JPH0710237B2 - Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性定量法 - Google Patents
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性定量法Info
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- JPH0710237B2 JPH0710237B2 JP34048292A JP34048292A JPH0710237B2 JP H0710237 B2 JPH0710237 B2 JP H0710237B2 JP 34048292 A JP34048292 A JP 34048292A JP 34048292 A JP34048292 A JP 34048292A JP H0710237 B2 JPH0710237 B2 JP H0710237B2
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- acetylhexosamine
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は試料、特に水性液中のＮ
−アセチルヘキソサミニダーゼ活性の定量法に関するも
のである。近年臨床医学の分野において、体液中の各種
化学物質、酵素活性の定量は、有用な診断情報を与える
ものとして臨床的意義の重要性が高まってきている。特
に体液中のＮ−アセチルヘキソサミンの酵素的定量は多
くの糖関連化合物及び酵素活性についての情報を与える
ものである。これら対象となる化学物質、酵素として
は、例えばＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ、ムラミダ
ーゼ、β−グルクロニダーゼ、シアル酸、シアリダー
ゼ、ムコ多糖等が挙げられる。これらの臨床的意義とし
ては、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性の測定は腎
疾患、特に近位尿細管障害、腎移植拒絶反応等の早期発
見に、ムラミダーゼ活性の測定は急性単球性白血病、非
典型的結核症等の診断に、β−グルクロニダーゼ活性の
測定は、尿路悪性腫瘍、膀胱癌等の診断に、シアル酸の
定量は炎症的疾患等の診断に、シアリダーゼ活性の測定
は細菌感染症等の診断に、ムコ多糖の測定はムコ多糖症
の診断等に有効な情報を与える。
−アセチルヘキソサミニダーゼ活性の定量法に関するも
のである。近年臨床医学の分野において、体液中の各種
化学物質、酵素活性の定量は、有用な診断情報を与える
ものとして臨床的意義の重要性が高まってきている。特
に体液中のＮ−アセチルヘキソサミンの酵素的定量は多
くの糖関連化合物及び酵素活性についての情報を与える
ものである。これら対象となる化学物質、酵素として
は、例えばＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ、ムラミダ
ーゼ、β−グルクロニダーゼ、シアル酸、シアリダー
ゼ、ムコ多糖等が挙げられる。これらの臨床的意義とし
ては、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性の測定は腎
疾患、特に近位尿細管障害、腎移植拒絶反応等の早期発
見に、ムラミダーゼ活性の測定は急性単球性白血病、非
典型的結核症等の診断に、β−グルクロニダーゼ活性の
測定は、尿路悪性腫瘍、膀胱癌等の診断に、シアル酸の
定量は炎症的疾患等の診断に、シアリダーゼ活性の測定
は細菌感染症等の診断に、ムコ多糖の測定はムコ多糖症
の診断等に有効な情報を与える。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ
（β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ、以下Ｎ
ＡＧと略する）活性は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンの還元末端にｐ−ニトロフエノール等の発色団を結合
したクロモジェニックな基質を用いてＮＡＧを作用さ
せ、遊離していくるｐ−ニトロフエノール等の発色団を
アルカリ性下で比色する方法が一般的である（Methods
Enzymol., 28, 702 (1971), Clinca Chimica et Acta 6
9(1), 85-91 (1976))。ところがこの方法では目的とす
る酵素、ＮＡＧの至適ｐＨ（ｐＨ４〜５．５）と発色団
であるｐ−ニトロフエノールの発色ｐＨ（ｐＨ９以上）
とが異なるために、ＮＡＧ活性を測定するには酵素反応
と発色反応を別々に行う必要があり、そのため、試薬数
及び操作ステップが多く必要となり、酵素活性を求める
場合に一番適当であるといわれている速度分析（レート
アッセイ）法が出来ない欠点がある。その他、Ｎ−アセ
チルグルコサミンにフエノールを結合させた基質を用い
る方法（特開昭５４−６０９９７号）、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンにｍ−クレゾールスルホイソフタレインを結
合させた基質を用いる方法（Clin. Chem., 29, 1713(19
83)) も上記ｐ−ニトロフエノールを用いる場合と同様
の欠点がある。
（β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ、以下Ｎ
ＡＧと略する）活性は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンの還元末端にｐ−ニトロフエノール等の発色団を結合
したクロモジェニックな基質を用いてＮＡＧを作用さ
せ、遊離していくるｐ−ニトロフエノール等の発色団を
アルカリ性下で比色する方法が一般的である（Methods
Enzymol., 28, 702 (1971), Clinca Chimica et Acta 6
9(1), 85-91 (1976))。ところがこの方法では目的とす
る酵素、ＮＡＧの至適ｐＨ（ｐＨ４〜５．５）と発色団
であるｐ−ニトロフエノールの発色ｐＨ（ｐＨ９以上）
とが異なるために、ＮＡＧ活性を測定するには酵素反応
と発色反応を別々に行う必要があり、そのため、試薬数
及び操作ステップが多く必要となり、酵素活性を求める
場合に一番適当であるといわれている速度分析（レート
アッセイ）法が出来ない欠点がある。その他、Ｎ−アセ
チルグルコサミンにフエノールを結合させた基質を用い
る方法（特開昭５４−６０９９７号）、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンにｍ−クレゾールスルホイソフタレインを結
合させた基質を用いる方法（Clin. Chem., 29, 1713(19
83)) も上記ｐ−ニトロフエノールを用いる場合と同様
の欠点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等はこれらの
事情を考慮して、正確で簡便、迅速な糖関連酵素の定量
法を見出すために、種々鋭意検討したところ、Ｎ−アセ
チルヘキソサミンオキシダーゼ（以下ＮＡＨＯＤと略す
る）を用いるＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性の定
量法が上記目的を達成することを見出し本発明に到達し
た。
事情を考慮して、正確で簡便、迅速な糖関連酵素の定量
法を見出すために、種々鋭意検討したところ、Ｎ−アセ
チルヘキソサミンオキシダーゼ（以下ＮＡＨＯＤと略す
る）を用いるＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性の定
量法が上記目的を達成することを見出し本発明に到達し
た。
【０００４】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は下記式
（Ｉ）で示されるＮ−アセチルヘキソサミニドに、Ｎ−
アセチルヘキソサミニダーゼを含有する試料を作用さ
せ、生成するＮ−アセチルヘキソサミンにＮ−アセチル
ヘキソサミンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素または消費される酸素を測定することを特徴とする
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性の定量法である。
（Ｉ）で示されるＮ−アセチルヘキソサミニドに、Ｎ−
アセチルヘキソサミニダーゼを含有する試料を作用さ
せ、生成するＮ−アセチルヘキソサミンにＮ−アセチル
ヘキソサミンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素または消費される酸素を測定することを特徴とする
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性の定量法である。
【０００５】
【化２】 （式中、Ｒはアルキル基、フェニル基、ナフチル基また
は置換基としてニトロ基を有するこれらの基を示す。）
は置換基としてニトロ基を有するこれらの基を示す。）
【０００６】本発明の測定原理は下記に示す通りであ
る。
る。
【化３】
【０００７】本発明における上記式（化１）で示される
Ｎ−アセチルヘキソサミニドとしては、例えばメチル−
Ｎ−アセチル−β─Ｄ−グルコサミニド、フェニル−Ｎ
−アセチル−β─Ｄ−グルコサミニド、ｐ−ニトロフェ
ニル−Ｎ−アセチル−β─Ｄ−グルコサミニド、メチル
−Ｎ−アセチル−β─Ｄ−ガラクトアミニド、フェニル
−Ｎ−アセチル−β─Ｄ−ガラクトサミニド、ｐ−ニト
ロフェニル−Ｎ−アセチル−β─Ｄ−ガラクトサミニド
などが挙げられる。
Ｎ−アセチルヘキソサミニドとしては、例えばメチル−
Ｎ−アセチル−β─Ｄ−グルコサミニド、フェニル−Ｎ
−アセチル−β─Ｄ−グルコサミニド、ｐ−ニトロフェ
ニル−Ｎ−アセチル−β─Ｄ−グルコサミニド、メチル
−Ｎ−アセチル−β─Ｄ−ガラクトアミニド、フェニル
−Ｎ−アセチル−β─Ｄ−ガラクトサミニド、ｐ−ニト
ロフェニル−Ｎ−アセチル−β─Ｄ−ガラクトサミニド
などが挙げられる。
【０００８】本発明におけるＮ−アセチルヘキソサミニ
ダーゼ（ＮＡＧ）を含有する試料とは尿、血清などの体
液を含有するものであり、本発明におけるＮ−アセチル
ヘキソサミンは上記式で示される基質、Ｎ−アセチルヘ
キソサミニドにＮＡＧを含有する試料を作用させて生成
したＮ−アセチルヘキソサミンである。
ダーゼ（ＮＡＧ）を含有する試料とは尿、血清などの体
液を含有するものであり、本発明におけるＮ−アセチル
ヘキソサミンは上記式で示される基質、Ｎ−アセチルヘ
キソサミニドにＮＡＧを含有する試料を作用させて生成
したＮ−アセチルヘキソサミンである。
【０００９】本発明において使用するＮＡＨＯＤはいか
なる起源のものでもよいが、例えばシュードモナス属に
属する微生物が産生するＮＡＨＯＤがある。ＮＡＨＯＤ
の精製と性質については、日本農芸化学会 昭和５８年
度大会において発表されている。
なる起源のものでもよいが、例えばシュードモナス属に
属する微生物が産生するＮＡＨＯＤがある。ＮＡＨＯＤ
の精製と性質については、日本農芸化学会 昭和５８年
度大会において発表されている。
【００１０】ＮＡＧを含有する試料に上記Ｎ−アセチル
ヘキソサミニドを作用させ、生成するＮ−アセチルヘキ
ソサミンにＮＡＨＯＤを作用させる条件としては、特に
限定はないが、ｐＨ４．０〜１０．０を保つ適当な緩衝
液を用い、反応温度２０〜５０℃が適当である。緩衝液
の種類は特に制限されない。使用ｐＨに最適な緩衝液を
選択すればよい。例えば中性域ではリン酸緩衝液、酸性
域では酢酸緩衝液、アルカリ域ではトリス塩酸緩衝液な
どがある。緩衝液の濃度は特に限定されないが、通常
０．０１Ｍ〜１Ｍ程度である。反応方法としてはＮ−ア
セチルヘキソサミニダーゼ反応とＮＡＨＯＤ反応を同時
に行うワンステップ法でも、Ｎ−アセチルヘキソサミニ
ダーゼ反応をまず行い、続いてＮＡＨＯＤ反応を行うツ
ーステップ法でも良い。また反応系には必要に応じて界
面活性剤等を添加してもよい。
ヘキソサミニドを作用させ、生成するＮ−アセチルヘキ
ソサミンにＮＡＨＯＤを作用させる条件としては、特に
限定はないが、ｐＨ４．０〜１０．０を保つ適当な緩衝
液を用い、反応温度２０〜５０℃が適当である。緩衝液
の種類は特に制限されない。使用ｐＨに最適な緩衝液を
選択すればよい。例えば中性域ではリン酸緩衝液、酸性
域では酢酸緩衝液、アルカリ域ではトリス塩酸緩衝液な
どがある。緩衝液の濃度は特に限定されないが、通常
０．０１Ｍ〜１Ｍ程度である。反応方法としてはＮ−ア
セチルヘキソサミニダーゼ反応とＮＡＨＯＤ反応を同時
に行うワンステップ法でも、Ｎ−アセチルヘキソサミニ
ダーゼ反応をまず行い、続いてＮＡＨＯＤ反応を行うツ
ーステップ法でも良い。また反応系には必要に応じて界
面活性剤等を添加してもよい。
【００１１】本発明では生成した過酸化水素を例えばペ
ルオキシダーゼあるいはカタラーゼと共役させて測定す
るか、または直接過酸化水素電極により測定する。ペル
オシダーゼと共役する測定系では、一般的には４−アミ
ノアンチピリンとフェノール誘導体又はアニリン誘導体
を使用する系が好ましい。
ルオキシダーゼあるいはカタラーゼと共役させて測定す
るか、または直接過酸化水素電極により測定する。ペル
オシダーゼと共役する測定系では、一般的には４−アミ
ノアンチピリンとフェノール誘導体又はアニリン誘導体
を使用する系が好ましい。
【００１２】過酸化水素の定量を妨害する試料中のアス
コルビン酸はアスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡＳＯ
と略記する）を作用させることによって除去することが
好ましい。この場合、ＡＳＯは他の酵素反応に先立って
作用させても、また他の酵素反応と共役させて同時に作
用させて除去してもよい。ＡＳＯは微生物由来のものま
たは植物由来のものでもいが、特にカボチャ、キュウリ
等の植物由来のものが好ましい。ＨＡＨＯＤの反応系で
消費する酸素の量は、例えば酸素電極などにより測定す
ることができる。
コルビン酸はアスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡＳＯ
と略記する）を作用させることによって除去することが
好ましい。この場合、ＡＳＯは他の酵素反応に先立って
作用させても、また他の酵素反応と共役させて同時に作
用させて除去してもよい。ＡＳＯは微生物由来のものま
たは植物由来のものでもいが、特にカボチャ、キュウリ
等の植物由来のものが好ましい。ＨＡＨＯＤの反応系で
消費する酸素の量は、例えば酸素電極などにより測定す
ることができる。
【００１３】
【発明の効果】本発明に従えば、簡単な操作で感度よく
共存物質の影響受けずに特異性高く正確に試料中のＮ−
アセチルヘキソサミニダーゼ（ＮＡＧ）活性を定量する
ことが可能となり、臨床検査の診断分野において極めて
有意義である。
共存物質の影響受けずに特異性高く正確に試料中のＮ−
アセチルヘキソサミニダーゼ（ＮＡＧ）活性を定量する
ことが可能となり、臨床検査の診断分野において極めて
有意義である。
【００１４】
【実施例】次に本発明を実施例により説明する。実施例
中の略号は以下のものを示す。ＮＡＨＯＤ（Ｎ−アセチ
ルヘキソサミンオキシダーゼ）４−ＡＡ （４−アミノ
アンチピリン）ＴＯＯＳ （Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン・ナ
トリウム）
中の略号は以下のものを示す。ＮＡＨＯＤ（Ｎ−アセチ
ルヘキソサミンオキシダーゼ）４−ＡＡ （４−アミノ
アンチピリン）ＴＯＯＳ （Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン・ナ
トリウム）
【００１５】
【実施例】被検液中のＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ
活性量を下記試薬を用いて下記方法により測定した。
１．試薬ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド １ｍＭ塩化ナトリウム
２００ｍＭＮ−アセチルヘ
キソサミンオキシダーゼ ５０Ｕ／ml
ペルオキシダーゼ
３０Ｕ／mlＴＯＯＳ
１ｍＭ４−ＡＡ
０．５ｍＭ０．０５
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）２．測定方法ＮＡＧ含
有被検液５０μｌに上記試薬２ｍｌを加え、３７℃で反
応させ、その吸光度を波長５５０ｎｍで測定して発色速
度を求めた。その反応曲線を図１に示す。また検量線を
図２に示す。図１および図２から明らかなように、本発
明方法では短時間に正確にかつ簡単にＮＡＧをレートア
ッセイすることができる。
活性量を下記試薬を用いて下記方法により測定した。
１．試薬ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド １ｍＭ塩化ナトリウム
２００ｍＭＮ−アセチルヘ
キソサミンオキシダーゼ ５０Ｕ／ml
ペルオキシダーゼ
３０Ｕ／mlＴＯＯＳ
１ｍＭ４−ＡＡ
０．５ｍＭ０．０５
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）２．測定方法ＮＡＧ含
有被検液５０μｌに上記試薬２ｍｌを加え、３７℃で反
応させ、その吸光度を波長５５０ｎｍで測定して発色速
度を求めた。その反応曲線を図１に示す。また検量線を
図２に示す。図１および図２から明らかなように、本発
明方法では短時間に正確にかつ簡単にＮＡＧをレートア
ッセイすることができる。
【図１】実施例１における反応曲線を示す。
【図２】実施例１における検量線を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】 下記式（Ｉ）で示されるＮ−アセチルヘ
キソサミニドに、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを含
有する試料を作用させ、生成するＮ−アセチルヘキソサ
ミンにＮ−アセチルヘキソサミンオキシダーゼを作用さ
せ、生成する過酸化水素または消費される酸素を測定す
ることを特徴とするＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ活
性定量法。 【化１】 （式中、Ｒはアルキル基、フェニル基、ナフチル基また
は置換基としてニトロ基を有するこれらの基を示す。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34048292A JPH0710237B2 (ja) | 1992-12-21 | 1992-12-21 | Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34048292A JPH0710237B2 (ja) | 1992-12-21 | 1992-12-21 | Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性定量法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4265284A Division JPS60186300A (ja) | 1984-03-05 | 1984-03-05 | シアル酸の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317094A JPH05317094A (ja) | 1993-12-03 |
| JPH0710237B2 true JPH0710237B2 (ja) | 1995-02-08 |
Family
ID=18337389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34048292A Expired - Lifetime JPH0710237B2 (ja) | 1992-12-21 | 1992-12-21 | Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0710237B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12319511B2 (en) | 2022-03-23 | 2025-06-03 | Ricoh Company, Ltd. | Device for attaching and detaching roller, and belt conveyor including the device |
-
1992
- 1992-12-21 JP JP34048292A patent/JPH0710237B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12319511B2 (en) | 2022-03-23 | 2025-06-03 | Ricoh Company, Ltd. | Device for attaching and detaching roller, and belt conveyor including the device |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05317094A (ja) | 1993-12-03 |
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