JPH0691816B2 - Ｆｋ−５０６の新規な製造方法 - Google Patents
Ｆｋ−５０６の新規な製造方法Info
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- JPH0691816B2 JPH0691816B2 JP4011794A JP1179492A JPH0691816B2 JP H0691816 B2 JPH0691816 B2 JP H0691816B2 JP 4011794 A JP4011794 A JP 4011794A JP 1179492 A JP1179492 A JP 1179492A JP H0691816 B2 JPH0691816 B2 JP H0691816B2
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- culture
- fermentation
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/445—The saccharide radical is condensed with a heterocyclic radical, e.g. everninomycin, papulacandin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
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Description
【０００１】本発明は微生物、ストレプトミセス種（Ｍ
Ａ ６８５８）ＡＴＣＣ No. ５５０９８を利用して免
疫抑制剤、ＦＫ−５０６を製造するための新規な製造方
法に関するものである。１９８３年にアメリカ合衆国食
品医薬品局（ＵＳ ＦＤＡ）は臓器移植手術の分野に大
変革をもたらした極めて有用な抗拒絶反応薬、シクロス
ポリンを認可した。本薬は移植された異種蛋白質を拒絶
するために体内の免疫システムが広大に蓄積された天然
防御物質を起動させるのを阻止する働きがある。本薬は
移植拒絶反応に対抗するには有用であるが、多くの場合
極めて重症となることがある腎臓機能不全、肝臓損傷及
び潰瘍を起す欠点がある。
Ａ ６８５８）ＡＴＣＣ No. ５５０９８を利用して免
疫抑制剤、ＦＫ−５０６を製造するための新規な製造方
法に関するものである。１９８３年にアメリカ合衆国食
品医薬品局（ＵＳ ＦＤＡ）は臓器移植手術の分野に大
変革をもたらした極めて有用な抗拒絶反応薬、シクロス
ポリンを認可した。本薬は移植された異種蛋白質を拒絶
するために体内の免疫システムが広大に蓄積された天然
防御物質を起動させるのを阻止する働きがある。本薬は
移植拒絶反応に対抗するには有用であるが、多くの場合
極めて重症となることがある腎臓機能不全、肝臓損傷及
び潰瘍を起す欠点がある。
【０００２】ここに引用して組み入れるフジサワ（Fuji
sawa) に対するアメリカ合衆国特許（ＵＳＰ）４，８９
４，３６６及びヨーローパ特許局（ＥＰＯ）公報No. ０
１８４１６２はシクロスポリンより１００倍有効である
と評される新規なマクロライド免疫抑制剤、ＦＫ−５０
６について記述している。本マクロライドはストレプト
ミセスの単型種であるストレプトミセス・ツクバエンシ
ス（Streptomyces tsukubaensis)の発酵によって製造さ
れる。シクロスポリンの副作用を持たないこれらの免疫
抑制剤、特にＦＫ−５０６の製造方法又は製造用微生物
は常に本分野で探索されている。
sawa) に対するアメリカ合衆国特許（ＵＳＰ）４，８９
４，３６６及びヨーローパ特許局（ＥＰＯ）公報No. ０
１８４１６２はシクロスポリンより１００倍有効である
と評される新規なマクロライド免疫抑制剤、ＦＫ−５０
６について記述している。本マクロライドはストレプト
ミセスの単型種であるストレプトミセス・ツクバエンシ
ス（Streptomyces tsukubaensis)の発酵によって製造さ
れる。シクロスポリンの副作用を持たないこれらの免疫
抑制剤、特にＦＫ−５０６の製造方法又は製造用微生物
は常に本分野で探索されている。
【０００３】本発明を要約すると、免疫抑制剤、ＦＫ−
５０６（ＦＲ−９００５０６）は、窒素栄養分を含む液
体炭水化物培地中液面下の好気的条件で、約７のpHで実
施する本微生物、ストレプトミセス種、ＡＴＣＣ No.
５５０９８の発酵により得ることができる。製造された
化合物は欧州特許公報No. ０１８４１６２に記述された
ＦＫ−５０６（ＦＲ−９００５０６）の全ての物理的及
び化学的特徴を持ち、且つ示している。この発明に従っ
て、ストレプトミセス種、（ＭＡ ６８５８）ＡＴＣＣ
No.５５０９８、又は公知の手法で作成されるその変
異株を窒素栄養物を含む液体炭水化物培地中液面下の好
気的発酵条件下でＦＫ−５０６を生産するのに十分な時
間、培養する工程からなる、ＦＫ−５０６として同定さ
れた免疫抑制剤の製造方法を提供する。また、微生物学
的に純粋型である新規な微生物、ストレプトミセス種、
（ＭＡ６８５８）ＡＴＣＣ No. ５５０９８を提供す
る。
５０６（ＦＲ−９００５０６）は、窒素栄養分を含む液
体炭水化物培地中液面下の好気的条件で、約７のpHで実
施する本微生物、ストレプトミセス種、ＡＴＣＣ No.
５５０９８の発酵により得ることができる。製造された
化合物は欧州特許公報No. ０１８４１６２に記述された
ＦＫ−５０６（ＦＲ−９００５０６）の全ての物理的及
び化学的特徴を持ち、且つ示している。この発明に従っ
て、ストレプトミセス種、（ＭＡ ６８５８）ＡＴＣＣ
No.５５０９８、又は公知の手法で作成されるその変
異株を窒素栄養物を含む液体炭水化物培地中液面下の好
気的発酵条件下でＦＫ−５０６を生産するのに十分な時
間、培養する工程からなる、ＦＫ−５０６として同定さ
れた免疫抑制剤の製造方法を提供する。また、微生物学
的に純粋型である新規な微生物、ストレプトミセス種、
（ＭＡ６８５８）ＡＴＣＣ No. ５５０９８を提供す
る。
【０００４】以下本発明を詳細に説明する。本発明はＦ
Ｋ−５０６を生産するためのストレプトミセス種（ＭＡ
６８５８）ＡＴＣＣ No. ５５０９８の発酵を含むも
のである。本微生物は現在、メリーランド州ロックビル
のパークローン・ドライブ１２３０１にあるアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection) にＡＴＣＣ No. ５５０９８とし
て限定寄託されている。その微生物学的特徴を簡単に以
下に記述する。これらのデータに基づいて、本微生物は
ストレプトミセス属の菌として同定されている。
Ｋ−５０６を生産するためのストレプトミセス種（ＭＡ
６８５８）ＡＴＣＣ No. ５５０９８の発酵を含むも
のである。本微生物は現在、メリーランド州ロックビル
のパークローン・ドライブ１２３０１にあるアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection) にＡＴＣＣ No. ５５０９８とし
て限定寄託されている。その微生物学的特徴を簡単に以
下に記述する。これらのデータに基づいて、本微生物は
ストレプトミセス属の菌として同定されている。
【０００５】下記はストレプトミセス種、菌株 ＭＡ
６８５８、ＡＴＣＣNo. ５５０９８の一般的記述であ
る。ＭＡ−６８５８ −発育、一般的な培養特徴及び炭素源利
用の観察はシャーリング（Shirling) 及びゴットリーブ
（Gottleib) の方法（インターナショナル・ジャーナル
・オブ・システム・バクテリオロジー（Internat. J. S
ystem．Bacteriol. １６巻：３１３−３４０頁）に従っ
て実施した。細胞の化学的組成はレチェバリアー（Lech
evalier)及びレチェバリアー（Lechevalier)の方法（放
線菌分類学（Actinomycete Taxonomy)、エイ・キーツ
（A. Kietz) 及びディ・ダブリュ・サイヤー（D. W. Th
ayer) 、産業微生物学会（Societyfor Industrial Micr
obiology)出版、１９８０年）を使用して測定した。培
養物の色調は国際学会色調協議会−国立標準局セントロ
イド・カラー・テャート（米国商務省国立標準局の国立
標準局回状５５３に対する補足、１９８５年）に含まれ
る色調標準と比較して測定した。本菌株のＤＮＡ−ＤＮ
Ａ相同性はクルツマン（Kurtman)等（インターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・システム・バクテリオロジー
（Int. J. Syst. Bacteriol)、３０巻：２０８−２１６
頁）により記述された方法で測定した。由来−ＭＡ ６８５８ −この培養菌はバージニア州モン
ゴメリー郡ポバティ・クリーク・ドレインネッジのオジ
ロジカの糞から分離された。細胞膜組成の分析−ＭＡ ６８５８ −ペプチドグリカン
はＬ−ジアミノピメリン酸を含む。全細胞炭水化物分析
ではグルコースが示された。
６８５８、ＡＴＣＣNo. ５５０９８の一般的記述であ
る。ＭＡ−６８５８ −発育、一般的な培養特徴及び炭素源利
用の観察はシャーリング（Shirling) 及びゴットリーブ
（Gottleib) の方法（インターナショナル・ジャーナル
・オブ・システム・バクテリオロジー（Internat. J. S
ystem．Bacteriol. １６巻：３１３−３４０頁）に従っ
て実施した。細胞の化学的組成はレチェバリアー（Lech
evalier)及びレチェバリアー（Lechevalier)の方法（放
線菌分類学（Actinomycete Taxonomy)、エイ・キーツ
（A. Kietz) 及びディ・ダブリュ・サイヤー（D. W. Th
ayer) 、産業微生物学会（Societyfor Industrial Micr
obiology)出版、１９８０年）を使用して測定した。培
養物の色調は国際学会色調協議会−国立標準局セントロ
イド・カラー・テャート（米国商務省国立標準局の国立
標準局回状５５３に対する補足、１９８５年）に含まれ
る色調標準と比較して測定した。本菌株のＤＮＡ−ＤＮ
Ａ相同性はクルツマン（Kurtman)等（インターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・システム・バクテリオロジー
（Int. J. Syst. Bacteriol)、３０巻：２０８−２１６
頁）により記述された方法で測定した。由来−ＭＡ ６８５８ −この培養菌はバージニア州モン
ゴメリー郡ポバティ・クリーク・ドレインネッジのオジ
ロジカの糞から分離された。細胞膜組成の分析−ＭＡ ６８５８ −ペプチドグリカン
はＬ−ジアミノピメリン酸を含む。全細胞炭水化物分析
ではグルコースが示された。
【０００６】一般的発育特徴−本菌は酵母・麦芽エキス
寒天培地（ＹＭＥ）、無機塩・澱粉寒天培地、ペプトン
・鉄寒天培地及びオートミール寒天培地で良好に発育す
る。グリセリン・アスパラギン寒天培地、ツァペック寒
天培地、トリプチケース大豆寒天培地及びＮＺ−アミン
（シェフィールド・ケミカル社（Sheffield Chemical C
o.))で補足した水道水寒天培地で中程度の発育である。
水道水寒天培地では貧弱な発育である。同様にトリプト
ン・酵母エキス・ブロスでも発育する。２７℃で生育す
るが３７℃では生育しない。コロニーの形態 −（２１日間のＹＭＥ寒天培地で）基底
菌糸は中間の黄褐色である。気菌糸は白色である。胞子
塊は存在する場合、黄白色から明るい灰色である。コロ
ニーは不透明で、隆起し、全縁ないし裂片状縁を有し、
粗いテクスチャーで弾性のある硬さである。微細構造 −気菌糸（０．７２μｍ）は基底菌糸から房と
なって発生し、枝分かれして屈曲性がある。菌核は本培
養物がＹＭＥ又はオートミール寒天培地で発育した時に
気菌糸集合体に観察される。成熟した培養物では７−２
８日で気菌糸の末端が胞子の屈曲した鎖となるものがあ
る。胞子形成はＹＭＥ、無機塩−澱粉寒天培地で起こ
る。胞子の鎖は繊維状の鞘に入っており、最終には頂部
で“結び目状”構造となるものもある。この特徴はツァ
ペック寒天培地で最も顕著であり、未成熟培養物では胞
子嚢状小嚢のように見えることがある。
寒天培地（ＹＭＥ）、無機塩・澱粉寒天培地、ペプトン
・鉄寒天培地及びオートミール寒天培地で良好に発育す
る。グリセリン・アスパラギン寒天培地、ツァペック寒
天培地、トリプチケース大豆寒天培地及びＮＺ−アミン
（シェフィールド・ケミカル社（Sheffield Chemical C
o.))で補足した水道水寒天培地で中程度の発育である。
水道水寒天培地では貧弱な発育である。同様にトリプト
ン・酵母エキス・ブロスでも発育する。２７℃で生育す
るが３７℃では生育しない。コロニーの形態 −（２１日間のＹＭＥ寒天培地で）基底
菌糸は中間の黄褐色である。気菌糸は白色である。胞子
塊は存在する場合、黄白色から明るい灰色である。コロ
ニーは不透明で、隆起し、全縁ないし裂片状縁を有し、
粗いテクスチャーで弾性のある硬さである。微細構造 −気菌糸（０．７２μｍ）は基底菌糸から房と
なって発生し、枝分かれして屈曲性がある。菌核は本培
養物がＹＭＥ又はオートミール寒天培地で発育した時に
気菌糸集合体に観察される。成熟した培養物では７−２
８日で気菌糸の末端が胞子の屈曲した鎖となるものがあ
る。胞子形成はＹＭＥ、無機塩−澱粉寒天培地で起こ
る。胞子の鎖は繊維状の鞘に入っており、最終には頂部
で“結び目状”構造となるものもある。この特徴はツァ
ペック寒天培地で最も顕著であり、未成熟培養物では胞
子嚢状小嚢のように見えることがある。
【０００７】種々の生理学的反応−培養物はペプトン−
鉄寒天培地でＨ2 Ｓを生産するが、メラノイド色素は生
産しない。炭素源の利用パターンは下記のようである：
β−Ｄ−乳糖、Ｄ−マンノースを良好に利用する；セロ
ビオース、Ｄ−フラクトース、α−Ｄ−乳糖を適度に利
用する；Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ラ
フィノース、Ｌ−ラムノースをあまり利用しない；Ｄ−
アラビノース、イノシトール、Ｄ−マルトース、蔗糖、
Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロースを利用しない。ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性 −ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性の研究は
この種の化合物を生産することで知られる３種のストレ
プトミセス菌株、（ＭＡ ６４９２ ストレプトミセス
・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis)、ＦＫ
−５０６特許菌株（ＥＰＯ ０１８４１６２参照）；Ｍ
Ａ ６５３１ ストレプトミセス・ハイグロスコピクス
亜種ヤクシマエンシス（Streptomyces hygroscopicus s
ubsp. yakushimaensis) 、ＦＫ−５２０／ＦＫ−５２３
特許菌株（ＥＰＯ ０１８４１６２参照）；ＭＡ ６４
７５ ストレプトミセス・ハイグロスコピクス亜種アス
コミセチクス（Streptomyces hygroscopicus subsp. as
comyceticus)、ＦＫ−５２０生産菌株（ＵＳＰ ３，２
４４，５９２参照）を使用して実施した。これらの実験
ではＭＡ ６８５８がこれらの３種の菌株（Ｔｍ−２５
ＣでＭＡ ６４９２−５４％、ＭＡ ６５３１−５２
％、ＭＡ ６４７５−４８％）の中間レベルの相同性を
示すことがわかった。更に、再会合運動力学ではＭＡ
６８５８のゲノムが大きさではＭＡ ６５３１及びＭＡ
６４７５に匹敵するがＭＡ ６４９２よりも約３０％
大きいことが示されている。
鉄寒天培地でＨ2 Ｓを生産するが、メラノイド色素は生
産しない。炭素源の利用パターンは下記のようである：
β−Ｄ−乳糖、Ｄ−マンノースを良好に利用する；セロ
ビオース、Ｄ−フラクトース、α−Ｄ−乳糖を適度に利
用する；Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ラ
フィノース、Ｌ−ラムノースをあまり利用しない；Ｄ−
アラビノース、イノシトール、Ｄ−マルトース、蔗糖、
Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロースを利用しない。ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性 −ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性の研究は
この種の化合物を生産することで知られる３種のストレ
プトミセス菌株、（ＭＡ ６４９２ ストレプトミセス
・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis)、ＦＫ
−５０６特許菌株（ＥＰＯ ０１８４１６２参照）；Ｍ
Ａ ６５３１ ストレプトミセス・ハイグロスコピクス
亜種ヤクシマエンシス（Streptomyces hygroscopicus s
ubsp. yakushimaensis) 、ＦＫ−５２０／ＦＫ−５２３
特許菌株（ＥＰＯ ０１８４１６２参照）；ＭＡ ６４
７５ ストレプトミセス・ハイグロスコピクス亜種アス
コミセチクス（Streptomyces hygroscopicus subsp. as
comyceticus)、ＦＫ−５２０生産菌株（ＵＳＰ ３，２
４４，５９２参照）を使用して実施した。これらの実験
ではＭＡ ６８５８がこれらの３種の菌株（Ｔｍ−２５
ＣでＭＡ ６４９２−５４％、ＭＡ ６５３１−５２
％、ＭＡ ６４７５−４８％）の中間レベルの相同性を
示すことがわかった。更に、再会合運動力学ではＭＡ
６８５８のゲノムが大きさではＭＡ ６５３１及びＭＡ
６４７５に匹敵するがＭＡ ６４９２よりも約３０％
大きいことが示されている。
【０００８】識別−細胞膜の分析ではＭＡ ６８５８が
タイプＩ細胞膜を持つことが示され、形態学的研究では
本菌株が気菌糸から生ずる直線ないし屈曲性担胞子体上
に胞子を作ることが示されている。これらはストレプト
ミセス菌株に典型的な特徴である。ＭＡ ６８５８の表
現型データと文献に確実に公表されているストレプトミ
セス菌株との比較では、本菌株がストレプトミセス・セ
トニイ（Streptomyces setonii) 及びストレプトミセス
・グーゲロチ（Streptomyces gougeroti) に多少類似性
を持っていることを示しているが、それらの菌株は気菌
糸上に菌核、偽胞子嚢又は他の形態学的組織の何れも作
らないと報告されている。更に、これらの２種の培養菌
株がＤ−グルコースを利用すると報告されているが、Ｍ
Ａ ６８５８は全く少ししか利用しない。下記の表はＭ
Ａ ６８５８の培養上の特徴と炭水化物利用パターンを
記載したものである。
タイプＩ細胞膜を持つことが示され、形態学的研究では
本菌株が気菌糸から生ずる直線ないし屈曲性担胞子体上
に胞子を作ることが示されている。これらはストレプト
ミセス菌株に典型的な特徴である。ＭＡ ６８５８の表
現型データと文献に確実に公表されているストレプトミ
セス菌株との比較では、本菌株がストレプトミセス・セ
トニイ（Streptomyces setonii) 及びストレプトミセス
・グーゲロチ（Streptomyces gougeroti) に多少類似性
を持っていることを示しているが、それらの菌株は気菌
糸上に菌核、偽胞子嚢又は他の形態学的組織の何れも作
らないと報告されている。更に、これらの２種の培養菌
株がＤ−グルコースを利用すると報告されているが、Ｍ
Ａ ６８５８は全く少ししか利用しない。下記の表はＭ
Ａ ６８５８の培養上の特徴と炭水化物利用パターンを
記載したものである。
【０００９】 ストレプトミセス種 ＭＡ ６８５８の２１日目の培養上の特徴 ─────────────────────────────────── 培地 発育量 気菌糸及び／又は胞子 可溶性色素 裏面の色 ─────────────────────────────────── 酵母エキス 良好 気菌糸は黄白色 認められ 中間黄褐色 麦芽エキス （92yWhite) ない (76m.yBr) 胞子は直鎖に発生する。 菌核は気中発育で観察 される。 ─────────────────────────────────── グルコース 中ぐらい 気菌糸は疎生。 明るい アスパラギン 白色(236White)。 認められ 黄褐色 胞子形成は明白ではな ない (73l.yBr) い。 ─────────────────────────────────── 無機塩・澱粉 良好 気菌糸は黄白 認められ 淡い橙黄色 （92yWhite) ない (73p.OY) 胞子は直鎖で発育。 菌核も見られる。澱粉 は活発に加水分解される。 ─────────────────────────────────── オーミール 良好 気菌糸は淡い橙黄色 認められ 明るい (73pOY) 。 ない 橙黄色 胞子は直鎖で発生。 (70l.OY) 菌核は気菌糸体に存在。 ─────────────────────────────────── 水道水 蘇生 気中発育は観察され 認められ ない。 ない ─────────────────────────────────── ツァベック 中くらい 気中発育は観察され 認められ ない。 ない ─────────────────────────────────── ペプトン・鉄 良好 メラニンは 陰性。 H2S は陽性。 ───────────────────────────────────
【００１０】 ストレプトミセス種 ＭＡ ６８５８ の２１日間での炭水化物利用パターン ────────────────────────── 炭素源 利用 ────────────────────────── Ｄ−アラビノース ０ Ｌ−アラビノース １ セロビオース ２ Ｄ−フラクトース ２ イノシトール ０ α−Ｄ−乳糖 ２ β−Ｄ−乳糖 ３ Ｄ−マルトース ０ Ｄ−マンニトール １ Ｄ−マンノース ３ Ｄ−ラフィノース １ Ｌ−ラムノース １ 蔗糖 ０ Ｄ−キシロース ０ Ｌ−キシロース ０ α−Ｄ−グルコース（コントロール） ２ ────────────────────────── ３＝良好な利用 ２＝中ぐらいの利用 １＝殆ど利用しない ０＝利用しない
【００１１】ＭＡ ６８５８とＦＫ−５０６／ＦＫ−５
２０／ＦＫ−５２３を生産することが知られている３種
のストレプトミセス菌株との比較では殆ど全く類似性が
無いことが示されている。ＦＫ−５２０及びＦＫ−５２
３の既知の生産菌株はストレプトミセス・ハイグロスコ
ピクス種連合体の１部である。両菌株は灰色系に属し、
らせん形の担胞子体上に胞子を生産し成熟中に胞子集団
の合体を示す。これらの特徴は明らかにこれらの菌株を
ＭＡ ６８５８と区別するものである。同様にＭＡ ６
８５８とストレプトミセス・ツクバエンシスと比較した
場合もかなりの表現型の相違を示している。ＭＡ ６８
５８は白色又は黄色系に属するがストレプトミセス・ツ
クバエンシスは灰色系に属する。同様に栄養菌糸体の色
調も異なり、ＭＡ ６８５８は橙黄色から中間黄褐色の
範囲でありストレプトミセス・ツクバエンシスは薄桃色
から赤橙色、薄茶色の範囲である。ＭＡ ６８５８は澱
粉を利用しＨ2 Ｓを生産するが、ストレプトミセス・ツ
クバエンシスはそうしない。同様にこれの菌株の炭素源
利用パターンに重要な相違が認められる。ＭＡ６８５８
はＤ−フラクトース、乳糖、ラムノース、ラフィノー
ス、アラビノース及びマンニトールを利用するが、スト
レプトミセス・ツクバエンシスは利用しない。ストレプ
トミセス・ツクバエンシスは蔗糖及びマルトースを利用
するがＭＡ６８５８は利用しない。上記のＤＮＡ−ＤＮ
Ａ相同性の結果はこれらの菌株間の属レベルの関係を示
すものである。しかし、ＭＡ ６８５８はストレプトミ
セス・ハイグロスコピクスの菌株でもなく、ストレプト
ミセス・ツクバエンシスの菌株でもなく、上記の比較分
析に基づく唯一の菌株であると考えられる。
２０／ＦＫ−５２３を生産することが知られている３種
のストレプトミセス菌株との比較では殆ど全く類似性が
無いことが示されている。ＦＫ−５２０及びＦＫ−５２
３の既知の生産菌株はストレプトミセス・ハイグロスコ
ピクス種連合体の１部である。両菌株は灰色系に属し、
らせん形の担胞子体上に胞子を生産し成熟中に胞子集団
の合体を示す。これらの特徴は明らかにこれらの菌株を
ＭＡ ６８５８と区別するものである。同様にＭＡ ６
８５８とストレプトミセス・ツクバエンシスと比較した
場合もかなりの表現型の相違を示している。ＭＡ ６８
５８は白色又は黄色系に属するがストレプトミセス・ツ
クバエンシスは灰色系に属する。同様に栄養菌糸体の色
調も異なり、ＭＡ ６８５８は橙黄色から中間黄褐色の
範囲でありストレプトミセス・ツクバエンシスは薄桃色
から赤橙色、薄茶色の範囲である。ＭＡ ６８５８は澱
粉を利用しＨ2 Ｓを生産するが、ストレプトミセス・ツ
クバエンシスはそうしない。同様にこれの菌株の炭素源
利用パターンに重要な相違が認められる。ＭＡ６８５８
はＤ−フラクトース、乳糖、ラムノース、ラフィノー
ス、アラビノース及びマンニトールを利用するが、スト
レプトミセス・ツクバエンシスは利用しない。ストレプ
トミセス・ツクバエンシスは蔗糖及びマルトースを利用
するがＭＡ６８５８は利用しない。上記のＤＮＡ−ＤＮ
Ａ相同性の結果はこれらの菌株間の属レベルの関係を示
すものである。しかし、ＭＡ ６８５８はストレプトミ
セス・ハイグロスコピクスの菌株でもなく、ストレプト
ミセス・ツクバエンシスの菌株でもなく、上記の比較分
析に基づく唯一の菌株であると考えられる。
【００１２】本発明の方法はストレプトミセス種に属す
る全ての“ＦＫ−５０６−生産”菌株を使用して実施で
きるものであり、特に望ましいのは（ＭＡ ６８５８）
ＡＴＣＣ No. ５５０９８菌株である。一般的にＦＫ−
５０６は、ＦＫ−５０６物質−生産菌株を資化性炭素及
び窒素源を含む液体栄養培地で、望ましくは液面下の好
気的条件（例えば、振盪培養、液面下培養、その他）で
培養（発酵）を行うことにより製造できる。望ましくは
液体培地のpHを発酵工程の最初と終了（収穫）時に約７
−８に維持する。これより高いpHは製造物の実質的な及
び／又は全面的なロスをもたらす。望ましいpHはモルフ
ォリノエタン・スルホン酸（ＭＥＳ）、モルフォリノプ
ロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）及び同類物のような緩衝
物質の使用により、又は以下に記述した生産培地のよう
な本質的に緩衝作用を持つ栄養物質を選択することによ
り維持しても良い。
る全ての“ＦＫ−５０６−生産”菌株を使用して実施で
きるものであり、特に望ましいのは（ＭＡ ６８５８）
ＡＴＣＣ No. ５５０９８菌株である。一般的にＦＫ−
５０６は、ＦＫ−５０６物質−生産菌株を資化性炭素及
び窒素源を含む液体栄養培地で、望ましくは液面下の好
気的条件（例えば、振盪培養、液面下培養、その他）で
培養（発酵）を行うことにより製造できる。望ましくは
液体培地のpHを発酵工程の最初と終了（収穫）時に約７
−８に維持する。これより高いpHは製造物の実質的な及
び／又は全面的なロスをもたらす。望ましいpHはモルフ
ォリノエタン・スルホン酸（ＭＥＳ）、モルフォリノプ
ロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）及び同類物のような緩衝
物質の使用により、又は以下に記述した生産培地のよう
な本質的に緩衝作用を持つ栄養物質を選択することによ
り維持しても良い。
【００１３】栄養培地の望ましい炭素源は、グルコー
ス、キシロース、ガラクトース、グリセリン、澱粉、デ
キストリン及び同類物のような炭水化物である。その他
含まれても良い炭素源はマルトース、ラムノース、ラフ
ィノース、アラビノース、マンノース、サリシン、コハ
ク酸ナトリウム及び同類物である。
ス、キシロース、ガラクトース、グリセリン、澱粉、デ
キストリン及び同類物のような炭水化物である。その他
含まれても良い炭素源はマルトース、ラムノース、ラフ
ィノース、アラビノース、マンノース、サリシン、コハ
ク酸ナトリウム及び同類物である。
【００１４】望ましい窒素源は、アンモニウム塩（例え
ば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモ
ニウム、その他）、尿素、アミノ酸、及び同類物のよう
な無機及び有機窒素化合物ばかりでなく、酵母エキス、
肉エキス、ペプトン、グルテン・ミール、綿実ミール、
大豆ミール及びその他の植物性ミール（部分又は全脱脂
のもの）、カゼイン加水分解物、大豆加水分解物及び酵
母加水分解物、コーン・スチープ・リカー、乾燥酵母、
小麦胚芽、羽毛ミール、ピーナツ粉、ジスチルド・ソリ
ュブル、その他である。
ば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモ
ニウム、その他）、尿素、アミノ酸、及び同類物のよう
な無機及び有機窒素化合物ばかりでなく、酵母エキス、
肉エキス、ペプトン、グルテン・ミール、綿実ミール、
大豆ミール及びその他の植物性ミール（部分又は全脱脂
のもの）、カゼイン加水分解物、大豆加水分解物及び酵
母加水分解物、コーン・スチープ・リカー、乾燥酵母、
小麦胚芽、羽毛ミール、ピーナツ粉、ジスチルド・ソリ
ュブル、その他である。
【００１５】炭素及び窒素源は都合良く組み合わせて使
用するが、純品を使用する必要はない。というのは微量
の発育因子及び多量のミネラル栄養素を含有している純
度の劣る物質も同様に使用に適しているからである。望
むならば培地に炭酸ナトリウム又はカルシウム、燐酸ナ
トリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、
ヨウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅
塩、コバルト塩、及び同類物のようなミネラル塩を加え
ても良い。もし必要ならば、特に培養培地がひどく泡立
つ場合は液体パラフィン、脂肪酸、植物油、鉱油又はシ
リコンのような消泡剤を添加しても良い。
用するが、純品を使用する必要はない。というのは微量
の発育因子及び多量のミネラル栄養素を含有している純
度の劣る物質も同様に使用に適しているからである。望
むならば培地に炭酸ナトリウム又はカルシウム、燐酸ナ
トリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、
ヨウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅
塩、コバルト塩、及び同類物のようなミネラル塩を加え
ても良い。もし必要ならば、特に培養培地がひどく泡立
つ場合は液体パラフィン、脂肪酸、植物油、鉱油又はシ
リコンのような消泡剤を添加しても良い。
【００１６】大量のＦＫ−５０６の製造条件として、液
面下の好気的培養条件がそのために望ましいものであ
る。少量の製造にはフラスコ又は瓶での振盪又は表面培
養が使用される。更に、発育を大容量タンクで行わせる
場合は、ＦＫ−５０６の製造工程での発育の遅れを避け
るために本微生物の栄養細胞形を製造タンクへの接種に
使用することが望ましい。よって最初に比較的少量の培
養培地に“スラント”で製造した本微生物の胞子又は菌
糸体を接種し、“種菌培地”とも呼ばれるこの接種済み
培地を培養することにより本微生物の栄養細胞接種物を
製造して、次に培養した栄養細胞接種物を無菌的に大容
量タンクに接種することが望ましい。栄養細胞接種物を
製造する発酵培地は本質的にＦＫ−５０６の製造に使用
する培地と同一又は異なるものであり、一般的に接種前
にオートクレーブ処理して培地を滅菌する。培地のpHは
一般的にオートクレーブ工程の前に酸又は塩基を、望ま
しくは緩衝液の形で適度に加えることにより約7.０に調
整する。
面下の好気的培養条件がそのために望ましいものであ
る。少量の製造にはフラスコ又は瓶での振盪又は表面培
養が使用される。更に、発育を大容量タンクで行わせる
場合は、ＦＫ−５０６の製造工程での発育の遅れを避け
るために本微生物の栄養細胞形を製造タンクへの接種に
使用することが望ましい。よって最初に比較的少量の培
養培地に“スラント”で製造した本微生物の胞子又は菌
糸体を接種し、“種菌培地”とも呼ばれるこの接種済み
培地を培養することにより本微生物の栄養細胞接種物を
製造して、次に培養した栄養細胞接種物を無菌的に大容
量タンクに接種することが望ましい。栄養細胞接種物を
製造する発酵培地は本質的にＦＫ−５０６の製造に使用
する培地と同一又は異なるものであり、一般的に接種前
にオートクレーブ処理して培地を滅菌する。培地のpHは
一般的にオートクレーブ工程の前に酸又は塩基を、望ま
しくは緩衝液の形で適度に加えることにより約7.０に調
整する。
【００１７】培養混合物の攪拌及び通気は種々の方法で
行える。攪拌はプロペラ又は類似の攪拌装置により、又
は発酵槽の回転又は振盪により、種々のポンプ装置又は
培地に無菌空気を通すことにより行っても良い。通気は
発酵混合物に無菌空気を通すことにより行える。発酵は
通常、約２０℃から４０℃、望ましくは２５−３５℃の
温度で約８０時間から１２０時間行うが、これらの条件
は発酵状態及び規模に応じて変更しても良い。望ましく
は、製造用培養物は２２０rpmで運転している回転式振
盪器で２７℃で約９６時間培養する。この場合、発酵培
地のpHを収穫時まで７．０に維持する。 培養／製造及び発酵の実施用培地は下記の物を含む：
行える。攪拌はプロペラ又は類似の攪拌装置により、又
は発酵槽の回転又は振盪により、種々のポンプ装置又は
培地に無菌空気を通すことにより行っても良い。通気は
発酵混合物に無菌空気を通すことにより行える。発酵は
通常、約２０℃から４０℃、望ましくは２５−３５℃の
温度で約８０時間から１２０時間行うが、これらの条件
は発酵状態及び規模に応じて変更しても良い。望ましく
は、製造用培養物は２２０rpmで運転している回転式振
盪器で２７℃で約９６時間培養する。この場合、発酵培
地のpHを収穫時まで７．０に維持する。 培養／製造及び発酵の実施用培地は下記の物を含む：
【００１８】 バサ（ＢａＳａ）種菌培地 原料 Ｌ当り ＫＮＯ3 ２ｇ グルコース ２０ｇ 酵母エキス（フィドコ（Fidco)) ２０ｇ ハイケイス・ＳＦ（シェフィールド(Sheffield)) ２０ｇ ＮａＣｌ（１２．５％濃度） ４ml ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（１２．５％濃度） ４ml ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ（０．５％濃度） １ml ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（１．０％濃度） １ml ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（２．０％濃度） １ml ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２５mg ５Ｎ ＮａＯＨでpH７．０に調整する。 蒸留水 １Ｌ ２５mlを２５０ml容綿栓付きバッフルド・エレンマイヤ
ー・フラスコに加える。１２１℃で２０分間オートクレ
ーブ処理をする。
ー・フラスコに加える。１２１℃で２０分間オートクレ
ーブ処理をする。
【００１９】ＫＥ 種菌培地 （土壌放線菌用） 構成物 ｇ／Ｌ デキストロース １．０ デキストリン １０．０ Ｄifco・ビーフ・エキス ３．０ アーダミン pH ５．０ ＮＺ アミン Ｅ ５．０ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５ 燐酸緩衝液 pH７．０ ２．０ml （ａ）ＫＨ2 ＰＯ4 −１０００mlの蒸留水に９１．０ｇ （ｂ）Ｎａ2 ＨＰＯ4 −１０００mlの蒸留水に９５．０
ｇ １１mlの（ａ）及び１９mlの（ｂ）を混合してpH７．０
の緩衝液とする。 ＣａＣＯ3 ０．５ｇ 蒸留水 １０００ml ＮａＯＨでpH７．０から７．２に調整する。次に滅菌前
にＣａＣＯ3 を加える。
ｇ １１mlの（ａ）及び１９mlの（ｂ）を混合してpH７．０
の緩衝液とする。 ＣａＣＯ3 ０．５ｇ 蒸留水 １０００ml ＮａＯＨでpH７．０から７．２に調整する。次に滅菌前
にＣａＣＯ3 を加える。
【００２０】ＫＪ−２製造培地 構成物 ｇ／Ｌ グルコース ２５．０ コーン・スチープ・リカー １５．０ ジスチラーズ・ソリュブル １０．０ ファーマメディア（Pharmamedia) ５．０ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ １０mg 蒸留水 １０００ml CaCO3 ３．０ 滅菌前にpH７．３に調整する。
【００２１】ＦＫＡ 製造培地 構成物 ｇ／Ｌ 可溶性澱粉 ４５．０ コーン・スチープ・リカー １０．０ 乾燥酵母 １０．０ 蒸留水 １０００ml ＣａＣＯ3 １．０ Ｐ−２０００ １ml 滅菌前にpH６．８に調整する。 滅菌は、５０mlの培地を２５０ml容エレンマイヤー・フ
ラスコ（バッフル無し）に入れ１２１℃、１５psi で２
０分間オートクレーブ処理することにより行う。
ラスコ（バッフル無し）に入れ１２１℃、１５psi で２
０分間オートクレーブ処理することにより行う。
【００２２】製造されたＦＫ−５０６は、他の既知であ
る生物学的に活性のある物質のブロスからの回収に一般
的に使用されている従来の手段、例えば高圧液体クロマ
トグラフィ（ＨＰＬＣ）により培養培地から回収するこ
とができる。製造したＦＫ−５０６物質は培養した菌糸
体及び濾液中に認められ、そのため培養したブロスを濾
過し、遠心分離することにより得た菌糸体及び濾液か
ら、減圧濃縮、凍結乾燥、メタノール及び同類物のよう
な従来の溶媒による抽出、pH調整、従来の樹脂（例え
ば、陰イオン又は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹
脂、その他）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性
炭、珪酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ、その
他）による処理、結晶化、再結晶化、及び同類方法のよ
うな従来の方法により分離、精製することができる。望
ましい方法は溶媒抽出、特にメタノールを使用する抽出
である。
る生物学的に活性のある物質のブロスからの回収に一般
的に使用されている従来の手段、例えば高圧液体クロマ
トグラフィ（ＨＰＬＣ）により培養培地から回収するこ
とができる。製造したＦＫ−５０６物質は培養した菌糸
体及び濾液中に認められ、そのため培養したブロスを濾
過し、遠心分離することにより得た菌糸体及び濾液か
ら、減圧濃縮、凍結乾燥、メタノール及び同類物のよう
な従来の溶媒による抽出、pH調整、従来の樹脂（例え
ば、陰イオン又は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹
脂、その他）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性
炭、珪酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ、その
他）による処理、結晶化、再結晶化、及び同類方法のよ
うな従来の方法により分離、精製することができる。望
ましい方法は溶媒抽出、特にメタノールを使用する抽出
である。
【００２３】発酵から得られたブロスは“Ｔ−細胞増殖
検定”で明確な免疫抑制活性を示し、これに基づき有用
性を有する。
検定”で明確な免疫抑制活性を示し、これに基づき有用
性を有する。
【００２４】本製造物ＦＫ−５０６は下記の物理的特徴
を示す： １．白い不定形粉末 ２．メタノールに可溶 ３．電子イオン化質量分析により測定した場合分子イオ
ン（ｍ／ｚ ８０３）及びフラグメントイオンはＦＫ−
５０６と一致している。 ４．陽子核磁気共鳴スペクトルとＦＫ−５０６と一致し
ている。
を示す： １．白い不定形粉末 ２．メタノールに可溶 ３．電子イオン化質量分析により測定した場合分子イオ
ン（ｍ／ｚ ８０３）及びフラグメントイオンはＦＫ−
５０６と一致している。 ４．陽子核磁気共鳴スペクトルとＦＫ−５０６と一致し
ている。
【００２５】上述の発酵工程によって得られたＦＫ−５
０６は、従来の方法、例えば、抽出、沈殿、分画結晶
化、再結晶化、クロマトグラフ処理、及び同類方法で分
離、精製することができる。本発明のＦＫ−５０６はア
メリカ合衆国特許No. ４，８９４，３６６に記述される
ように免疫抑制活性のような薬理学的活性を有し、それ
故に心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、その他のような器
官及び組織の移植拒絶反応、骨髄移植による対宿主性移
植片病及び同類反応、の処置及び防止に有用である。下
記の実施例は本発明を例証するものであって本発明をそ
れに限定するものではない。 〔実施例１〕 ＭＡ６８５８培養物の分離。 発酵ブロスの試料を、分離する為にＡＫ寒天培地に画線
した後に２８℃で培養した。本寒天培地の組成は次の通
りである。ＡＫ寒天培地 寒天 ２０．０ｇ デキストロース １０．０ｇ アスパラギン １．０ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ 酵母抽出物 ０．５ｇ 微量元素 １０ml* 蒸留水 １０００ml pH ７．２ ＊ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０００mg ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ １０００mg ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ２５mg ＣａＣｌ2 １００mg Ｈ3 ＢＯ3 ５６mg （ＮＨ4)6 Ｍｏ7 Ｏ24・４Ｈ2 Ｏ １９mg ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２００mg ０．１Ｎ ＨＣｌ １０００ml 次に述べる方法により、本ブロスはＴ−細胞増殖活性の
調節器として免疫抑制活性が陽性であることを示した。
０６は、従来の方法、例えば、抽出、沈殿、分画結晶
化、再結晶化、クロマトグラフ処理、及び同類方法で分
離、精製することができる。本発明のＦＫ−５０６はア
メリカ合衆国特許No. ４，８９４，３６６に記述される
ように免疫抑制活性のような薬理学的活性を有し、それ
故に心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、その他のような器
官及び組織の移植拒絶反応、骨髄移植による対宿主性移
植片病及び同類反応、の処置及び防止に有用である。下
記の実施例は本発明を例証するものであって本発明をそ
れに限定するものではない。 〔実施例１〕 ＭＡ６８５８培養物の分離。 発酵ブロスの試料を、分離する為にＡＫ寒天培地に画線
した後に２８℃で培養した。本寒天培地の組成は次の通
りである。ＡＫ寒天培地 寒天 ２０．０ｇ デキストロース １０．０ｇ アスパラギン １．０ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ 酵母抽出物 ０．５ｇ 微量元素 １０ml* 蒸留水 １０００ml pH ７．２ ＊ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０００mg ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ １０００mg ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ２５mg ＣａＣｌ2 １００mg Ｈ3 ＢＯ3 ５６mg （ＮＨ4)6 Ｍｏ7 Ｏ24・４Ｈ2 Ｏ １９mg ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２００mg ０．１Ｎ ＨＣｌ １０００ml 次に述べる方法により、本ブロスはＴ−細胞増殖活性の
調節器として免疫抑制活性が陽性であることを示した。
【００２６】“インターロイキン−２放出抑制検定” ＦＳ．６Ｔハイブリドーマ細胞系統はコンカナバリンＡ
（Con Ａ）で刺激するとＩＬ−２を生産する。テスト用
の化合物は最初にＤＭＳＯ（２mg／ml）に溶かし、次に
ＲＰＭＩ１６４０で適正な濃度に希釈した。６．７μｇ
／mlのＣonＡで刺激したＦＳ．６細胞（完全培地０．２
ml中４×１０3 ）を、化合物を添加した、又は添加して
ない平底・９６穴・マイクロタイタープレートの各ウエ
ルの中で培養した。完全培地は、１０％牛胎児血清を補
足したＰＲＭＩ１６４０、２mMＬ−グルタミン、０．１
mM非必須アミノ酸類、２×１０-5Ｍ ２−メルカプト・
エタノール、１００Ｕ／mlのペニシリン及び１００μｇ
／mlのストレプトマイシンからなる。２４時間培養（３
７℃、５％ＣＯ2 ）後、各培養物の上清を集め、そして
ＩＬ−２依存型Ｔ細胞系ＣＴＬＬの増殖維持に対する本
上清の能力によりＩＬ−２活性の検定を行った。０．１
mlの完全培地中４×１０3 ＣＴＬＬ細胞を、０．１mlの
テスト上清（完全培地で１：８に希釈）と共に培養し
た。３７℃で２０分間培養後、培養物は０．４５mg／ml
のＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イ
ル）−２，５−２Ｈ−ジフェニルテトラゾウムブロミ
ド］と共に培養した。培養物の光学濃度（Ｏ．Ｄ）を、
９６穴・タイターテック（商標登録）・マルチスキャン
・リーダーを用いて５７０nmで測定した。ＩＬ−２生産
に及ぼす各化合物の効力は、次のような計算による抑制
パーセントとして表現した。
（Con Ａ）で刺激するとＩＬ−２を生産する。テスト用
の化合物は最初にＤＭＳＯ（２mg／ml）に溶かし、次に
ＲＰＭＩ１６４０で適正な濃度に希釈した。６．７μｇ
／mlのＣonＡで刺激したＦＳ．６細胞（完全培地０．２
ml中４×１０3 ）を、化合物を添加した、又は添加して
ない平底・９６穴・マイクロタイタープレートの各ウエ
ルの中で培養した。完全培地は、１０％牛胎児血清を補
足したＰＲＭＩ１６４０、２mMＬ−グルタミン、０．１
mM非必須アミノ酸類、２×１０-5Ｍ ２−メルカプト・
エタノール、１００Ｕ／mlのペニシリン及び１００μｇ
／mlのストレプトマイシンからなる。２４時間培養（３
７℃、５％ＣＯ2 ）後、各培養物の上清を集め、そして
ＩＬ−２依存型Ｔ細胞系ＣＴＬＬの増殖維持に対する本
上清の能力によりＩＬ−２活性の検定を行った。０．１
mlの完全培地中４×１０3 ＣＴＬＬ細胞を、０．１mlの
テスト上清（完全培地で１：８に希釈）と共に培養し
た。３７℃で２０分間培養後、培養物は０．４５mg／ml
のＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イ
ル）−２，５−２Ｈ−ジフェニルテトラゾウムブロミ
ド］と共に培養した。培養物の光学濃度（Ｏ．Ｄ）を、
９６穴・タイターテック（商標登録）・マルチスキャン
・リーダーを用いて５７０nmで測定した。ＩＬ−２生産
に及ぼす各化合物の効力は、次のような計算による抑制
パーセントとして表現した。
【００２７】７−１０日培養後、形態学的に特徴のある
コロニー・タイプのものが寒天培地上にはえるのが見ら
れた。このコロニーの顕微鏡観察では、ストレプトミセ
スであることを示した。純粋培養にまで単離した本スト
レプトミセスを発酵させてブロスを生産し、これを実施
例２で示すＴ−細胞増殖活性のテストにかけた。生物活
性があることが分かった。本活性純粋培養菌を、登録番
号ＭＡ６８５８としてメルク・カルチャー・コレクショ
ンに寄託した。
コロニー・タイプのものが寒天培地上にはえるのが見ら
れた。このコロニーの顕微鏡観察では、ストレプトミセ
スであることを示した。純粋培養にまで単離した本スト
レプトミセスを発酵させてブロスを生産し、これを実施
例２で示すＴ−細胞増殖活性のテストにかけた。生物活
性があることが分かった。本活性純粋培養菌を、登録番
号ＭＡ６８５８としてメルク・カルチャー・コレクショ
ンに寄託した。
【００２８】発酵 種菌培養は、ＭＡ６８５８のスラント懸濁液２〜４ml
を、２５０ml容の３枚バッフル付エレンマイヤーフラス
コに入れた５０mlバサ種菌培地又はＫＥ種菌培地に接種
して作った。本培養容器は、湿度８５％下で２２０rpm
で振盪しながら２７℃で培養した。４８時間培養後、種
菌培養物は接種原として充分使えるものに成長した。先
述の生産培地ＫＪ−２及びＦＫＡ（２５０ml容バッフル
無しエレンマイヤーフラスコ当たり４４ml）に、２mlの
種菌培養物を接種し、先述と同条件の温度、振盪、湿度
で４−７日間培養した。培養中１日間隔で、サンプル
（２ml）を生産培養液から無菌的に採取して、Ｔ−細胞
増殖活性即ち免疫抑制（ＩＰ）活性のテストにかけた。
４日又は７日間発酵後に全フラスコを採取した。標準条
件（ＫＥ種菌培地４８時間、ＫＪ−２生産培地４日間）
は、ＦＫ−５０６（約１０μｇ／ml）として同定された
ＩＬ−２放出抑制活性を生じた。本実験では、最高の４
日目力価が、４２時間バサ種菌をＦＫＡ生産培地に移植
したものから得られ、３３．３μｇ／mlのＦＫ−５０６
を生成した。最高の７日目力価は、７２時間ＫＥ種菌を
ＦＫＡ培地に接種した場合の３７．８μｇ／mlのＦＫ−
５０６であった；７２時間バサ種菌を同じ培地（ＦＫ
Ａ）に接種した場合には、３５μｇ／mlのＦＫ−５０６
を生成した。
を、２５０ml容の３枚バッフル付エレンマイヤーフラス
コに入れた５０mlバサ種菌培地又はＫＥ種菌培地に接種
して作った。本培養容器は、湿度８５％下で２２０rpm
で振盪しながら２７℃で培養した。４８時間培養後、種
菌培養物は接種原として充分使えるものに成長した。先
述の生産培地ＫＪ−２及びＦＫＡ（２５０ml容バッフル
無しエレンマイヤーフラスコ当たり４４ml）に、２mlの
種菌培養物を接種し、先述と同条件の温度、振盪、湿度
で４−７日間培養した。培養中１日間隔で、サンプル
（２ml）を生産培養液から無菌的に採取して、Ｔ−細胞
増殖活性即ち免疫抑制（ＩＰ）活性のテストにかけた。
４日又は７日間発酵後に全フラスコを採取した。標準条
件（ＫＥ種菌培地４８時間、ＫＪ−２生産培地４日間）
は、ＦＫ−５０６（約１０μｇ／ml）として同定された
ＩＬ−２放出抑制活性を生じた。本実験では、最高の４
日目力価が、４２時間バサ種菌をＦＫＡ生産培地に移植
したものから得られ、３３．３μｇ／mlのＦＫ−５０６
を生成した。最高の７日目力価は、７２時間ＫＥ種菌を
ＦＫＡ培地に接種した場合の３７．８μｇ／mlのＦＫ−
５０６であった；７２時間バサ種菌を同じ培地（ＦＫ
Ａ）に接種した場合には、３５μｇ／mlのＦＫ−５０６
を生成した。
【００２９】ブロスの分離と精製法 先述の全発酵ブロス４０mlバッチに、３０mlのメタノー
ルを加え混合液を１時間攪拌した。サンプルを、焼結ガ
ラス漏斗に入れたスーパー・セルのパッドを通して濾過
した。１０mlのメタノールとついで２０mlの水で予め調
整した２ケのウォータース・Ｃ−１８・セプ−パック
（WatersC-18 Sep-Pak)カートリッジを連結したものに
濾液を通した。本セプ−パックを２×５mlの５０％メタ
ノール溶液で洗浄した後に、５mlの１００％メタノール
で溶出した。本メタノール溶出液を真空下で乾燥した
後、２５０μＬのメタノールに溶解した。濃縮抽出物を
ワットマンＯＤＳ−３カラム０．９４×２５cmを用いた
逆相ＨＰＣＬにかけて精製した。２５０μＬのサンプル
を平衡化したカラムに注入し、ＡｃＣＮ：０．２％トリ
フルオロ酢酸水溶液５０：５０にて、流速５ml／分で抽
出した。１８−２０分間目に溶出した分画液を集め、乾
燥してサンプルとした。ＩＬ−２検定（実施例２）によ
るバイオアッセイは、本物質は活性物質であることを示
した。本サンプルをマス・スペクトル分析にかけ、陽子
ＮＭＲも行った。分析結果は、分離された本化合物は欧
州特許公報No. ０１８４１６２及びアメリカ合衆国特許
４，８９４，３６６に述べられているフジサワのＦＳ−
９００５０６（ＦＫ−５０６）と同
ルを加え混合液を１時間攪拌した。サンプルを、焼結ガ
ラス漏斗に入れたスーパー・セルのパッドを通して濾過
した。１０mlのメタノールとついで２０mlの水で予め調
整した２ケのウォータース・Ｃ−１８・セプ−パック
（WatersC-18 Sep-Pak)カートリッジを連結したものに
濾液を通した。本セプ−パックを２×５mlの５０％メタ
ノール溶液で洗浄した後に、５mlの１００％メタノール
で溶出した。本メタノール溶出液を真空下で乾燥した
後、２５０μＬのメタノールに溶解した。濃縮抽出物を
ワットマンＯＤＳ−３カラム０．９４×２５cmを用いた
逆相ＨＰＣＬにかけて精製した。２５０μＬのサンプル
を平衡化したカラムに注入し、ＡｃＣＮ：０．２％トリ
フルオロ酢酸水溶液５０：５０にて、流速５ml／分で抽
出した。１８−２０分間目に溶出した分画液を集め、乾
燥してサンプルとした。ＩＬ−２検定（実施例２）によ
るバイオアッセイは、本物質は活性物質であることを示
した。本サンプルをマス・スペクトル分析にかけ、陽子
ＮＭＲも行った。分析結果は、分離された本化合物は欧
州特許公報No. ０１８４１６２及びアメリカ合衆国特許
４，８９４，３６６に述べられているフジサワのＦＳ−
９００５０６（ＦＫ−５０６）と同
【００３０】一物であることを示した。 〔実施例２〕Ｔ−細胞増殖検定 １．サンプルの調製 等量のメタノールを、上記ブロスの１mlのサンプルに各
々加え、１：２全ブロス等量物（ＷＢＥ）を作った。本
サンプルを５分間３，０００rpm で遠心分離機にかけ、
得られた上澄液をＴ−細胞増殖検定用のスタート物質と
した。 ２．検定 Ｃ５７Ｂ１／６マウスから脾臓を無菌的に取り出し、１
０％の加熱・不活化牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）で補足し
た氷冷のＲＰＭＩ１６４０発酵培地（ＧＩＢＣＯ、Gran
d Island, N. Y.)中で穏かに解離させた。細胞は、１５
００rpm で８分間遠心分離機にかけてペレット状にし
た。混入した赤血球細胞は、本ペレットを塩化アンモニ
ウム溶解緩衝液（ＧＩＢＣＯ）で４℃、２分間処理する
ことにより除去した。冷却した培地を添加し、細胞を
１，５００r.p.m.で８分間再遠心分離した。次にＴリン
パ球は、下記の様なナイロン・ウール・カラム上での細
胞懸濁液の分離により単離した。ナイロン・ウール・カ
ラムは、洗浄・乾燥した約４グラムのナイロン・ウール
を２０ml容のプラスチック製注射器に詰めて調製した。
本カラムを１２０℃で３０分間オートクレイブにかけて
滅菌した。ナイロン・ウール・カラムを、加温した（３
７℃）培養培地で湿らせ、そして同じ培地で洗い落とし
た。洗浄した脾臓細胞を加温した培地に再懸濁したもの
を、徐々にナイロン・ウールに注入した。次に、カラム
は立てたままの姿で３７℃で１時間培養した。非付着性
のＴリンパ球は加温培養培地でカラムから溶出された、
そして細胞懸濁液を上記の様に遠心機にかけた。
々加え、１：２全ブロス等量物（ＷＢＥ）を作った。本
サンプルを５分間３，０００rpm で遠心分離機にかけ、
得られた上澄液をＴ−細胞増殖検定用のスタート物質と
した。 ２．検定 Ｃ５７Ｂ１／６マウスから脾臓を無菌的に取り出し、１
０％の加熱・不活化牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）で補足し
た氷冷のＲＰＭＩ１６４０発酵培地（ＧＩＢＣＯ、Gran
d Island, N. Y.)中で穏かに解離させた。細胞は、１５
００rpm で８分間遠心分離機にかけてペレット状にし
た。混入した赤血球細胞は、本ペレットを塩化アンモニ
ウム溶解緩衝液（ＧＩＢＣＯ）で４℃、２分間処理する
ことにより除去した。冷却した培地を添加し、細胞を
１，５００r.p.m.で８分間再遠心分離した。次にＴリン
パ球は、下記の様なナイロン・ウール・カラム上での細
胞懸濁液の分離により単離した。ナイロン・ウール・カ
ラムは、洗浄・乾燥した約４グラムのナイロン・ウール
を２０ml容のプラスチック製注射器に詰めて調製した。
本カラムを１２０℃で３０分間オートクレイブにかけて
滅菌した。ナイロン・ウール・カラムを、加温した（３
７℃）培養培地で湿らせ、そして同じ培地で洗い落とし
た。洗浄した脾臓細胞を加温した培地に再懸濁したもの
を、徐々にナイロン・ウールに注入した。次に、カラム
は立てたままの姿で３７℃で１時間培養した。非付着性
のＴリンパ球は加温培養培地でカラムから溶出された、
そして細胞懸濁液を上記の様に遠心機にかけた。
【００３１】精製したＴリンパ球を、１０％の加熱・不
活性牛胎児血清を加えたＲＰＭＩ１６４０、１００mMグ
ルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、２×１０-5Ｍ２
−メルカプトエタノール及び５０μｇ／mlゲンタマイシ
ンからなる完全培地に、１０6 細胞／mlの割合で再懸濁
した。イオノマイシンを２５０ng／mlの割合で、そして
ＰＭＡを１０ng／mlの割合で加えた。細胞懸濁液は、直
ちに９６穴平底ミクロカルチャープレート（Costar) に
１００μｇ／mlの割合で分注した。テスト薬品を含まな
い培地である対照サンプルと、テストにかけるサンプル
（前述の抽出物）を下記のような種々の希釈をしたもの
を、１０μｇ／ウエルの割合で３連のウエルに加えた。
ＦＫ−５０６は標準として使用した。次に、本カルチャ
ー・プレートは、５％ＣＯ2 −９５％空気の加湿雰囲気
で４４時間、３７℃で培養した。Ｔリンパ球の免疫抑制
は、上述の比色式ＭＴＴ法（実施例１）により評定し次
の様に計算した： 生産培地ＦＫＡを、種々に希釈した場合の％抑制の結果
は、本サンプルは実質上ＦＫ−５０６と同程度の生物活
性特性を持っていることを示した。更に、本サンプルの
Ｔ−細胞増殖の抑制は、培養の開始時に１００単位／ml
のＩＬ−２（組替えＩＬ−２）の添加により解除され
た。結果は次の表に示す。
活性牛胎児血清を加えたＲＰＭＩ１６４０、１００mMグ
ルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、２×１０-5Ｍ２
−メルカプトエタノール及び５０μｇ／mlゲンタマイシ
ンからなる完全培地に、１０6 細胞／mlの割合で再懸濁
した。イオノマイシンを２５０ng／mlの割合で、そして
ＰＭＡを１０ng／mlの割合で加えた。細胞懸濁液は、直
ちに９６穴平底ミクロカルチャープレート（Costar) に
１００μｇ／mlの割合で分注した。テスト薬品を含まな
い培地である対照サンプルと、テストにかけるサンプル
（前述の抽出物）を下記のような種々の希釈をしたもの
を、１０μｇ／ウエルの割合で３連のウエルに加えた。
ＦＫ−５０６は標準として使用した。次に、本カルチャ
ー・プレートは、５％ＣＯ2 −９５％空気の加湿雰囲気
で４４時間、３７℃で培養した。Ｔリンパ球の免疫抑制
は、上述の比色式ＭＴＴ法（実施例１）により評定し次
の様に計算した： 生産培地ＦＫＡを、種々に希釈した場合の％抑制の結果
は、本サンプルは実質上ＦＫ−５０６と同程度の生物活
性特性を持っていることを示した。更に、本サンプルの
Ｔ−細胞増殖の抑制は、培養の開始時に１００単位／ml
のＩＬ−２（組替えＩＬ−２）の添加により解除され
た。結果は次の表に示す。
【００３２】 ＭＡ６８５８カルチャー・ブロスによるＴ細胞増殖の抑制 希釈 ％抑制 No IL-2 +IL-2 １／２５，０００ ９３ １２ １／５０，０００ ８３ １０ １／１００，０００ ３７ ５ １／２００，０００ ９ ３ 表についての備考： １．マウスＴ細胞培養液は、４８時間目に回収する４時
間前にＭＴＴでパルスした。 ２．標準ＦＫ−５０６（１ng／ml）は１００％抑制を示
した。 ３．Ｔ細胞増殖の抑制は、培養の開始時に、ヒト組替え
ＩＬ−２を５０単位／ml添加（＋ＩＬ−２）することに
より解除された。
間前にＭＴＴでパルスした。 ２．標準ＦＫ−５０６（１ng／ml）は１００％抑制を示
した。 ３．Ｔ細胞増殖の抑制は、培養の開始時に、ヒト組替え
ＩＬ−２を５０単位／ml添加（＋ＩＬ−２）することに
より解除された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フランシス デュモン アメリカ合衆国，07065 ニュージャーシ ィ，ローウェイ，ウエスト チェリー ス トリート 54 (72)発明者 ジョージ エム．ギャリティ アメリカ合衆国，07090 ニュージャーシ ィ，ウエストフィールド，クラーク スト リート 617 (72)発明者 リーユアン ファング アメリカ合衆国，07060 ニュージャーシ ィ，ウォッチュング，ウィル レーン 33 (72)発明者 イー．トレイシー ティー．ジョーンズ アメリカ合衆国，08817 ニュージャーシ ィ，エジソン，ハナ ロード 99 (72)発明者 メアリ ナリン オムステッド アメリカ合衆国，07090 ニュージャーシ ィ，ウエストフィールド，ウエストフィー ルド アヴェニュー 634 (72)発明者 イザベル マルティン フェルナンデス スペイン国，28005 マドリッド，ロザリ オ ７ (72)発明者 テレサ ディエス マタス スペイン国，28010 マドリッド，オリド ４
Claims (6)
- 【請求項１】 ストレプトミセス種（Streptomyces sp)
の菌株、ＡＴＣＣNo. ５５０９８を窒素栄養分を含む液
体炭水化物培地中液面下の好気的発酵条件下でＦＫ−５
０６を生産するのに十分な時間、培養する工程からな
る、ＦＫ−５０６として同定される免疫抑制剤の製造方
法。 - 【請求項２】 その微生物がＡＴＣＣ No. ５５０９８
のＦＫ−５０６生産変異株である請求項１の方法。 - 【請求項３】 その培地がＦＫＡ発酵培地である請求項
１の方法。 - 【請求項４】 その培地がＫＪ−２発酵培地である請求
項１の方法。 - 【請求項５】 請求項１の方法によって生産されるブロ
スであってＦＫ−５０６及びストレプトミセス種、ＡＴ
ＣＣ No. ５５０９８を含み、Ｔ−細胞活性の陽性阻害
を示すブロス。 - 【請求項６】 ストレプトミセス種、ＡＴＣＣ No. ５
５０９８の微生物学的に純粋な培養菌。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US646555 | 1984-08-31 | ||
| US07/646,555 US5116756A (en) | 1991-01-28 | 1991-01-28 | Process for producing FK-506 |
| US07/772,520 US5194378A (en) | 1991-01-28 | 1991-10-07 | Process for producing fk-506 |
| US772520 | 1991-10-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05130860A JPH05130860A (ja) | 1993-05-28 |
| JPH0691816B2 true JPH0691816B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=27094956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4011794A Expired - Lifetime JPH0691816B2 (ja) | 1991-01-28 | 1992-01-27 | Ｆｋ−５０６の新規な製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5194378A (ja) |
| EP (1) | EP0497515A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0691816B2 (ja) |
| CA (1) | CA2059706A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5612217A (en) * | 1994-10-25 | 1997-03-18 | Merck & Co., Inc. | Streptomyces sp. MA 7074 (ATCC 55605) used for microbial synthesis of HIV protease inhibitors |
| US7452692B2 (en) * | 2002-02-13 | 2008-11-18 | Teva Gyógyszergyár Zártkörüen Müködö Részvénytársaság | Method for extracting a macrolide from biomatter |
| MXPA04007847A (es) * | 2002-02-13 | 2005-02-24 | Biogal Gyogyszergyar | Metodo para extraer un macrolido de biomateria. |
| US20060169199A1 (en) * | 2003-03-31 | 2006-08-03 | Vilmos Keri | Crystallization and purification of macrolides |
| US20070191415A1 (en) * | 2003-10-17 | 2007-08-16 | Ranbaxy Laboratories Limited | Production of tacrolimus (fk-506) using new streptomyces species |
| WO2006115509A2 (en) | 2004-06-24 | 2006-11-02 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Small molecule immunopotentiators and assays for their detection |
| ITMI20042098A1 (it) * | 2004-11-03 | 2005-02-03 | Antibioticos Spa | Processo per la purificazione di tacrolimus |
| CA2590675A1 (en) * | 2004-12-15 | 2006-06-22 | Elan Pharma International Ltd. | Nanoparticulate tacrolimus formulations |
| WO2006069333A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Teva Gyógyszergyár Zàrtköruen Muködo Rèszvènytàrsasàg | Method of purifying macrolides |
| MX2007006119A (es) * | 2005-01-05 | 2007-07-19 | Teva Gyogyszergyar Zartkoruen | Tacrolimus amorfo y preparacion de el. |
| US20060210638A1 (en) * | 2005-03-17 | 2006-09-21 | Elan Pharma International Limited | Injectable compositions of nanoparticulate immunosuppressive compounds |
| CN1876822B (zh) * | 2005-06-06 | 2010-05-12 | 上海市农药研究所 | 他克莫司的产生菌株及生产方法 |
| US20080318289A1 (en) * | 2005-10-05 | 2008-12-25 | Parveen Kumar | Fermentation Processes for the Preparation of Tacrolimus |
| JP4700022B2 (ja) * | 2006-03-15 | 2011-06-15 | アイバックス ファーマシューティカルズ スポレツノスト エス ルチェニム オメゼニム | タクロリマスの精製方法 |
| KR100891313B1 (ko) * | 2007-08-17 | 2009-03-31 | (주) 제노텍 | 담체로 작용하는 흡착성 수지의 제공에 의한 트리사이클로화합물의 생산 및 추출 방법 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3244592A (en) * | 1962-06-09 | 1966-04-05 | Arai Tadashi | Ascomycin and process for its production |
| US4894366A (en) * | 1984-12-03 | 1990-01-16 | Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. | Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same |
| EP0356399A3 (en) * | 1988-08-26 | 1991-03-20 | Sandoz Ag | Substituted 4-azatricyclo (22.3.1.04.9) octacos-18-ene derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| US4984366A (en) * | 1988-10-28 | 1991-01-15 | Powers Robert B | Elastomeric receptacle for nail clipper |
-
1991
- 1991-10-07 US US07/772,520 patent/US5194378A/en not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-01-20 CA CA002059706A patent/CA2059706A1/en not_active Abandoned
- 1992-01-24 EP EP92300624A patent/EP0497515A1/en not_active Withdrawn
- 1992-01-27 JP JP4011794A patent/JPH0691816B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05130860A (ja) | 1993-05-28 |
| EP0497515A1 (en) | 1992-08-05 |
| CA2059706A1 (en) | 1992-07-29 |
| US5194378A (en) | 1993-03-16 |
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|---|---|---|---|
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