JPH07101215B2 - 生体機能物質固定化電極を用いた分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 「発明の目的」 「産業上の利用分野」 この発明は、生体機能物質の分子識別機能を利用して生
体物質を検知するバイオセンサによる分析方法に関する
ものである。特に、生体機能物質を多孔性電極に直接包
括固定化して作製した固定化電極を用いた、再現性なら
びに信頼性に優れた微量試料に対する迅速分析法に関す
るものである。

「従来の技術」 本発明者らは、すでに白金黒表面への生体機能物質の包
括固定化が可能であることを見い出し、これを利用した
固定化電極を作製することに成功し、特許出願した（昭
和62年特許願第55387号（特開昭63-222256号公報）及び
第56472号（特公平６−75054号公報））。さらに、固定
化電極を用い、静止した微量サンプルの測定が可能な分
析システムとこれを用いた電気化学的非定常法に基づく
分析法を開発し、特許出願した（昭和62年特許願第3045
23号（特開平１−147357号公報））。

この方法は、試料溶液の採取量を厳密に規定する必要が
なく、微量の静止試料の測定や無希釈測定が可能であ
り、ミリ秒オーダーでの迅速測定を特徴とする点で、バ
イオセンサの応用範囲の可能性を大きく広げたものであ
った。しかし、事前に測定対象物質を含まない緩衝溶液
（以下ブランク溶液と呼ぶ）でのブランク測定を行い、
その値を目的の試料溶液に対する応答から差し引く必要
があり、その操作が煩雑となる。このため、この方法は
ミリ秒オーダーでの応答を利用した迅速分析法でありな
がら、試料溶液測定前の操作も含めた測定操作全体で
は、その利点を十分に発揮することができなかった。

「発明が解決しようとする問題点」 白金黒電極上に酵素を包括固定化した酵素電極に電気化
学的非定常法を適用して定電位単純パルスに対する非定
常応答電流を記録したとき、その応答電流は実施２に示
すごとくブランク溶液に対しても０とはならない。この
非定常電流は、パルス印加直後の電気二重層容量の充電
電流の他に、不純物分子や電極表面の電気化学的酸化還
元応答に由来するファラデー電流を含んでいる。このた
め、検体試料対して観測された非定常電流値から、ブラ
ンク溶液について観測された非定常電流値を差し引く必
要がある。また、このブランク溶液に対する応答が検体
試料に対する応答電流に比して無視し得るほど小さくな
い場合には、センサ応答の再現性、信頼性も損なわれ
る。そこで、この発明はブランク溶液に関する応答の測
定、いわゆるブランク測定を必要としない分析方法を提
供しようとするものであり、これによって再現性良く、
信頼性に優れた迅速分析方法を提供するものである。

「発明の構成」 「問題点を解決するための手段」 この発明は、上記の問題点を解決するために、測定パル
スを加える直前に予備パルスを印加し、電気化学的な前
処理によって測定対象物質に由来しない応答を低減せし
め、その後一定時間開回路状態を保った後、引き続く測
定パルスによってセンサ応答の測定を行うことを特徴と
する分析方法を提供する。

この発明において利用する生体機能物質を包括固定化し
た電極ならびに分析システムは、出願特許（昭和62年特
許願第304523号（特開平１−147357号公報））に述べら
れている非定常応答を用いた分析システムである。すな
わち、昭和62年特許願第55387号（特開昭63-222256号公
報）、第56472号（特公平６−75054号公報）に述べられ
ているように、白金などの微粒子から構成された微小電
極の表面に酵素などの生体機能物質を包括固定化した導
電性微粒子層を有する構造の電極を作用電極とし、銀・
塩化銀などの参照電極ならびに対極を備えた三電極を有
する電気化学システムであり、その構造の一例を第一図
に示す。第一図において、作用電極１は生体機能物質
（例えばグルコース酸化酵素）を包括固定化した微小電
極であり、直径が例えば、約１μｍ〜500μｍの範囲の
微小電極である。これに白金線の対極２と銀・塩化銀系
の参照電極３とをもって構成したものがセンサ素子６で
ある。以上の三電極、すなわち、微小固定化電極１、対
極２と参照電極３は、テフロン（登録商標名）型枠５の
穴のなかにポリエステル樹脂４で包埋されたものであ
る。このようなセンサ素子６は、細い金属線を３本封入
固定しただけの構造であるから、微細加工技術を用いれ
ば、これら全体を非常に微小なセンサに構成することも
できる。

このセンサ素子を用いれば、例えば１μ１程度の微量試
料でも測定可能である。即ち、微量試料を滴下した後に
電位を印加し、このときに発生する電流値を検知する方
式によって、微量試料中の物質を検知できるものであ
る。

上に述べた分析システムを用いた、定電位パルスに対す
る非定常電流応答を記録してセンサ応答を得るが、単純
パルスに対する応答では、測定対象物質を含まない溶液
に対しても、実例２に示すように無視し得ないほどのフ
ァラデー電流が観測される。従来、ブランク測定が必要
とされたのは、この電流を差し引く必要があったためで
ある。

この発明は、第２図に示すように、測定用の定電位パル
ス９を印加する直前に、予備的な定電位パルス７を印加
し、一定時間の電位を印加しない、いわゆる開回路状態
８に保った後、測定用パルス９を印加することによって
上記問題点を解決せんとするものである。

「作用」 電気化学系に定電位パルスを印加したときに観測される
非定常電流応答は、一般に、電気二重層容量の充電に由
来する容量性電流と電極における電気化学的酸化還元反
応に由来するいわゆるファラデー電流の二つの成分より
成っている。容量性電流は数十マイクロ秒から数百マイ
クロ秒の時定数で減衰してしまうので、この発明で問題
とする数ミリ秒から数十ミリ秒程度の非定常電流におい
て問題となるのはファラデー電流のみであると考えてよ
い。

ブランク溶液に対するファラデー電流は、主として、溶
液中に含まれる不純物の電極反応ならびに電極表面の電
気化学的酸化還元反応から成っていると考えることがで
きる。以下の説明ならびに実施例においては、グルコー
ス検知に適用した場合を例として述べる。この場合、電
極表面に固定化したグルコース酸化酵素の作用によって
グルコースが酸化されるが、この際生成した過酸化水素
電気化学的に酸化するに要する電流を検知することによ
ってグルコースを検出しようとするものである。従っ
て、以下の記述においては予備パルス、測定パルスとも
に酸化パルスを用いているが、生体機能物質と測定対象
物質との組合せによっては、還元パルスを印加すべき場
合もある。

銀・塩化銀参照電極に対して0.6Vの定電位パルスを印加
したときに観測される酸化電流は、過酸化水素の酸化電
流の他に、電極近傍の還元性不純物の酸化電流および白
金黒表面を酸化して表面酸化物を生成する酸化電流を含
む可能性がある。ブランク溶液において観測される非定
常電流は主として還元性不純物の酸化電流ならびに白金
黒表面の酸化電流に由来すると考えられる。従って、測
定パルスに先立つ予備パルスの印加によって、ブランク
溶液に対しては、電極表面近傍に存在した還元性不純物
を酸化し、白金黒表面の酸化状態を、測定用パルスを印
加した場合と同じ状態に調整する効果があるために、ブ
ランク溶液の応答を無視しうるほど小さくすることがで
きる。

グルコースを含む試料溶液に対しては、すでに生成して
いた過酸化水素も予備パルスによって同様に酸化される
が、８の開回路状態の期間にグルコースの反応によって
再び過酸化水素が生成するので、このとき発生した過酸
化水素を測定パルス９によって検出することになる。こ
のような開回路状態は従来の定電位パルス印加法等の電
気化学測定では電極電位が不定となるため使用されるこ
とのなかった技術であるが、本発明の生体機能電極では
必須の技術である。

「実施例」 実施例１ センサ素子の作製 第一図に示したセンサは以下の手順によって作製した。
テフロン型枠５の中に、１μｍ〜500μｍ径の範囲の微
小白金線、200μｍ径の対極用の白金線、そして500μｍ
〜1mm径程度の銀線をそれぞれ１本ずつポリエステル樹
脂４で封入した後に、アルミナ研磨剤で研磨した。白金
作用電極表面に対する酵素の固定化は次の方法で行っ
た。

300ppmの酢酸鉛含有の３％塩化白金酸溶液の中で、銀・
塩化銀参照電極に対し、−0.1Vの電位で５分間定電位電
解して白金黒の電解析出を行い、厚さ約数μｍの白金黒
を得た。次に、得られた白金黒析出電極を室温で60秒間
乾燥した後に、0.5M硫酸水溶液中で−0.3Vに30分間保持
し、白金黒電極から水素を発生させた。60秒間風乾した
後に、1.2Vの一定電位を15分間印加し、電極表面の酸化
処理を行った後、5500単位のグルコース酸化酵素含有リ
ン酸緩衝液（pH6.8）1mlに30分間浸漬し、再度風乾し
た。

次に、以上のようにして得られた微小電極を有するセン
サ素子６において、銀線を銀・塩化銀参照電極とした。
このようにして作製した三電極より成るセンサ素子６を
0.1Mリン酸緩衝溶液中で一昼夜攪拌、洗浄し、この発明
に用いる三電極系センサ素子を得た。

実施例２ 単純パルスを用いたグルコース濃度の測定 グルコース濃度の測定にあたっては、第３図に示した測
定系を用いた。即ち、センサ素子６の作用電極１、対極
２、参照電極８をそれぞれポテンシオスタット10に結線
し、パルスの印加は、ファンクションジェネレータ11か
らの信号によってポテンシオスタットを駆動せしめた。
非定常電流は、ディジタルメモリスコープ12に記録し
た。直径50μｍの白金線を用いて作製した固定化酵素電
極を作用極とし、銀・塩化銀参照電極に対して0.6Vの単
純定電位パルスを印加したときの非定常電流応答を第４
図に示す。曲線13は20mMのグルコースを含むリン酸緩衝
溶液に対する応答であり、14はリン酸緩衝溶液のみのブ
ランク溶液に対する応答であって、15は20mMフルクトー
スを含むリン酸緩衝溶液に対する応答である。

いずれの応答も、１ミリ秒程度で二重層容量の充電によ
ると思われる初期のピーク電流は減衰し、２ミリ秒以降
はファラデー電流が観測されていると思われる。フルク
トース溶液がブランク溶液とほぼ同一の曲線を与えてい
ることから、曲線13と14との差は、20mMの濃度のグルコ
ースの存在によって生成した過酸化水素を、電気化学的
に酸化するに際して流れた電流に由来するものと考えら
れる。そこで、２ミリ秒後のグルコース溶液とブランク
溶液との電流応答の差をセンサ応答と定義し、種々の濃
度におけるセンサ応答を測定した。この結果を第５図に
示すが、センサ応答は濃度に対して一義的に対応してお
り、この応答からグルコース濃度を知ることができる。
しかしながら、第４図に示したデータを再現性良く得る
ためには、センサと溶液とが接触してから測定開始まで
の時間を一定に保たねばならず、また、ブランク溶液に
対する応答もその都度測定することが必要であった。

実施例３ 予備パルスを用いたグルコース濃度の測定 実施例２と同じ装置を用い、第２図に示した予備パルス
７を与えた後、一定時間開回路状態８に保持し、その後
測定パルス９による測定を行った。銀・塩化銀参照電極
に対して0.6Vの定電位予備パルスを60秒間与えた後、10
秒間開回路状態に保ち、引き続いて同じく0.6Vの定電位
測定パルスを印加して得られた非定常電流応答を第６図
に示す。曲線16は、5mMグルコースに対する応答であ
り、17はブランク溶液に対する応答である。

ブランク溶液に対する応答は、５ミリ秒程度で1.5μＡ
程度であって、10ミリ秒以降はグルコース溶液に対する
応答電流に比較して無視できるほど小さい。即ち、予備
パルスを用いた場合には、ブランク溶液の応答は非常に
小さいので、ブランク溶液に対する応答をその都度測定
して電流値を差し引く操作は必要ない。

実施例４ センサ応答のグルコース濃度依存 実施例３で得られた非定常電流応答からグルコース濃度
を定めるために、測定パルス印加後一定時間における電
流値とグルコース濃度との関係を求めた。

種々のグルコース濃度の試料溶液に対して、実施例３と
同時に予備パルスを20秒間印加した後、10秒間開回路状
態に保ち、その後定電位測定パルスに対する非定常電流
の測定を行い、10ミリ秒後の電流値をセンサ応答とし
て、そのグルコース濃度依存を測定した結果を第７図に
示す。グルコース濃度0.1Mから10mMまでの間で良い直線
性を示しており、予備パルスを用いることによってブラ
ンク溶液に対する応答の測定なしに、測定パルスに対す
る非定常電流値からグルコース濃度を直接定めることが
できることを示している。

実施例５ パルス印加時間とセンサ応答 実施例２と同じ装置を用いて、実施例３、４と同じ電位
条件にて、第２図におけるパルス印加時間とセンサ応答
の関連について調べた。予備パルス印加時間を１秒から
60秒まで変化させ、10秒間開回路状態に保った後に測定
した10ミリ秒後の非定常電流値を第８図に示す。曲線18
は5mMグルコースを含むリン酸緩衝溶液に対する応答
を、19はブランク溶液に対する応答を示す。

ブランク溶液に対する応答は、予備パルス15秒程度まで
急速に減少し、十分に減衰するには60秒程度を必要とす
る。一方、グルコースに対する応答は、30秒程度でほぼ
一定値をとる。

一方、開回路時間とセンサ応答との関係を調べるため
に、予備パルス時間を20秒に保ち、開回路時間を１秒か
ら30秒へと変化させた時の、10ミリ秒後の非定常電流値
で定義したセンサ応答を調べた結果を第９図に示す。曲
線20、21、22はそれぞれ10mM、5mM、2mMグルコース溶液
に対する応答である。この結果から開回路状態において
は、主としてグルコース酸化酵素によるグルコースの酸
化反応が進行し、電極表面において過酸化水素の生成が
進行するものと考えられる。

以上の結果をまとめると、予備パルス時間の長いほどブ
ランク溶液の与える応答は小さく、開回路時間の長いほ
どセンサ応答は大きくなることがわかる。一方、実用上
の見地に立てば、これらの時間の短い方が迅速分析には
有利である。そこで、予備パルス５秒、開回路時間５秒
の条件で種々の濃度のグルコース溶液に対するセンサ応
答の測定を行った結果を第10図に示す。

グルコース濃度ゼロ、即ち、ブランク溶液に対する応答
はゼロとはならないが、それぞれのグルコース濃度に対
して再現性の良いセンサ応答が得られており、予備パル
スを与えた場合、ブランク溶液に対する応答が完全にゼ
ロとなるまで待たない場合にも再現性の良い測定が可能
である場合があり、必要に応じて、この条件によって測
定の迅速化をはかることも可能であることを示してい
る。

実施例６ 応答の再現性の検討 予備パルスの印加による再現性の向上を検討するため
に、予備パルスを用いた場合と単純パルスを用いた場合
とについてセンサ応答を繰り返し測定した。測定装置は
実施例２と同じであり、10mMグルコース溶液を試料と
し、予備パルス時間は20秒、開回路時間は30秒であっ
た。結果の一例を第11図に示す。

第11図の白丸は予備パルスを用いない単純パルスの場合
のセンサ応答であり、黒丸が上記予備パルスを用いた結
果である。

単純パルスの場合、第１回目の応答は常に異常に大きい
値を与え、２回目以降についても標準偏差３％程度のば
らつきが観測された。一方、予備パルスを用いた場合、
再現性も向上し、標準偏差は0.4％程度となった。

「発明の効果」 電気化学的非定常法を酵素包括白金黒電極に適用し、生
体物質の検知に利用することは、センサ応答が試料量に
依存しない迅速分析法を確立するための道を拓いたもの
であったが、ブランク測定を要する等簡便さに難があ
り、糖尿病性網膜症患者等の血糖値の自己管理等に利用
するためのセンサ素子としてはそのままで実用化するに
は困難があった。この発明による予備パルスと開回路状
態との併用によって、実施例３、４、５に示した如く操
作は著しく簡便化することが可能となり、かつ、実施例
６に示した如く信頼性は著しく向上した。

以上要するに、この発明の技術的効果は、微量試料に対
して、簡便、かつ、信頼性の高い高感度迅速分析を可能
とする点にある。

【図面の簡単な説明】

第１図 この発明において利用するセンサ素子の構成例
である。 第２図 この発明において用いる予備パルスおよび開回
路状態のプログラムの一例である。 第３図 実施例２−実施例６において用いた測定系の概
念図である。 第４図 定電位単純パルスを印加したときの非定常電流
応答の例である。 第５図 定電位単純パルスに対する非定常電流応答を用
いて得られたセンサ応答のグルコース濃度に対する依存
を表す。 第６図 予備パルスを用いたときの非定常電流応答の例
である。 第７図 予備パルスを用いたときの非定常電流応答から
得られたセンサ応答のグルコース濃度依存を表す。 第８図 センサ応答の予備パルス時間に対する依存を表
す。 第９図 開回路状態の時間に対するセンサ応答の依存を
表す。 第10図 予備パルス、開回路状態ともに５秒間としたと
きのセンサ応答を表す。 第11図 単純定電位パルスに対する応答から得られたセ
ンサ応答と予備パルスを用いた場合のセンサ応答の再現
性を比較したものである。 「主要な部分の符号の説明」 １……生体機能物質固定化電極 ２……対極 ３……銀・塩化銀参照電極 ４……ポリエステル樹脂 ５……テフロン型枠 ６……センサ素子 ７……予備パルス ８……開回路期間 ９……定電位測定パルス 10……ポテンシオスタット 11……ファンクションジェネレーター 12……ディジタルメモリースコープ 13……20mMグルコースに対する応答 14……ブランク溶液に対する応答 15……20mMフルクトース溶液に対する応答 16……5mMグルコースに対する応答 17……ブランク溶液に対する応答 18……5mMグルコースに対する応答 19……ブランク溶液に対する応答 20……10mMグルコースに対する応答 21……5mMグルコースに対する応答 22……2mMグルコースに対する応答

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生体機能物質を固定化した白金黒および金
   黒等の多孔性電極を用いて電気化学的非定常法により測
   定対象物質の検出または濃度の決定を行うシステムにお
   いて、定電位測定パルスに先立つ定電位予備パルスによ
   る電気化学的な前処理と一定時間の開回路状態を保つこ
   とを特徴とする分析方法。