JPH07100662B2

JPH07100662B2 - 治療用組成物

Info

Publication number: JPH07100662B2
Application number: JP62150069A
Authority: JP
Inventors: ミカエル・アンジェロ・パラディノ; アーサー・ジェイ・アマン
Original assignee: ジエネンテク，インコ−ポレイテツド
Priority date: 1986-06-16
Filing date: 1987-06-16
Publication date: 1995-11-01
Anticipated expiration: 2010-11-01
Also published as: PH26613A; JPS6354327A; DK302887D0; DK302887A; NZ220686A; AU598817B2; AU7422387A; EP0250192A3; EP0250192A2; IL82862A0; PT85076A; PT85076B

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、細菌および真菌類による感染症の治療に関す
るものである。詳細には、本発明は、この様な治療にお
けるサイトカイン（cytokines）の使用に関する。なか
でも本発明は、抗感染症剤としての、サイトカイン、腫
瘍壊死因子アルファ（TNF−α）の使用に関する。

本発明の抗感染症剤によって治療される感染症は、食細
胞に欠陥があるために生じる感染症である。単核細胞、
多形核好中球、マクロファージおよび好酸球を包含する
食細胞は、通常、細菌および真菌類病原体を取り込む。
この食細胞は、「呼吸激発（burst）」によって証拠だ
てられる様に、酸素を利用すると思われる未知の機構に
よって、取り込んだ病原菌を殺す。ある種の病気では、
食細胞は、病原体を取り込むことによって血液および組
織からこれらを除去することができるが、捕食した微生
物を殺すことはできない。これらの非殺菌性食細胞に含
有されている微生物は、生育可能である。慢性肉芽腫症
（CGD）は、非殺菌性多形核好中球を生じる遺伝的欠陥
に起因する症状の一例である。慢性肉芽腫症は子供に最
も頻繁に起こるが、成人にも観察される。慢性肉芽腫症
を有する患者は、感染症に対して過度の感受性を示す
（ハカンソン等（Hakansson,L.et al.）、Arch.Dis.Chi
ld.55、776（1980））。慢性肉芽腫症は、重大な小児科
上の問題となっており、不完全な食細胞によるこの様な
病気の一例である。CGDの特徴は、その他の全ての点に
おいて正常であるらしい食細胞による呼吸激発が実質上
全く存在しないことである。CGD患者は、そのリンパ
節、肝臓、骨、皮膚および呼吸器に、しばしば重篤でし
ばしば致死的な感染症を有する。

呼吸激発は、酸素ラジカルの産生を示す。この酸素消費
は、最も一般的な細菌および真菌類病原体を殺すための
最適条件を作り出すために必要とされると考えられる。
酸素が欠乏している細菌は、ある種の病原菌を取り込む
が、効果的に殺さない（マンデル（Mandell,G.L.）、In
fect.Immun.９、337、1974）。病原体を殺すことに関係
していると思われる物質であって、酸素を要求する物質
には、過酸化物、ヒドロキシラジカル、原子状酸素およ
び過酸化水素がある。

腫瘍壊死因子（TNF）と呼ばれている物質は、自然に癌
症状が軽減している患者が同時に細菌感染症を有してい
ることが観察された時、初めて記載された。腫瘍壊死因
子アルファは、生物学的活性および構造において種々の
程度の類似性を有する一群の蛋白質類に属するようであ
る。時折カケクチン（cachectin）とも呼ばれる腫瘍壊
死因子ベータ（以前はリンホトキシンと呼ばれていた）
は、この蛋白質群に含まれるその他の既知分子の一例で
ある。感染症における腫瘍壊死因子アルファの役割につ
いての推論はあるが、一定の範囲の細菌および真菌類で
試験した結果は、直接の腫瘍壊死因子アルファ感受性の
証拠を示さなかった（オールド（Old,L.J.）、Science
230、632（1985）における概説）。腫瘍壊死因子アルフ
ァは、ヒト臍静脈内皮細胞単層へのヒト好中球の粘着性
を高めることが示された（ギャンブル等（Gamble,J.R.e
t al.）、PNAS 82、8667（1985））。内皮細胞に対する
PMNの粘着性のこの増大は、腫瘍拒否における腫瘍壊死
因子の効果の１要素であると考えられた（前掲8667）。
組換えヒトインターフェロンガンマ（rHuIFN−γ）およ
び天然のヒト腫瘍壊死因子ベータ（nHuTNF−β）は、イ
ン・ビトロにおいてPMNの食菌活性を高めることが、PMN
のラテックスビーズ取り込み能によって測定された（シ
ャラビー等（Shalaby,M.R.,et al.）、ASBC/AAI（198
4））。ヒトインターフェロンガンマおよびヒト腫瘍壊
死因子ベータは、PMNに媒介される抗体依存性細胞の細
胞毒性を高め、またO₂ ^-の産生を増加することが示され
た（シャラビー等（Shalaby,M.R.et al.）、J.of Immun
ology,135（３）、2069（1985））。腫瘍壊死因子は、
投与量に依存してヒト好酸球の、寄生体を殺す能力を高
めることが示された（シルバースタイン（Silberstein,
D.S.）およびデイビッド（David,J.R.）、P.N.A.S.83、
1055（1986））。

本発明は、ヒト腫瘍壊死因子アルファが多形核好中球
（PMN）を活性化するという新しい観察に基づいてい
る。本発明者らは、ヒト腫瘍壊死因子アルファがイン・
ビトロでPMNの食菌活性を高めることを見い出した。本
発明者らはまた、ヒト腫瘍壊死因子アルファがＸ−関連
CGDに罹患した男性患者の不活性なPMNをイン・ビトロで
変性させ、呼吸激発を生じさせることを見い出した。

本発明は、食菌作用を必要とする種々の感染症のための
抗感染症治療剤を提供することを目的とするものであ
る。より詳細には、ヒト腫瘍壊死因子アルファを、正常
な食細胞を有する、種々の感染症に罹患している患者に
おる抗感染症剤として使用することができる。

本発明はまた、不完全な食菌細胞を活性化するための抗
感染症治療剤を提供することを目的とするものである。

発明の要約本発明は、ヒト腫瘍壊死因子アルファが、正常および不
完全な多形核好中球（PMN）を活性化するという新しい
観察に基づいている。従って、本発明の一態様は、正常
な食細胞を有する感染症患者における抗感染症治療とし
て、ヒト腫瘍壊死因子アルファを含有している組成物を
投与することである。本発明の別の態様は、不完全な食
細胞を有する患者にこの組成物を投与し、抗病原菌応答
をもたらすことである。

図面の説明第１図は、ヒト腫瘍壊死因子アルファによる、正常
（Ａ）およびCGD（Ｂ）提供者からのPMNの食菌作用の活
性化を示す。食菌作用の検定は、実施例１の一般的な物
質および方法に記載した様にして行った。食菌細胞の分
類は、FACSのプロファイルによって示す。Ｘ軸に近い曲
線は、バックグラウンドの自己蛍光および／またはビー
ズを取り込まなかった細胞を表わす。（Ａ）では、非処
理正常PMNを（−）で、ヒト腫瘍壊死因子アルファで処
理した正常PMNを（−−）を表わし、（Ｂ）では、非処
理CGD PMNを（−−）で、ヒト腫瘍壊死因子アルファで
処理したCGD PMNを（−）で表わす。

詳細な説明多形核好中球（PMN）、単核細胞、マクロファージおよ
び好酸球を包含する食細胞は、細菌および真菌類病原体
に起因する感染症を排除する役割を有する。宿主の防御
メカニズムへの食菌細胞の関与は、よく調べられてい
る。PMNは、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に対し、
抗体依存性の細胞毒性活性を示すことができる（デレグ
リ等（Dellegri,F.et al.）、Immunology 48、273（198
3））。PMNはまた、病原体の排除に独特の方法を示す。
PMNはまず、病原菌を取り込み、次いで急速に多量の酸
素を消費することによって病原菌を殺す。酸素の消費
は、最も一般的な細菌および真菌類病原体を殺すための
最適条件を作り出すために必要とされる。酸素由来の代
謝産物は、病原菌を殺すことに関与する（ベイビオー
（Babior,B.M.）、N.Engl.J.Med.298、659（1978））。

ある種の病気では、食細胞は、血液および組織から病原
体を取り込むことができるが、捕食した微生物を殺すこ
とはできない。リンパ腺炎、肺炎、肝臓膿癌および蜂巣
炎の様な感染症は、この様な、食細胞に欠陥がある場合
に発症する。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphy
lococcus aureus）、エンテロバクター・アエロゲネス
（Enterobacter aerogenes）、E.コリ（E.coli）、セラ
チア・マルセッセンス（Serattia marcescens）、カン
ジダ・アルビカンス（Candida albicans）およびアスペ
ルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）を包
含する種々の微生物が、この様な状態の病巣から培養さ
れた。これらの病原体を殺すことができない食細胞、即
ち不完全な食細胞によって取り込まれた病原体は、抗生
物質から保護される。従って、この様な患者における抗
生物質の使用は制限される。本発明は、細胞内微生物に
起因する感染症の治療をも包含する。より詳細には、本
発明は、正常な食細胞を有する感染症の患者の治療をも
包服する。本発明は特に、慢性肉芽腫症に罹患している
患者を含む不完全な食細胞を有する患者に生じるこれら
の感染症に適用することができる。

腫瘍壊死因子アルファ、および組換え細胞培養からの回
収を包含するその製造方法は、よく知られている（ヨー
ロッパ特許出願第85304758.7号）。組換え、天然または
合成供給源からの腫瘍壊死因子アルファが、腫瘍壊死因
子アルファの範囲に含まれる。アミノ酸が置き換えおよ
び／または除去および／または付加された腫瘍壊死因子
アルファの変異体、その有機および無機塩、および腫瘍
壊死因子アルファの共有結合的に修飾された誘導体も腫
瘍壊死因子アルファの範囲に含まれる。

本発明に使用するに当たっては、腫瘍壊死因子アルファ
を注射用または局所用製剤のいずれかに製剤化すること
ができる。非経口的製剤は知られていて、本発明の使用
に好適であり、筋肉内または静脈内投与用製剤が好まし
い。これらの製剤は、腫瘍壊死因子アルファの治療的有
効量を含有する滅菌溶液剤、懸濁液剤または凍結乾燥物
のいずれかであり、安定化剤または賦形剤を含有してい
てもよい。凍結乾燥組成物は通常、適当な希釈剤、例え
ば注射用の水、生理食塩水等で約.001mg/ccから10mg/cc
の濃度、即ち繊維芽細胞（Ｌ−Ｍ）で測定した生物学的
活性が約４×10⁷単位/mgとなるように復元する。

腫瘍壊死因子アルファは、皮膚科用賦形薬に治療的有効
濃度の腫瘍壊死因子アルファを含有させることにより、
局所治療のための外用製剤に製剤化される。投与すべき
腫瘍壊死因子アルファの量、および局所用製剤中の腫瘍
壊死因子アルファの濃度は、選ばれる賦形薬、患者の臨
床的症状、使用される腫瘍壊死因子アルファの種類およ
び製剤中の腫瘍壊死因子の安定性によって決まる。従っ
て、医師は、製剤中に適当な濃度の腫瘍壊死因子アルフ
ァを含有している適当な製剤、および問題の患者または
同等の患者についての臨床上の経験によって決められる
投与すべき製剤の量を使用しなければならない。通常、
局所用製剤のための濃度は、約.01mg/ml〜100mg/ml以上
の範囲である。腫瘍壊死因子アルファの固形分散剤およ
び可溶化製剤を使用することができる。従って、賦形薬
中に使用される正確な濃度は、治療上の応答を最も効果
的にするために、適度の実験的処理によって決められる
であろう。皮膚感染症の治療では、１％w/wの水酸化ア
ルミニウムゲル賦形薬を用い、賦形薬100グラム当たり
約10mg以上の腫瘍壊死因子を使用することができる。ゲ
ル以外の好適な賦形薬は、鉱油、ワセリン等を使用した
水中油型または油中水型の乳濁液である。

腫瘍壊死因子アルファは、経皮治療系を使用して、局所
的に投与することができる（バリー（Barry）、1983、D
ermatological Formulations、p.181およびその引用文
献）。この様な系は、主として低分子量薬物の経皮投与
のためにデザインされてきたが、これらは、範囲を限定
することにより経皮投与することができる。これらは、
速度調節用多孔性膜を適当に選択することにより、腫瘍
壊死因子アルファおよび関連する治療用タンパク質に容
易に適用することができる。しかしながら、この皮膚結
合粘着剤が初回投与量の腫瘍壊死因子を含有している必
要はない。

腫瘍壊死因子アルファの局所用（外用）製剤は、全身ま
たは局所投与のいずれかのために使用することができ、
非経口投与のための上記の賦形薬、および相互溶媒、界
面活性剤、油、湿潤剤、皮膚軟化剤、保存剤、安定化剤
および抗酸化剤の様な局所用製剤に使用されるその他の
賦形薬を含有することができる。例えばトリスまたはリ
ン酸緩衝液のような、薬理学的に許容し得る緩衝液を使
用することができる。場合により、局所用製剤に、腫瘍
壊死因子アルファの経皮浸透を高めるための薬物または
その他の薬物の様な、増進剤、界面活性剤、反応促進
剤、吸着促進剤または浸透増進剤と呼ばれる１またはそ
れ以上の薬物を含有させてもよい。この様な薬物は、好
ましくは当業者に知られている以下の特性、即ち薬理学
的に不活性であり、体液または電解質の損失を促進せ
ず、腫瘍壊死因子アルファと共存することができ（不活
化しない）、そして所望によりクリーム、ゲルまたはそ
の他の局所投与系に製剤化することができるという性質
の幾つかまたは全てを有しているべきである。

好ましい１態様では、クリーム基剤の局所用製剤は以下
の成分を含有する：クリーム基剤グラム/100グラム rTNF 0.01−1.0 グリセリルステアリン酸エステル 3.0 イソプロピルミリスチン酸エステル 4.0 プロピレングリコール 3.0 PEG−40ステアレート 1.0 セチルアルコール 2.0 ヒドロキシエチルセルロース 0.5 −1.0 保存剤 95 水 100 その他の例では、グリーム基剤の局所用製剤は以下の成
分を含有する：クリーム基剤グラム/100グラムｒ−TNF 0.01−1.0 ステアリン酸 15.0 グリセリン 8.0 水酸化カリウム 0.7 保存剤 95 水 76.3 局所用製剤の更に別の例では、ゲルまたは軟膏はそれぞ
れ以下の成分を含有する：ゲルグラム/100グラム rTNF 0.01−1.0 リン酸ナトリウム緩衝液 95 塩化ナトリウム１保存剤 95 メチルセルロース２水 100 軟膏ｒ−TNF粉末 0.01− 1.0 ラノリン 15 保存剤 95 白色ワセリン 95 −100 腫瘍壊死因子アルファは、約25μg/m²/日より多い投与
量で筋肉内注射することにより、局所的ではなく、全身
的に投与することができる。投与量は、使用する腫瘍壊
死因子アルファ種の特性、例えばその活性および生物学
的半減期、製剤中の腫瘍壊死因子アルファの濃度、投与
の部位および割合、問題の患者の臨床的な耐久力、患者
が罹患している感染症等、医師の技量の範囲内で決めら
れる。

本発明の腫瘍壊死因子アルファは、溶液状で投与するこ
とができる。溶液のpHは、pH5〜9.5、好ましくはpH6.5
〜7.5の範囲にするべきである。腫瘍壊死因子アルファ
は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン−HClまたはクエン酸塩等の様な適当な薬学的に許容
し得る緩衝液を含有する溶液にするべきである。緩衝液
の濃度は、１〜100mMの範囲にするべきである。腫瘍壊
死因子アルファの溶液は、塩化ナトリウムまたは塩化カ
リウムの様な塩を50〜750mMの濃度で含有することもで
きる。腫瘍壊死因子アルファを含有している溶液または
溶液が調製される組成物に、アルブミン、グロブリン、
ゼラチン、プロタミンまたはプロタミンの塩の様な安定
化剤の有効量を含有させてもよく、加えることができ
る。

腫瘍壊死因子アルファの全身投与は、毎日、通常筋肉内
注射によって行なわれるが、静脈内注射してもよい。鼻
腔内またはその他の非注射経路によって投与してもよ
い。腫瘍壊死因子アルファを、血液などのある種の組織
に適用するためのミクロスフェアー、リポソームまたは
その他の微粒子からなる投与系によって投与することも
できる。局所用製剤は、毎日直接皮膚または粘膜に塗布
し、次いで好ましくはこの局所用製剤を通さない包帯
（帯具）、ポリオレフィンフィルムまたはその他の防御
物質でおおう。

実施例１一般的物質および方法組換え腫瘍壊死因子アルファ（rHuTNF−α）をクローン
してE.コリ中で発現させ、99パーセント純度以上に精製
した（ペニカ等（Pennica,D.et al.）、Nature 312、72
4（1984））。腫瘍壊死因子アルファの力価を、アクチ
ノマイシンＤで処理したＬ−Ｍマウスの繊維芽細胞にお
ける細胞溶解活性を測定することにより計算した。Id.
分析結果に基づくと、組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ
の比活性は、4.0×10⁷U/mgタンパク質であった。全ての
腫瘍壊死因子アルファ製剤は、ルミラス・アモエボサイ
ト・リゼイト（Lumulus amoebocyte lysate）法（マリ
ンクロット（Mallinkrodt）、セント・ルイス（St.Loui
s）、ミズーリ）によって試験したところ、リポポリサ
ッカライド汚染について陰性であった。

末梢血液中の単核細胞（PBMC）および多形核好中球（PM
N）をシャラビー等（Shalaby,M.R.et al.）、J.Immuno
l.135、2069、1985の記載に従って分離した。フィコー
ル−ハイパークグラジエント上で、ヘパリン化した血液
を遠心することにより、簡便にPBMCを得た。パイロジェ
ンを含んでいないデキストラン（ファルマシア・ラボラ
トリーズ（Pharmacia Laboratories）、ピスカッタウェ
イ（Piscataway）、ニュージャージー）の沈降によりPM
Nに富んだペレットから赤血球を除去し、次いで蒸留水
中で約20秒間低張的に溶解させた。ギエムサ（Giemsa）
染色した細胞標本をモニターすると、最終的なPMN細胞
懸濁液は通常、＞97パーセント純度であった。トリパン
青エクスクルージョンによって求めた細胞の生存率は、
一貫して＞95パーセントであった。

PBMCを、10％熱不活化（50℃で30分間）ウシ胎児血清
（FBS、アーヴィン・サイエンティフィック（Irvine Si
entific）、アーヴィン、カリフォルニア））、１％Ｌ
−グルタミン、１％非必須アミン酸およびペニシリン／
ストレプトマイシン（完全MEM）を補足したイーグルの
最小必須培地（MEM、グランド・アイランド・バイオロ
ジカル・コル（Grand Island Biological Col）、グラ
ンド・アイランド、ニューヨーク）中で３回洗浄した。
完全MEM2ml中の４×10⁶PBMCを24ウェル組織培養プレー
ト（コスター（Costar）、ケンブリッジ（Cambridg
e）、マサチューセッツ）に入れ、5ng/mlの12−β−ホ
ルボール−12−β−ミリステート−13−α−アセテート
（PMA）（シグマ（Sigma））、および／または1:500希
釈のフィトへマグルチン−Ｐ（PHA−Ｐ）（ディフコ・
ラボラトリーズ（Difco Laboratories）、デトロイト、
ミシガン）で刺激した。腫瘍壊死因子アルファの測定の
ために、刺激の24、48および72時間後に試料を集めた。

腫瘍壊死因子アルファの濃度を、特異的ELISA検定によ
り測定した。腫瘍壊死因子アルファのためのELISAは、
0.4ng/mlを検出する（ヴァドハン−ラジュ等（Vadhan
−Raj,S.,et al.）、J.Clinical Oncology ４、137（19
86））。

５％熱不活化FBS（アーヴィン・サイエンティフィッ
ク）を補足した最小必須培地（ギブコ（GIBCO））にPMN
を懸濁した（2.5×10⁶/ml）。0.5mlずつの細胞を種々の
ヒト腫瘍壊死因子アルファ投与量の存在または不在下、
12×75mmプラスチックチューブに分注し、円弧を描く振
盪機にて37℃で20分間インキュベートした。各培養に、
1.5ミクロンの蛍光ラテックスビーズを単分散させた懸
濁液（10⁹/ml）（ポリサイエンシズ・インコーポレイテ
ッド（Polysciences Inc.）、ワーリントン（Warringto
n）、ペンシルバニア）60マイクロリットルを加え、チ
ューブを更に37℃で60分間培養した。等容量の２％グル
タルアルデヒド（シグマ、セント・ルイス、ミズーリ）
を加えて細胞を固定し、FBSグラジエント上で遠心する
ことにより、取り込まれなかったビーズを除いた。蛍光
活性化細胞選別機（FACS IV,ベクトン・ディキンソン・
アンド・カンパニー（Becton Dickinson and Co.）、サ
ニーベイル（Sunnyvale）、カリフォルニア）を使用
し、捕食したPMNの数を調べた。

アルゴンレーザーを通り過ぎる時の前部角度の光散乱
（細胞サイズ）および蛍光（捕食されたラテックスビー
ズ）について、FACS IVによりPMN（８×10^4-）を分析し
た。これらの測定は、１個ずつの細胞に基づいて行い、
度数分布ヒストグラムとしてディスプレイした。取り込
まれなかったビーズ、細胞残骸、細胞凝集塊および蛍光
ビーズを含有している細胞を電気的に区別するように、
FACS IVをプログラムした。取り込まれたビーズを含有
しているPMNを、ヒストグラム上にディスプレイされた
その相対蛍光に基づいて定量した。幾つかの試料を顕微
鏡試験にも付し、取り込まれなかったかまたは破壊作用
を受けたビーズが除外されていることを確認した。

抗体依存性細胞の細胞毒性（ADCC）活性を、PMNを完全
培地に懸濁し、種々の投与量でのヒト腫瘍壊死因子アル
ファの存在または不在下、37℃で２時間インキュベート
することにより検定した。次いで、種々の数のPMNを含
有している0.1ml容量を３個の丸底微量滴定プレート
（コスター（Costar）、ケンブリッジ、マサチューセッ
ツ）に移した。１ウェル当たり、10⁴個の⁵¹Cr標識され
たニワトリ赤血球（CRBC）を含有している0.1mlずつを
加え、次いで抗体を加えた。４時間インキュベートした
後、上清を集め（スカトロン・インコーポレイテッド
（Skatron,Inc.）、スターリング（Sterling）、バージ
ニア）、自動ガンマカウンターモデル28037（マイクロ
メディック・システムズ・インコーポレイテッド（Micr
omedic Systems,Inc.）、ホーシャム（Horsham）、ペン
シルバニア）を使用して、放射活性を測定した。細胞毒
性の百分率で表される比標的溶解活性を以下の様にして
計算した：式中、Ａは試験上清（対照または処理PMNと共培養され
た標的）中の平均cpmを表わし、Ｂは自然放出平均cpm
（単独で培養された標的）を表わし、Ｃは最大放出平均
cpm（１％ノニデット（Nonidet）Ｐ−40で溶解された標
的）を表わす。抗体の不在下、常法により試験した比細
胞毒性は５％またはそれ以下であった。

実施例２ PMN−ADCCの増大試験した少なくとも20人の提供者からの結果は、ヒト腫
瘍壊死因子アルファでPMNを処理すると、90％以上のケ
ースにおいてADCCを高めるということを示した。第１図
における結果は、ヒト腫瘍壊死因子アルファがPMN−ADC
C活性を高めるということを示している。投与量応答検
定試験を行ない、３回の実験からの代表的な結果を第１
表に示す。ヒト腫瘍壊死因子アルファ処理した後、試験
した全ての投与量で一致して、PMN−ADCCの実質的増大
が明らかであった。１または10U/mlでの処理についての
細胞毒性パーセントは0.05であった。以下の第１表に、
CRBCに対するPMN媒介ADCCにおける、種々の投与量のヒ
ト腫瘍壊死因子アルファの影響を示す。

実施例３ O₂ ^-産生の増加第２表に示す様に、正常な提供者からのPMNは、12−β
−ホルボール−12−β−ミリステート−13−α−アセテ
ート（PMA）刺激後、有意な濃度のO₂ ^-を産生した（非刺
激0.44nmに対し、PMA刺激2.59;p＜0.001）。PMAは、PMN
活性に効果があることが知られている。O₂ ^-濃度は、PMA
刺激したものについて0.57nmO₂ ^-から5.6nmO₂ ^-、培地対
照群について０〜137nmO₂ ^-の範囲であった。これに対
し、３人の男性Ｘ−関連CGD提供者（DD、JMおよびRD）
からのPMNは、PMA刺激後、正常者に比較して有意に低い
濃度のO₂ ^-を産生した（それぞれ0.17nmO₂ ^-対2.59nm
O₂ ^-）（ｐ＜0.001）。２人の女性CGDキャリヤー（JRお
よびCM）によって産生されたO₂ ^-濃度は、正常者と有意
差がなかった。この結果は、３人の男性患者がＸ−関連
CGDであるという臨床上の診断を裏付けした。以下の第
２表に、正常およびCGD提供者由来のPMNによるO₂ ^-産生
を示す。

第３表に示した様に、ヒト腫瘍壊死因子アルファは、正
常な提供者の末梢血液から得たPMNにおいて、刺激の60
分後、非処理対照群に比較して有意なO₂ ^-濃度を生じた
（ｐ＜0.001）。ヒト腫瘍壊死因子アルファおよび腫瘍
壊死因子ベータ（リンホトキシンとも呼ばれる）の両方
が好中球活性を刺激するが、ヒト腫瘍壊死因子アルファ
は、腫瘍壊死因子ベータより大きい好中球活性の増大を
示した。以下の第３表に、rHuTNF−αによるO₂ ^-産生を
示す。

第４表に示した様に、ヒト腫瘍壊死因子アルファは、正
常者、CGDキャリヤーおよびＸ−関連CGD提供者から得た
PMNを刺激し、非刺激対照群に比較して有意に高い濃度
のO₂ ^-を産生した。PMAおよびヒト腫瘍壊死因子アルファ
の両者によって誘導されるO₂ ^-は、過酸化物分子変位補
酵素（SOD）によって阻害され、それによって、測定さ
れた活性が事実上O₂ ^-であり、Ｘ−関連CGD提供者からの
PMNがO₂ ^-を産生し得るということが証明された。以下の
第４表に、rHuTNF−αで刺激した後のO₂ ^-産生を示す。

実施例４食菌作用の刺激ヒト腫瘍壊死因子アルファの刺激によるPMN媒介食菌作
用の増大を調べた。第１図のＡおよびＢ枠に示した様
に、正常（MW）およびCGD（JM）の両提供者からのPMNは
それぞれ、ヒト腫瘍壊死因子アルファ10U/mlで刺激した
後、食菌作用が高まった。これは、３個以上の捕食され
たラテックスビーズを含有しているPMNの数によって測
定した。この結果は、CGD提供者からのPMNは、O₂ ^-発生
系の欠陥にもかかわらず、正常な食菌作用を保持してい
ることを証明している。

CGD提供者の免疫機能障害がPMNのO₂ ^-発生系に限定され
ているのか、またはサイトカインの産生にも影響するの
かを決定するために、PHA−Ｐ、PMAまたはPHA−P/PMAで
刺激した後、IFN−γおよびTNF−αを産生する末梢血液
中の単核細胞の能力を調べた。３回の実験の内の１つの
結果を第５表に示す。即ち、第５表は、正常なCGDキャ
リヤーおよびCGD提供者の末梢血液中単核細胞による、
インターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファの
産生を示す。

正常およびCGDキャリヤーからのPBMCをPMAで刺激した
後、ナノグラムの濃度のインターフェロン−ガンマが産
生されただけであった。しかしながら、驚くべきこと
に、PNA単独は、Ｘ−関連CGD患者（DDおよびJM）からの
PBMCにおいて高濃度のIFN−γの産生を刺激した（第３
日には、Ｘ−関連CGD提供者については361±247ng/mlで
あるのに対し、正常およびCGDキャリヤーについては1.9
5±0.2ng/ml、ｐ＜0.001であった）。更に、PHA−P/PMA
で刺激されたＸ−関連CGD提供者からのPBMCは、第３日
（574±181ng/ml対73±16ng/ml、ｐ＜0.001）、および
第１および２日（データは示さず）に、正常またはCGD
キャリヤーに比較して有意に多いインターフェロンガン
マを産生した。別の試験（第５表）では、腫瘍壊死因子
アルファの産生においても同様の増加が得られた。即
ち、PMAで刺激したＸ−関連CGD提供者からのPBMCは、第
３日（5952±1389pg/ml対1510±727pg/ml、ｐ＜0.00
1）、および第１および２日（データは示さず）に、正
常またはCGDキャリヤーに比較して有意に高い濃度の腫
瘍壊死因子アルファの産生した。これに対し、PHA−P/P
MAで刺激したCGD、正常またはCGDキャリヤー提供者から
のPBMCは、第３日（正常CGDキャリヤー提供者について1
1669±4750pg/ml対Ｘ−関連CGDについて11615±6117pg/
ml、ｐ＝ns）、および第２日（データは示さず）に、同
等のレベルの腫瘍壊死因子アルファを産生した。Ｘ−関
連CGD群におけるPHA−P/PMA刺激後の腫瘍壊死因子アル
ファの産生は、第１日（データ示さず）のみ、有意に高
かった。

これらの結果は、正常な提供者に比較して、CGD提供者
からのPBMCは、マイトジェン（mitogen）による刺激
後、IFN−γを産生するためのその能力に種々の変化を
示すということを証明している。腫瘍壊死因子アルファ
の産生においても同様の変化が観察された。CGD提供者
からのPBMCはまた、PMAおよびPMA/PHA−Ｐ刺激後、正常
な提供者からのPBMCに比較して、共に有意に高い濃度の
TNF−αおよびIFN−γを産生した。先の研究は、PMA
は、正常な提供者からのPBMC培養においてマイトジェン
として作用し、これは単独では有意な濃度のIFN−γま
たはインターロイキン−２の産生を刺激することはでき
ないが、マイトジェンの存在下ではリンホカインの産生
を有意に高めるということを示した（パールシュタイン
等（Pearlstein,K,T.et al.）、J.Biol.Response Modei
fiers ２、81−91（1983））。従ってこれらの結果は、
正常な提供者からのPBMCに比較して、CGD患者におけるP
BMCの活性化に必要なシグナルには有意な差が存在する
ことを示しており、この病気における免疫機能障害は、
従来考えられていたより重大であるということを示唆し
ている（シーガル（Segal,A.W.）、The Lancet,June 1
5、1378−1382、（1985））。

実施例５カンジダ・アルビカンスによる好中球の活性
化に対する腫瘍壊死因子アルファの影響カンジダ・アルビカンスによるPMNの活性化に対する、
組換え腫瘍壊死因子アルファの影響を調べた。先のデー
タは、非オプソニン化菌糸に比較して、オプソニン化粒
子（ザイモサンまたは菌糸）によって誘導されたPMN応
答に差があることを示唆した。PMNを得、末梢血液から
分離した。PMNを腫瘍壊死因子アルファ（100単位10⁶PM
N）と一緒に30分間インキュベートした結果、過酸化物
（O₂ ^-）の非刺激ベースライン放出に対する影響は全く
観察されなかった。PMNを腫瘍壊死因子アルファ（100単
位10₆）と一緒に30分間プレインキュベートすると、ザ
イモサン（20.2％）、およびオプソニン化菌糸（38.6
％）および非オプソニン化菌糸（42.0％）によるO₂ ^-の
発生が増加する。過酸化物（O₂ ^-）放出の阻害剤として
知られている百日咳の毒素（PT）500ng/ml2時間、およ
びカルシウム（Ca⁺⁺）キレート化（細胞内、有機緩衝液
BAPTAで負荷させることによる；細胞外、EGTAで負荷さ
せることによる）。PTを加えた、または加えなかったBA
PTAまたはEGTAは、腫瘍壊死因子アルファの予備処理に
関係なく、オプソニン化ザイモサンに対するPMNのO₂ ^-応
答をほとんど完全に除く（95−99％）。しかしながら、
オプソニン化されたか否かにかかわらず、菌糸によって
腫瘍壊死因子アルファ刺激PMNから誘導された呼吸激発
応答は、部分的に低下しただけであった（オプソニン化
菌糸対非オプソニン化菌糸によるそれぞれの阻害:PTに
より、24.6＋4.3対25.0＋2.4％、BAPTAにより、20.0＋
8.4対45.5＋4.9％、EGTAにより、47.3＋2.4対27.5＋1.4
％、および３種全ての組み合わせにより、68.9＋2.8対5
4.3＋3.3％）。全ての場合、即ち一連の条件について、
菌糸に対するPMNのO₂ ^-応答は、腫瘍壊死因子アルファに
よって有意に高められた（ｐ＜0.05）。これらのデータ
は、腫瘍壊死因子アルファは、サイトソリック（cytoso
lic）カルシウム濃度の変化で、検出し得るカルシウム
イオン流によって媒介される「セカンド・メッセンジャ
ー」応答またはPT−阻害能を有するグアニンヌクレチオ
ド調節プロテインの関係する活性化過程に近い部位にお
いて、PMNの呼吸激発を高めるように作用するというこ
とを示唆している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト腫瘍壊死因子アルファによる、正常
（Ａ）およびCGD（Ｂ）提供者からのPMNの食菌作用の活
性化を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】腫瘍壊死因子アルファの治療的有効量と薬
学的に許容し得る賦形剤を含有してなる慢性肉芽腫症治
療剤。
【請求項２】注射可能な剤型に製剤化されている第１項
に記載の治療剤。
【請求項３】注射可能な溶液である第２項に記載の治療
剤。
【請求項４】pHが５〜9.5である第３項に記載の治療
剤。
【請求項５】pHが６〜7.5である第４項に記載の治療
剤。
【請求項６】更に薬学的に許容し得る緩衝剤を含んでい
る第４項又は第５項に記載の治療剤。
【請求項７】凍結乾燥品である第２項に記載の治療剤。
【請求項８】局所用製剤として製剤化されている第１項
記載の治療剤。
【請求項９】腫瘍壊死因子アルファを約0.01mg/ml〜100
mg/mlの割合で含有している第８項に記載の治療剤。
【請求項１０】抗菌剤を更に含んでいる第１項〜第９項
のいずれかに記載の治療剤。