JPH07101992A - 細胞増殖抑制蛋白 - Google Patents
細胞増殖抑制蛋白Info
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- JPH07101992A JPH07101992A JP5249355A JP24935593A JPH07101992A JP H07101992 A JPH07101992 A JP H07101992A JP 5249355 A JP5249355 A JP 5249355A JP 24935593 A JP24935593 A JP 24935593A JP H07101992 A JPH07101992 A JP H07101992A
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- cell growth
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規な細胞増殖抑制蛋白質を提供する。
【構成】 ヒト子宮内膜癌の抽出物から得られ、ストロ
ーマ繊維芽細胞の増殖の抑制活性を有し、Ｎ末端に疎水
性に富むアミノ酸配列を有し、分子量が約６８,０００
であり、生体内でパラクライン増殖抑制因子として作用
していると思われる、新規細胞増殖抑制蛋白質。
ーマ繊維芽細胞の増殖の抑制活性を有し、Ｎ末端に疎水
性に富むアミノ酸配列を有し、分子量が約６８,０００
であり、生体内でパラクライン増殖抑制因子として作用
していると思われる、新規細胞増殖抑制蛋白質。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト子宮内膜繊維芽細
胞の増殖抑制作用を有し、癌の増殖や転移を抑制するた
めの医薬として有用な細胞増殖抑制蛋白質に関する。
胞の増殖抑制作用を有し、癌の増殖や転移を抑制するた
めの医薬として有用な細胞増殖抑制蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの腫瘍細胞は、直接若しくは間接的
に自己の増殖を促進する物質を生産することが知られて
いる。また、腫瘍細胞が直接若しくは間接的に自己の増
殖を抑制する物質を生産する例も知られている（Iverse
n OH. Adv. Cancer Res. 1991;57: 413-52）。
に自己の増殖を促進する物質を生産することが知られて
いる。また、腫瘍細胞が直接若しくは間接的に自己の増
殖を抑制する物質を生産する例も知られている（Iverse
n OH. Adv. Cancer Res. 1991;57: 413-52）。
【０００３】例えば、癌細胞を馴化培地中で培養する
と、しばしば培地中に蛋白質様の増殖因子を分泌する
（James R, Bradshaw RA. Annu.Rev.Biochem. 1984; 5
3: 259-92, Rozengurt E. Science 1986; 234: 161-6
6, Sporn MB, Roberts AB. Nature1985; 313: 745-47,
Bradshaw RA, Sporn MB. Fed.Proc. 1983; 42: 2590-9
1）。これらの癌細胞若しくは癌細胞と一緒に培養した
繊維芽細胞は、分泌された蛋白質様の増殖因子に対する
受容体を有する場合がしばしばある（Sporn MB, Robert
s AB. Nature 1985; 313: 745-47）。タイプαおよびβ
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよび
β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびボンベシ
ンを含むこれらの因子の多くのタイプは、最終的には細
胞の分裂促進反応を引き起こすことが知られている。
と、しばしば培地中に蛋白質様の増殖因子を分泌する
（James R, Bradshaw RA. Annu.Rev.Biochem. 1984; 5
3: 259-92, Rozengurt E. Science 1986; 234: 161-6
6, Sporn MB, Roberts AB. Nature1985; 313: 745-47,
Bradshaw RA, Sporn MB. Fed.Proc. 1983; 42: 2590-9
1）。これらの癌細胞若しくは癌細胞と一緒に培養した
繊維芽細胞は、分泌された蛋白質様の増殖因子に対する
受容体を有する場合がしばしばある（Sporn MB, Robert
s AB. Nature 1985; 313: 745-47）。タイプαおよびβ
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよび
β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびボンベシ
ンを含むこれらの因子の多くのタイプは、最終的には細
胞の分裂促進反応を引き起こすことが知られている。
【０００４】また、ＴＧＦ−βは既に相当均一に精製さ
れている。そして、ＴＧＦ−βは繊維芽細胞および上皮
細胞のいずれの腫瘍細胞に対しても増殖抑制活性を有す
るが（Tucker RF, Shipley GD, Moses HL, Holly RW. S
cience 1984; 226: 705-07,Tucker RF, Braum EL, Ship
ley GD, Ryan RJ, Moses HL. Proc.Natl.Acad.Sci.USA
1984; 81: 6757-61）、ＴＧＦ−βの働きが増殖を促進
するか抑制するかを決定する細胞における一群の条件の
組み合わせは複雑で、細胞のタイプの違い、培養の条件
若しくはＴＧＦ−βの濃度で単純には説明できない。さ
らに、子宮頸部癌および子宮内膜癌においても子宮内膜
繊維芽細胞から蛋白質様増殖因子が生産・分泌されてい
ると推測される（Imai A, Matsunami K, Tamaya T. Obs
tet.Gynecol.Invest. 1992; 33: 109-13, Imai A, Mat
sunami K, Iida K, Tamaya T.Biosci.Rep. 1990; 10: 4
7-53）。これらの増殖因子は、パラクライン（paracrin
e）若しくはオウトクライン（autocrine）のメカニズム
によって効果を及ぼしていると考えられる。すなわち、
これらの因子は効果を及ぼす極近傍において生産・分泌
されている可能性がある。
れている。そして、ＴＧＦ−βは繊維芽細胞および上皮
細胞のいずれの腫瘍細胞に対しても増殖抑制活性を有す
るが（Tucker RF, Shipley GD, Moses HL, Holly RW. S
cience 1984; 226: 705-07,Tucker RF, Braum EL, Ship
ley GD, Ryan RJ, Moses HL. Proc.Natl.Acad.Sci.USA
1984; 81: 6757-61）、ＴＧＦ−βの働きが増殖を促進
するか抑制するかを決定する細胞における一群の条件の
組み合わせは複雑で、細胞のタイプの違い、培養の条件
若しくはＴＧＦ−βの濃度で単純には説明できない。さ
らに、子宮頸部癌および子宮内膜癌においても子宮内膜
繊維芽細胞から蛋白質様増殖因子が生産・分泌されてい
ると推測される（Imai A, Matsunami K, Tamaya T. Obs
tet.Gynecol.Invest. 1992; 33: 109-13, Imai A, Mat
sunami K, Iida K, Tamaya T.Biosci.Rep. 1990; 10: 4
7-53）。これらの増殖因子は、パラクライン（paracrin
e）若しくはオウトクライン（autocrine）のメカニズム
によって効果を及ぼしていると考えられる。すなわち、
これらの因子は効果を及ぼす極近傍において生産・分泌
されている可能性がある。
【０００５】このような、腫瘍細胞由来の増殖促進ある
いは抑制物質は、医薬品として利用することが可能であ
ろうと期待されており、腫瘍細胞から細胞の増殖に影響
を及ぼす物質を見いだすために種々の研究が行われてい
る。
いは抑制物質は、医薬品として利用することが可能であ
ろうと期待されており、腫瘍細胞から細胞の増殖に影響
を及ぼす物質を見いだすために種々の研究が行われてい
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、間質細胞(s
tromal cell)、特に繊維芽細胞の増殖を抑制し、最終的
に癌細胞の増殖を抑制する作用を有する細胞増殖抑制蛋
白質、例えば、腫瘍細胞のひとつである子宮内膜癌由来
の細胞増殖抑制蛋白質を提供し、もって癌細胞の増殖抑
制剤の開発に寄与することを目的とする。
tromal cell)、特に繊維芽細胞の増殖を抑制し、最終的
に癌細胞の増殖を抑制する作用を有する細胞増殖抑制蛋
白質、例えば、腫瘍細胞のひとつである子宮内膜癌由来
の細胞増殖抑制蛋白質を提供し、もって癌細胞の増殖抑
制剤の開発に寄与することを目的とする。
【０００７】更に、本発明は、当該蛋白質に特異的に反
応する抗体を用いて免疫学的に生体試料中の当該蛋白質
を検出し、もって癌細胞の存在を検出する方法に関す
る。
応する抗体を用いて免疫学的に生体試料中の当該蛋白質
を検出し、もって癌細胞の存在を検出する方法に関す
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】癌細胞の増殖には沢山の
因子が関与していると考えられるが、そのひとつに癌細
胞が増殖するにはその周りの間質細胞までも増殖させる
ことにより増殖していることが考えられている。事実、
癌細胞自身が、癌細胞の周りの間質細胞に対する分裂促
進因子（mitogen)を産生していることが知られている。
例えば、子宮内膜癌は、数種類の分裂促進因子を合成・
分泌しており、それらの分裂促進因子は子宮内膜繊維芽
細胞においてその増殖を促進する反応を示すことが知ら
れている（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.203;117-122,1993)。
因子が関与していると考えられるが、そのひとつに癌細
胞が増殖するにはその周りの間質細胞までも増殖させる
ことにより増殖していることが考えられている。事実、
癌細胞自身が、癌細胞の周りの間質細胞に対する分裂促
進因子（mitogen)を産生していることが知られている。
例えば、子宮内膜癌は、数種類の分裂促進因子を合成・
分泌しており、それらの分裂促進因子は子宮内膜繊維芽
細胞においてその増殖を促進する反応を示すことが知ら
れている（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.203;117-122,1993)。
【０００９】最近、本発明者らは癌細胞が間質細胞に対
する増殖促進因子のみならず増殖抑制因子も産生してい
る可能性があることを見い出し、当該因子に係る蛋白質
を単離・精製するに至り本発明を完成した。
する増殖促進因子のみならず増殖抑制因子も産生してい
る可能性があることを見い出し、当該因子に係る蛋白質
を単離・精製するに至り本発明を完成した。
【００１０】本発明の細胞増殖抑制蛋白質は、下記の性
質を有する。
質を有する。
【００１１】１）［3Ｈ］チミジンの取り込みにより細
胞増殖能を調べるアッセイにおいて、繊維芽細胞、例え
ば、子宮内膜癌のストローマの繊維芽細胞による
［3Ｈ］チミジンの取り込みを抑制する、新しいクラス
のパラクライン増殖抑制因子である。
胞増殖能を調べるアッセイにおいて、繊維芽細胞、例え
ば、子宮内膜癌のストローマの繊維芽細胞による
［3Ｈ］チミジンの取り込みを抑制する、新しいクラス
のパラクライン増殖抑制因子である。
【００１２】２）ゲル濾過法により測定した分子量が約
６８,０００であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法による分子量も約６８,０００である。
６８,０００であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法による分子量も約６８,０００である。
【００１３】３）蛋白質全体としては親水性であるが、
Ｎ末端部に配列表の配列番号１の疎水性に富むアミノ酸
配列を有する。
Ｎ末端部に配列表の配列番号１の疎水性に富むアミノ酸
配列を有する。
【００１４】４）Ａｆｆｉ−Ｇｅｌブルークロマトグラ
フィーにより、アルブミンとは明瞭に分離される。
フィーにより、アルブミンとは明瞭に分離される。
【００１５】本発明の細胞増殖抑制蛋白質は、子宮内膜
癌組織中から発見された。しかし、本抑制蛋白質は、他
の腫瘍組織中あるいは正常組織中に存在する可能性もあ
る。さらに、そのような組織の細胞を in vivo または
in vitro で培養した細胞中にも存在すると考えられ
る。それらの組織または細胞を材料として、本抑制蛋白
質を抽出・精製するには、例えば、以下のように行うこ
とができる。
癌組織中から発見された。しかし、本抑制蛋白質は、他
の腫瘍組織中あるいは正常組織中に存在する可能性もあ
る。さらに、そのような組織の細胞を in vivo または
in vitro で培養した細胞中にも存在すると考えられ
る。それらの組織または細胞を材料として、本抑制蛋白
質を抽出・精製するには、例えば、以下のように行うこ
とができる。
【００１６】本抑制蛋白質を含むと予想される組織また
は細胞を、適当な液中、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）
のような中性付近の緩衝液中にて、好ましくは低温でホ
モジェナイズし、高速遠心等の手段で不溶物を除去して
上清を得る。この上清を限外濾過、陰イオン交換体によ
る精製、ゲル濾過、および、例えば，Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ
ブルークロマトグラフィーによるアルブミンの除去を適
当に組み合わせて精製することができる。必要に応じ、
電気泳動や他の慣用の蛋白質精製法により更に精製して
もよい。
は細胞を、適当な液中、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）
のような中性付近の緩衝液中にて、好ましくは低温でホ
モジェナイズし、高速遠心等の手段で不溶物を除去して
上清を得る。この上清を限外濾過、陰イオン交換体によ
る精製、ゲル濾過、および、例えば，Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ
ブルークロマトグラフィーによるアルブミンの除去を適
当に組み合わせて精製することができる。必要に応じ、
電気泳動や他の慣用の蛋白質精製法により更に精製して
もよい。
【００１７】上記精製工程において、本抑制蛋白質を含
む画分の追跡は、子宮内膜から分離して培養した初代若
しくは継代繊維芽細胞による［3Ｈ］チミジンの取り込
み抑制能に基づいて行うことができる。
む画分の追跡は、子宮内膜から分離して培養した初代若
しくは継代繊維芽細胞による［3Ｈ］チミジンの取り込
み抑制能に基づいて行うことができる。
【００１８】上記精製工程によって、元の細胞若しくは
組織のホモジェネート上清に対して約２０,０００倍に
精製され、濃度がナノモル若しくはそれ以下の範囲で子
宮内膜繊維芽細胞への［3Ｈ］チミジンの取り込みを約
９０％抑制する、約６８ｋＤａの実質的に純粋な蛋白質
が得られる。本蛋白質は、Ｎ末端部に配列表の配列番号
１の疎水性に富む、独特のアミノ酸配列を有する新規蛋
白質である。
組織のホモジェネート上清に対して約２０,０００倍に
精製され、濃度がナノモル若しくはそれ以下の範囲で子
宮内膜繊維芽細胞への［3Ｈ］チミジンの取り込みを約
９０％抑制する、約６８ｋＤａの実質的に純粋な蛋白質
が得られる。本蛋白質は、Ｎ末端部に配列表の配列番号
１の疎水性に富む、独特のアミノ酸配列を有する新規蛋
白質である。
【００１９】更に、本発明は、上記蛋白質に対する抗体
を用いて免疫化学的に生体試料中の当該蛋白質を検出す
る方法にも関する。即ち、生体試料中に本発明に係る細
胞増殖抑制蛋白質が検出されることにより、子宮内膜癌
等の存在を間接的に知ることができる。
を用いて免疫化学的に生体試料中の当該蛋白質を検出す
る方法にも関する。即ち、生体試料中に本発明に係る細
胞増殖抑制蛋白質が検出されることにより、子宮内膜癌
等の存在を間接的に知ることができる。
【００２０】当該検出方法に用いることができる抗体は
上記蛋白質に特異的に反応する抗体であれば特に特定さ
れる必要はなく、即ちポリクローナル抗体でもモノクロ
ーナル抗体でも用いることができる。これらの抗体の作
製方法については既に一般的に知られている方法に従っ
て当業者であれば容易に作製することができる。
上記蛋白質に特異的に反応する抗体であれば特に特定さ
れる必要はなく、即ちポリクローナル抗体でもモノクロ
ーナル抗体でも用いることができる。これらの抗体の作
製方法については既に一般的に知られている方法に従っ
て当業者であれば容易に作製することができる。
【００２１】生体試料中の蛋白を免疫化学的に検出する
方法も広く知られており、当業者であれば適宜適切な方
法を用いることができるが、それらの方法としては、例
えば蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ等
を挙げることができる。
方法も広く知られており、当業者であれば適宜適切な方
法を用いることができるが、それらの方法としては、例
えば蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ等
を挙げることができる。
【００２２】
【発明の効果】本発明に係る細胞増殖抑制蛋白質は、子
宮内膜癌−繊維芽細胞の相互作用において、常に子宮内
膜繊維芽細胞の増殖を抑制する反応を引き起こす。従っ
て、本発明に係る細胞増殖抑制蛋白を癌患者、特に子宮
内膜癌の患者に投与して、当該癌細胞近傍の間質細胞、
特に繊維芽細胞の増殖を抑制することにより、最終的に
は当該癌細胞の増殖を抑制することが可能あると考えら
れる。
宮内膜癌−繊維芽細胞の相互作用において、常に子宮内
膜繊維芽細胞の増殖を抑制する反応を引き起こす。従っ
て、本発明に係る細胞増殖抑制蛋白を癌患者、特に子宮
内膜癌の患者に投与して、当該癌細胞近傍の間質細胞、
特に繊維芽細胞の増殖を抑制することにより、最終的に
は当該癌細胞の増殖を抑制することが可能あると考えら
れる。
【００２３】
【実施例】以下の実施例により、本発明を詳細に説明す
る。
る。
【００２４】増殖抑制活性測定法 Ａ．ヒト子宮内膜繊維芽細胞の調製 正常な子宮内膜材料は、子宮平滑筋腫のため部分的な子
宮摘出手術を受けた患者、若しくは拡張症で腫瘍のスク
リーニングテストとして掻爬術を受けた患者から得た。
切除後の組織をハンクスの平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）で
洗浄し、次いで、既に文献に記載されているように（Im
ai A, Matsunami K, Tamaya T. Obstet.Gynecol.Inves
t. 1992; 33: 109-13, Imai A, Matsunami K, Iida K,
Tamaya T. Biosci.Rep. 1990; 10: 47-53, Imai A, F
urui T, Matsunami K, TakahashiK, Tamaya T. Proc.So
c.Exp.Biol.Med. 1993; 203: 117-122）、０.２５％コ
ラゲナーゼ（タイプＩ、シグマ）を含むＨＢＳＳ溶液中
で３７℃、１.５時間処理した。細胞懸濁液をナイロン
メッシュで濾過し、組織断片、細胞残渣および繊維を取
り除いた。濾液を遠心し、ＨＢＳＳで洗浄した。ペレッ
ト中の細胞を再懸濁し、最小必須培養液、イーグルス
（ＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えた溶
液中でインキュベートした。数日間のインキュベーショ
ンの後、付着していない細胞は取り除き、繊維芽細胞を
単層として培養した。細胞が集密的な状態（confluenc
e）になるまで培養培地を２日おきに交換し、これらは
上記培地中にストック培養細胞として保存した。１つの
ストック培養細胞は一人の患者から調製し、実験は常に
３つのストック培養を用いて行った。本発明者の分析で
は、分泌期の子宮内膜由来の繊維芽細胞と増殖期の子宮
内膜由来の細胞の間に著しい相違は検出されなかった。
宮摘出手術を受けた患者、若しくは拡張症で腫瘍のスク
リーニングテストとして掻爬術を受けた患者から得た。
切除後の組織をハンクスの平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）で
洗浄し、次いで、既に文献に記載されているように（Im
ai A, Matsunami K, Tamaya T. Obstet.Gynecol.Inves
t. 1992; 33: 109-13, Imai A, Matsunami K, Iida K,
Tamaya T. Biosci.Rep. 1990; 10: 47-53, Imai A, F
urui T, Matsunami K, TakahashiK, Tamaya T. Proc.So
c.Exp.Biol.Med. 1993; 203: 117-122）、０.２５％コ
ラゲナーゼ（タイプＩ、シグマ）を含むＨＢＳＳ溶液中
で３７℃、１.５時間処理した。細胞懸濁液をナイロン
メッシュで濾過し、組織断片、細胞残渣および繊維を取
り除いた。濾液を遠心し、ＨＢＳＳで洗浄した。ペレッ
ト中の細胞を再懸濁し、最小必須培養液、イーグルス
（ＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えた溶
液中でインキュベートした。数日間のインキュベーショ
ンの後、付着していない細胞は取り除き、繊維芽細胞を
単層として培養した。細胞が集密的な状態（confluenc
e）になるまで培養培地を２日おきに交換し、これらは
上記培地中にストック培養細胞として保存した。１つの
ストック培養細胞は一人の患者から調製し、実験は常に
３つのストック培養を用いて行った。本発明者の分析で
は、分泌期の子宮内膜由来の繊維芽細胞と増殖期の子宮
内膜由来の細胞の間に著しい相違は検出されなかった。
【００２５】Ｂ．子宮内膜繊維芽細胞への［3Ｈ］チミ
ジンの取り込み抑制 ［６-3Ｈ］チミジン（１.１１ ＴＢｑ/ｍｍｏｌ, Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）のトリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）不溶性画分への移行を測定することによって
ＤＮＡ合成を分析した。実験を行う前に、コンフルエン
トになった細胞をプラスチック製２４穴プレートに密度
が１.０×１０5細胞／ｃｍ2になるように播種した。細
胞がコンフルエントになった状態において、単層培養を
１％ＦＢＳを含むＭＥＭ中において２日間プレインキュ
ベートし、並列に種々の試薬に３７℃で処理してテスト
を行った。［3Ｈ］チミジンの取り込みは、連続標識若
しくは２時間のパルス標識で１μＣi／穴でラベルする
ことによって調べ、取り込みは培地を吸い出してしまう
ことによって終了させた。細胞を氷冷した０.５％ＴＣ
Ａで洗浄し、さらに遠心分離（４００×ｇ、５分間）を
３回行って洗浄した。チューブの底の酸不溶性画分の放
射活性を測定した。
ジンの取り込み抑制 ［６-3Ｈ］チミジン（１.１１ ＴＢｑ/ｍｍｏｌ, Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）のトリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）不溶性画分への移行を測定することによって
ＤＮＡ合成を分析した。実験を行う前に、コンフルエン
トになった細胞をプラスチック製２４穴プレートに密度
が１.０×１０5細胞／ｃｍ2になるように播種した。細
胞がコンフルエントになった状態において、単層培養を
１％ＦＢＳを含むＭＥＭ中において２日間プレインキュ
ベートし、並列に種々の試薬に３７℃で処理してテスト
を行った。［3Ｈ］チミジンの取り込みは、連続標識若
しくは２時間のパルス標識で１μＣi／穴でラベルする
ことによって調べ、取り込みは培地を吸い出してしまう
ことによって終了させた。細胞を氷冷した０.５％ＴＣ
Ａで洗浄し、さらに遠心分離（４００×ｇ、５分間）を
３回行って洗浄した。チューブの底の酸不溶性画分の放
射活性を測定した。
【００２６】実施例１ Ａ．ヒト子宮内膜癌由来の抽出物の調製 子宮内膜癌を手術による摘出後、直ちに氷冷したリン酸
緩衝液（ＰＢＳ）につけて洗浄した後、直ちに使用する
か若しくは液体窒素中に保存した。組織学的に充分に分
化した腺癌を示す試料は実験から除外した。０-４℃で
ＰＢＳで洗浄した後、摘出した組織の容量の４-５倍の
量のホモジェナイズバッファー（０.２５Ｍ ショ糖、1
ｍＭ エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ,ｐＨ７．４）を加えた。続いて、常法通
り２−５ｇの組織をテフロンホモジェナイザーを用いて
０−４℃でホモジェナイズした。ホモジェネートを１０
０,０００×ｇで１時間遠心し、得られた上清を液体窒
素中に保存した。蛋白質量は、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を標準としてローリー法（Lowry et al）によっ
て決定した（Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Ran
dall RJ. J.Biol.Chem. 1951; 193: 265-75）。
緩衝液（ＰＢＳ）につけて洗浄した後、直ちに使用する
か若しくは液体窒素中に保存した。組織学的に充分に分
化した腺癌を示す試料は実験から除外した。０-４℃で
ＰＢＳで洗浄した後、摘出した組織の容量の４-５倍の
量のホモジェナイズバッファー（０.２５Ｍ ショ糖、1
ｍＭ エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ,ｐＨ７．４）を加えた。続いて、常法通
り２−５ｇの組織をテフロンホモジェナイザーを用いて
０−４℃でホモジェナイズした。ホモジェネートを１０
０,０００×ｇで１時間遠心し、得られた上清を液体窒
素中に保存した。蛋白質量は、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を標準としてローリー法（Lowry et al）によっ
て決定した（Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Ran
dall RJ. J.Biol.Chem. 1951; 193: 265-75）。
【００２７】Ｂ．限外濾過 使用説明書に従い、分離限界分子量１０,０００の膜（C
entriprep-10 若しくは Centricon-10、アミコン社製）
を用いて、子宮内膜癌の粗抽出物（５-１５ｍｌ）を限
外濾過した。分子量が１０,０００ダルトン以上の画分
は、［3Ｈ］チミジンの取り込みがコントロールの約２
０％となっている（表１）ことで示されるように、子宮
内膜繊維芽細胞の増殖を抑制した。一方、それより低い
分子量（１０,０００ダルトン未満）を有する画分は増
殖刺激活性を有していた（データは示さない）。抑制活
性を有する濃縮液をプールした。プールするために必要
な活性の最低基準はコントロールと比較した時に
［3Ｈ］チミジンの取り込みを３０％抑制する量とし
た；７個の摘出試料のうち２個の活性がこの最低基準に
満たなかった。
entriprep-10 若しくは Centricon-10、アミコン社製）
を用いて、子宮内膜癌の粗抽出物（５-１５ｍｌ）を限
外濾過した。分子量が１０,０００ダルトン以上の画分
は、［3Ｈ］チミジンの取り込みがコントロールの約２
０％となっている（表１）ことで示されるように、子宮
内膜繊維芽細胞の増殖を抑制した。一方、それより低い
分子量（１０,０００ダルトン未満）を有する画分は増
殖刺激活性を有していた（データは示さない）。抑制活
性を有する濃縮液をプールした。プールするために必要
な活性の最低基準はコントロールと比較した時に
［3Ｈ］チミジンの取り込みを３０％抑制する量とし
た；７個の摘出試料のうち２個の活性がこの最低基準に
満たなかった。
【００２８】なお、表１において、比較に用いたヒトの
血清は、健常な女性の提供者の腕の静脈血液から得て、
３７℃で２時間凝固させ、続いて軽く遠心を行って得
た。そして血清を凝固物と分離して用いた。
血清は、健常な女性の提供者の腕の静脈血液から得て、
３７℃で２時間凝固させ、続いて軽く遠心を行って得
た。そして血清を凝固物と分離して用いた。
【００２９】Ｃ．陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー 限外濾過工程で得られた活性画分をさらに精製するた
め、４℃条件下、０.０２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４ で
平衡化した陰イオン交換Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲカラム（１０
×１ｃｍ、ファルマシア社）を用いたＨＰＬＣ装置によ
ってクロマトグラフィーを行った。０−１.０Ｍ Ｎａ
Ｃｌの直線濃度勾配を与えた０.０２ＭＨＥＰＥＳを流
速２ｍｌ／分で流すことによって増殖抑制因子を溶出し
た。蛋白質の溶出は２８０ｎｍの吸収によってモニター
した。画分（２分毎）を収集し、全ての画分について増
殖抑制活性を測定した。図１は、３回の実験により得ら
れた結果から作成した典型的な溶出パターンを示すもの
である。図中、増殖抑制活性は、測定画分の存在下での
細胞による［3Ｈ］チミジン取り込みを、抑制因子の不
在下での取り込みに対する％として、３回の平均値±Ｓ
Ｄにより示されている。この図から明らかな通り、０．
１８-０．２０Ｍ ＮａＣｌ 溶出画分に存在する成分の
みが子宮内膜繊維芽細胞による［3Ｈ］チミジンの取り
込みを抑制した。増殖抑制活性を有する画分をプール
し、増殖抑制活性ゲル濾過プールと名付けた。活性を有
する画分をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ装置（クボタ、日本）中
で凍結乾燥して保存した。次いで、乾燥試料を再溶解
し、直ちに次の精製過程に用いた。
ー 限外濾過工程で得られた活性画分をさらに精製するた
め、４℃条件下、０.０２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４ で
平衡化した陰イオン交換Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲカラム（１０
×１ｃｍ、ファルマシア社）を用いたＨＰＬＣ装置によ
ってクロマトグラフィーを行った。０−１.０Ｍ Ｎａ
Ｃｌの直線濃度勾配を与えた０.０２ＭＨＥＰＥＳを流
速２ｍｌ／分で流すことによって増殖抑制因子を溶出し
た。蛋白質の溶出は２８０ｎｍの吸収によってモニター
した。画分（２分毎）を収集し、全ての画分について増
殖抑制活性を測定した。図１は、３回の実験により得ら
れた結果から作成した典型的な溶出パターンを示すもの
である。図中、増殖抑制活性は、測定画分の存在下での
細胞による［3Ｈ］チミジン取り込みを、抑制因子の不
在下での取り込みに対する％として、３回の平均値±Ｓ
Ｄにより示されている。この図から明らかな通り、０．
１８-０．２０Ｍ ＮａＣｌ 溶出画分に存在する成分の
みが子宮内膜繊維芽細胞による［3Ｈ］チミジンの取り
込みを抑制した。増殖抑制活性を有する画分をプール
し、増殖抑制活性ゲル濾過プールと名付けた。活性を有
する画分をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ装置（クボタ、日本）中
で凍結乾燥して保存した。次いで、乾燥試料を再溶解
し、直ちに次の精製過程に用いた。
【００３０】Ｄ．ゲル濾過 Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ＨＲ（１×３０ｃｍ、ファルマ
シア社）を用いてゲル濾過を行った。カラムは、２０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平
衡化した。再溶解した試料をカラムに導入し、２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４からな
るバッファーで流速０.５ｍｌ／分で溶出した。蛋白質
の溶出は２８０ｎｍの吸収によってモニターした。画分
（１分毎）を収集し、それらの増殖抑制活性を測定し
た。カラムにおける分子量の標準曲線は、ＢＳＡ（６
７,０００）、卵白アルブミン（４２,０００）およびキ
モトリプシノーゲン（２５,０００）を用いて作成し
た。３回の実験からの典型的なゲル濾過パターンを図２
に示す。この図から明らかなように、分子量約６８,０
００の物質が抑制活性を有した。しかし、この活性の溶
出時間（リテンションタイム）が血清アルブミンの溶出
時間と一致することから、この活性は同じ画分内に存在
する血清アルブミンによるものである可能性も考えられ
た。そこで下記のように、Ａｆｆｉ-Ｇｅｌブルーゲル
を用いて増殖抑制活性からアルブミンを分離した。
シア社）を用いてゲル濾過を行った。カラムは、２０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平
衡化した。再溶解した試料をカラムに導入し、２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４からな
るバッファーで流速０.５ｍｌ／分で溶出した。蛋白質
の溶出は２８０ｎｍの吸収によってモニターした。画分
（１分毎）を収集し、それらの増殖抑制活性を測定し
た。カラムにおける分子量の標準曲線は、ＢＳＡ（６
７,０００）、卵白アルブミン（４２,０００）およびキ
モトリプシノーゲン（２５,０００）を用いて作成し
た。３回の実験からの典型的なゲル濾過パターンを図２
に示す。この図から明らかなように、分子量約６８,０
００の物質が抑制活性を有した。しかし、この活性の溶
出時間（リテンションタイム）が血清アルブミンの溶出
時間と一致することから、この活性は同じ画分内に存在
する血清アルブミンによるものである可能性も考えられ
た。そこで下記のように、Ａｆｆｉ-Ｇｅｌブルーゲル
を用いて増殖抑制活性からアルブミンを分離した。
【００３１】Ｅ．Ａｆｆｉ-Ｇｅｌブルーゲルクロマト
グラフィー Ａｆｆｉ-Ｇｅｌブルーゲル（色素親和性支持体）を用
い、アルブミンとブルーＦ-３-ＧＡ色素との選択的な相
互作用（Travis J, Bowen J, Tewksbury D, Johnson D,
Pannell R. Biochem.J. 1976; 157: 301-06, Marshal
l JJ. J.Chromatogr. 1970; 53: 379-80）を利用して試
料からアルブミンを取り除いた。使用説明書に従って、
４℃条件下、０.０２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７.１で平
衡化した、Ａｆｆｉ-Ｇｅｌブルーゲル（バイオ−ラド
社）を充填したＥｃｏｎｏ-Ｐａｃブルーカートリッジ
に活性画分を導入した。カラムを０.０２Ｍ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4、１０-１５ｍｌによって流速１ｍｌ／分で溶出し
た。溶出された画分を収集し（１分毎）、上述したよう
に Centriprep-10 を用いた限外濾過によって実験開始
時の容量まで濃縮した。カラムに結合した蛋白質（アル
ブミンを含む）は、１０−２０ｍｌの１．４Ｍ ＮａＣ
ｌ、０.０２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７.１）によって流
速１ｍｌ／分でカートリッジを洗浄することによって溶
出させた。
グラフィー Ａｆｆｉ-Ｇｅｌブルーゲル（色素親和性支持体）を用
い、アルブミンとブルーＦ-３-ＧＡ色素との選択的な相
互作用（Travis J, Bowen J, Tewksbury D, Johnson D,
Pannell R. Biochem.J. 1976; 157: 301-06, Marshal
l JJ. J.Chromatogr. 1970; 53: 379-80）を利用して試
料からアルブミンを取り除いた。使用説明書に従って、
４℃条件下、０.０２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７.１で平
衡化した、Ａｆｆｉ-Ｇｅｌブルーゲル（バイオ−ラド
社）を充填したＥｃｏｎｏ-Ｐａｃブルーカートリッジ
に活性画分を導入した。カラムを０.０２Ｍ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4、１０-１５ｍｌによって流速１ｍｌ／分で溶出し
た。溶出された画分を収集し（１分毎）、上述したよう
に Centriprep-10 を用いた限外濾過によって実験開始
時の容量まで濃縮した。カラムに結合した蛋白質（アル
ブミンを含む）は、１０−２０ｍｌの１．４Ｍ ＮａＣ
ｌ、０.０２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７.１）によって流
速１ｍｌ／分でカートリッジを洗浄することによって溶
出させた。
【００３２】２回の実験で得られた典型的なクロマトグ
ラフィーパターンを図３に示す。Ａｆｆｉ-Ｇｅｌブル
ーゲルに弱く結合したアルブミン画分２および強く結合
したアルブミン画分３には抑制活性は溶出されなかっ
た。逆に、アルブミンを含まない画分１は２万−３万倍
に希釈しても常に活性を有していた。画分２および３は
アルブミンを含んでおり、かつ、これらの２つの画分に
は増殖抑制活性が検出されなかったことは注目に値す
る。この結果から、抑制活性物質とアルブミンとは異な
ることが確認された。
ラフィーパターンを図３に示す。Ａｆｆｉ-Ｇｅｌブル
ーゲルに弱く結合したアルブミン画分２および強く結合
したアルブミン画分３には抑制活性は溶出されなかっ
た。逆に、アルブミンを含まない画分１は２万−３万倍
に希釈しても常に活性を有していた。画分２および３は
アルブミンを含んでおり、かつ、これらの２つの画分に
は増殖抑制活性が検出されなかったことは注目に値す
る。この結果から、抑制活性物質とアルブミンとは異な
ることが確認された。
【００３３】以上の精製工程における試料の増殖抑制活
性を測定した。その結果を表１に示す。同じ抑制活性を
誘導するのに要求される蛋白質の量は、１／２０,００
０に減少した（比活性が２０,０００倍に上昇した）。
性を測定した。その結果を表１に示す。同じ抑制活性を
誘導するのに要求される蛋白質の量は、１／２０,００
０に減少した（比活性が２０,０００倍に上昇した）。
【００３４】
【表１】 表１ 精製工程の各段階における増殖抑制活性の定量 精製工程 蛋白質 精製度 ［3Ｈ］チミジン取り込み (ｍｇ) (倍率） (ｄｐｍ×１０-3)（％） 精製前 ８.５（１００） 粗抽出物 ２０,０００ １ − 限外濾過 ６,２００ ３.２ １.５（１８.２） Mono Q カラム ２４０ ８３.３ １.１（１２.９） ゲル濾過 ３５.５ ５６３.３ １.６（１８.８）Affi-Gel ブルーゲル ０．８８ ２２,７２７ １.５（１８.２） ヒト 血清 ９.２／１μｇ 画分は全て精製開始の粗抽出物の容量（２ｍｌ）に合わ
せ、そのうちの１μｌを子宮内膜繊維芽細胞に対する増
殖抑制活性を測定するのに使用した。
せ、そのうちの１μｌを子宮内膜繊維芽細胞に対する増
殖抑制活性を測定するのに使用した。
【００３５】Ｆ．電気泳動 Laemmli によって記載されている（Laemmli WK. Nature
1970; 227: 680）のと実質的に同じ方法で、蛋白質を
ドデシル硫酸ナトリウム中１０％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって分離した。分子量６８,０００の単
一の蛋白質のバンドが確認された。
1970; 227: 680）のと実質的に同じ方法で、蛋白質を
ドデシル硫酸ナトリウム中１０％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって分離した。分子量６８,０００の単
一の蛋白質のバンドが確認された。
【００３６】Ｇ．Ｎ末端部分配列の決定 上記に記載したように精製した増殖抑制因子を、通常の
方法に従って、ＰＴＨアミノ酸をオンラインＨＰＬＣで
同定できる Applied Biosystems パルス液体シーケンサ
ーを用いたエドマン分解によって分析した。その結果、
この因子のＮ末端アミノ酸配列は、図４に示すように単
一の明白な配列を示し、既知の蛋白質分子の配列とは全
く相同性がなかった。図４中、網掛けの円で囲んだ部分
は、非極性のアミノ酸残基である。
方法に従って、ＰＴＨアミノ酸をオンラインＨＰＬＣで
同定できる Applied Biosystems パルス液体シーケンサ
ーを用いたエドマン分解によって分析した。その結果、
この因子のＮ末端アミノ酸配列は、図４に示すように単
一の明白な配列を示し、既知の蛋白質分子の配列とは全
く相同性がなかった。図４中、網掛けの円で囲んだ部分
は、非極性のアミノ酸残基である。
【００３７】
配列番号：１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質のＮ末端部分 起源 生物名：ヒト 組織の種類：子宮内膜癌 配列 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Gln Ser Trp Asp Phe Xaa Ser Gln Xaa 5 10
【図１】子宮内膜癌抽出物の分子量１０,０００ダルト
ン以上のフラクションを陰イオン交換クロマトグラフィ
ーで精製した際の溶出パターンを示す図である。
ン以上のフラクションを陰イオン交換クロマトグラフィ
ーで精製した際の溶出パターンを示す図である。
【図２】陰イオン交換クロマトグラフィーで溶出された
細胞増殖抑制活性を含む画分をゲル濾過で分離した際の
分離パターンを示す図である。
細胞増殖抑制活性を含む画分をゲル濾過で分離した際の
分離パターンを示す図である。
【図３】ゲル濾過により精製された細胞増殖抑制活性を
含む画分を、更にＡｆｆｉ−Ｇｅｌブルーゲルクロマト
グラフィーで精製した際の精製パターンを示す図であ
る。
含む画分を、更にＡｆｆｉ−Ｇｅｌブルーゲルクロマト
グラフィーで精製した際の精製パターンを示す図であ
る。
【図４】Ａｆｆｉ−Ｇｅｌブルーゲルクロマトグラフィ
ーで精製された細胞増殖抑制蛋白質のＮ末端１４アミノ
酸を示す図である。
ーで精製された細胞増殖抑制蛋白質のＮ末端１４アミノ
酸を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/574 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＶ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】以下の性質： １）ヒト子宮内膜繊維芽細胞の増殖抑制作用を有し、 ２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法および
ゲル濾過法により測定した分子量が約６８,０００であ
り、 ３）Ｎ末端部に配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有
する、ことを特徴とする、細胞増殖抑制蛋白質。 - 【請求項２】子宮内膜癌由来である請求項１の細胞増殖
抑制蛋白質。 - 【請求項３】ナノモル程度以下の濃度において、子宮内
膜から分離したストローマの繊維芽細胞への［3Ｈ］チ
ミジンの取り込みを約９０％抑制する、請求項１または
２の細胞増殖抑制蛋白質。 - 【請求項４】以下の性質： １）ヒト子宮内膜繊維芽細胞の増殖抑制作用を有し、 ２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びゲ
ル濾過法により測定した分子量が約６８,０００であ
り、 ３）Ｎ末端部に配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有
する、ことを特徴とする細胞増殖抑制蛋白質に特異的に
反応する抗体を組織試料と反応させ、該抗体と該試料中
の蛋白質との間に抗原抗体反応が生じた場合に該組織試
料中に癌細胞が存在すると判定することよりなる、組織
試料中の癌細胞の存在を検出する方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5249355A JPH07101992A (ja) | 1993-10-05 | 1993-10-05 | 細胞増殖抑制蛋白 |
| ES94115680T ES2159536T3 (es) | 1993-10-05 | 1994-10-05 | Proteina que inhibe el crecimiento celular. |
| EP94115680A EP0646600B1 (en) | 1993-10-05 | 1994-10-05 | A cell growth-inhibiting protein |
| DE69427623T DE69427623T2 (de) | 1993-10-05 | 1994-10-05 | Zellwachstum hemmendes Protein |
| AT94115680T ATE202786T1 (de) | 1993-10-05 | 1994-10-05 | Zellwachstum hemmendes protein |
| DK94115680T DK0646600T3 (da) | 1993-10-05 | 1994-10-05 | Et cellevækstinhiberende protein |
| US08/920,872 US5932700A (en) | 1993-10-05 | 1997-08-29 | Protein inhibiting the growth of human endometrial fibroblasts |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5249355A JPH07101992A (ja) | 1993-10-05 | 1993-10-05 | 細胞増殖抑制蛋白 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07101992A true JPH07101992A (ja) | 1995-04-18 |
Family
ID=17191800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5249355A Ceased JPH07101992A (ja) | 1993-10-05 | 1993-10-05 | 細胞増殖抑制蛋白 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5932700A (ja) |
| EP (1) | EP0646600B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07101992A (ja) |
| AT (1) | ATE202786T1 (ja) |
| DE (1) | DE69427623T2 (ja) |
| DK (1) | DK0646600T3 (ja) |
| ES (1) | ES2159536T3 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4803163A (en) * | 1984-06-04 | 1989-02-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Preparation of a protein fraction exhibiting cell growth-inhibiting activity |
-
1993
- 1993-10-05 JP JP5249355A patent/JPH07101992A/ja not_active Ceased
-
1994
- 1994-10-05 DE DE69427623T patent/DE69427623T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-05 DK DK94115680T patent/DK0646600T3/da active
- 1994-10-05 AT AT94115680T patent/ATE202786T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-10-05 ES ES94115680T patent/ES2159536T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-05 EP EP94115680A patent/EP0646600B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-08-29 US US08/920,872 patent/US5932700A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0646600T3 (da) | 2001-09-17 |
| ES2159536T3 (es) | 2001-10-16 |
| ATE202786T1 (de) | 2001-07-15 |
| EP0646600B1 (en) | 2001-07-04 |
| DE69427623T2 (de) | 2002-05-08 |
| US5932700A (en) | 1999-08-03 |
| EP0646600A1 (en) | 1995-04-05 |
| DE69427623D1 (de) | 2001-08-09 |
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