JPH0698032B2 - クレアチンもしくはクレアチニンの測定法及びこれらの測定用試薬 - Google Patents
クレアチンもしくはクレアチニンの測定法及びこれらの測定用試薬Info
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- JPH0698032B2 JPH0698032B2 JP62013645A JP1364587A JPH0698032B2 JP H0698032 B2 JPH0698032 B2 JP H0698032B2 JP 62013645 A JP62013645 A JP 62013645A JP 1364587 A JP1364587 A JP 1364587A JP H0698032 B2 JPH0698032 B2 JP H0698032B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素法による体液中のクレアチン又はクレア
チニンの測定法及びこれらの測定用試薬に関する。
チニンの測定法及びこれらの測定用試薬に関する。
［従来技術］ 現在、腎臓疾患、筋肉疾患の重要な検査項目として、血
清、尿中のクレアチニンあるいはクレアチンが、それぞ
れ臨床検査室で測定されている。その測定法の大部分
は、非特異的な化学反応に基づくヤツフエ法でおこなわ
れ、測定値に誤差が生じる大きな欠点がある。最近にな
つて、この欠点を克服するために種々の酵素的測定法が
開発されているが、例えば次の酵素反応による発色定量
法が挙げられる。（特公昭60−3480）。
清、尿中のクレアチニンあるいはクレアチンが、それぞ
れ臨床検査室で測定されている。その測定法の大部分
は、非特異的な化学反応に基づくヤツフエ法でおこなわ
れ、測定値に誤差が生じる大きな欠点がある。最近にな
つて、この欠点を克服するために種々の酵素的測定法が
開発されているが、例えば次の酵素反応による発色定量
法が挙げられる。（特公昭60−3480）。
［発明が解決しようとする問題点］ この方法は、ヤツフエ法に影響を与える各種物質（蛋白
質、ケトン体、セフアロスポリン系抗生物質等）の影響
がなく非常に優れた方法である。しかし、ザルコシン・
オキシダーゼはその基質特異性のために、ザルコシンの
みならず、治療上投与されている薬物（例えばリドカイ
ン等）の代謝物質であるＮ−エチルグリシンにも作用す
るので、プラスの誤差（測定値の異常高）が生じてくる
という欠点がある。このような酵素法による従来の測定
法の欠点を解消すべく鋭意検討を重ねた結果、被検試料
中に存在するＮ−エチルグリシンに対し極めて高い作用
活性を有する酵素を用いて該物質を予め分解した後、ク
レアチンもしくはクレアチニンを測定すれば、精度良く
試料中のクレアチンもしくはクレアチニンを測定出来る
ことを知り本発明を完成した。
質、ケトン体、セフアロスポリン系抗生物質等）の影響
がなく非常に優れた方法である。しかし、ザルコシン・
オキシダーゼはその基質特異性のために、ザルコシンの
みならず、治療上投与されている薬物（例えばリドカイ
ン等）の代謝物質であるＮ−エチルグリシンにも作用す
るので、プラスの誤差（測定値の異常高）が生じてくる
という欠点がある。このような酵素法による従来の測定
法の欠点を解消すべく鋭意検討を重ねた結果、被検試料
中に存在するＮ−エチルグリシンに対し極めて高い作用
活性を有する酵素を用いて該物質を予め分解した後、ク
レアチンもしくはクレアチニンを測定すれば、精度良く
試料中のクレアチンもしくはクレアチニンを測定出来る
ことを知り本発明を完成した。
本発明は下記の方法及び試薬を提供するものである。
（１） クレアチン・アミジノヒドロラーゼを用いて試
料中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在する
Ｎ−エチルグリシンを酵素的に分解した後、ザルコシン
・オキシダーゼを作用させることを特徴とするクレアチ
ンの測定方法。
料中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在する
Ｎ−エチルグリシンを酵素的に分解した後、ザルコシン
・オキシダーゼを作用させることを特徴とするクレアチ
ンの測定方法。
（２） クレアチン・アミジノヒドロラーゼを用いて試
料中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在する
Ｎ−エチルグリシンを該物質に対するKm値（ミカエリス
定数）が20mM以下のザルコシン・オキシダーゼで分解し
た後、該物質に対するKm値（ミカエリス定数）が50mM以
上のザルコシン・オキシダーゼを添加するか又は別個に
作用させてクレアチンを測定することを特徴とする上記
第（１）項記載の方法。
料中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在する
Ｎ−エチルグリシンを該物質に対するKm値（ミカエリス
定数）が20mM以下のザルコシン・オキシダーゼで分解し
た後、該物質に対するKm値（ミカエリス定数）が50mM以
上のザルコシン・オキシダーゼを添加するか又は別個に
作用させてクレアチンを測定することを特徴とする上記
第（１）項記載の方法。
（３） クレアチニン・アミドヒドロラーゼとクレアチ
ン・アミジノヒドロラーゼを用いて試料中のクレアチニ
ンを測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチルグリ
シンを酵素的に分解した後、ザルコシン・オキシダーゼ
を作用させることを特徴とするクレアチニンの測定方
法。
ン・アミジノヒドロラーゼを用いて試料中のクレアチニ
ンを測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチルグリ
シンを酵素的に分解した後、ザルコシン・オキシダーゼ
を作用させることを特徴とするクレアチニンの測定方
法。
（４） クレアチニン・アミドヒドロラーゼとクレアチ
ン・アミジノヒドロラーゼを用いて、試料中のクレアチ
ニンを測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチルグ
リシンを該物質に対するKm値（ミカエリス定数）が20mM
以下のザルコシン・オキシダーゼで分解した後、該物質
に対するKm値（ミカエリス定数）が50mM以上のザルコシ
ン・オキシダーゼを添加するか又は別個に作用させてク
レアチニンを測定することを特徴とする上記第（３）項
記載の方法。
ン・アミジノヒドロラーゼを用いて、試料中のクレアチ
ニンを測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチルグ
リシンを該物質に対するKm値（ミカエリス定数）が20mM
以下のザルコシン・オキシダーゼで分解した後、該物質
に対するKm値（ミカエリス定数）が50mM以上のザルコシ
ン・オキシダーゼを添加するか又は別個に作用させてク
レアチニンを測定することを特徴とする上記第（３）項
記載の方法。
（５） ザルコシン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシ
ンに対するKm値;20mM以下（pH8、37℃）］及びカタラー
ゼ、又は上記ザルコシン・オキシダーゼ、並びに４−ア
ミノアンチピリンと酸化縮合する水素供与体及びパーオ
キシダーゼから成る第１反応試薬及びクレアチン・アミ
ジノヒドロラーゼ、ザルコシン・オキシダーゼ［Ｎ−エ
チルグリシンに対するKm値;50mM以上（pH8、37℃）］、
パーオキシダーゼ及びH2O2発色剤から成る第２反応試薬
を組合せて成るクレアチン測定用試薬。
ンに対するKm値;20mM以下（pH8、37℃）］及びカタラー
ゼ、又は上記ザルコシン・オキシダーゼ、並びに４−ア
ミノアンチピリンと酸化縮合する水素供与体及びパーオ
キシダーゼから成る第１反応試薬及びクレアチン・アミ
ジノヒドロラーゼ、ザルコシン・オキシダーゼ［Ｎ−エ
チルグリシンに対するKm値;50mM以上（pH8、37℃）］、
パーオキシダーゼ及びH2O2発色剤から成る第２反応試薬
を組合せて成るクレアチン測定用試薬。
（６） クレアチン・アミジノヒドロラーゼ、ザルコシ
ン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するKm値;2
0mM以下（pH8、37℃）］及びカタラーゼ、又は上記クレ
アチン・アミジノヒドロラーゼ及びザルコシン・オキシ
ダーゼ、並びに４−アミノアンチピリンと酸化縮合する
水素供与体及びパーオキシダーゼから成る第１反応試薬
及びクレアチニン・アミドヒドロラーゼ、ザルコシン・
オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するKm値;50mM
以上（pH8、37℃）］、パーオキシダーゼ、及びH2O2発
色剤とから成る第２反応試薬を組合せて成るクレアチニ
ン測定用試薬。
ン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するKm値;2
0mM以下（pH8、37℃）］及びカタラーゼ、又は上記クレ
アチン・アミジノヒドロラーゼ及びザルコシン・オキシ
ダーゼ、並びに４−アミノアンチピリンと酸化縮合する
水素供与体及びパーオキシダーゼから成る第１反応試薬
及びクレアチニン・アミドヒドロラーゼ、ザルコシン・
オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するKm値;50mM
以上（pH8、37℃）］、パーオキシダーゼ、及びH2O2発
色剤とから成る第２反応試薬を組合せて成るクレアチニ
ン測定用試薬。
以下、本発明を具体的に示す。先ず本発明の被検液とし
ては、血清、尿等如何なる試料でも良い。
ては、血清、尿等如何なる試料でも良い。
I.クレアチンの測定 第１反応： なお、上記反応時のpHは、何れも6.5〜9.0の範囲である
のが望ましい。前記した４−アミノアンチピリンと酸化
縮合する水素供与体としては、（ｉ）一般式（Ｉ）： （但し、Ｘはハロゲン原子、Ｙは水素原子、ハロゲン原
子、低級アルキル基、又は低級アルコキシル基、Ｚは水
素原子、スルホン酸基又はカルボキシル基を示す。）で
表わされるフエノール性化合物、（ii）一般式（II）： （但し、R1、R4は水素原子、低級アルキル基、低級アル
コキシ基、R2、R3は低級アルキル基、ヒドロキシ低級ア
ルキル基、アセチルアミド基を含む低級アルキル基また
はスルホン酸基を含む低級アルキル基を示す。）で表わ
されるアニリン誘導体、（iii）トルイジン系誘導体或
いは（iv）アニシジン系誘導体を用いることができる。
のが望ましい。前記した４−アミノアンチピリンと酸化
縮合する水素供与体としては、（ｉ）一般式（Ｉ）： （但し、Ｘはハロゲン原子、Ｙは水素原子、ハロゲン原
子、低級アルキル基、又は低級アルコキシル基、Ｚは水
素原子、スルホン酸基又はカルボキシル基を示す。）で
表わされるフエノール性化合物、（ii）一般式（II）： （但し、R1、R4は水素原子、低級アルキル基、低級アル
コキシ基、R2、R3は低級アルキル基、ヒドロキシ低級ア
ルキル基、アセチルアミド基を含む低級アルキル基また
はスルホン酸基を含む低級アルキル基を示す。）で表わ
されるアニリン誘導体、（iii）トルイジン系誘導体或
いは（iv）アニシジン系誘導体を用いることができる。
一般式（Ｉ）で表わされるフエノール性化合物として
は、例えばｐ−クロルフエノール、ｐ−ブロムフエノー
ル、2,4−ジクロルフエノール、2,4−ジブロムフエノー
ル、2,4−ジクロルフエノールスルホネート等がある。
は、例えばｐ−クロルフエノール、ｐ−ブロムフエノー
ル、2,4−ジクロルフエノール、2,4−ジブロムフエノー
ル、2,4−ジクロルフエノールスルホネート等がある。
一般式（II）で表わされるアニリン誘導体としては、例
えばジエチルアニリン、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジ
ン、ｍ−メトキシ−N,N−ジメチルアニリン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（３−メチルフエニル）−Ｎ−アセチルエチレ
ンジアミン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スル
ホプロピル）メタトルイジン、ナトリウム−Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,5
−ジメトキシアニリン等がある。
えばジエチルアニリン、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジ
ン、ｍ−メトキシ−N,N−ジメチルアニリン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（３−メチルフエニル）−Ｎ−アセチルエチレ
ンジアミン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スル
ホプロピル）メタトルイジン、ナトリウム−Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,5
−ジメトキシアニリン等がある。
トルイジン系誘導体としては例えば、N,N−ジメチル−
ｍ−トルイジン、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジン、N,N
−ジエタノール−ｍ−トルイジン、３−メチル−Ｎ−エ
チル−Ｎ′−ヒドロキシ−エチルアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−メチルフエニル）−Ｎ′−アセチルエチレ
ンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフエニル）
−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−（３−メチル
スルホンアミドエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−メチル
−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、ナト
リウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジン、ナトリウム−3,5−ジ
メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−アニリン等がある。
ｍ−トルイジン、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジン、N,N
−ジエタノール−ｍ−トルイジン、３−メチル−Ｎ−エ
チル−Ｎ′−ヒドロキシ−エチルアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−メチルフエニル）−Ｎ′−アセチルエチレ
ンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフエニル）
−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−（３−メチル
スルホンアミドエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−メチル
−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、ナト
リウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジン、ナトリウム−3,5−ジ
メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−アニリン等がある。
アニシジン系誘導体としては例えばN,N−ジメチル−ｍ
−メトキシ−アニリン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ｍ−アニシジ
ン、ナトリウム−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−3,5−ジメトキシアニリン、ｍ−アセトアミ
ド−N,N−ジエチルアニリン等がある。
−メトキシ−アニリン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ｍ−アニシジ
ン、ナトリウム−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−3,5−ジメトキシアニリン、ｍ−アセトアミ
ド−N,N−ジエチルアニリン等がある。
又、本発明に於けるH2O2の発色剤としては、（ｉ）４−
アミノアンチピリンと一般式（Ｉ）： （但し、Ｘはハロゲン原子、Ｙは水素原子、ハロゲン原
子、低級アルキル基、又は低級アルコキシル基、Ｚは水
素原子、スルホン酸基又はカルボキシル基を示す。）で
表わされるフエノール性化合物、（ii）４−アミノアン
チピリンと一般式（II）： （但し、R1、R4は水素原子、低級アルキル基、低級アル
コキシ基、R2、R3は低級アルキル基、ヒドロキシ低級ア
ルキル基、アセチルアミド基を含む低級アルキル基また
はスルホン酸基を含む低級アルキル基を示す。）で表わ
されるアニリン系誘導体、（iii）４−アミノアンチピ
リンとトルイジン系誘導体、（iv）４−アミノアンチピ
リンとアニシジン系誘導体、或いは（ｖ）ジエチルアニ
リンまたはジメチルアニリンと３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾンを用いることができる。
アミノアンチピリンと一般式（Ｉ）： （但し、Ｘはハロゲン原子、Ｙは水素原子、ハロゲン原
子、低級アルキル基、又は低級アルコキシル基、Ｚは水
素原子、スルホン酸基又はカルボキシル基を示す。）で
表わされるフエノール性化合物、（ii）４−アミノアン
チピリンと一般式（II）： （但し、R1、R4は水素原子、低級アルキル基、低級アル
コキシ基、R2、R3は低級アルキル基、ヒドロキシ低級ア
ルキル基、アセチルアミド基を含む低級アルキル基また
はスルホン酸基を含む低級アルキル基を示す。）で表わ
されるアニリン系誘導体、（iii）４−アミノアンチピ
リンとトルイジン系誘導体、（iv）４−アミノアンチピ
リンとアニシジン系誘導体、或いは（ｖ）ジエチルアニ
リンまたはジメチルアニリンと３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾンを用いることができる。
一般式（Ｉ）で表わされるフエノール性化合物として
は、例えばｐ−クロルフエノール、ｐ−ブロムフエノー
ル、2,4−ジクロルフエノール、2,4−ジブロムフエノー
ル、2,4−ジクロルフエノールスルホネート等がある。
は、例えばｐ−クロルフエノール、ｐ−ブロムフエノー
ル、2,4−ジクロルフエノール、2,4−ジブロムフエノー
ル、2,4−ジクロルフエノールスルホネート等がある。
一般式（II）で表わされるアニリン誘導体としては、例
えばジエチルアニリン、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジ
ン、ｍ−メトキシ−N,N−ジメチルアニリン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（３−メチルフエニル）−Ｎ−アセチルエチレ
ンジアミン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スル
ホプロピル）メタトルイジン、ナトリウム−Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）3,5−
ジメトキシアニリン等がある。
えばジエチルアニリン、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジ
ン、ｍ−メトキシ−N,N−ジメチルアニリン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（３−メチルフエニル）−Ｎ−アセチルエチレ
ンジアミン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スル
ホプロピル）メタトルイジン、ナトリウム−Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）3,5−
ジメトキシアニリン等がある。
トルイジン系誘導体としては例えば、N,N−ジメチル−
ｍ−トルイジン、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジン、N,N
−ジエタノール−ｍ−トルイジン、３−メチル−Ｎ−エ
チル−Ｎ′−ヒドロキシ−エチルアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−メチルフエニル）−Ｎ′−アセチルエチレ
ンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフエニル）
−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−（３−メチル
スルホンアミドエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−メチル
−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、ナト
リウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジン、ナトリウム−3,5−ジ
メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−アニリン等がある。
ｍ−トルイジン、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジン、N,N
−ジエタノール−ｍ−トルイジン、３−メチル−Ｎ−エ
チル−Ｎ′−ヒドロキシ−エチルアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−メチルフエニル）−Ｎ′−アセチルエチレ
ンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフエニル）
−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−（３−メチル
スルホンアミドエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−メチル
−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、ナト
リウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジン、ナトリウム−3,5−ジ
メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−アニリン等がある。
アニシジン系誘導体としては例えばN,N−ジメチル−ｍ
−メトキシ−アニリン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ｍ−アニシジ
ン、ナトリウム−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−3,5−ジメトキシアニリン、ｍ−アセトアミ
ド−N,N−ジエチルアニリン等がある。
−メトキシ−アニリン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ｍ−アニシジ
ン、ナトリウム−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−3,5−ジメトキシアニリン、ｍ−アセトアミ
ド−N,N−ジエチルアニリン等がある。
本発明では過酸化水素の発色を妨害する検体中のアスコ
ルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させるこ
とによつて除去することができる。この場合、アスコル
ビン酸オキシダーゼは他の酵素反応に先だつて作用させ
ても、また他の酵素反応と共役させて同時に作用させて
除去してもよい。アスコルビン酸オキシダーゼとしては
植物由来のもの、好ましくはカボチヤ、キユウリ由来の
ものがある。
ルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させるこ
とによつて除去することができる。この場合、アスコル
ビン酸オキシダーゼは他の酵素反応に先だつて作用させ
ても、また他の酵素反応と共役させて同時に作用させて
除去してもよい。アスコルビン酸オキシダーゼとしては
植物由来のもの、好ましくはカボチヤ、キユウリ由来の
ものがある。
なお、ここで使用されるザルコシン・オキシダーゼ−
はＮ−エチルグリシンに対し作用活性が高く、該物質に
対するミカエリス定数Kmが20mM以下の酵素から酵素の起
源は問わないが、例えばコリネバクテリウム属、アース
ロバクター属、アルカリゲネス属、シユウドモナス属、
ミクロコツカス属等の微生物が生産するザルコシン・オ
キシダーゼがこれにあたる。これらの酵素はいずれも培
養によつて生産でき、又市販品として手することもでき
る。また、ザルコシン・オキシダーゼは、Ｎ−エチル
グリシンに対し作用活性が低く、該物質に対するミカエ
リス定数Km値は50mM以上であり、ザルコシンに対し作用
活性が高い酵素であれば、その起源を問わないが、例え
ばバチルス属の生産するザルコシン・オキシダーゼ、特
にザルコシン・オキシダーゼ−Ｎ（特開昭61−162174
号）が好適な例として挙げられる。
はＮ−エチルグリシンに対し作用活性が高く、該物質に
対するミカエリス定数Kmが20mM以下の酵素から酵素の起
源は問わないが、例えばコリネバクテリウム属、アース
ロバクター属、アルカリゲネス属、シユウドモナス属、
ミクロコツカス属等の微生物が生産するザルコシン・オ
キシダーゼがこれにあたる。これらの酵素はいずれも培
養によつて生産でき、又市販品として手することもでき
る。また、ザルコシン・オキシダーゼは、Ｎ−エチル
グリシンに対し作用活性が低く、該物質に対するミカエ
リス定数Km値は50mM以上であり、ザルコシンに対し作用
活性が高い酵素であれば、その起源を問わないが、例え
ばバチルス属の生産するザルコシン・オキシダーゼ、特
にザルコシン・オキシダーゼ−Ｎ（特開昭61−162174
号）が好適な例として挙げられる。
II、クレアチニンの測定 第１反応： 第２反応： ４−アミノアンチピリンと酸化縮合する水素供与体及び
H2O2の発色剤としては前述のクレアチンの測定に使用し
たものと同じものが使用できる。
H2O2の発色剤としては前述のクレアチンの測定に使用し
たものと同じものが使用できる。
本発明に用いる酵素は、いかなる起源、由来のものでも
よく、クレアチニン・アミドヒドロラーゼ、クレアチン
・アミジノヒドロラーゼに関しては、通常のクレアチニ
ン及びクレアチンの測定に於て用いられている酵素は例
外なく用いられるが、それらの内の数例を挙げれば、ク
レアチニン・アミドヒドロラーゼに於ては、例えば、ア
ルカリゲネス属、ペニシリユウム属、シユードモナス
属、フルボバクテリウム属、アースロバクター属、コリ
ネバクテリウム属などの微生物が産生するクレアチニン
・アミドヒドロラーゼがあり、クレアチン・アミジノヒ
ドロラーゼに於ては、例えば、シユードドモナス属、バ
チルス属、アルカリゲネス属、フラボバクテリウム属、
アースロバクター属、コリネバクテリウム属などの微生
物が産生するクレアチン・アミジノヒドロラーゼがあげ
られる。又カタラーゼ及びパーオキシダーゼも動物、植
物、微生物等の何れの起源のものを用いてもよい。これ
ら酵素はいずれも培養によつて生産でき、又市販品とし
て入手できる。
よく、クレアチニン・アミドヒドロラーゼ、クレアチン
・アミジノヒドロラーゼに関しては、通常のクレアチニ
ン及びクレアチンの測定に於て用いられている酵素は例
外なく用いられるが、それらの内の数例を挙げれば、ク
レアチニン・アミドヒドロラーゼに於ては、例えば、ア
ルカリゲネス属、ペニシリユウム属、シユードモナス
属、フルボバクテリウム属、アースロバクター属、コリ
ネバクテリウム属などの微生物が産生するクレアチニン
・アミドヒドロラーゼがあり、クレアチン・アミジノヒ
ドロラーゼに於ては、例えば、シユードドモナス属、バ
チルス属、アルカリゲネス属、フラボバクテリウム属、
アースロバクター属、コリネバクテリウム属などの微生
物が産生するクレアチン・アミジノヒドロラーゼがあげ
られる。又カタラーゼ及びパーオキシダーゼも動物、植
物、微生物等の何れの起源のものを用いてもよい。これ
ら酵素はいずれも培養によつて生産でき、又市販品とし
て入手できる。
本発明のクレアチンあるいはクレアチニンの分析は液体
中でおこなうか、または乾式分析法を用いておこなうこ
とができる。液体中でおこなう場合には、前述の第１反
応液と試料を混合して、除去すべき物質（例えばザルコ
シン、Ｎ−エチルグリシン等）を約37℃で酵素分解し、
次いで第２反応試薬を加えて酵素反応させ、試料中のク
レアチンあるいはクレアチニンから生成する過酸化水素
をパーオキシダーゼと過酸化水素の発色剤との反応で発
色させ、分光光度計で測定する。乾式分析法で行うばあ
いには、前記した第１反応試薬と第２反応試薬を別々の
吸収性担体（例えばロ紙、ストリツプ、ゼラチン質膜
等）に浸漬被覆し、その２層間にポリアクリルアミド等
の分子分画膜を入れる。これ等多層のものを支持膜で、
分光光度計で分析可能な透明な材質の上にのせる。試料
液を多層面上に滴下し、反応によつて生ずる色の度合を
測定しクレアチン或いはクレアチニンを測定する。
中でおこなうか、または乾式分析法を用いておこなうこ
とができる。液体中でおこなう場合には、前述の第１反
応液と試料を混合して、除去すべき物質（例えばザルコ
シン、Ｎ−エチルグリシン等）を約37℃で酵素分解し、
次いで第２反応試薬を加えて酵素反応させ、試料中のク
レアチンあるいはクレアチニンから生成する過酸化水素
をパーオキシダーゼと過酸化水素の発色剤との反応で発
色させ、分光光度計で測定する。乾式分析法で行うばあ
いには、前記した第１反応試薬と第２反応試薬を別々の
吸収性担体（例えばロ紙、ストリツプ、ゼラチン質膜
等）に浸漬被覆し、その２層間にポリアクリルアミド等
の分子分画膜を入れる。これ等多層のものを支持膜で、
分光光度計で分析可能な透明な材質の上にのせる。試料
液を多層面上に滴下し、反応によつて生ずる色の度合を
測定しクレアチン或いはクレアチニンを測定する。
［発明の効果］ 本発明によれば、試料中に存在するＮ−エチルグリシン
に対し作用活性の高い酵素（ザルコシン・オキシダー
ゼ）を用いて該物質を予め分解した後、クレアチンもし
くはクレアチニンを測定するため、著しく高い精度で試
料中のクレアチンもしくはクレアチニンを測定すること
が可能となり、臨床検査の診断分野において極めて有意
義である。
に対し作用活性の高い酵素（ザルコシン・オキシダー
ゼ）を用いて該物質を予め分解した後、クレアチンもし
くはクレアチニンを測定するため、著しく高い精度で試
料中のクレアチンもしくはクレアチニンを測定すること
が可能となり、臨床検査の診断分野において極めて有意
義である。
［実施例］ 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例１ 第１反応試薬：クレアチン・アミジノヒドロラーゼ（盛
進製薬株式会社製）40KU、ザルコシン・オキシダーゼ
（SO）（盛進製薬株式会社製、Ｎ−エチルグリシンに対
するKm値、11mM）3KU、西洋ワサビ由来のパーオキシダ
ーゼ7KU、アスコルビン酸オキシダーゼ0.5KU、2,4−ジ
クロルフエノールスルフオネート0.5mM、EDTA・2Na200m
g、トリトンＸ−100 0.4gを0.1モルTESグツド・バツフ
アー（pH8.0）100mlに溶解したもの。
進製薬株式会社製）40KU、ザルコシン・オキシダーゼ
（SO）（盛進製薬株式会社製、Ｎ−エチルグリシンに対
するKm値、11mM）3KU、西洋ワサビ由来のパーオキシダ
ーゼ7KU、アスコルビン酸オキシダーゼ0.5KU、2,4−ジ
クロルフエノールスルフオネート0.5mM、EDTA・2Na200m
g、トリトンＸ−100 0.4gを0.1モルTESグツド・バツフ
アー（pH8.0）100mlに溶解したもの。
第２反応試薬：クレアチニン・アミドヒドロラーゼ（盛
進製薬株式会社製）10KU、ザルコシン・オキシダーゼＮ
（特開昭61−162174号に記載の方法により製造したも
の、Ｎ−エチルグリシンに対するKm値、77mM）1KU、フ
エロシアン化カリウム1.7mg、2,4−ジクロルフエノール
スルフオネート0.15mM、４−アミノアンチピリン0.05m
M、EDTA・2Na200mg、トリトンX100 0.4gを0.1モルTES
グツド・バツフアー（pH8.0）100mlに溶解したもの。
進製薬株式会社製）10KU、ザルコシン・オキシダーゼＮ
（特開昭61−162174号に記載の方法により製造したも
の、Ｎ−エチルグリシンに対するKm値、77mM）1KU、フ
エロシアン化カリウム1.7mg、2,4−ジクロルフエノール
スルフオネート0.15mM、４−アミノアンチピリン0.05m
M、EDTA・2Na200mg、トリトンX100 0.4gを0.1モルTES
グツド・バツフアー（pH8.0）100mlに溶解したもの。
試料（ヒト血清）0.1mlを採取し、これに第１反応試薬
を0.1ml加え37℃、５分間反応させ、試料中に含まれる
クレアチン、ザルコシン、及びＮ−エチルグリシンを分
解した。次いでこれに第２反応試薬を1.5ml加え、37
℃、５分間反応させた後、ミクロスペクトロメーター
（ギルホード社製ステーサIII型）でΔOD510nmにてO.D.
値を求め、予じめ既知濃度の標準クレアチニン試料で求
めた検量線よりクレアチニン量を求めた。
を0.1ml加え37℃、５分間反応させ、試料中に含まれる
クレアチン、ザルコシン、及びＮ−エチルグリシンを分
解した。次いでこれに第２反応試薬を1.5ml加え、37
℃、５分間反応させた後、ミクロスペクトロメーター
（ギルホード社製ステーサIII型）でΔOD510nmにてO.D.
値を求め、予じめ既知濃度の標準クレアチニン試料で求
めた検量線よりクレアチニン量を求めた。
他方比較のため、クレアチニンを1.00mg/dl含有（標準
クレアチニンを1.00mg/dl添加した標準ヒト血清）ヒト
血清にＮ−エチルグリシンを0.9mg/dlの割合になるよう
に添加し、本発明法と従来法（Ｎ−エチルグリシンの分
解反応を行なわないで、第１反応試薬と第２反応試薬の
２種の試薬を混合して37℃で10分間作用させる。ただし
カタラーゼは作用させない。）で測定したところ、本発
明法では0.99mg/dl、従来法では1.81mg/dlとなつた。
クレアチニンを1.00mg/dl添加した標準ヒト血清）ヒト
血清にＮ−エチルグリシンを0.9mg/dlの割合になるよう
に添加し、本発明法と従来法（Ｎ−エチルグリシンの分
解反応を行なわないで、第１反応試薬と第２反応試薬の
２種の試薬を混合して37℃で10分間作用させる。ただし
カタラーゼは作用させない。）で測定したところ、本発
明法では0.99mg/dl、従来法では1.81mg/dlとなつた。
実施例２ 第１次反応試薬：ザルコシン・オキシダーゼ（SO）（盛
進製薬（株）製、Ｎ−エチルグリシンに対するKm値、11
mM）3KU、東洋紡（株）製西洋ワサビのパーオキシダー
ゼ7KU、東洋紡（株）製アスコルビン酸オキシダーゼ0.5
KU、2,4−ジクロルフエノールスルフオネート0.5ミリモ
ル、EDTA・２−ソーダ200mg、、トリトンＸ−100、0.4g
を100mlの0.1モルTESグツド・バツフアー（pH8.0）に溶
解したもの。
進製薬（株）製、Ｎ−エチルグリシンに対するKm値、11
mM）3KU、東洋紡（株）製西洋ワサビのパーオキシダー
ゼ7KU、東洋紡（株）製アスコルビン酸オキシダーゼ0.5
KU、2,4−ジクロルフエノールスルフオネート0.5ミリモ
ル、EDTA・２−ソーダ200mg、、トリトンＸ−100、0.4g
を100mlの0.1モルTESグツド・バツフアー（pH8.0）に溶
解したもの。
第２反応試薬：クレアチン・アミジノヒドロラーゼ3K
U、ザルコシン・オキシダーゼＮ（実施例１と同じも
の）1KU、フエロシアン化カリウム1.7mg、2,4−ジクロ
ルフエノールスルフオネート0.15ミリモル、４−アミノ
アンチピリン0.05ミリモル、EDTA・2Na200mg、トリトン
Ｘ−100、0.4gを100mlの0.1モルTESグツド・バツフアー
（pH8）に溶解したもの。
U、ザルコシン・オキシダーゼＮ（実施例１と同じも
の）1KU、フエロシアン化カリウム1.7mg、2,4−ジクロ
ルフエノールスルフオネート0.15ミリモル、４−アミノ
アンチピリン0.05ミリモル、EDTA・2Na200mg、トリトン
Ｘ−100、0.4gを100mlの0.1モルTESグツド・バツフアー
（pH8）に溶解したもの。
試料（ヒト血清）0.1mlを採取し、第１反応試薬を0.1ml
加え、５分間37℃で反応させ、試料中に含まれるザルコ
シン及びＮ−エチルグリシンを分解した。次いで、第２
反応試薬を1.5ml加えて37℃５分間反応させて、ミクロ
スペクトロホトメーター（ギルホード社製ステーサIII
型）でΔOD510nm値を求め、予め標準クレアチン試料で
求めた検量線より、クレアチン量を求めた。
加え、５分間37℃で反応させ、試料中に含まれるザルコ
シン及びＮ−エチルグリシンを分解した。次いで、第２
反応試薬を1.5ml加えて37℃５分間反応させて、ミクロ
スペクトロホトメーター（ギルホード社製ステーサIII
型）でΔOD510nm値を求め、予め標準クレアチン試料で
求めた検量線より、クレアチン量を求めた。
他方比較のためクレアチンを1.00mg/dl含有する（標準
クレアチンを1.00mg/dl添加した標準ヒト血清）ヒト血
清にＮ−エチルグリシンを0.9mg/dlの割合になるよう添
加し、本発明方法と従来法で測定したところ、本発明法
で1.01mg/dl、従来法では1.84mg/dlとなつた。
クレアチンを1.00mg/dl添加した標準ヒト血清）ヒト血
清にＮ−エチルグリシンを0.9mg/dlの割合になるよう添
加し、本発明方法と従来法で測定したところ、本発明法
で1.01mg/dl、従来法では1.84mg/dlとなつた。
前記した実施例より明らかな如く、本発明によれば従来
法と比較して、特異的な反応を行なうものであり、クレ
アチン及びクレアチニンを精度良く定量出来ることが認
められた。
法と比較して、特異的な反応を行なうものであり、クレ
アチン及びクレアチニンを精度良く定量出来ることが認
められた。
Claims (6)
- 【請求項１】クレアチン・アミジノヒドロラーゼを用い
て試料中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在
するＮ−エチルグリシンを酵素的に分解した後、ザルコ
シン・オキシダーゼを作用させることを特徴とするクレ
アチンの測定方法。 - 【請求項２】クレアチン・アミジノヒドロラーゼを用い
て試料中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在
するＮ−エチルグリシンを該物質に対するKm値（ミカエ
リス定数）が20mM以下のザルコシン・オキシダーゼで分
解した後、該物質に対するKm値（ミカエリス定数）が50
mM以上のザルコシン・オキシダーゼを添加するか又は別
個に作用させてクレアチンを測定することを特徴とする
特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 - 【請求項３】クレアチニン・アミドヒドロラーゼとクレ
アチン・アミジノヒドロラーゼを用いて試料中のクレア
チニンを測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチル
グリシンを酵素的に分解した後、ザルコシン・オキシダ
ーゼを作用させることを特徴とするクレアチニンの測定
方法。 - 【請求項４】クレアチニン・アミドヒドロラーゼとクレ
アチン・アミジノヒドロラーゼを用いて、試料中のクレ
アチニンを測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチ
ルグリシンを該物質に対するKm値（ミカエリス定数）が
20mM以下のザルコシン・オキシダーゼで分解した後、該
物質に対するKm値（ミカエリス定数）が50mM以上のザル
コシン・オキシダーゼを添加するか又は別個に作用させ
てクレアチニンを測定することを特徴とする特許請求の
範囲第（３）項記載の方法。 - 【請求項５】ザルコシン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグ
リシンに対するKm値;20mM以下（pH8、37℃）］及びカタ
ラーゼ、又は上記ザルコシン・オキシダーゼ、並びに４
−アミノアンチピリンと酸化縮合する水素供与体及びパ
ーオキシターゼから成る第１反応試薬及びクレアチン・
アミジノヒドロラーゼ、ザルコシン・オキシダーゼ［Ｎ
−エチルグリシンに対するKm値;50mM以上（pH8、37
℃）］、パーオキシダーゼ及びH2O2発色剤から成る第２
反応試薬を組合せて成るクレアチン測定用試薬。 - 【請求項６】クレアチン・アミジノヒドロラーゼ、ザル
コシン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するKm
値;20mM以下（pH8、37℃）］及びカタラーゼ、又は上記
クレアチン・アミジノヒドロラーゼ及びザルコシン・オ
キシダーゼ、並びに４−アミノアンチピリンと酸化縮合
する水素供与体及びパーオキシダーゼから成る第１反応
試薬及びクレアチニン・アミドヒドロラーゼ、ザルコシ
ン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するKm値;5
0mM以上（pH8、37℃）］、パーオキシダーゼ、及びH2O2
発色剤とから成る第２反応試薬を組合せて成るクレアチ
ニン測定用試薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62013645A JPH0698032B2 (ja) | 1987-01-23 | 1987-01-23 | クレアチンもしくはクレアチニンの測定法及びこれらの測定用試薬 |
| US07/141,043 US5047329A (en) | 1987-01-23 | 1988-01-05 | Method for the measurement of creatine or creatinine and reagents for these measurements |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62013645A JPH0698032B2 (ja) | 1987-01-23 | 1987-01-23 | クレアチンもしくはクレアチニンの測定法及びこれらの測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63182000A JPS63182000A (ja) | 1988-07-27 |
| JPH0698032B2 true JPH0698032B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=11838965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62013645A Expired - Fee Related JPH0698032B2 (ja) | 1987-01-23 | 1987-01-23 | クレアチンもしくはクレアチニンの測定法及びこれらの測定用試薬 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5047329A (ja) |
| JP (1) | JPH0698032B2 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4103220A1 (de) * | 1991-02-02 | 1992-08-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur stabilisierung von 1-methylhydantoinase, verwendung einer stabilisierten 1-methylhydantoinase zur bestimmung eines analyten, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignete mittel |
| US5662867A (en) * | 1991-12-09 | 1997-09-02 | Bayer Corporation | System for creatinine determination |
| US5547878A (en) * | 1993-11-02 | 1996-08-20 | Kell; Michael | Method of monitoring patient compliance with medications prescriptions |
| US5955370A (en) * | 1993-11-02 | 1999-09-21 | U.D. Testing, Inc. | Urine adulteration test method |
| US5776783A (en) * | 1993-11-02 | 1998-07-07 | Private Clinic Laboratories, Inc. | Method of monitoring therapeutic agent consumption |
| US6124136A (en) * | 1993-11-02 | 2000-09-26 | U. D. Testing, Inc. | Method of monitoring compliance with methadone treatment program |
| DE69432976D1 (de) * | 1993-11-02 | 2003-08-28 | U D Testing Inc | Verffahren zum überwachen der befolgung einer vorgeschriebenen medikation durch einen patienten |
| US6136801A (en) * | 1998-12-24 | 2000-10-24 | U. D. Testing, Inc. | Therapeutic agent with quantitative consumption marker |
| US6933104B1 (en) * | 1999-04-23 | 2005-08-23 | Shiva Biomedical, Llc | Diagnosis and treatment of human kidney diseases |
| WO2005052596A1 (en) * | 2003-11-28 | 2005-06-09 | Radiometer Medical Aps | A reference solution |
| EP2228645B1 (en) | 2008-05-16 | 2013-09-04 | Panasonic Corporation | Method, device and apparatus for measuring the concentration of creatinine, and method, device and apparatus for measuring the amount of salt using the same |
| JP6055236B2 (ja) * | 2011-08-17 | 2016-12-27 | 株式会社三和化学研究所 | 測定方法 |
| JP2019195300A (ja) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 東洋紡株式会社 | 測定感度を改善した生体成分測定キット及び生体成分測定方法 |
| CN109916898A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-06-21 | 吉林省汇酉生物技术股份有限公司 | 一种用于检测液体样本的干化学试剂片的制备方法 |
| CN109916895A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-06-21 | 吉林省汇酉生物技术股份有限公司 | 一种定量测定肌酐浓度的干化学试剂片及其制备方法 |
| CN111766234B (zh) * | 2020-08-07 | 2022-11-29 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 一种抗羟苯磺酸钙等药物干扰的肌酐检测试剂 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122294C3 (de) * | 1971-05-05 | 1979-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase |
| US4039384A (en) * | 1975-04-05 | 1977-08-02 | Noda Institute For Scientific Research | Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them |
| JPS603480A (ja) * | 1983-06-21 | 1985-01-09 | Toyota Motor Corp | エンジンの点火時期制御方法 |
| US4812399A (en) * | 1986-04-21 | 1989-03-14 | Eastman Kodak Company | Analytical element and method for the determination of creatinine or creatine |
-
1987
- 1987-01-23 JP JP62013645A patent/JPH0698032B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-01-05 US US07/141,043 patent/US5047329A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63182000A (ja) | 1988-07-27 |
| US5047329A (en) | 1991-09-10 |
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