貯蔵タンパク質の合成にもつながるので、ＰＥ
ＰＣａｓｅ活性を強めた場合には、タンパク質合成が結
果的には促進される。逆に、このＰＥＰＣａｓｅ活性を
抑えることによって、相対的に脂肪酸合成を促進し、油
脂成分の生産量の増大をはかることができるものと思わ
れる。すなわち、植物のＰＥＰＣａｓｅ活性を人為的に
操作することによって、タンパク質合成あるいは油脂合
成の効率を変えることが可能となった。

【００６７】特に、アブラナは油脂をつくる作物として
非常に有用である。本発明のアブラナ由来のＰＥＰＣａ
ｓｅ遺伝子を用いる分子育種的手法によって、油脂成分
を増大させることは非常に高い経済効果が期待される。

【００６８】さらに、本発明のＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の
塩基配列を基に、部位特異的置換法あるいはＰＣＲ法な
どの手法を用いて、この塩基配列の一部を特異的に変異
させて、ＰＥＰＣａｓｅを人工的に改変することが可能
である。これは、ＰＥＰＣａｓｅの機能向上を求める研
究に用いることができる。また、同時に酵素タンパク質
の機能発現に関する幅広い研究にも用いることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】アブラナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子のゲノムクロー
ン、λＰＥ３、λＰＥ１５、λＰＥ１０５、およびλＰ
Ｅ１９の物理的地図を示す。それぞれのゲノムクローン
において、上段に示す線は、ラムダファージベクター挿
入断片の全領域を示す。物理的地図は、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩを用いて作成し
た。また、ＰＥＰＣａｓｅ酵素タンパク質のコード域
を、それぞれの物理的地図の下段に四角で示した。

【図２】ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子のイントロン、エキソン
構造の比較図である。アブラナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の
ゲノムクローン、λＰＥ３、λＰＥ１５、λＰＥ１０
５、およびλＰＥ１９にのっているＰＥＰＣａｓｅをコ
ードする領域のエキソン、イントロンの関係を示す。エ
キソンを四角で示す。番号はエキソン番号である。それ
ぞれのエキソンの長さは四角の大きさに対応する。イン
トロンは棒線で示す。

【図３】アブラナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子のゲノムクロー
ンλＰＥ１０５のエキソン２以下の塩基配列とそれにコ
ードされているアミノ酸配列からなる配列を示す。

【図４】同配列の続きの配列を示す。

【図５】同配列の続きの配列を示す。

【図６】同配列の続きの配列を示す。

【図７】同配列の続きの配列を示す。

【図８】同配列の続きの配列を示す。なお、これらの図
において、塩基配列の中で未決定のものはＮで示し、ア
ミノ酸配列の中で決定できなかったものは？？？で示し
た。

【図９】エキソン１０領域の構造比較図である。アブラ
ナＰＥＰＣａｓｅ遺伝子のゲノムクローン、λＰＥ３、
λＰＥ１５、λＰＥ１０５、およびλＰＥ１９のＰＥＰ
Ｃａｓｅのエキソン１０部分のアミノ酸配列を並列し
た。アミノ酸配列は１文字表記した。ギャップは相同性
を極大化するために導入した。λＰＥ３のＰＥＰＣａｓ
ｅと相同なアミノ酸残基は下線で示した。

【図１０】図９におけるアミノ酸配列を１文字表記では
なく３文字表記した図面である。なお、「−」で示すも
のは、相同性を高めるために導入したギャップである。

【図１１】図１０の続きである。

【図１２】アンチセンスＰＥＰＣａｓｅ遺伝子ベクター
を示す。上段の線は、ＰＥＰＣａｓｅのｃＤＮＡの物理
的地図を示す。このｃＤＮＡ配列を用いて、アンチセン
スＰＥＰＣａｓｅ遺伝子ベクター（ｐＢＰＡ３）を構築
した。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１及び同２に示すホス
   ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの１〜９６４番
   目のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示すホスホエノー
   ルピルビン酸カルボキシラーゼの１〜８９２番目に塩基
   配列に含まれるプロモーター部位。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の遺伝子の全部あるいは
   一部をプローブとして釣り出したアブラナのホスホエノ
   ールピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列を含む遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項１〜請求項３のいずれか１項で規
   定されるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺
   伝子の植物体内での発現を抑制し、植物体内でのホスホ
   エノールピルビン酸カルボキシラーゼの合成量に変化を
   もたらすよう構築されてなる、アンチセンスホスホエノ
   ールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子。