JPH0710226B2 - プロトプラスト攪拌装置並びにそれを含む細胞融合装置及びフローサイトメーター装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、プロトプラストを液内に均一に分散させるた
めの装置並びに該装置を含む細胞融合装置及びフローサ
イトメーター装置に関する。

［従来の技術］ 従来、細胞の攪拌には振盪（回転式又は往復式）が簡便
な方法として用いられていた。しかし扱う容器の形状
（フラスコ、試験管等）によっては均一な攪拌が困難で
あり、また、強い攪拌はプロトプラストのように細胞壁
を持たない細胞には細胞破壊のおそれがあるのであまり
向かない方法であった。

また、植物プロトプラスト等の細胞懸濁液を調製し、細
胞融合等に供する場合、プロトプラストを崩壊させない
ように穏やかに攪拌し、処理を行なう必要がある。特
に、連続して細胞を処理しようとする場合には、時間経
過と共に生じるプロトプラストの沈降を防ぎながら、常
に一定した細胞密度で細胞を融合チャンバーに送ること
が融合効率上重要である。しかしながら、従来の方法で
は、このように常に一定の細胞密度に細胞を懸濁するこ
とは困難であった。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って、本発明の目的は、プロトプラストを液中で均
一、かつ、ほぼ一定の細胞密度に分散、維持することが
できるプロトプラスト攪拌装置を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、空気又は窒素ガス等
の圧力を利用し、特殊なノズルの先端からプロトプラス
ト懸濁液を吸引し、これを吐出するという操作を繰返す
ことにより、プロトプラストを液中で均一に分散するこ
とができ、しかもプロトプラストへの障害もない有効な
攪拌効果が得られることを見出し、さらに、このような
攪拌を自動的及び連続的に行なう装置を作製することに
成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、プロトプラスト懸濁液を収容する
ための容器と、該容器に収容される前記プロトプラスト
懸濁液中に少なくともその先端が浸漬される、空気を吸
引することなく前記プロトプラスト懸濁液の吸引及び吐
出を行なうためのノズルと、該ノズルに接続され、該ノ
ズルから吸引された前記プロトプラスト懸濁液を一時的
に保存するためのチューブと、前記ノズルを介して前記
プロトプラスト懸濁液の吸引及び吐出を行なうための手
段を有するプロトプラスト攪拌装置を提供する。

さらに、本発明は、電気的刺激により連続してプロトプ
ラスト融合を行なう装置と、該装置の細胞懸濁液吸入口
に接続された上記本発明のプロトプラスト攪拌装置とを
有する細胞融合装置を提供する。

さらにまた、本発明は、フローサイトメーターと、該フ
ローサイトメーターのプロトプラスト懸濁液吸入口に接
続された上記本発明のプロトプラスト攪拌装置とを有す
るフローサイトメーター装置を提供する。

［発明の具体的説明］ 以下、上記ノズルを介して前記プロトプラスト懸濁液の
吸引及び吐出を行なうための手段が、前記ノズル、前記
チューブ及び前記容器内空間を連通する流路系と、該流
路系に接続され、前記プロトプラスト懸濁液を送液する
ための圧力源としての加圧ポンプと、該加圧ポンプによ
り加圧され、前記流路系の少なくとも一部を流通する加
圧媒体としてのガスと、前記流路系に設けられ、前記加
圧ポンプによって加圧される流路を変更するための複数
のバルブを有するものである、本発明の好ましい一態様
の一実施例を図面に基づき詳細に説明する。

第１図に示すように、本発明のプロトプラスト攪拌装置
は、懸濁プロトプラストを保持するための試験管３に空
気を吸引することなくプロトプラスト懸濁液21を吸引及
び吐出するためのノズル１と、該ノズルを試験管に設置
するための保持体であって、前記試験管の気密な蓋とし
ても機能する保持体４、さらに吸引したプロトプラスト
懸濁液を一時的に保持するためのチューブ２から構成さ
れる。さらに、該攪拌装置は懸濁液の吸引、吐出のため
の圧力源として空気や窒素等のガス圧力を利用するた
め、例えば加圧ポンプ15や圧力を調整するためのレギュ
レーター16とその導入、排出のためのバルブ５、10及び
懸濁プロトプラストを流路13から該装置外に送り出すべ
く途中の流路に設置された流路切替のためのバルブ６、
７、８から成る。また、必要に応じて、該装置の流路系
を洗浄するための洗浄液ボトルと流路切り替えバルブ９
を設置する。これらのバルブ類は全て制御回路14で開閉
をコントロールされる。

本装置を使用する際には、加圧ポンプ15からのガス圧を
レギュレーター16で適当な圧力に調節する。通常、圧力
は0.05〜1.0kgf/cm²が適当であり、約0.5kgf/cm²程度が
好ましい。圧力媒体としては空気や窒素ガス等を使用す
ることが可能であり、窒素ガスが特に好ましい。また、
必要に応じて無菌化のためのフィルター17の設置も可能
である。

操作にあたっては、先ず最初に第２図に示すように、プ
ロトプラスト懸濁液21の入った試験管３にバルブ５を開
いて加圧する。

次に、懸濁液の攪拌の際には、第３図に示す如くバルブ
６を開きノズル１の先端部から空気を吸引することなく
懸濁液21を吸引し、チューブ２内に一時的に保持してバ
ルブ６を閉じる。

それからバルブ10、７、６を開き、チューブ２内に保持
されていた懸濁液をノズル１の先端から試験管内に吐出
する。

この操作を１回ないし数回、連続的又は断続的に行なう
ことにより試験管３内のプロトプラスト懸濁液21を攪拌
する。ここで、チューブ内に吸引する懸濁液の量は、懸
濁液の一部又は全量でも良く、好ましくは懸濁液全体の
約半分程度である。

ノズル１によるプロトプラスト攪拌の様子が第４図に模
式的に示されている。第４図に示されるように、プロト
プラスト懸濁液21中のプロトプラスト22は、ノズルによ
る吸引及び吐出を繰返すことによりプロトプラスト22が
均一に分散される。このような攪拌を連続的又は断続的
に攪拌することによりプロトプラスト懸濁液を均一のプ
ロトプラスト濃度に維持することが可能である。

このようにして攪拌されたプロトプラスト細胞液は、流
路13を通して装置の外に送液される。後述のように、例
えば、連続式に電気的な刺激によってプロトプラストを
融合するための装置やフローサイトメーター等の装置と
組合わせることが適当である。

使用の際、流路系の無菌化にはエタノール等を用いるこ
とができる。また、流路系の洗浄には、洗浄液ボトル11
の洗浄液、例えば滅菌水や滅菌したバッファー、培養液
等が利用できる。具体的には、第５図に示す如くバルブ
６、７、９及び20を開き、洗浄液をチューブ２及びノズ
ル１に導入する。次に第６図に示す如くバルブ10、７、
６を開き試験管３内にガスを送りバブリングする。最終
的に第７図に示す如くバルブ５及び８を開き試験管３内
の洗浄液を廃液ボトル12へ排出する。

上記した本発明のプロトプラスト攪拌装置は、好ましく
は、電気的刺激により連続して細胞融合を行なう装置又
はフローサイトメーターのプロトプラスト懸濁液吸入口
に接続され、プロトプラスト融合装置又はフローサイト
メーター装置を構成することができる。本発明のプロト
プラスト攪拌装置が接続されるプロトプラスト融合を行
なう装置及びフローサイトメーターはこの分野において
周知である。本発明のプロトプラスト撹拌装置を接続し
た細胞融合装置及びフローサイトメーターにおいては、
常に均一の細胞密度の懸濁液が供給されるので、連続的
な細胞融合やセルソーティングを効率良く行なうことが
できる。

実施例１ 上記したプロトプラスト攪拌装置の流路13側に、電気的
に連続して細胞融合を行なう装置（日本分光社製CET-20
0型）をフローチャンバーと共に接続した。該細胞融合
装置は、半連続的にプロトプラスト懸濁液に電気刺激を
与え細胞を融合させる仕組になっている。すなわち、白
金パネル電極を備えたフロー型のチャンバー内にプロト
プラスト懸濁液を取り込み、電気パルス７を印加した
後、チャンバー内のプロトプラスト処理液を排出すると
同時に新しいプロトプラスト懸濁液を取り込む操作を繰
返すことにより、連続的にプロトプラストを融合させる
ための装置である。通常、該細胞融合装置には、サンプ
ルボトル中のプロトプラスト懸濁液をペリスタルポンプ
により送液しているが、処理時間が経過するにつれて次
第に懸濁液中のプロトプラストが沈降してしまい、プロ
トプラスト密度が均一な状態で送液できなくなることが
あった。

そこで該攪拌装置を接続してプロトプラスト懸濁液のサ
ンプリングを行なったところ、プロトプラストが崩壊す
ることなく、効果的な攪拌が得られた。すなわち、フロ
ーチャンバー内へ送液する直前に１回ないしは数回の吸
引、吐出操作を繰返し行なうことにより、均一なプロト
プラスト懸濁液を送液できることがわかった。

実施例２ 上記したプロトプラスト攪拌装置の流路13側に、フロー
サイトメーターのサンプル導入管を接続した。フローサ
イトメーター（コールター社製、EPICS-752J型）のサン
プルボトルは、沈降を防ぐための回転振盪装置が備え付
けられているタイプであるが、植物細胞のプロトプラス
トをサンプルとする場合には、効果的な攪拌が得られ
ず、サンプルボトル内で細胞が沈降してしまう様子が肉
眼でも確認できる。

そこで、該攪拌装置をフローサイトメーターのサンプル
導入管に接続してプロトプラスト懸濁液の連続送液を行
なった。攪拌は１回ないし数回、断続的に行ないながら
連続的にフローセルに送液した。フローセルからシース
液と共に流出される細胞数を検出器でカウントしたとこ
ろ、単位時間当りに流出されるプロトプラスト数は、常
に一定の値を示した。

［発明の効果］ 本発明によれば、懸濁プロトプラスト液を保持する試験
管等の容器を振盪することなく、液内のプロトプラスト
が効果的に攪拌される。また、加圧ポンプ等の圧力を適
当に調節することにより、壊れ易いプロトプラストの攪
拌にも有効である。従って、プロトプラストを材料にし
て行なう実験の前処理としての利用にも有効である。さ
らに、攪拌効果は容器の形態にほとんど左右されず、振
盪を行なう場合に必要なスペースも考慮しなくてすむた
め、小型化された機械装置、例えば細胞融合装置等の一
部として組み込めば理想的な攪拌効果を発揮できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のプロトプラスト攪拌装置の一実施例を
示す模式図、 第２図及び第３図は第１図に示すプロトプラスト攪拌装
置の使用状態を説明するための部分図、 第４図は本発明のプロトプラスト攪拌装置におけるノズ
ルによるプロトプラスト懸濁液の攪拌の様子を示す模式
部分拡大図、 第５図ないし第７図は第１図に示すプロトプラスト攪拌
装置のさらなる使用状態を説明するための部分図であ
る。 １……ノズル、２……チューブ、３……試験管、４……
保持体、５、６、７、８、９、10……バルブ、11……洗
浄液ボトル、12……廃液ボトル、13……排出流路、14…
…制御回路、15……加圧ポンプ、16……レギュレータ
ー、17……滅菌フィルター、18……マニホールド、19…
…圧力メーター、20……バルブ、21……プロトプラスト
懸濁液、22……プロトプラスト

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】プロトプラスト懸濁液を収容するための容
   器と、該容器に収容される前記プロトプラスト懸濁液中
   に少なくともその先端が浸漬される、空気を吸引するこ
   となく前記プロトプラスト懸濁液の吸引及び吐出を行な
   うためのノズルと、該ノズルに接続され、該ノズルから
   吸引された前記プロトプラスト懸濁液を一時的に保存す
   るためのチューブと、前記ノズルを介して前記プロトプ
   ラスト懸濁液の吸引及び吐出を行なうための手段を有す
   るプロトプラスト攪拌装置。
2. 【請求項２】電気的刺激により連続して細胞融合を行な
   う装置と、該装置のプロトプラスト懸濁液吸入口に接続
   された請求項１に記載されたプロトプラスト攪拌装置と
   を有する細胞融合装置。
3. 【請求項３】フローサイトメーターと、該フローサイト
   メーターのプロトプラスト懸濁液吸入口に接続された請
   求項１に記載されたプロトプラスト攪拌装置とを有する
   フローサイトメーター装置。