JPH0693835B2 - 酵素不活性で免疫活性のβ‐ガラクトシダーゼ‐突然変異蛋白質、その製法、血清蛋白質の免液学的測定法及び酵素イムノアツセイ用試薬 - Google Patents

酵素不活性で免疫活性のβ‐ガラクトシダーゼ‐突然変異蛋白質、その製法、血清蛋白質の免液学的測定法及び酵素イムノアツセイ用試薬

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JPH0693835B2
JPH0693835B2 JP63180448A JP18044888A JPH0693835B2 JP H0693835 B2 JPH0693835 B2 JP H0693835B2 JP 63180448 A JP63180448 A JP 63180448A JP 18044888 A JP18044888 A JP 18044888A JP H0693835 B2 JPH0693835 B2 JP H0693835B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は酵素的に不活性で、免疫学的に活性のβ−ガラ
クトシダーゼ突然変異蛋白質、その製法及び標識酵素と
してβ−ガラクトシダーゼを含有する酵素イムノアツセ
イ（EIA）に関して、血清妨害を回避し、非特異的空値
を低下させるためにβ−ガラクトシダーゼ−突然変異蛋
白質を使用することに関する。
従来の技術 酵素免疫反応において、実際には僅かな量の被分析物含
量の人血清がしばしば高いシグナルを与えるということ
が観察された。この妨害は本来意図した結合体の抗−被
分析物−結合機能に相応しない、抗被分析物−β−ガラ
クトシダーゼ−結合体と結合する血清フアクターに起因
する。その結果、そのような血清は誤まつた分析値に関
係づけられる。
酵素イムノアツセイは種々の方法で実施される。これら
はサンドイツチ法としても均質な可溶性相中でも可能で
ある。
サンドイツチ法を使用する際、所望の血清蛋白質の量の
測定は容易である：固相で存在する抗原−抗体−酵素複
合体を上澄液から分離し、引き続き酵素活性を測定す
る。
しかしながら、β−ガラクトシダーゼを用いて均質な酵
素イムノアツセイにおいて問題となつている血清蛋白質
の量を測定することは困難である。この際、選択するた
めの多くの可能性がある：例えば比色分析による酵素抑
制化−イムノアツセイ（Gibbons等著、Immobilized Enz
yms and Cells,Methods in Enzymology、K.Moosbach、A
cademic Press社、New York）比濁法による酵素活性化
−イムノアツセイ（Gibbons等、Clin.Chem.、第27巻、
第16002頁、1981年）及びより敏感な螢光分析による酵
素抑制−イムノアツセイ（Armenta等著、Anal.Biochem.
1985年）。
しかしながら、すべての方法において血清中の妨害フア
クター、すなわちβ−ガラクトシダーゼ分子自体に又は
β−ガラクトシダーゼと結合した抗被分析物抗体又はそ
の結合位に結合する蛋白質並びにその中に含有されるβ
−ガラクトシダーゼ−活性の抑制物質が定量的な測定を
著しく妨害する。そのような抑制物質は抗−β−ガラク
トシダーゼ抗体でもあり、これは酵素の巨大分子基質の
活性中心を遮断することにより酵素活性を抑制する。
酵素イムノアツセイの正確さのような妨害を回避するた
めに多くの方法が発達した。こうして酵素に多数のアル
ブミン分子を結合させることにより抗体−酵素複合体を
抗酵素抗体から“保護”した。このことを酵素活性に影
響を与えることなく実施することができるということは
興味深い。しかしながら、これにより立体障害が抗酵素
抗体の結合にだけでなく、測定すべき蛋白質への所望の
結合にも生じる。更に、活性β−ガラクトシダーゼへの
抗酵素抗体の結合を回避するために、酵素の天然抗原性
を示す、不活性β−ガラクトシダーゼ誘導体を過剰に使
用することも公知である。この方法でも、必要とする正
確さでテストを実施することはできなかつた。
発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の課題は、前記の困難を回避し、かつ試
料血清から妨害フアクターを除去するための方法を提供
することである。
課題を解決するための手段 本発明により、この課題は天然配列の461番目のアミノ
酸Glu（アミノ酸Glu461）及び／又は503番目のアミノ酸
Tyr（アミノ酸Tyr503）が他のアミノ酸で置換してお
り、かつ酵素活性は天然の酵素に対して１％以下である
酵素不活性で免疫活性のβ−ガラクトシダーゼ−突然変
異蛋白質の提供により解決する。
有利な実施形においては、アミノ酸Glu461をアミノ酸Se
r、Ala、Asp又はTyrで、及び／又はアミノ酸Tyr503をア
ミノ酸Phe、Glu又はSerで置換することができる。しか
しながら、そのつど他の１つのアミノ酸での置換も考え
られる。記載した範囲でのこのアミノ酸置換により酵素
活性は天然のβ−ガラクトシダーゼの酵素活性の１％
に、有利に１％に減少しβ−ガラクトシダーゼの免疫活
性は影響を受けない。
これらのβ−ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質の製造
は種々の方法で行なわれる。本発明による製造は、相応
する位置でDNA面上にβ−ガラクトシダーゼをコードす
るプラスミドの特定部位での突然変異誘発により及び引
き続く好適な宿主中での表現により実施する。特定部位
での突然変異誘発を有利にヘテロ二本鎖法（Morinega等
著、Biotechnology、1984年７月号、第636頁、1984年）
により生ぜしめることができる。このためにはβ−ガラ
クトシダーゼをコードするプラスミドを制限エンドヌク
レアーゼで２つの異なる種類のものに切断する：まずβ
−ガラクトシダーゼをコードする範囲を酵素Ａ及びＢで
切断することによりプラスミドから取り出すと、β−ガ
ラクトシダーゼ配列を有さない線状プラスミドが残る；
次に同じプラスミドをβ−ガラクトシダーゼをコードす
る範囲の外側を切断する制限酵素Ｃで切断し、これによ
りプラスミドは線状になる。次いで加熱による変性によ
り二本鎖DNA構造の融解に作用し、このことは一本鎖DNA
鎖の形成に導く。この一本鎖DNA−フラグメントの溶液
にβ−ガラクトシダーゼ配列の小さな１部を構成する
が、所望のアミノ酸置換の位置にアミノ酸をコードする
トリプレツトの１つの塩基の突然変異を包含する、リン
酸化オリゴヌクレオチドを添加する。このオリゴヌクレ
オチドを含有する１本鎖−DNA−混合物の段階的冷却に
よる再結合の後、４つの異なる二本鎖DNA分子Ｉ、ａ、
ｂ及びIIの形成の可能性がある。二本鎖DNA−分子Ｉ及
びIIはハイブリツド形成による出発分子の単なる再形成
を示す。分子ａ及びｂにおいては出発分子の両方の部分
鎖が再び相互に合わさらず、それぞれ出発分子Ｉ及びII
の一本鎖である。従つて、β−ガラクトシダーゼをコー
ドする範囲において一本鎖である二本鎖DNA−分子が生
じる。従つて、オリゴヌクレオチドのDNA−配列の相補
的鎖を有する分子ａにオリゴヌクレオチドはハイブリツ
ド形成によりはりつき、その際塩基置換の範囲でいわゆ
る“不適性”が生じる。DNA−ポリメラーゼＩ及びデス
オキシヌクレオチド４つ並びにT4−DNA−リガーゼの添
加により、残りの一本鎖範囲を満たし、二本鎖DNAを閉
鎖する。塩基置換を、相応するプラスミド中で制限酵素
で消化する際に切断パターンが変わり、これにより形質
転換後突然変異を起こしたプラスミドを含有するコロニ
ーの選択が容易になるように実施するのが特に有利であ
る。このことは好適な塩基の選択により制限酵素のため
の制限切断部位の破壊又は挿入によりおこなうことがで
きる。しかしながら、コロニーの評価は他の公知の方
法、例えばハイブリツド形成分析（コロニー／プラスミ
ド）、Ｘ−galでのコロニーの染色、全細胞抽出物のSDS
−ゲル電気泳動、羊−抗−β−gal−IgG−POD−結合体
でのイムノアツセイ、天然ゲル電気泳動又は他の種々の
有色塩基での酵素活性テストにより実施することができ
る。突然変異プラスミドを含有する（ポジテイブ）コロ
ニーを更に培養すると、この際細胞自体の修復機構が
“不適性”を２つの方法で修復することができる、すな
わち１方では突然変異プラスミドが、他方では再び野性
型プラスミドが生じる。再び得られたコロニーを前記の
方法で評価し、突然変異プラスミドを好適な宿主細胞中
でβ−ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質の表現のため
に使用する。実施例中で実施したすべてのアミノ酸置換
において、β−ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質−モ
ノマーのテトラマーへの凝集はそこなわれなかつた。
β−ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質を被分析物と結
合活性でない免疫グルブリンのFab部と一緒に使用す
る。これにより、血清中に場合により存在する抗被分析
物−免疫グロブリンの結合活性Fab−部と反応する妨害
フアクターもβ−ガラクトシダーゼ蛋白質と反応する妨
害フアクターと同様捕捉される。突然変異蛋白質とFab
の分離した使用のかわりに化学的に結合した結合体を使
用する場合、この際両方の成分β−ガラクトシダーゼ−
突然変異蛋白質と被分析物と結合しない免疫グロブリン
のFab−部とは活性結合体に使用すると同じ方法、すな
わちＮ−／マレインイミドヘキサノイル−０−サクシン
イミドを介する結合により結合しているのだが、もう１
つの利点としてテストの確実性が更に上昇するというこ
とを挙げることができる。それというのも、この際Fab
と、もしくは突然変異蛋白質とFabとの間の結合位と反
応する、すなわち橋かけ物質自体と、又は橋かけ物質と
両方に相互に結合する物質との間の結合位と反応する妨
害フアクターも相殺されるためである。
本発明のもう１つの課題は血清妨害の回避及び非特異的
空値の低下のための、β−ガラクトシダーゼを標識酵素
として含有する酵素イムノアツセイ（EIA）のための試
薬であり、これは酵素的に不活性で免疫学的に活性のβ
−ガラクトシダーゼ突然変異蛋白質を含有し、これを被
分析物−非−結合免疫グロブリンのFab部と一緒に、で
きるだけ化学的に結合した形で使用する時、血清妨害フ
アクターの非特異的結合が反応する抗−被分析物−結合
体のすべての特性は正確に同じように進行するが、酵素
的又は被分析物活性ではない。これにより血清妨害フア
クターは捕捉され、引き続く酵素活性β−ガラクトシダ
ーゼでの測定をもはや妨害しない。
次に実施例並びに図面につき本発明を詳細に説明する： 実施例 例１ 分子生物学的標準法、例えば形質転換、制限及びプラス
ミド単離をT.マニアテイス（Maniatis）、E.F.フリツチ
（Fritsch）、及びJ.サムブルーク（Sambrook）による
方法（“Molecular Cloning"、Cold Sprimger Harbor L
aboratory、ニユーヨーク、11724）で実施する。
β−Gal−突然変異蛋白質‐遺伝子の製造 1a）出発プラスミドの製造 大腸菌−フアージλplac5−１（DSM4176P）の遺伝子
（C.Pourcel等著、Molec.gen.Genet.第170巻、1979年、
第161〜169頁参照）の遺伝子から制限酵素BstEIIで切断
することにより約5.2kb−フラグメントが得られ、ゲル
電機泳動により分取される。プラスミドpACYC177（DSM3
693p）は酵素Pst Iで切断することにより線状にされ
る。λplac5−１からの、lac Zを有する大きさ約5.2kb
のBstEIIフラグメントの末端を酵素ヌクレーゼS1の使用
下に平らに消化し、酵素、ターミナルトランスフエラー
ゼ及びdCTPを用いて３′末端で任意の数のｄ−シチジン
−残基だけ延ばす（方法はManiatis等著の第217〜246頁
参照）。Pst Iで直線となつたpACYC177分子を酵素、タ
ーミナルトランスフエラーゼ及びGTPで３′末端で任意
の数のｄ−グアニジン‐残基だけ延ばす。両方のこのよ
うに延ばしたフラグメントの混合物を合し、菌株BMTU24
89（DSM4178）の大腸菌細胞中に形質転換により導入す
る。この大腸菌細胞をカナマイシン25μg/ml及び５−ブ
ロム−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
シド（X-Gal）40μg/mlを含有する培養基上で選択す
る。青く、アンピシリン50μg/mlに対し過敏である細胞
から、最初のBst E II−フラグメントの両方の末端が15
G/C一対だけ延びているプラスミドを単離する。このプ
ラスミドを出発プラスミドとして使用する。このプラス
ミドは、Pst Iでの切断により２つのフラグメントが得
られ、そのうちの大きい方はλ plac5−１からのlac Z
−遺伝子−フラグメントを含有するということによりλ
plac5−１及びpACYY177とは異なつている。
出発プラスミドを含有する大腸菌の細胞は基礎となるβ
−Galを製造する。
同様に出発プラスミドとして好適であるのはBst E II−
フラグメントの両方の末端が約５〜30G/C−対延びたプ
ラスミドである。
1a′）選択法としての出発プラスミドの製造 大腸菌−フア−ジλ plac5−１（DSM4176P）の遺伝子か
ら制限酵素Bst E IIで切断することにより約5db−フラ
グメントが得られ、ゲル電気泳動法により分取する。プ
ラスミドpACYC177（DSM3693P）を酵素Pst Iで切断する
ことにより線状にする。λ plac 5−１からの、lac Zを
有する約5kbの大きさのBst E IIフラグメントの末端を
酵素ヌクレアーゼS1を用いて平らに消化する。両方のフ
ラグメントを結合し、大腸菌中で形質転換する。
大腸菌細胞をカナマイシン25μg/ml及び５−ブロム−４
−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ
−Gsl）40μg/mlを含有する培養基上で選択する。青
く、アンピシリン50μg/mlに対して過敏である細胞を選
択する。これらの細胞はそれぞれ２つの異なるプラスミ
ド１つを含有する。これらのプラスミドはBst E II−フ
ラグメントの方向づけで異なつておりこれによりBamHI
及びEcoRIで異なる切断パターンを与える。BamHI及びEc
oRIでの消化により長さ偶導体9.1kbを有するものを選択
的出発プラスミドとして選択する。
1b）突然変異生成−混合物の製造及び突然変異生成処置 1a又は1a′により製造した出発プラスミドを酵素Bcl I
及びSac Iで処理し、大きい方のフラグメント（長さ約
8.2bp）をゲル電気泳動により分取する。もう１つの配
合物においては出発プラスミドをHind IIIで切断するこ
とにより線状にする。両方のプラスミドフラグメントを
混合して（それぞれ0.15pmol）、95℃に２分間加熱する
ことにより変性する。この際、あらかじめ付加的にキナ
ーゼ化オリゴヌクレオチド75pmolを添加する。オリゴヌ
クレオチドの配列は得られるべき突然変異蛋白質種類を
決定し、これを以下により詳細に説明する（式Ｉ〜III
参照）。これらの混合物を60℃で30分間処置することに
より、ヘテロ二本鎖分子の形成が達せられる。この突然
変異生成処置を、12℃で次の試薬を記載した最終濃度で
添加することにより実施する：デスオキシ−ヌクレオチ
ド−トリフオスフエート0.25mM、ATP1mM、NaCl0.1M、ト
リスHcl pH7.5 6.5mM;MgCl2 8mM、β−メルカプトエタ
ノール1mM、クレノウ（Klenow）−フラグメント0.125U/
μｌ、T4−リガーゼ0.0625U/μｌ。
恒温保持時間は４時間である。引き続き、ベクター0.00
75pmolを含有する、配合物の部分量を大腸菌細胞BMTU24
89（DSM4178）中に形質転換のために使用する。形質転
換したコロニーをカナマイシン25μg/ml及びＸ−Gal40
μg/mlを有する培地で選択する。所望の突然変異体はβ
−Galマイナス（白）であり８％の率で見い出される。
清浄化したコロニーをプラスミド製造のために使用し、
このように得られたプラスミドを前記のように再形質転
換する。このように得られた白色の第２の形質転換細胞
をプラスミド製造のために使用し、このプラスミド−DN
Aを使用した放射性標識オリゴヌクレオチドと共にハイ
ブリツド形成する。
50℃におけるハイブリツド形成フイルターの線状により
なおプラスの放射性結果を示すプラスミドは所望の突然
変異を有するプラスミドである。このプラスミドを含有
する細胞から粗抽出物を製造する。これは僅かな値のβ
−Gal−活性を有する（出発プラスミドを有する細胞の
0.5％より低い）。SDS−ゲル上で粗抽出物を電気泳動に
より分離し、コオマシ−（Coomassie）色素で蛋白質バ
ンドを染色する。所望のβ−Gal−突然変異体−遺伝子
を含有するプラスミドを担持する細胞からの粗抽出物は
出発プラスミドの粗抽出物からゲル中で移動しかつ同じ
大きさを示すものと同一であるβ−Galバンドを示す。
1c）突然変異蛋白質β−Gal Tyr503→Gluの製造 野性型lac Z−遺伝子中のTACのかわりにGAAをアミノ酸
コドン位503に有する配列： ５′TGC CCG ATG GAA GCG CGC GTG 3′，（Ｉ） のオリゴヌクレオチドを使用する。これによりこの位置
でTyrのかわりにGlu基がコードされる。この所望の突然
変異を有するプラスミドは出発プラスミドよりRsa I−
切断位１つ少ない。
1d）突然変異蛋白質β−Gal Glu461→Ala及びTyr503→P
heの製造 野性型lac Z−遺伝子中のGAAのかわりにアミノ酸コドン
位461にGCAを有する配列： ５′TG GGG AAT GCA TCA GGC CA 3′，（II） 及び野性型lac Z−遺伝子中のTACのかわりにアミノ酸コ
ドン位503でTTTを有する配列： ５′TGC CCG ATG TTT GCG CGC GTG 3′，（III） の両方のオリゴヌクレオチドを使用する。
この所望の突然変異を有するプラスミドは出発プラスミ
ドよりHinf I−切断位１つとRsa I−切断位１つを少な
く有する。
例２ 天然β−ガラクトシダーゼ及びGal突然変異蛋白質の比
較 2.1大腸菌のバイオマスからの清浄化 天然のβ−Galのための遺伝的インフオメーシヨンを有
する大腸菌のバイオマスもしくは1c又は1dにより得られ
たプラスミドを含有する形質転換大腸菌のバイオマスを
10l発酵器中の好適な培地中で製造する。β−Galの単離
をG.R.クラーベン（Craven）、E.ステイーヤーズ（Stee
rs）Jr.、C.B.アンフインゼン（Anfinsen）著、J.Biol.
Chem.第240巻（1965年）、第2468〜2477頁により実施す
る。この方法は硫酸アンモニウム沈殿工程、ゲル濾過工
程及びアニオン交換体−クロマトグラフイー工程を包含
する。Gal突然変異蛋白質はすべての精製工程において
同じ方法で処理する際に天然のβ−Galと区別不可能に
挙動する。酵素活性がないのでこの突然変異蛋白質の富
化はTSK G4000カラムでの高分解能ゲル濾過により管理
する（第2.3.1参照）。
Gal蛋白質の高い分子量は、通常の大腸菌蛋白質の背景
上にすべての精製工程にわたつて定量的に評価すること
のできる著しく特徴的な蛋白質ピークの原因となる。
2.2酵素活性 2.2.1β−ガラクトシダーゼの酵素活性の測定法 生じた２−ニトロフエノールをHg405nmにおいて測定 溶液： 1.燐酸カリウム−緩衝液（0.05mol/l;pH7.8）： ａ）KH2PO40.68gを二回蒸留した水中に溶かし、100mlと
する。
ｂ）K2HPO4・３H2O1.14gを二回蒸留した水中に溶かし、
100mlとする。
溶液ｂ）を溶液ａ）でpH値7.8に調節する。
2.塩化マグネシウム溶液（10mmol/l）： MgCl2.6H2O（M5833）203.3mgを二回蒸留した水100ml中
に溶かす。
3.ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液： ２−NP−β−Ｄ−ガラクトシド5.9mgを緩衝液（１）1ml
中に溶かす（この溶液はわずかに黄色に着色していてよ
い）。
4.メルカプトエタノール溶液： ２−メルカプトエタノール69.8mlを２回蒸留した水で10
0mlとする。
試料溶液： 天然のβ−ガラクトシダーゼもしくはβ−Gal−突然変
異蛋白質の原溶液を緩衝液１で希釈する。
実施 測定光 Hg405nm;層厚:1cm; 試験容量:2.98ml;温度:37℃ 計算 2.2.2活性測定の結果 天然β−Gal 600〜650U/mg蛋白質 Gal突然変異蛋白質（Glu 503） ＜0.2U/mg蛋白質 Gal突然変異蛋白質（Ala 461/Phe 503） ＜0.2U/mg蛋白質 2.3高分解能分析方による分析 2.3.1アニオン交換体−クロマトグラフイー 分離カラム モノQ HR5/5（Pharmacia） 緩衝液Ａ 20mAトリス/HClpH7.6 緩衝液Ｂ 20mMトリス/HCl、1MNaClpH7.6 流速 1ml/分 ペーパー送り 0.5cm/分 傾斜溶液の形 第１図参照 UV−モニター280nm 室温 結果：天然β−GalおよびGal突然変異蛋白質（Glu503）
又はGal突然変異蛋白質（Ala461/Phe503）のような典型
的なGal突然変異蛋白質は区別不可能な第１図のクロマ
トグラムを示す。
2.3.2ゲル濾過 分離カラムTSK G4000 SW、7.5×300mm（LKB） 緩衝液0.1M燐酸カリウム/0.1％ナトリウムアチド、pH6.
8 流速 1ml/分 ペーパー送り 0.5cm/分 UV−モニター 280nm 室温 結果：天然β−Gal及び典型的なGal突然変異蛋白質、例
えばGal突然変異蛋白質（Glu503）又はGal突然変異蛋白
質（Ala461/Phe503）は差異なく第２図のクロマトグラ
ムを示す。分子量公知の基準蛋白質を用いた分離カラム
の較正により、天然のβ−Gal及びGal突然変異蛋白質は
約520000の分子量を有する。
2.3.3ポリアクリルアミドゲル電気泳動 電気泳動装置：フアスト（Phast）−システム（Pharmac
la） 傾斜ゲル８〜25％（Pharmacia） 天然電気泳動のための緩衝剤条件 フアルマシアのフアストシステム便覧による実施 コオマシー（Coomassie）染料での染色 結果：天然β−Gal及びGal突然変異蛋白質の2.1により
精製した調整物は第３図からわかるように異なるバンド
パターンを示さない。
2.4マウス−Fabとの結合における挙動によるGal突然変
異蛋白質の特徴付け Gal突然変異蛋白質の精製した調整物を例３に記載した
ようにマウス−Fabと結合させた。セフアロース6Bでの
ゲルクロマトグラフイーの前に結合配合物から１つの試
料（50μｌ）をTSK G4000での高度解析性ゲルクロマト
グラフイーにより分析する。得られた架橋パターン（第
4a図参照）は結合体マウス−Fab−Gal突然変異蛋白質の
分子量分布を特徴づける。第4b図は天然β−Galと結合
したマウス−Fabの結合配合物に関する相応するパター
ンである。
結果:Gal突然変異蛋白質（Glu503）はマウス−Fabとの
結合において天然β−Galと同じ挙動を示す；すなわちG
al突然変異蛋白質のSH−基は天然β−GalのSH−基と同
様にマレインイミド結合試薬との架橋に利用される。同
じ結果はGal突然変異蛋白質（Phe503）に関しても得ら
れる。
異なる天然β−Galチヤージ及び異なる結合配合物に関
しても同様な小さな差が回避されないので、パターン4a
及び4bの差は明らかでない。
2.5羊−抗β−Gal抗体に対する免疫活性の試験 2.5.1試験法 試験原理：マイクロ検量プレートの凹部のプラスチツク
にポリクロナール羊−抗−β−Gal−IgG−抗体を吸着さ
せる。β−GalもしくはGal突然変異蛋白質の希釈財の試
料でそのように被覆した凹部を満たす。免疫反応性蛋白
質はそれぞれのプラスチツク壁で希釈の濃度に比例して
結合する。凹部の洗浄後それぞれ結合した免疫反応性蛋
白質をペルオキシダーゼ標識羊−抗−β−Gal−Fabと混
合する。免疫反応性Gal−蛋白質のすでに壁に結合した
量に比例してペルオキシダーゼ結合体は固相に結合す
る。新たに洗浄した後、それぞれの壁に結合したPOD−
活性を基質添加（ABTSR）により発現させ、マイクロ検
量プレート用測光機で定量的に測定する。
試験実施： 第１工程：マイクロ検量プレートの各凹部中に40mM 燐酸カリウム緩衝液、pH7.4 1mlあたり羊− 抗−β−Gal IgG10μｇの溶液0.2mlをピペ ツトで入れる。室温で60分間恒温保持する。
第２工程：各凹部をカニユーレで吸引し、緩衝液Ａ（50
mM燐 酸カリウム緩衝液/100mM NaCl、pH7.5）中の 牛血清アルブミン10mgの溶液0.3mlで 満たす。室温で60分間恒温保持する。
第３工程：凹部を吸引して空にし、各２つの凹部を 0.1％牛血清アルブミンを含有する緩衝液A1m
lあたりβ −Gal0、５、10、20、30、30mgを含有する 希釈物0.2mlで満たす。室温で60分間恒温 保持する。
第４工程：すべての凹部を吸引し、緩衝液A0.3mlで満た
し 、新たに吸引する。次いで、各凹部あたり緩
衝 液A/0.1％牛血清アルブミン中のペルオキシ ダーゼ−羊−抗−β−Gal Fabの溶液0.2ml をピペツトで入れる（ペルオキシダーゼ含量 100mU/ml）。室温で60分恒温保持。
第５工程：すべての凹部を吸引し、緩衝液Ａで２回洗浄 する。次いで0.1M燐酸カリウム／クエン酸塩
緩 衝液pH4.4中のABTSR（ベーリンガー・マン ハイム社）100mgを有する基質溶液0.2ml をそれぞれ装入する。室温で60分間恒温保持
する。
第６工程：凹部中の着色溶液の吸光をマイクロ検量 プレート用の測光機で405nmで測定する。
評価：各蛋白質希釈に関する対になつている吸光度二重
値を平均し、この値をダイヤグラムの縦座標に、属する
横座標に記載された蛋白質濃度に関して記載する。点を
適合する線で結ぶ。β−GalもしくはGal−突然変異蛋白
質に関してこの試験を実施して得られる典型的なグラフ
を第５図として示す。
2.5.2結果 第５図は酵素免疫テストにおける吸光度がβ−Galもし
くはGal−突然変異蛋白質の蛋白質量に依存することを
グラフにより示す。実験したGal−突然変異蛋白質に関
する曲線は測定誤差限界の範囲において天然β−Galの
曲線と同じである。すなわち、すべての突然変異蛋白質
は天然β−Galで羊を免疫化することにより得られる抗
体により免疫原天然β−Galと全く同様に認識される。
これを言いかえると、突然変異蛋白質の表面上の免疫決
定基はその天然のβ−Galと識別不可能である。
例３ マウス−Fab−β−ガラクトシダーゼ結合体の製造 β−ガラクトシダーゼのFab−フラグメントへの共有結
合はT.キタガワ（“Enzyme Immunoassay"、発行者:E.イ
シカワ、T.カワイ、K.ミヤイ、医学書院、東京／ニユー
ヨーク、1981年、第81〜89頁）の記載に従う。Fab−蛋
白質10mgを0.05M燐酸塩緩衝液pH7.0、2ml中に溶かし、
テトラハイドロフラン中のＮ−（ｍ−マレインイミドベ
ンゾイルオキシ）サクシンイミド（5mg/ml）の溶液75μ
ｌと混合する。該混合物を室温で30分間恒温保持し、時
々振盪する。セフアデツクスG25−充填15mlのゲルクロ
マトグラフイーカラム（Pharmacia）を介して反応混合
物を通過させることにより、反応したFabを過剰の試薬
から分離する。使用緩衝液は10mM燐酸塩緩衝液pH6.2で
ある。
マレインイミドヘキサノイル化Fab（Fab−蛋白質8mg）
に0.075M燐酸塩緩衝液pH7.02ml中のβ−ガラクトシダー
ゼ（大腸菌）20mgを加え、室温で２時間恒温保持する。
反応生成物をセフアロース6B（Pharmacia）でゲルクロ
マトグラフイーにより精製する。カラムの寸法は２×50
cm;クロマトグラフイー緩衝液、0.02M燐酸塩/1mM MgCl2
/0.1％ナトリウムアジド、0.1％NaCl。活性結合体フラ
クシヨンを590000〜約2500000の分子量においてカラム
から溶離する。これらのフラクシヨンから試験配合物中
に試料分ずつ取り出して使用することにより試験に好適
なフラクシヨンを求める。最も有利なフラクシヨンをプ
ールする。
例４ 標識酵素β−ガラクトシダーゼに対する妨害フアクター
の存在において人血清中のチレオトロピン（TSH）の測
定 測定を乾燥化学試薬担体で二重−抗体固相−サンドイツ
チ−原理（DASP）による１工程試験において西ドイツ国
特許公告第3425008.5号公報中に記載された分析装置を
備える遠心分離分析機を用いて回転装入部材中で実施す
る。
1.試薬溶液の製造 1.1緩衝財Ｉ K2HPO4溶液50mmol/lとKH2PO4溶液50mmol/lとをpH値6.0
が達せられるまで混合することにより燐酸カリウム緩衝
液、pH6.0、50mmol/lを製造する。
1.2緩衝剤II pH値を7.5に調節し、緩衝液が付加的に牛血清アルブミ
ン10g/l及びNaCl150mmol/lを含有するという差以外は緩
衝液Ｉと同様に緩衝液IIを製造する。
1.3TSHと結合製のレセプターR1−溶液レセプターR1とし
てはモノクロナールマウス−抗−TSH−抗体を使用す
る。この抗体を含有する腹水に硫酸アンモニウムを全1.
8mo/lで加える。沈殿を燐酸ナトリウム15mmol/l、pH7.0
及び塩化ナトリウム50mmol/lからなる緩衝液中に取り込
む。このようにして得られたTSH−結合性溶液をDEAE−
セルロースを介して通過させる。このように得られたTS
H−結合性抗体を含有する溶離液を緩衝液IIで蛋白質濃
度１μg/mlに希釈する。
1.4酵素標識レセプターR3−溶液 レセプターR3としては同様にモノクロナールマウス−抗
−TSH−抗体を使用するが、この抗体はレセプターR1以
外の抗原決定基を認識する。この抗体を含有する腹水を
1.3に記載したように精製する。完全な抗体をR.P.ポー
ター（Porter）（Biochem.J.第73巻、1959年、第119
頁）の方法による公知法で切断してFab−フラグメント
とする。得られたFab−フラグメントを例３によりβ−
ガラクトシダーゼと結合する。該レセプターR3−β−ga
l−結合体溶液を緩衝液II中に500mU/mlの濃度に希釈す
る（ｏ−ニトロフエニル−β−ガラクトシドを用いて37
℃で測定）。
1.5不活性酵素溶液；β−Gal−突然変異蛋白質（Glu50
3） 酵素不活性であるが、その表面構造において変化してお
らず、このため天然酵素と同じ抗原決定基を有する、コ
ドン503での点突然変異により天然標識酵素β−ガラク
トシダーゼ（レセプターR3中）の所定の変化により生じ
たβ−Gal−突然変異蛋白質（Glu503）は緩衝液II中で1
mg/mlの濃度に希釈される。
1.6レセプターR2−溶液 羊−抗−マウス−Fcr−抗血清に硫酸アンモニウムを全
1.8mol/lで加える。沈殿を燐酸ナトリウム15mmol/l、pH
7.0及び塩化ナトリウム50mmol/lからなる緩衝液中に取
り込む。このように得られた溶液をDEAE−セルロースを
介して通過させる。特異的な抗体を含有する溶離液を緩
衝液Ｉ中で50μg/mlの蛋白質濃度に希釈する。
1.7基質溶液 クロルフエノールレツド−β−ガラクトシド（西ドイツ
特許第3345748号明細書により製造） 5mmol/l（3.05g/
l） HEPES 70mmol/l（16.7g/l） NaCl 154mmol/l（9g/l） 牛血清アルブミン 0.3％ （3g/l） ツウイーン 20 0.2％ （2g/l） pH（NaOHで） 7.25 2.試薬担体の製造 2.1試薬担体 １（突然変異蛋白質なし） １あたり燐酸ナトリウム100mmol、pH7.3（37℃）、塩
化マグネシウム2mmol、塩化ナトリウム9g、牛血清アル
ブミン5g、マウスからの抗−TSHモノクロナール抗体
（レセプターR1）5mg、抗−TSH−抗体−（マウス）−Fa
b−フラグメント−β−ガラクトシダーゼ結合体1000U
（レセプター−R3−結合体溶液；活性は37℃でオルト−
ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシドで測定）を含有
する溶液40μｌを市販のポリエステルペーパーからなる
フリース上に滴下する。引き続き、室温で乾燥する。こ
のフリースを使用するで４℃で空気相対湿度20％で貯蔵
する。
2.2試薬担体１′（突然変異蛋白質の添加） 製造は、含浸溶液１あたり付加的にβ−Gal−突然変
異蛋白質（Glu503）を含有する他は全く試薬担体１と同
様に行なう。
2.3試薬担体２ マウス抗体のFcγ−部に対する羊抗体（レセプターR2溶
液）をブロムシアン活性化法（西ドイツ国特許公開第17
68512号公報）により固定し、その際繊維材料1gあたり
抗体10μｇを固定に提供する。洗浄により結合していな
い抗体を除去し、フリースを室温で注意深く乾燥する。
このようにして得られたフリースの貯蔵は試薬担体１と
同様にして行なう。
3.測定の実施 これら両方の試薬担体１及び２、もしくは１′及び２を
用いて測定を、西ドイツ国特許公告第3425008.5号公報
中に記載されている分析測定を実施するための装置によ
り行なう。
該明細書は第６図に図示した１つの構造部材より成る自
動遠心分析装置用回転子差込部材を開示しており、この
構造部材は一定の試薬で含浸された吸収性担持材料をそ
れぞれ包含する複数個の試薬区分と連結している試料装
入室、少なくとも１個の混合弁室及び測定室を有してお
り、同時にこれらは、差込部材が回転子上に固定され、
かつ溶液を吸収する少なくとも１個の他の室及びこの室
から測定部に通じていて、試料液体輸送路と少なくとも
部分的に同一である輸送路を有する際に、半径方向で内
側から外側へ案内する試料液体輸送路を構成する。その
際に、試料液体輸送路は試料装入室Ｐから、吸収性材料
が充填され、緩衝液を含有する室ａ、室ｃ及び室ａとｃ
との間に配置した第１弁室VK1を介して第２弁室VK2に連
結し、かつ弁室VK2から室ｄ及び捕集室AKを介して測定
室Ｋに接続している。他の液体を収容するためポンプ室
として構成した基質室PKが設けられており、この基質室
PKは配量室DK及び毛管Kapより成る配量装置と溢流室
Ｋを介して第２弁室VK2と連結している。
吸光度ａ（妨害シグナルを包含する測定シグナル）の測
定のためには試薬担体１及び試薬担体２を使用し、吸光
度ｂ（妨害シグナルのない特異的な測定シグナル）の測
定のためには試薬担体１′及び２を使用する。
試薬担体１もしくは１′を回転子差込部材の区分ｃ上
に、試薬担体２を区分ｄ上に装入する。この際、濃縮試
薬40μｌを上縁部の開口部を通して直接区分ａ上にピペ
ツトで装入する。基質溶液270μｌを室PKにピペツト装
入する。高い回転数と停止とを交互に組合わせた好適な
遠心分離プログラムにより試料と基室は分離マトリツク
スとキユベツトの方向に供給される。
この際、プログラムの進行において突然変異蛋白質を有
していないか、もしくは有しているレセプターR1及びR3
は試料液体によつて区分ｃから溶離し、引き続き均質な
混合物が反応にもたらされる。区分ｄ上では形成された
複合体がR1を介してレセプターR2に結合する。区分ｃか
らｄへの試料の移動は非常に短時間で行なわれる。
基質溶液は配量室DKを通つて少量ずつに分けられ、その
うちの最初のものは過剰の、複合体形成していない結合
体の洗出に使われる。
R3を架橋するであろう妨害フアクターは天然標識酵素に
対して20倍過剰のβ−Gal−突然変異蛋白質を使用する
際無力化され、同様に洗出される（試薬担体R1′の使
用）。
ｄ上に複合体形成により結合したβ−ガラクトシダーゼ
活性は試料中に含有されるTSH量にもしくは試料空値に
比例する。この活性は他の基質で測定され、この際この
基質は５分間の反応で有色生成物となる。液相中で形成
された色素及び異なる発色／分をキユベツト中576nmで
測定する。
この条件下に次の結果が得られた： すべての測定をλ＝576nmで層厚0.3cmで実施し、層厚ｄ
＝1cmに換算する。
ａ）試薬担体１を使用するTSH−測定 ｂ）ガラクトシダーゼ特異的妨害フアクターの無力化の
ためのβ−Gal−突然変異蛋白質を含有する試薬担体
１′を使用するTSH測定 ｃ）TSH−標準を2.IRP80/588で較正。
例５ 人血清中のチレオトロピン（TSH）の測定非特異的空値
の低下 測定を例４と同様に実施する。すべての試薬溶液は例４
の1.5に記載された溶液と同一である。この場合、不活
性β−ガラクトシダーゼ突然変異蛋白質で標識された被
分析物非特異的Fab−結合体溶液を使用する。
製造： 天然の標識酵素β−ガラクトシダーゼ（レセプターR
3中）をコドン503で点突然変異させることによる所定の
変化により生じた、酵素的に不活性であるが表面構造は
変わつていない、従つて天然酵素と同様な抗原決定基を
有するβ−Gal−ムテイン（Glu503）を例４の1.4に記載
されているように免疫グロブリンのFab−部と結合させ
るが、この際このFab−部は被分析物に結合性ではな
い。このようにして得られた突然変異蛋白質−Fab−結
合体を緩衝液II中に1mg/mlの濃度に希釈する。
試薬担体の製造も、測定の実施も例４と同様に行なう。
非特異的な空値の原因となる血清フアクターは過剰の
（免疫学的並びに酵素的に不活性な突然変異蛋白質−Fa
b−結合体）の使用において無力化並びに洗浄される
（試薬担体R1′の使用）。
ｄ上に複合体形成を介して結合したβ−ガラクトシダー
ゼ活性は試料中に含有されるTSH−量もしくは試料空値
に比例する。
この活性は他の基質で測定され、この際この基質を５分
間反応させた有色生成物にする。液層中のこの生じた色
及び更なる発色／分をキユベツト中576nmで測定する。
この条件下に次の結果が得られる： すべての測定をλ＝576nmで層厚0.3cmで実施し、層厚ｄ
＝1cmに換算する。
ａ）試薬担体１を使用するTSH−測定 ｂ）非特異的空値の減少のために突然変異蛋白質−Fab
−結合体を含有する試薬担体１′を使用するTSH−測
定。
ｃ）TSH−標準を2.IRP80/588で較正。
【図面の簡単な説明】
第１図は例2.3.1によるアニオン交換体でのクロマトグ
ラフイーの結果を示すグラフ図であり、第２図は例2.3.
2によるゲル濾過クロマトグラフイーの結果を示すグラ
フ図であり、第３図は例2.3.3によるポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果を示す図であり、第4a図はマウス
−FabとGal−突然変異蛋白質Phe503との架橋パターンを
示すグラフ図であり、第4b図はマウス−Fabと天然β−
ガラクトシダーゼとの架橋パターンを示すグラフ図であ
り、第５図はGal−突然変異蛋白質及び天然β−Galの免
疫活性を示したグラフ図であり、第６図は例４及び５で
使用した遠心分離−回転子差込部材の該略図である。 PK……基質室、DK……計量室、Kap……毛管、Ｋ……
溢流室、Ｐ……試料装入室、a,b,c,d……室、VK1,VK2…
…弁室、AK……補集室、Ｋ……測定室。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/535 8310−2Ｊ 33/543 Ｃ 8310−2Ｊ (72)発明者 ヴエルナー・シユトツク ドイツ連邦共和国グレーフエルフイング・ グラヴオルフシユトラーセ ２

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】天然配列の461番目のアミノ酸Glu及び／又
    は503番目のアミノ酸Tyrが他のアミノ酸で置換されてお
    り、かつ酵素活性は天然の酵素に対して１％以下である
    ことを特徴とする酵素不活性で免疫活性のβ−ガラクト
    シダーゼ−突然変異蛋白質。
  2. 【請求項２】461番目のアミノ酸Gluがアミノ酸Ser、Al
    a、Asp、Tyrの１つで及び／又は503番目のアミノ酸Tyr
    がアミノ酸Phe、Glu又はSerの１つで置換されている請
    求項１記載のβ−ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質。
  3. 【請求項３】請求項１による酵素不活性で免疫活性のβ
    −ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質の遺伝子工学的製
    法において、β−ガラクトシダーゼをコードするプラス
    ミド中のDNA配列を、表現後蛋白質の461番目のアミノ酸
    Glu及び／又は503番目のアミノ酸Tyrが他のアミノ酸で
    置換されているように、特定部位の突然変異誘発により
    変化させることを特徴とする酵素不活性で免疫活性のβ
    −ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質の製法。
  4. 【請求項４】461番目のアミノ酸Gluをアミノ酸Ser、Al
    a、Asp、Tyrの１つで及び／又は503番目のアミノ酸Tyr
    をアミノ酸Phe、Glu又はSerの１つで置換する請求項３
    記載の方法。
  5. 【請求項５】標識酵素として酵素β−ガラクトシダーゼ
    を使用する、酵素−イムノアッセイ（EIA）の原理によ
    る血清蛋白質の免疫学的測定において、テスト結果を誤
    まらせることのある抗−β−ガラクトシダーゼ−抗体又
    は他のβ−GALに作用する結合蛋白質を捕捉するため
    に、請求項１又は２記載の酵素不活性で免疫活性のβ−
    ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質を使用することを特
    徴とする血清蛋白質の免疫学的測定法。
  6. 【請求項６】酵素不活性β−ガラクトシダーゼ−突然変
    異蛋白質を被分析物に結合活性でない免疫グロブリンの
    Fab部と一緒に使用する請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】酵素不活性β−ガラクトシダーゼ−突然変
    異蛋白質が被分析物に結合活性でない免疫グロブリンの
    Fab部と化学的に結合して存在する請求項６記載の方
    法。
  8. 【請求項８】被分析物に結合活性でない免疫グロブリン
    のFab部と酵素不活性β−ガラクトシダーゼ−突然変異
    蛋白質とからの混合物を使用する請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】血清妨害の回避のための、かつ非特異的空
    値の低下のための、標識酵素としてβ−ガラクトシダー
    ゼを含有する酵素イムノアッセイ（EIA）のための試薬
    において、請求項１又は２記載の酵素不活性、免疫活性
    β−ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質を使用する酵素
    イムノアッセイ用試薬。
  10. 【請求項１０】酵素不活性で、免疫活性のβ−ガラクト
    シダーゼ−突然変異蛋白質を、被分析物に結合活性でな
    い免疫グロブリンのFab部と一緒に含有する請求項９記
    載の試薬。
  11. 【請求項１１】β−ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質
    及び被分析物に結合活性でない免疫グロブリンのFab部
    が混合物として存在する請求項10記載の試薬。
  12. 【請求項１２】β−ガラクトシダーゼ−突然変異蛋白質
    及び被分析物に結合活性でない免疫グロブリンのFab部
    を化学的に結合した形で含有する請求項10記載の試薬。
JP63180448A 1987-07-24 1988-07-21 酵素不活性で免疫活性のβ‐ガラクトシダーゼ‐突然変異蛋白質、その製法、血清蛋白質の免液学的測定法及び酵素イムノアツセイ用試薬 Expired - Lifetime JPH0693835B2 (ja)

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DE3724625.9 1987-07-24
DE19873724625 DE3724625A1 (de) 1987-07-24 1987-07-24 Enzymatisch inaktive, immunologisch aktive ss-galactosidase-muteine

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JPS6467197A JPS6467197A (en) 1989-03-13
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