JPH0710228B2

JPH0710228B2 - 電気透析方法

Info

Publication number: JPH0710228B2
Application number: JP29660086A
Authority: JP
Inventors: 正宜岩原; 善幸野村; 和夫四方
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1986-12-15
Filing date: 1986-12-15
Publication date: 1995-02-08
Anticipated expiration: 2010-02-08
Also published as: JPS63148979A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、発酵によって得られた生成物をイオン交換膜
を用いて発酵液から分離する電気透析方法に関する。

〔従来技術及び発明が解決しようとする問題点〕

微生物工業に於いて、発酵によつて生成する目的物質の
発酵液からの分離を行なうために、陽極と陰極との間に
陽イオン交換膜及び陰イオン交換膜を配置し、陰極室に
発酵液を供給して発酵により生成した目的物質を電気透
析により分離する方法が試みられている。〔アプライド
・アンド・エンバイロンメンタル・ミクロバイオロジー
（Applied and Enrironmental microliology 52巻２号
314〜319頁 1986年）〕。この方法は、発酵液からの目
的物質の分離が極めて迅速に、且つ容易に行なえるとい
う利点を有している。しかしながら、実際の上記の方法
を実施してみると、起動直後は優れた効果が得られるの
であるが、時間の経過に伴つて目的物質の生成量の増加
に頭打ちが見られるようになり、目的物質の生成量が増
加しないという問題点が現われた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、上述のイオン交換膜を用いて発
酵による生成物を分離する方法に於ける問題点を解決
し、目的物質の生成量の増加を計るために鋭意研究を重
ねてきた。その結果、上記の問題点が、発酵液中に存在
する微生物の増殖の低下に基因するものであることを見
い出した。そして、さらに微生物の増殖の低下を防止す
る方法について研究を続けた結果、微生物の培養のため
に発酵液中に加えられるリン酸イオン源としてポリリン
酸又はその塩を用いることによつて優れた効果が得られ
ることを見い出し、本発明を完成するに至つた。

即ち、本発明は、陽極と陰極との間に陽イオン交換膜及
び陰イオン交換膜を配置してなる電気透析槽中で、発酵
により得られた生成物を発酵液から分離する電気透析方
法に於いて、該発酵液にポリリン酸又はその塩を存在さ
せることを特徴とする電気透析方法である。

本発明で用いられるポリリン酸としては、公知のものが
何ら制限されず用い得る。本発明で用いられるポリリン
酸を具体的に例示すれば、ピロリン酸,3リン酸,4リン
酸,5リン酸,6リン酸等の鎖状ポリリン酸;3メタリン酸,4
メタリン酸,5メタリン酸,6メタリン酸等の環状ポリリン
酸を挙げることができる。また、ポリリン酸の塩として
は、上記のポリリン酸の金属塩が何ら制限されずに用い
得るが、特にナトリウム塩，カリウム塩等のアルカリ金
属塩；或いはマグネシウム塩，カルシウム塩，バリウム
塩等のアルカリ土類金属塩が好適である。本発明で用い
られるポリリン酸又はその塩としては、３リン酸若しく
は３メタリン酸以上の鎖状若しくは環状のポリリン酸又
はその塩が好適であり、特に４リン酸若しくは４メタリ
ン酸以上の鎖状若しくは環状のポリリン酸又はその塩
が、微生物の増殖及び目的物質の生産が良好であるため
に好ましい。

上記したポリリン酸又はその塩の使用量は、特に制限さ
れるものではないが、発酵による生産を増大させる観点
から、発酵液中に0.007g/dl〜10g/dlさらに0.02g/dl〜
0.2g/dlの範囲で存在させることが好ましい。

本発明の電気透析方法は、生成物が電解質であるもので
あれば、公知のどのような発酵にも適用することができ
る。例えば、グルタミン酸発酵，リジン発酵，バリン発
酵，オルニチン発酵，ホモセリン発酵，スレオニン発
酵，イソロイシン発酵等のアミノ酸発酵；イノシン酸発
酵，グアニル酸発酵等の核酸発酵；クエン酸発酵，フマ
ール酸発酵，乳酸発酵，コハク酸発酵，酢酸発酵，グル
コン酸発酵，ピルビン酸発酵，α−ケトグルタール酸発
酵，イタコン酸発酵，りんご酸発酵等の有機酸発酵；脂
肪酸発酵；抗生物発酵等を挙げることができる。

また、本発明に於ける発酵で用いる微生物の種類，培地
の組成，培養温度，発酵液のpH,通気撹拌の程度等の培
養上の諸条件は、上記した種々の発酵に於いて公知の条
件が何ら制限なく採用される。

この際、使用する培地としては、主炭素源の他，窒素
源，無機物その他の生育促進物質を程よく含有する培地
ならば合成培地または天然培地の何れも使用可能である
が、電気透析を行なう時、イオン交換膜の目詰まり、劣
化等が生じて電圧が異常に上昇して電流効果が低下する
のを防止するため、できうる限り合成培地を用いること
が望ましい。

例えば、よく用いる炭素源としては、シユクロース，ガ
ラクトース，フラクトース，グルコース，デンプン，マ
ルトース，ラムノース，キシロース，ラクトース等の糖
類；メタノール，エタノール,n−プロピルアルコール，
グリセリン等のアルコール類;n−パラフインなどの鎖状
炭化水素類等があり、これらを混合して使用する場合も
ある。窒素源とては、アンモニア，硫安，塩安，硝安，
燐安，尿素，酢酸アンモニウム，クエン酸アンモニウム
などの無機若しくは有機窒素化合物が使用される。通常
はこれらに、リン酸源，カリウム源，マグネシウム源，
硫黄源，鉄源，マンガン源としてこれらの金属塩をさら
にビオチン，チアミン等の生育促進物質やpH低下防止剤
として炭酸カルシウムを加えることもある。

本発明において、発酵で使用する微生物としては、菌体
の培養液を直接そのまま用い得るが、公知の方法によつ
て固定化したものがより好ましい。例えば、固定化の方
法としては培養液より遠心分離や濾過によつて集菌した
菌を食塩水に懸濁し、この菌体懸濁液に、ポリビニルア
ルコール，ポリアクリルアミド，カツパー・カラギーナ
ン，アルギン酸カルシウム，光架橋性樹脂プレポリマ
ー，コラーゲン，セルロースサクシネート，カゼインサ
クシネート，メチルアクリレート，メタアクリル酸共重
合体などの担体，架橋剤，又は包括用材料を加えて固定
化した微生物菌体を得るという方法を挙げることができ
る。

本発明に於いて、発酵液中に可逆的に酸化還元を受ける
物質を存在させておくことは好ましい態様である。この
ような物質としては、鉄，マンガン，銅，亜鉛，コバル
ト，鉛等の金属イオン；赤血塩，黄血塩等の含鉄錯化合
物；メチルビオロゲン，ベンジルビオロゲン，ニユート
ラルレツド，ニユートラルバイオレツト等の酸化還元色
素等が挙げられる。これらの物質の使用量としては、特
に制限されるものではないが、発酵生産量を勘案する
と、一般に発酵液中に0.1mg/dl〜10mg/dlの範囲で使用
することが好ましい。

本発明の電気透析方法で用いられる電気透析槽は、通常
の電気透析で用いられている電気透析槽が何ら制限なく
使用し得る。本発明で用いられる電気透析槽の一例を図
示すると第１図のようである。図中、１は陽極２と陰極
３との間に陽イオン交換膜４及び陰イオン交換膜５を交
互に配置した電気透析槽である。この電気透析槽１は、
二対の陽イオン交換膜４及び陰イオン交換膜５によつて
５室に区切られている。これら５室は、陽極２の存在す
る室から順に、陽極室6,濃縮室7,希釈室8,濃縮室７及び
陰極室９である。第１図には陽イオン交換膜及び陰イオ
ン交換膜を二対用いた例を示したが、これらイオン交換
膜は一対であつても良く、また、三対以上であつても良
い。

陽イオン交換膜及び陰イオン交換膜は、公知のものが何
ら制限されず用い得る。この場合、発酵液中に存在する
菌の増殖に必要な培地成分，例えばマグネシウム，マン
ガン，鉄，カリウム，ナトリウムなどの各種塩類に対す
る発酵生産物の選択透過性の優れたものが好ましい。ま
た、紫外線，γ−線，アルコール，界面活性剤，塩素系
殺菌剤や加熱等によつて滅菌処理が可能で且つ洗滌操作
が行なえるものが望ましい。本発明に於いて好ましい陽
イオン交換膜は、スルホン酸基を有するものであり、ま
た、陰イオン交換膜は、第４級アンモニウム塩基を有す
るものである。さらに、陰イオン交換膜としては、平均
細孔径が100Å以下であるものが本発明に於いて好まし
く採用される。

次に、陽極２としては、白金，黒鉛，銅等が、また、陰
極３としては、白金，鉄，ステンレス等が好適に用いら
れる。陽極液及び陰極液は、公知のものが用い得るが、
一般には陽極液として硫酸水溶液が、陰極液として水酸
化ナトリウム水溶液が用いられる。また、後述するよう
に陰極液を用いないで、発酵液を陰極室に通ずることも
できる。陽極２と陰極３との間には、直流電源10が接続
されている。

発酵槽11で培養された発酵液は、希釈室８及び陰極室９
に導かれ、発酵によつて生成した生成物は陰イオン交換
膜５を通過して濃縮室７へと移動する。一方、発酵液
は、発酵槽11に回収される。濃縮室７へ移動した発酵に
よる生成物は、濃縮室７へ循環されている濃縮液と共に
回収槽12に回収される。第１図では、発酵槽11と電気透
析槽１とが独立して設けられており、発酵と電気透析が
別個の槽で行なわれているが、これら２つの槽を兼用し
て、希釈室８及び／又は陰極室９の中で発酵を行なうこ
ともできる。

第１図には、希釈室と陰極室の両方に発酵液を導入する
電気透析槽を示したが、発酵液の導入はいずれか一方で
もかまわない。

次に、第２図に長期間連続して電気透析を行なうのに好
適に用いられる電気透析槽の一例を示した。この電気透
析槽では発酵槽11中の発酵液のpHを測定して、その値に
応じて陽極及び陰極間の直流電源10をオン・オフ制御或
いは電流制御するpHコントローラー13が組み込まれてい
る。これによつて、発酵による目的物質の濃度が菌の増
殖や代射阻害を引き起こす濃度以上となつて発酵の至適
pHの範囲をはずれた場合に電気透析を開始し、或いは電
流密度を高くして目的物質を発酵液から分離するといつ
たコントロールが可能である。

以上に述べたような電気透析槽の運転は、一般には、電
圧が0.1〜35ボルト，電流密度が1.6〜10アンペア/dm²の
範囲から選択されて行なわれる。このような条件を採用
することによつて、通常３〜30日間の安定した運転が可
能である。また、前述した固定化微生物菌体と第２図に
示したpHコントロールの可能な電気透析槽を用いた場合
には、３〜８カ月の連続運転も可能である。

〔効果〕

本発明の電気透析方法を採用することによつて、長期間
にわたつて安定した発酵を行なうことが可能となり、目
的とする発酵生産物の生産量を増大させることができ
る。即ち、後述する実施例１及び比較例１からも明らか
なように、イオン交換膜を用いた電気透析において、菌
体の増殖に必要なリン酸イオンとしてポリリン酸（和光
紙薬）を培地に加えた実施例１では、培養72時間後の菌
体量は660nmの吸光度で0.4であり、発酵によるＬ−乳酸
の全生産量は使用した培地1dl当りに換算して8.0gに達
している。一方、通常、リン酸イオン源として従来から
培地に用いられてきたリン酸二水素カリウムを用い、他
は実施例１と同一条件電気透析を行なつた比較例１で
は、培養後の菌体量が0.2に抑制されており、Ｌ−乳酸
の生産量も2.0g/dlでしかない。

実施例１の値は、リン酸二水素カリウムとpH調整剤に10
％の炭酸カルシウムを用い、イオン交換膜を用いた電気
透析ではなく従来の発酵方法である。比較例２で得られ
た値とほぼ同じである。

このように、本発明の電気透析方法によれば、リン酸イ
オン源として通常培地に加えられて来たリン酸二水素カ
リウム又はナトリウム，リン酸一水素ニカリウム又はナ
トリウムあるいはそれらを組合せて用いた従来からの方
法に比べて、一定時間培養後の菌体量ならびに発酵によ
り生成する目的物質の量が多く、優れた効果が得られ
る。しかも、本発明は、発酵を行ないながら、目的物質
を迅速且つ容易に発酵液から分離することができるた
め、目的物質による発酵のフイードバツクインヒビシ
ヨンを解除し、且つ発酵液のpH変化や粘度上昇を防ぎ、
菌体の持つ発酵生産能力の低下を防止できる。

さらに、pH調整剤として通常よく使用されるカルシウム
塩は、増殖した菌体を溶菌するフアージの菌体への吸着
を助長するものであるが、本発明によれば、発酵により
生成した目的物質を直ちに発酵液から分離することがで
きるため、このようなpH調整剤を使用する必要はない。
従つて、本発明によれば、フアージによる菌体の汚染を
防止することが可能となる。さらにまた、ポリリン酸が
フアージの菌体への浸入を抑制する作用を持つているた
め、この点からもフアージ汚染の防止が可能となる。

これらの結果として、本発明は、発酵を長時間連続して
安定に行なうことを可能にする優れた効果を有する。

〔実施例〕

実施例１及び比較例1,2 種菌として、Ｌ−乳酸生産菌であるラクトバチラス・デ
ルブルツキイ−IFO3534を用いた。グルコース1.0g/dl,
ポリペプトン5.0g/dl,酵母エキス0.5g/dlからなる液体
培地（pH7.0）10mlを中型試験管に分注し、121℃,15分
間高圧蒸気滅菌を行なつた。これに種菌を１白金耳接種
し、45℃で24時間静置培養を行なつた。この培養液10ml
を100mlの同様に滅菌したグルコース1.0g/dl,ポリペプ
トン1.0g/dl,酵母エキス0.5g/dl,酢酸ナトリウム1.0g/d
lからなる液体培地（pH6.8）に接種し、45℃で15時間静
置培養することで種母を調製した。

本培養の培地としては、グルコース10.0g/dl,酵母エキ
ス2.0g/dl,ポリペプトン0.8g/dl,4リン酸0.02g/dl,硫酸
マグネシウム７水塩0.05g/dl,食塩0.01g/dlを用い、pH
を7.2とした。

第２図に示した電気透析槽を用いて電気透析を行なうに
当たり、750ml容ガラス製発酵槽に上記の培地500mlを分
注し、滅菌後、室温まで冷却したところで前記種母50ml
を接種し、45℃で静かに撹拌しながら培養を行なつた。

電気透析を行なうために、予め発酵槽に取り付けておい
た発酵用pH電極（アドバンテツク FX−180T）を直流電
源（高砂製作所（株）製MPO35−２）と連結したpHコン
トローラー（オリエンタル電気（株）製pHD II）に接続
した。さらに、直流電源は電気透析槽の各電極に接続さ
れており、これによつて発酵液のpHが指定された値以下
になると自動的に電気透析槽に電流が流れ、電気透析が
行なえるようにした。陰イオン交換膜（徳山曹達（株）
製ネオセプタ ACH−45T）および陽イオン交換膜（徳
山曹達（株）製ネオセプタ CH−45T）を組み合わせ
た電気透析槽の陽極には銅，陰極には白金を用い、極液
として陽極室に0.1NH₂SO₄・陰極室に0.1NNaOHを使用
し、又濃縮室及び回収槽には脱イオン水をマイクロチユ
ーブポンプ（東京理化（株）製 MP−３）で循環した。

電気透析は、本培養開始約７時間後、発酵液のpHが4.7
に低下した時に発酵液をマイクロチユーブポンプで希釈
室に循環して開始した。発酵液注と回収槽中のＬ−乳酸
の全生産量を使用した培地1dl当りに換算した値と発酵
液中の菌体量を第３図に示した。

なお、発酵液中及び回収槽中のＬ−乳酸量は、バーカー
・サマーソン法によつて定量した。菌体量は培養液を1N
塩酸によつて11倍希釈後、その660nmの吸光度を分光光
度計（（株）島津製作所 UV−240）を用いて測定し
た。

比較例１として、本培養の培地中の４リン酸に替えて、
リン酸二水素カリウム0.2g/dlを用いた以外は、上記の
実施例１と同様にして電気透析を行なつた。

さらに比較例２として本培養の培地中の４リン酸に替え
て、リン酸二水素カリウム0.2g/dlを用い、さらにpH調
製剤として160℃で90分間乾熱滅菌を行なつた炭酸カル
シウム10.0g/dlを添加した他は、実施例１及び比較例１
と同様にして培養を行なつたが、実施例１及び比較例１
と異なり、イオン交換膜を用いた電気透析は行なわず、
従来の発酵を行なつた。

これらの比較例1,比較例２におけるＬ−乳酸生産量，菌
体量を第３図に併記した。

リン酸イオンとして４リン酸を用いた実施例１では、培
養72時間後の菌体量が0.4（OD660nm）であり、Ｌ−乳酸
の全生産量は、使用した培地1dl当たりに換算して8.0g
であつた。これに対し、リン酸二水素カリウムを培地に
用いた比較例１では菌体の増殖が0.2に抑制されている
とともに、Ｌ−乳酸量も2.0g/dlと低かつた。

同様に、リン酸二水素カリウムをリン酸イオンとして用
いた比較例２では、実施例１と同程度のＬ−乳酸を生産
し、菌隊の増殖も見られた。しかしながら、この場合、
Ｌ−乳酸の中和のために加えられた炭酸カルシウムとＬ
−乳酸との間で乳酸カルシウムが生成するため、その濃
度の上昇に伴なつて発酵液の粘度が高くなり、72時間で
発酵を停止しなければならかなつた。この点、実施例１
では、電気透析によつて発酵液中のＬ−乳酸濃度を0.5g
/dl以下（pH5.5以上）にコントロールし、しかも中和剤
を必要としないので、72時間経過後も発酵を安定して行
なうことができた。

実施例２実施例１で用いた酵母培養液より菌体を遠心分離し、水
にて洗滌した。該洗滌菌体を生理食塩水に懸濁し、この
菌体懸濁液に２％になるようにアルギン酸ナトリウムを
加え、30℃に加温，スラリー化したものを注射器によ
り、0.1モル塩化カルシウム溶液中に滴下凝固させ球状
の固定化菌体を得た。この固定化菌体を用い、時々、一
部の培地を交換する以外は、実施例１と同様にして電気
透析を行なつたところ、約８ケ月間連続して運転するこ
とができた。Ｌ−乳酸は、従来の通電発酵で8.0g/dlで
あるのに対し、本発明によるとその60倍の生産量が得ら
れた。

実施例３麹汁を高圧滅菌して冷却したのち、これにエタノール4.
0g/dlを加え、酢酸菌（アセトバクターアセテイ IFO
3281）を１白金耳接種し、30℃で３〜５日間静置培養を
行なつた。次にグルコース0.1g/dl,グリセリン0.1g/dl,
硫酸アンモニウム0.1g/dl,4メタリン酸0.06g/dl,硫酸マ
グネシウム７水塩0.01g/dl,食塩0.01g/dl,酵母エキス0.
05g/dlからなる滅菌培地（pH7.0）に酢酸1.5g/dl,エタ
ノール8.0g/dlを加え、これに前記の培養液を10％接種
し、30℃で４日間，静置培養を行なうことによつて馴養
した。こうして得た培養液に10％ポリビニルアルコール
水溶液を10容量％加えて懸濁させ、これを凍結乾燥する
ことによつて固定化菌体を調製した。本培養も同じ培地
を行い、固定化菌体を10％（V/V）加え、実施例１と同
様にしてpHを4.5にコントロールしながら電気透析pHを
行なつた。また、４メタリン酸の替わりにリン酸二水素
カリウム0.2g/dlを用いて行なつた。生成した全酢酸濃
度（g/dl）の経時変化は第１表のとおりであつた。

また、電気透析は約３ケ月間連続して運転することがで
きた。

実施例４種菌としてクエン酸生産能を有するキヤンデイダ・ギヤ
マンデイ IFO 0566を用いた。シヨ糖5.0g/dl,アスパ
ラギン0.25g/dl,5リン酸0.02g/dl,硫酸マグネシウム７
水塩0.05g/dl,炭酸カルシウム20g/dlからなる液体培地
（pH6.0）に斜面培地から１白金耳接種し、30℃で２日
間振盪培養後遠心分離によつて集菌した。この菌体8gを
0.9％食塩水50mlに懸濁し、この懸濁液にN,N−ジメチル
ビニルベンジルアミンポリマー4gと4,4′−ビス（ジメ
チルアミン）ベンゾフエノン5mgを分散させたアセトン5
0mlを加えて乳化させ、これを25℃,2時間超高圧水銀ラ
ンプで光を照射した。生成した固定化ゲルを真空乾燥
し、２〜3mm³の粒子にして固定化菌体を調製した。本培
養の培地としてはグルコース10.0g/dl,塩化アンモニア
0.4g/dl,5リン酸0.02g/dl,硫酸マグネシウム７水塩0.05
g/dl,酵母エキス0.1g/dlからなる液体培地（pH6.0）を
用い、これに固定化菌体を10.0％（V/V）接種し、30℃,
200rpmの通気撹拌を行ない、pHを4.8にコントロールし
ながら５日間電気透析を行なつた所使用した培地に換算
して1.3g/dlのクエン酸を生成した。また、引き続き、
３カ月以上電気透析を連続して行なうことができた。

実施例５種菌としてＬ−グルタミン酸生産菌，ブレビバクテリウ
ム・フラバム ATCC13826を用いた。種母培地として、
グルコース5.0g/dl,尿素1.0g/dl,5メタリン酸カリウム
0.02g/dl,硫酸マグネシウム７水塩0.04g/dl,硫酸第一鉄
７水塩2mg/dl,ビオチン0.4μg/dl,チアミン塩酸塩20μg
/dl,コーンステイープリカ0.5g/dlからなる液体培地（p
H7.0）を用いた。この培地に斜面培地から１白金耳接種
し、30℃,36時間振盪培養を行ない遠心分離によつて集
菌した。この菌体10gを0.9％食塩水50mlに懸濁し、４％
のカツパー・カラギーナンと共に加温してスラリーとし
たものを注射器より２％塩化カリウム液に滴下し、球状
に成型ゲル化して固定化菌体を得た。

本培養の培地として、グルコース10.0g/dl,尿素2.8g/d
l,5メタリン酸カリウム0.04g/dl,硫酸マグネシウム７水
塩0.04g/dl,硫酸第一鉄７水塩2mg/dl,硫酸マンガン４水
塩2mg/dl,ビオチン0.4μg/dl,チアミン塩酸塩10μg/dl,
カザミノ酸0.1g/dl,ニユートラルレツド0.3mg/dlからな
る液体培地を用いた。この培地に固定化微生物菌体を1
0.0％（V/V）接種し、30℃でpHを7.5にコントロールし
ながら３日間電気透析を行なつた所、使用した培地に換
算して、4.1g/dlのＬ−グルタミン酸を生産した。

また、電気透析は、引き続き連続して３カ月以上運転が
可能であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、本発明の電気透析方法で用いられ
る電気透析槽の好適な例を示す概略図である。図中、１
は電気透析槽,2は陽極,3は陰極,4は陽イオン交換膜,5は
陰イオン交換膜,6は陽極室,7は濃縮室,8は希釈室,9は陰
極室,10は直流電源,11は発酵槽,12は回収槽,13はpHコン
トローラー,14は循環ポンプを夫々示す。また、第３図は、本発明の電気透析方法と従来の方法に
於ける培養時間と菌体量との関係、及び培養時間と生成
した全乳酸量との関係を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 7/56 8114−4Ｂ 13/14 2121−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】陽極と陰極との間に陽イオン交換膜及び陰
イオン交換膜を配置してなる電気透析槽中で、発酵によ
り得られた生成物を発酵液から分離する電気透析方法に
於いて、該発酵液にポリリン酸又はその塩を存在させる
ことを特徴とする電気透析方法