JPH0699377B2 - 蛋白質の改良された検出のためのポリアクリルアミドゲル - Google Patents

蛋白質の改良された検出のためのポリアクリルアミドゲル

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JPH0699377B2
JPH0699377B2 JP1503110A JP50311089A JPH0699377B2 JP H0699377 B2 JPH0699377 B2 JP H0699377B2 JP 1503110 A JP1503110 A JP 1503110A JP 50311089 A JP50311089 A JP 50311089A JP H0699377 B2 JPH0699377 B2 JP H0699377B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はゲル及び樹脂の架橋に関し、そして特に蛋白質
を分離する際に、及び蛋白質と核酸の銀染料検出の際に
有用なポリアクリルアミドゲルのための架橋剤に関する
ものである。
背景技術 背景染色の形成は、大部分のポリアクリルアミド銀染色
法の感度、再現性、及び定量分析を制限していた。ポリ
アクリルアミドゲル上で分離された蛋白質のための検出
法としての銀染色の最初の出願において、過剰の背景の
問題が述べられた。チオ硫酸ナトリウムを含む写真用
“還元剤”が過剰の背景染色を減少させるために使用さ
れた。しかしながら、この手法は背景のみならず、染色
された蛋白質の束又は斑点中の銀濃度にも影響を及ぼ
す。更に、蛋白質の束又は斑点に対する“還元剤”の作
用は必ずしも比例的ではない。この銀粒子の非比例的損
失は、特に定量的使用において、チオ硫酸塩の前記用途
を制限していた。アンモニア性銀染料の背景染色は、銀
還元又は現像の前に希釈チオ硫酸塩溶液を用いて前記ゲ
ルを前処理することにより減少させることができること
も分った。しかしながら、このような前処理はしばし
ば、微量の蛋白質を目に見えるようにすることを不可能
にする。背景染色を除くためのチオ硫酸塩の使用は更に
別の問題、例えば画像耐久性の損失を生ずる。
発明の開示 ポリアクリルアミドは、もしあるとしても非常に小さな
背景染色のみを生じることが分かった。この現像を可能
とする重要な観察は：銀染色反応による蛋白質の検出に
おける塩基性で且つ硫黄を含むアミノ酸の基本的性質
は、塩基性アミノ酸、イミダゾール、グアニジン中の活
性基、及び硫黄を含むアミノ酸中のアミノ基、又は硫黄
基は共同作用を必要とすると云うことを立証していると
云うことであった。それ故、これらがポリマー中から単
離された場合はそれらはわずかに機能するのみである
が、しかし２個又はそれより多くの塩基性アミノ酸又は
硫黄を含むアミノ酸が隣接して存在している場合には、
良好な染色反応が起るであろう。前記の観察は、活性ア
ミノ酸の間の共同作用に対する必要性を示すものであ
り、染色研究（ここで、塩基性アミノ酸は合成ポリマー
の系列において距離を変えることにより分離された）に
より確証された。
従来技術における困難、及び上記に概説した困難にも打
ち勝つことが本発明の目的である。
改良された染料検出を提供することが前記発明の別の目
的である。
ポリマー状ゲルの改良された架橋を提供することも又、
本発明の別の目的である。
蛋白質及び核酸を分離するために使用することができる
ポリアクリルアミドゲルを提供することが、本発明の他
の目的である。
蛋白質及び核酸を銀染色するために使用することができ
るポリアクリルアミドゲルを提供することも又、本発明
の他の目的である。
蛋白質及び核酸の分離及び銀染色において有用なポリア
クリルアミドゲルのための架橋剤を提供することも、本
発明の更に他の目的である。
銀染色の機構の研究は、メチレンビスアクリルアミド架
橋剤中のアミド基が銀染色を用いる際に見出された背景
に対して原因となっているかもしれないと云う発見に導
いた。メチレンビスアクリルアミドは、単一の炭素原子
に分離されている２個のアミド基を含む。
背景染色現象は主に架橋剤中のアミド基の存在及び位置
に、並びに他の基の存在については、架橋剤中又はアク
リルアミド鎖上の、特にヒドロキシル基及びケト基に依
存していることが今や分かった。カルボキシル基、ヒド
ロキシル基、イミダゾール基及び他の基は酸化−還元電
位に対して、又はいくつかの場合においてはゲルの内部
pHに対して影響を有し得るものであり、このことはイオ
ンから金属銀への還元速度に影響を及ぼすであろう。
本発明の架橋剤は、第三アミド基を形成する少なくとも
１種の第二アミンを有する化合物の重合性アミンアクリ
ロイル及びメタリロイル誘導体である。この化合物は１
個より多くのアクリロイル基又は１個より多くの第三ア
ミド基を含んでいてよい。アミンアクリロイル及びメタ
クリロイル誘導体に加えて、1,6−ヘプタンジエン−４
−オールもポリアクリルアミドゲルのための特に有効な
架橋剤であることが分かった。
（式中、Ｒは水素原子、メチル基、エチル基、プロピル
基、イソプロピル基、又はブチル基であってよい）を有
している。
本発明の架橋剤は蛋白質及び核酸を分離するための、そ
して蛋白質及び核酸を検出するためのポリアクリルアミ
ドゲルを製造するために特に有用である。本発明の架橋
剤を使用して架橋することができるゲルは、蛋白質及び
核酸の分離又は銀染色のために一般に使用されるどのよ
うなアクリルアミドゲルも含む。架橋剤は架橋すべきア
クリルアミドの約１重量％ないし約20重量％の範囲の量
で使用される。
本発明のゲルを製造するために、モノマー及び架橋剤を
水又は前記モノマー及び架橋剤の両方を溶解し得る溶媒
に溶解し、次いで慣用の開始剤例えば過硫酸アンモニウ
ムを用いて重合を開始する。
図面の簡単な説明 第１図はポリアクリルアミドゲルにおける銀染色へのメ
チレンビスアクリルアミド架橋の効果を示す。バックグ
ラウンドの強さはゲル中で重合したBISの量に大部分は
比例する。それは何故多孔グラジエントゲルにおけるバ
ックグラウンド染色が一様でないかを説明する。現像
は、最大コントラストを示すべく５分後止めた。
第２図はポリアクリルアミドゲルにおける銀染色への種
々の架橋剤の効果を示す。アミド基に欠ける架橋剤、ED
により形成されたバンドは銀染色でいかなるバックグラ
ウンドをも示さない。DATD、BISおよびDHDBAは、等級を
上げることにより、暗色に明るさを与えた。事実、DHEB
Aを架橋剤として用いたゲルは、アンモニア性硝酸銀溶
液中において二三分以内で黒色に変わった。この化合物
中のヒドロキシル基は銀イオンの金属銀への還元に活性
であってよい。この架橋剤により作られるゲルの可能な
相対的アルカリ度は銀イオンの還元においてより重要な
役割さえ果たすことができる。これに対して、有機塩基
であるTEMEDはバックグラウンド染色を高め、一方ゲル
中へのアクリル酸の混入はバックグラウンド染色を低減
する。EDは多孔グラジエントを作るための第二の架橋剤
として使用してもよい。それはいかなるバックグラウン
ドをも与えない。
第３図はポリアクリルアミドゲルにおける銀染色への本
発明の架橋剤の効果を示す。PIP架橋剤により形成され
たバンドは５分の現像時間の後銀染色でいかなるバック
グラウンドを示さず、また30分の現像時間の後黄色バッ
クグランドを示さず、一方BISで重合されたバンドは黒
色で不透明であった。PIPは単独またはアクリル酸とと
もにでさえはるかに最も小さいバックグラウンドを与え
た。ゲルはアクリル酸を用いてもバックグラウンドクー
マッシー（Coomassie）青色染色をも達成されなかっ
た。
第４図は銀染色プラズマ試料、高分解能銀染色二次元ゲ
ル電気泳動の0.3μｌプラズマ試料を示す。低水準のバ
ックグラウンドは、とりわけ現像時間（３分）直後は、
鮮明である。同一のゲルであるがBISを架橋剤として用
いたものは大変より暗色であった（図の右側）。アイコ
ニックス（Eikonix）二つのゲルについてのデジタルス
キャナーを使用したコンピュータ走査は、BIS架橋ゲル
はおよそ0.25OD（光学密度値）の平均バックグラウンド
を有する一方PIPゲルは0.03OD未満のバックグラウンド
を有することを示した。換言するに、最も低い灰色値
は、BISで重合されたゲルにあっては50/255であり、平
均値は111/255であり、またPIPで重合されたゲルにあっ
ては0/255であり、平均値は15/255であった。蛋白質分
離、特に高分子量で塩基性領域での改良は明らかであっ
た。このことは、より良好な蛋白質分離と斑点明確化に
より、同じ検出アルゴリズムを用いて10％より多い斑点
の検出を可能にした（23/24）。一次構造（IEF）から二
次構造（SDS）へのより良好な蛋白質変換による垂直縞
はほとんどなかった。この新規架橋剤はより再現できる
定量的結果を可能にするであろう。それはドーナツ効果
（doughnut effect）と呼ばれる現象を抑制した；高濃
度蛋白質は延長現像時間の後結局黒色に変わる斑点中心
において逆染色を有する傾向にある。図は時間を経ても
褪色しなかった。
発明の詳細な説明 ポリアクリルアミドゲル用の一連の新規架橋剤が開発さ
れてきた。蛋白質および核酸の分離と検出のためにポリ
アクリルアミドゲルを製造するためのこれら架橋剤の使
用はバックグラウンド染色を防止する。本発明の架橋剤
を使用して製造されたゲルは銀染色法による蛋白質およ
び核酸の分離と検出における再現性と精度の改良をもた
らす。
以下の実施例において、原液は、アクリルアミドおよび
N,N−メチレン−ビスアクリルアミドを水中に次の量で
溶解することにより製造した。それぞれ、原液Ａは30グ
ラムと0.15gを含む；原液Ｂは29.2グラムと0.8gを含
む；原液Ｃは28.5グラムと1.5gを含む。これら原液は水
で100mlの最終容量に調節しそして夫々0.5、2.7および
５％の架橋比を与えるようにした。
ゲルの重合のための溶液を調製した：溶液１は6mlの原
液Ａと3mlの水を含む；溶液２は6mlの原液Ｂと3mlの水
を含む；溶液３、４および５は6mlの水と3mlの各原液
Ａ、ＢまたはＣをそれぞれ含む。TEMEDを10マイクロリ
ットルずつにて、上記の５つのゲル溶液の各々に加え、
そしてこれを混合して脱気した。重合は100マイクロリ
ットルの過硫酸原液（10g/100mlの水）を５つのゲル溶
液の各々に加えることによりひき続いて開始した。
4mlの各溶液を逆の連続順序で、溶液５を始めに、1.5mm
のスペーサによって分けられた二枚のガラス板の間に、
４分の間隔で、ゆっくりと注入することによりゲルをキ
ャストした。段階的な複合ゲル、ゼブラ（zebra）ゲル
を二時間後にガラス板間より除去しそして蛋白質検出研
究（Protein detection studies）に記載されたように
すでに知られた架橋剤より作られたゲルで以て第1a図に
示すように染色した。
種々の特性をもつポリアクリルアミドゲルを製造するた
めに以前に合成された架橋剤を、銀染色のときに33yバ
ックグラウンドの場合あまり得られないゲルを形成する
べく、その能力を測定するためにこの研究の中に組み入
れた。４つの公知架橋剤：メチレン−ビスアクリルアミ
ド（BIS1）、エチレン−ジアクリレート（ED）、ジアリ
ル−タルタルジアミド（DATD）、そしてジヒドロキシ−
エチレン−ビスアクリルアミド（DHEBA）を使用した。
原液を次のとおり製造した：原液Ｄは100の水中に30グ
ラムのアクリルアミドと1.07gのDHEBAを含む；原液Ｅは
100の水中に30グラムのアクリルアミドと1.22gのDATDを
含む；原液Ｆは100の水中に30グラムのアクリルアミド
と1,6gのEDを含む；原液Ｇは100の水中に30グラムのア
クリルアミドと0.8gのBIS1を含む。種々の架橋剤の量は
同様の分子量分離またはSDSゲル上の見かけ孔径を得る
べく選択した。
ゲル流し込み用の次の溶液を調整した：それぞれ原液
Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧを3ml含み、各々水6mlを加えて希
釈したゲル帯６、７、８および９、それぞれ原液Ｄ、
Ｅ、ＦおよびＧを6ml含み、各々水3mlを加えて希釈され
たゲル帯10、11、12および13。部分標本10μｌ中のTEME
Dを各８種の溶液に加え、次いでそれらを混合し脱気し
た。過硫酸アンモニウム原液（10g/水100ml）100μｌを
連続的に添加し続いて1.5mm間隔で分離されている二枚
のガラスプレート間の空間に各溶液の4mlを４分間間隔
で緩やかに注ぐことにより重合を開始させた。２時間
後、ガラスプレート間から“縞のある”段階的複合ゲル
を取り出し、そして第２図、蛋白検知のところで述べた
ように染色した。
テトラ−、ヘキサ−、ノナ−及びドデカノ−メチレンビ
スアクリルアミドを、バックグラウンド染色に対するそ
れらの効果について試験した。ノナ−及びドデカノ−メ
チレン−ビスアクリルアミドは、特にドデカノ−メチレ
ン−ビスアクリルアミドは溶解性に乏しく、また溶解の
ためには60℃以上の温度を必要とした。ゲルは上記に類
似の方法で調整した。テトラ−及びヘキサメチレン−ビ
スアクリルアミドは以下に概略的に示す方法を用いて合
成または精製しなければならなかった。
血漿サンプルの二次元ゲル電気泳動は下記の如く行なっ
た。
本発明のアクリロイルまたはメタクリロイル第二アミン
誘導体架橋剤は全て一般的方法と同じ方法で合成した。
各架橋剤は、適当な無水第二アミン１ミリモルと少なく
とも１ミリモルのアクリロイルクロライドまたはメタク
リロイルクロライドとを反応させてアミノ−アクリロイ
ル誘導体化合物にすることにより製造した。この反応
は、使用されたアクリロイル−またはメタクリロイルク
ロライドの最初のモル数に依存して少なくとも１ミリモ
ルの塩酸を放出するが、それを容器中に存在させた適当
量のトリエチルアミンにより中和した。
含水アミン化合物の水は、合成におけるそれらの使用に
先立ち、トルエン中で蒸留することによって取り除かな
ければならなかった。次いでアミンを溶媒蒸発により回
収し、反応に使用する前にテトラヒドロフラン中に再溶
解した。他のアミンの塩酸塩分子は、アミン塩酸塩を水
に溶解し、10N−NaOHでpH14に滴定し、そしてアミンを
クロロホルムで抽出することにより除去した。水はクロ
ロホルムから、無水硫酸マグネシウムの添加によって完
全に除去され、硫酸マグネシウムはその後過によって
除去された。次いでクロロホルムを液から蒸発させ、
そしてアミンをテトラヒドロフラン中に溶解した。テト
ラヒドロフランは全ての反応に使用される溶媒であっ
た。クロロホルムはこのタイプの反応のための溶媒とし
て伝統的に用いられてきたけれども、本方法におけるク
ロロホルムの使用は、アミン−アクリロイル誘導体の収
率を低いか測定不可能かのどちらかにする結果となっ
た。ハイドロキノンは自動重合反応を防ぐべく加えられ
た。
本発明のアミン−アクリロイル架橋性化合物の幾つかを
製造するため、トリエチルアミン21ミリモルおよび特定
のアミン10mlを各々架橋剤としてテトラヒドロフラン50
ml中に溶解した。この溶液をアセトン／氷浴中で冷却
し、そしてアクリロイルクロライド20ミリモルを含むテ
トラヒドロフラン溶液20mlを、20分間にわたって一定に
攪拌しながら徐々に加えた。反応温度をモニターし、０
℃を越えさせなかった。アクリロイルクロライドの添加
後、アセトン／氷浴から反応容器を取り出し、15分間室
温と平衡になることを許した。これにより反応を終了さ
せた。次いで反応混合物にハイロドキノン6gを加え、次
いでそれを中等度に多孔性の浸漬ガラスフィルタを通し
て過した。アミン塩酸塩からなる沈殿物を捨て去り、
そして液を5N-HClでpH7.0に滴定した。その溶液をHCl
で滴定し、再過して新しく沈殿した遊離アミン化合物
を除去した。
最終のアミン−アクリロイル誘導体化合物を、石油エー
テルでの向流抽出により、溶媒テトラヒドロフンから抽
出した。排出後、その化合物を石油エーテルから20℃に
て結晶化させた。結果を、浸漬した中等度多孔性ガラス
フィルターを通して過することにより集めた。次いで
その結晶を新しいテトラヒドロフラン中に再溶解し、再
抽出し、そして石油エーテルから結晶化させた。総回収
率は30％以上であった。
石油エーテルから抽出され得なかったアミン−アクリロ
イル誘導体は、アミンの中和後にテトラヒドロフラン溶
媒を蒸発させ、過によりその化合物を取出すことによ
って精製した。
ジアクリルピペラジンの構造はプロトンNMR分光分析及
び融点測定により確められた。
ゲルは、アクリルアミド約30g及び本発明の架橋剤のビ
スアクリルアミド0.8gモル当量を用いることにより生成
させ、それを最終体積が100mlとなるよう脱イオン水中
に溶解した。この原液24mlをトリスHCl、OH8.8、1.5M溶
液（14.5ml）及び脱イオン水16.5mlと混合した。TEMED8
0μｌを一度加え、その溶液を脱気し、そして100g/l過
硫酸アンモニウム300μｌで重合を開始させた。
架橋剤としてヘプタジエノールを含むゲルは、その化合
物の水への不溶性ゆえに異なる製造方法を要求する。ア
クリルアミドを含む次の二つの原液を調整した：水中の
アクリルアミド30gを含む原液Ｈ、一方、メタノール中
のアクリルアミド30gを含む原液Ｉ。ヘプタジエノール
0.5mlと原液I16.5mlとを混合し、次いで原液H24mlを加
えた。この溶液のpHを、14.6mlの1.5MトリスHCl溶液pH
8.8で緩衝処理する。
本発明の新規の架橋剤のあるものは、各々「ゼブラ」
（“Zebra"）ゲル中、上述のように試験される。そし
て、アセトン−ビスアクリルアミドを除き、プラズマ試
料の２−DGE分離のために使用された。
重合前のゲル溶液中に添加する追加の添加剤のバックグ
ラウンド染色（background staining）に対する影響を
比較するために、ゲルを下記のように調製した； 最終容積100mlの水中の30gのアクリルアミドと0.8gのメ
チレンビス−アクリルアミドを含む原液J; 最終容積100mlの水中の30gのアクリルアミドと0.8gの高
純度メチレンビス−アクリルアミドを含む原液K; 最終容積100mlの水中の30gのアクリルアミドと1.0gのジ
アクリル−ピペラジンを含む原液L; 最終容積100mlの水中の30gのアクリルアミド、1.0gのジ
アクリル−ピペラジン、および1.5gのアクロレイン−ジ
メチルアセタールを含む原液M; 最終容積100mlの水中の30gのアクリルアミド、1.0gのジ
アクリリル−ピペラジン、および1.5gのアクリル酸を含
む原液N; 最終容積100mlの水中の30gのアクリルアミド、1.6gのエ
チレン−ジアクリレート、および50mgのジアクリリル−
ピペラジンを含有する原液Ｏ。
SDSゲル上の同程度の分子量の分離または見掛け孔径を
提供するために異なる架橋剤の量が選定された。
ゲルの注入成形のための溶液は下記のように調製され
た： それぞれ原液Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＮおよびＯの24mlを含有
する溶液14、15、16、17、18および19は、TrisHCl、pH
8.8、1.5Mの14.6および脱イオン水の16.5mlと混合され
る。
一度、80ミクロリッターのTEMEDを添加した後、この６
種の溶液を脱ガスした。次いで、リットル当たり100gの
過硫酸アンモニウムを含有する液を300ミクロリッター
で重合が開始される。
２次元電気泳動が、現在できる最高の電気泳動分離を提
供する。架橋剤を、高分離２−DGE系における分離能を
調べるために試験に供した。
等電点電気泳動（isoelectric focusing）およびSDS-PA
GE〔ポリアクリルアミドゲル電気泳動（polyacrylamde
gel electrophoresis）〕ゲルは、アクリルアミド/N,N
−メチレン−ビスアクリルアミド溶液（最終容積100ml
の脱イオン水中の、おのおの30gと0.8g）をアクリルア
ミド／架橋剤溶液〔最終溶積100mlの脱イオン水中の、
おのおの30gと試験される架橋剤の0.8gビス1分子当量
（BIS1molarequivalent）〕に換えた以外は、ホッホス
トラーセル（Hochstrasser）他、エレクトロホレシス (E
lectrophoresis) 7、505-511（1986）の方法に準じて調
製された。
等電点電気泳動（isoelectric focusing）分離は両性電
解質のキャリヤー（carrier）で行われ、不動性のpHグ
ラジエント（pH gradient）では行わなかった。
試験された架橋剤では、テトラ−とヘキサ−メチレンビ
スアクリルアミド、およびジアクリリル−ピペラジンが
他の架橋剤より鋭いバンドを示した。
さらに加えて、ジアクリリル−ピペラジンはゲルに物理
的強度の増加を与えた。この物理的強度の増加は、アク
リルアミドの全濃度の低下を可能にして、一次元におけ
る、孔径における増加を伴った。
等電点電気泳動（isoelectric focusing）毛管ゲルにお
けるアクリルアミドの全濃度は、ジアクリリル−ピペラ
ジン架橋剤１％で、３％（Ｔ値）に減少した。この濃度
は重合度が低いためにアクリルアミド／ビス1(Bis1)溶
液では不可能であった。
試料の調製、試料導入および実施条件は以前に発表され
ているホッホストラーセル（Hochstrasser）他、同上の
とおりである。
蛋白質の銀染色検出は下記のように行われた。
蛋白質の分離が完了した後、ゲルを水中に５分間、次い
でエタノール：酢酸：水（40:10:50）中に１時間、エタ
ノール：酢酸：水（5:5:90）に少なくとも３時間または
一夜浸漬した。５分間の水洗浄の後、ゲルと30分間10％
グルタールアルデヒド液に30分間浸漬する。グルタール
アルデヒドを水で、10分間洗浄３回、次いで30分間洗浄
４回と広く（extensively）に洗浄する。
アンモニヤ性硝酸銀溶液は、10mlの水酸化アンモニウ
ム、1.5mlの10N水酸化ナトリウムおよび160mlの水を含
有する溶液に、30mlの脱イオン水中の6gの硝酸銀を徐々
に添加することにより調製された。最後の容積は脱イオ
ン水で750mlに調節した。
ゲルをアンモニヤ性硝酸銀溶液に10分間浸漬し、次いで
水で５分間３回洗浄した。
現像液は、脱イオン水１中にクエン酸0.1gおよび1ml
のホルムアルデヒドを含有していた。
ゲルを３分間またはそれ以上この液中で現像し、次いで
現像を中止するために水１中50mlの酢酸を含有する溶
液中に入れた。保管の目的のために、酢酸液をグリセリ
ン：エタノール：水（2:10:88）液に換えた。
第２級アミド基または例えば第３級アミド基である全部
置換されている第３アミドを含有する架橋剤は、バック
グラウンドを僅かしか染色しないということが見出され
た。これらの化合物の内、ジアクリリル−ピペラジンは
合成と精製が容易なので特に重要である。
それの水への溶解度が高いことはポリアクリルアミドゲ
ルにおけるそれの架橋剤としての使用を容易にしてい
る。
これらの新規の化合物は、Ｎ−メチレン−ビスアクリル
アミドの分子等価物（molar equivalent）を伴うゲルよ
り深く重合するゲルを提供する。
ジアクリリル−ピペラジンはまた、Ｎ−メチレン−ビス
アクリルアミドにより合成された今のゲルが膨潤する程
には水で膨潤せず、かつ伝導等が僅かに増えるゲルを提
供する。
SDS PAGE（polyacrylamde gel electrophoresis）で
は、ジアクリリル−ピペラジンとＮ−メチレン−ブスア
クリルアミド架橋剤の分子当量が比較された場合、明ら
かに孔径の減少がある。
ジアクリリル−ピペラジンは、ポリアクリルアミドに物
理的強度の明らかな増加を与える。
これらの性質の全てが、等電点電気泳動（isoelectric
focusing）ゲルにおける全アクリルアミドゲルを３％ま
で減少させることを可能にした。
このアクリルアミドの濃度の減少と伝導率の僅かな増加
が等電点電気泳動（isoelectric focusing）による蛋白
質の分離を改善し、かつゲル上への蛋白質のより高い仕
込み量を可能にした。
本発明はある特殊な実施態様との関係で記述されている
のであるが、多くの変換が可能であり、代わりの物質と
試薬が本発明から分離されることなしに使用され得ると
理解されるであろう。
ある場合には、このような変換と置換はある種の実験行
為を必要とするであろうが、このような実験はきまりき
った（routine）試験を包含するのみである。
特殊な実施態様の上述の記述は、他の人が現在の知識を
利用して、本発明の一般的概念から離れることなしに種
々の応用のために、このような特殊な実施態様を容易に
変換および／または応用できる程に、本発明の一般的性
質を充分に表現している。そして従って、このような応
用と変換は開示された実施態様の等価（equivalents）
の意味と範囲内で理解されるものと意図されている。
なお、ここでの表現法または述語は記述のためのもので
あって、限定のためのものではないと理解されるべきで
ある。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 241/04 295/18 Ｃ０８Ｆ 220/56 ＭＮＣ 220/60 ＭＮＪ Ｇ０１Ｎ 27/447 33/68

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも１個の第三アミド基を有する第
    二アミンのアミン−アクリロイル誘導体、アセトンビス
    アクリルアミド、1,1−ジメチルエチレンビスアクリル
    アミド、2,2−ジメチル−プロピレンビスアクリルアミ
    ドおよび次式： （式中、ＲはＨ、メチル基、エチル基、プロピル基、イ
    ソプロピル基またはブチル基を表すが、ただし式VIIに
    おいてＲはＨを表さない）で表される化合物からなる群
    から選択される架橋性化合物をアクリルアミドの溶液に
    添加し、そして 該アクリルアミドを架橋させる、 ことからなる架橋されたアクリルアミドゲルの製造方
    法。
  2. 【請求項２】前記架橋性化合物が次式： （式中、ＲはＨ、メチル基、エチル基、プロピル基、イ
    ソプロピル基またはブチル基を表すが、ただしＲはＮに
    結合されている場合Ｈを表さない）で表される化合物群
    から選択される、少なくとも１個の第三アミド基を有す
    る第二アミンのアミン−アクリロイル誘導体である請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】前記架橋性化合物がジアクリロイルピペラ
    ジンまたはジアクリロイルエチレンジピペリジンである
    請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】前記架橋性化合物が1,6−ヘプタジエン−
    ４−オールである請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】前記架橋性化合物が２個のアクリロイル基
    を有する請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】前記架橋が過硫酸アンモニウムにより開始
    される請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】前記架橋性化合物が前記アクリルアミドの
    １−20重量％の量で存在する請求項１ないし６のいずれ
    か１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】請求項１ないし７のいずれか１項に記載の
    方法により形成されたアクリルアミドゲルからなる架橋
    されたアクリルアミドゲル。
  9. 【請求項９】請求項８記載の架橋されたアクリルアミド
    ゲル上に試料を載せ、 前記ゲルをアンモニア性の銀溶液中に浸漬し、そして 前記ゲルを現像することからなる、銀染色法により蛋白
    質を検出するために請求項８記載の架橋されたアクリル
    アミドゲルを使用する方法。
  10. 【請求項１０】蛋白質を含有する試料を請求項８記載の
    架橋されたアクリルアミドゲル上に載せ、 分離すべき蛋白質に適当な溶媒中に前記ゲルを浸漬し、
    そして 前記ゲルを介して予め決められた距離を前記溶媒に前記
    蛋白質を運搬させることからなる、蛋白質を分離するた
    めに請求項８記載の架橋されたアクリルアミドゲルを使
    用する方法。
JP1503110A 1988-02-24 1989-02-23 蛋白質の改良された検出のためのポリアクリルアミドゲル Expired - Lifetime JPH0699377B2 (ja)

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