JPH07103159B2 - 放射性核種金属キレート - Google Patents

放射性核種金属キレート

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JPH07103159B2
JPH07103159B2 JP4290223A JP29022392A JPH07103159B2 JP H07103159 B2 JPH07103159 B2 JP H07103159B2 JP 4290223 A JP4290223 A JP 4290223A JP 29022392 A JP29022392 A JP 29022392A JP H07103159 B2 JPH07103159 B2 JP H07103159B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】放射性ラベルされた化合物は医療
的診断及び処置における重要な道具である。このような
化合物は、深部静脈血栓の診断、リンパ節病理の研究、
並びに新生物の検出、進行度の決定及び治療を含む種々
の技法において用いられる。これらの化合物の多くが金
属放射性核種、例えばテクノチウム−９９ｍを使用す
る。
【０００２】イン−ビボ投与のために放射性核種を使用
する場合、その放射性核種が標的器官又は癌部位に局在
化するのが好ましい。従って、放射性核種は一般に、特
定の器官又は組織による選択的な結合又は吸着をもたら
すように製剤化される。
【０００３】放射性核種をあらかじめ選択された部位に
正確に向かわせて周囲の又は離れた組織に向けられるバ
ックグラウンド放射能を減少せしめ、投与量を減少し、
イン−ビボイメージングにおけるバックグラウンドを最
小にし、そして不所望の副作用を最小にすることが非常
に有利でる。この目的のため、それに放射性核種が接合
することができる特異的リガンド又はリセプターを用い
る方法が有利である。
【０００４】
【従来の技術】興味ある参照文献にはKhaw等、 J.Nucl.
Med. (1982) 23：1011；Rhodes,A.B.,Sem.Nucl.Med. (1
974) ４：281 ；Davidson等、 Inorg.Chem. (1981) 2
0：1629；並びに、 Byrne及びTolman, J.Nucl.Med. (19
83)24：P126が含まれる。
【０００５】特に、 Fritzberg等、 J.Nucl.Med. (198
2) 23： 592； Fritzberg等、前掲（1981）22： 258；
及び Fritzberg等、前掲（1982）23：P17 を、エチレン
ジアミンカルボン酸誘導体のメルカプトアセチル誘導体
の記載について参照のこと。さらに、米国特許 No.４，
４３４，１５１、 No.４，４４４，６９０、及び No.
４，４７２，５０９を参照のこと。
【０００６】
【発明の概要】種々の病理状態の診断及び処置のために
金属放射性核種でラベルされた蛋白質が提供される。特
に、リンパ節病及び深部静脈血栓を含む状態の診断、並
びに新生物の検出及び進行度の決定のために、キレート
化された放射性核種蛋白質接合体が使用される。さら
に、蛋白質接合体としてのキレート化放射性核種は腫瘍
の放射線療法のために使用される。
【０００７】
【具体的な説明】金属放射性核種キレートとペプチドと
の結合体、及びその製造方法が提供される。
【０００８】金属キレート化化合物はジチオ−、ジアミ
ノ−もしくはジアミド−カルボン酸又はアミン又はその
誘導体、例えばＮ，Ｎ′−ビス−メルカプトアセチル
ω、（ω−ｘ）−ジアミノカルボン（ｘは１又は２）、
水性媒体中でポリペプチドとアミド結合を形成すること
ができるエステル、及びキレートへの中間体である。キ
レート化化合物はＮ2 Ｓ2 リガンド又はキレートと称さ
れる。
【０００９】この発明の化合物の合成の原料は、主とし
て、次の式：
【化６】
【００１０】
【化７】
【００１１】により表わされる化合物のいずれかであ
り、ここで、Ｍはテクネチウム、レニウムもしくは銅又
はこれらの金属の酸化物であり； ｎは、１〜６の整数であり； Ｗは、＝ＮＨ又は＝Ｏであり；
【００１２】Ｙは、癌細胞に結合することができる免疫
グロブリン又はその特異的結合断片であり： Ｔは、金属のキレート化に際して除去される硫黄保護基
であり；そして Ｙ′は、ポリペプチドと共にアミド結合又はアミジノ結
合を形成することができる活性化基である。
【００１３】硫黄保護基Ｔは、２〜１０個、通常２〜８
個の炭素原子を有するアシル又はアシルチオ基、ヒドロ
カルビルアシル又は置換されたアシル基のいずれか、通
常はアリール、例えばフェニル又はアルキル、例えばメ
チル、炭素原子数１〜１０個の有機スルヒドリル基、置
換された又は非置換のヒドロカルビル、ヘテロシクリ
ル、特にカルコゲン（Ｏ，Ｓ）ヘテロシクリル、アシル
アミドメチレン（アシル基は上に定義されている通
り）、水素、スルホナート、又はアルカリ金属イオンで
ある。
【００１４】好ましい硫黄保護基Ｔには、アシル、アシ
ルチオ、ヒドロカルビルチオ又は置換されたヒドロカル
ビルチオ又はヘテロシクリルチオが含まれ、ここでアシ
ル及びヒドロカルビル基は脂肪族、脂環族、芳香族又は
これらの組合せであり、そしてアシル基にはさらに複素
環性のものが含まれ、ここでアシルは一般にカルボキシ
アシルであり；
【００１５】Ｔは、アシルである場合、一般に炭素原子
数１〜１０個、２〜１０個、一般に２〜８個からなり、
置換基には非−オキソ−カルボニル（カルボキシ）、ハ
ロ（アリール）、特にフルオロ及びクロロ、シアノ及び
ニトロが含まれる。
【００１６】置換基にはニトロ、シアノ、不活性ハロ
（アリール又はポリハロ）、非−オキソ−カルボニル
（カルボン酸、アミド及びエステル）等が含まれる。
【００１７】ポリペプチドと共にアミド結合又はアミジ
ノ結合を形成させるための活性化基Ｙ′は、例えば、ヒ
ドロキシル、オキシ塩、特にアルカリ金属塩、例えばリ
チウム、ナトリウム及びカリウム、エステルを形成する
有機オキシ化合物、通常は炭素原子数１〜６個の低級ア
ルコキシ、又は水性媒体中でアミドの形成を可能にする
基、特にポリペプチドとのアミドの形成を可能にする
基、−ＮＨ2 又は−ＮＨＮＨ2 などである。
【００１８】ＣＷとポリペプチドすなわち免疫グロブリ
ン又はその断片との間の連結はＣＷ−Ｙの性質により変
化するであろう。ＣＷ−Ｙがカルボキシル官能基である
場合、この連結はＷが＝Ｏであるか＝ＮＨであるかに依
存してカルボキサミド又はアミジンである。
【００１９】しかしながら、ＣＷ−Ｙがメチレンアミン
又はメチレンヒドラジンを定義する場合、還元的アミノ
化にはオキソ基に開裂されている（例えば過ヨウ素酸塩
によるグリコール開裂）糖置換されたポリペプチドが必
要であろう。
【００２０】還元的アミノ化は、オキソ−置換されたポ
リペプチドを、アミノ−又はヒドラジノ−置換されたＮ
2 Ｓ2 リガンドと、還元剤、例えばシアノボロヒドリド
の存在下で一緒にすることにより達成することができ
る。
【００２１】上記の方法により得られる、本発明のラベ
ルされたポリペプチドは、次の式：
【００２２】
【化８】
【００２３】（式中、Ｍはテクネチウム、レニウムもし
くは銅又はこれらの金属の酸化物であり；ｎは１〜６の
整数であり；Ｗは＝ＮＨ又は＝Ｏであり；そしてＹは癌
細胞に結合する免疫グロブリン又はその特異的結合断片
である）により表わされる。
【００２４】放射性核種金属には、銅、例えば67Ｃｕ及
び64Ｃｕ、テクネチウム、例えば 99mＴｃ、レニウム、
例えば 186Ｒｅ及び 188Ｒｅが含まれる。
【００２５】活性化基は好ましくはエステルであり、こ
のエステルは、水性媒体中でポリペプチドと反応するこ
とが知られているエステルである。特定の放射性核種、
蛋白質、及び接合の条件に依存してエステル類のいずれ
かが好ましい。
【００２６】使用される一般的なエステルは、ｏ−及び
ｐ−ニトロフェニル、２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル、シアノメチル、２−メルカプトピリジル、ヒドロキ
シベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ
ド、トリクロロフェニル、テトラフルオロフェニル、ｏ
−ニトロ−ｐ−スルホフェニル、Ｎ−ヒドロキシフタリ
ミド等である。
【００２７】ほとんどの場合、エステルは活性フェノー
ルのそれ、特にニトロ−活性化フェノール、及びヒドロ
キシルアミンに基礎を置く環状化合物のエステルであ
る。他のヒドロキシ化合物が入手可能となる場合、これ
らもこの発明において使用される。Ｙは、本発明におい
て癌細胞と結合することができる免疫グロブリン又はそ
の特異的結合断片であるが、同様にして、分子量約１０
００以上、さらに一般には分子量約２０００以上、一般
に約１．６MDal以下、さらに一般には約８００KDal以下
の他のポリペプチドにも適用可能である。ポリペプチド
として、免疫グロブリン、又はその特異的結合断片が特
に興味深い。ポリペプチド化合物は、使用する放射性核
種の性質に依存して広く異ることができる。すなわち、
化合物はリガンドであってもよく、又はリセプターであ
ってもよい。リガンドには、ホルモン、リンホカイン、
成長因子、基質、特に表面膜リセプターに結合する化合
物（複合体は表面に結合して保持され、又は細胞内に入
る）が含まれる。リセプターとして、表面膜リセプタ
ー、抗体、酵素、天然リセプター、レクチン等を挙げる
ことができる。免疫グロブリン又はその同等物（Ｆａｂ
断片、Ｆ（ａｂ′)2、Ｆｖを含む）、Ｔ−細胞リセプタ
ー等が興味深い。
【００２８】ω、（ω−ｘ）−ジアミノ脂肪族カルボン
酸、特にアルカン酸は炭素原子数４〜１０個、一般に４
〜７個のものであり、そして既知の化合物であり、又は
常法に従って、もしくはこの明細書に記載されるように
して容易に製造される。例えば、近接ジブロミドを緩和
な条件下で水性アンモニアと化合させることができる。
【００２９】次に、ジアミノエステル、例えば低級アル
キルエステルの塩酸塩を、不活性炭化水素溶剤、例えば
トルエン中でのα−ハロアシルクロリド、例えばクロロ
アセチルクロリドと反応せしめ、次に水素スルフィドの
適当な誘導体、例えばナトリウムベンズチオラート、ナ
トリウムチオアセテート、ｔ−ブチルメルカプタン等を
用いて、クロロ基をメルカプト基で置換することによ
り、誘導体化することができる。
【００３０】今や、エステルが酸に加水分解され、そし
て金属キレートが形成され、又はチオエーテルが活性化
されたスルホニルクロリドと反応し、次にチオグリコレ
ートで処理される。他の方法として、α−アルキルチオ
置換されたアシル化合物をカルボジイミドと共に用いて
アシル化し、次にチオエーテルを開裂してジスルフィド
を形成し、そして上記のようにしてジスルフィドをメル
カプトに還元する。
【００３１】４，５−ジアミノペンタノエートのために
使用される他の方法は容易に入手できるグルタメートを
用いる。５−カルボキシエステルを形成した後、アミノ
基を保護し、そして酸基（１−カルボキシル）を選択的
にアルコールに還元する。アルコールを活性開裂基、例
えばハライド又はシュードハライドに転換し、次にアミ
ノ基への中間体として機能する窒素陰イオン、例えばア
ジドで置き換える。
【００３２】アミノの中間体のアミノへの触媒的還元、
及びエステルの加水分解の後、Ｓ−保護α−メルカプト
アシル基によりアミノ基をアシル化する。保護基を除去
し、交換し、又は変形することができ、例えば水溶化基
を導入することができる。種々のＮ2 Ｓ2 キレート環を
調製するために種々の合成法を使用することができる。
【００３３】カルボキサミドを形成し、そしてアルミニ
ウム又はボロヒドリドを用いてアミンを形成することが
できる。脂肪族ハライドによりアミンをアルキル化する
ことができる。エチレンもしくはプロピレンジアミン又
はカルボキシアルキルアルキレンジアミンを用いてチオ
グリコール酸を連結することができる。Ｎ2 Ｂ2 リガン
ドに依存して他の合成法を使用することもできる。
【００３４】ニトリルによる置換によるアミノ保護ω、
（ω−ｘ）−ジアミノアルキルハライド又はシュードハ
ライドのニトリルの調製、前記のようにして脱保護され
たアミノ基のメルカプトアシル化、及び常法、例えば酸
性（ＨＣｌ）無水アルカノールによるイミドエステルの
形成により、イミデートを用いることができる。
【００３５】Ｓ−保護基は広範囲に変えることができ、
アシル基、チオ基、又は次の操作中にチオ基を保護しそ
してペプチド接合体への不都合な効果を伴わないで容易
に除去され得る他の化合物である。
【００３６】代表的な基にはベンゾイル、アセチル、ｍ
−もしくはｐ−フタロイル、チオグリコール酸、ｏ−カ
ルボキシチオフェノール、エチルチオカルボネート、β
−メルカプトプロピオン酸、テトラヒドロピラニル、ス
ルホナート等が含まれる。別法として、環状ジ−又はポ
リ−スルフィドを形成することができる。スルフィニル
ハライド、ジニトロチオフェノキシド置換されたメルカ
プタンを用いて、保護基等の過剰の存在下で穏和な酸化
によりジスルフィドを調製することができる。
【００３７】保護基は種々の方法で除去することができ
る。チオエステルは水性アンモニア、アルカノール中水
性アルコキシド、又は任意の常法を用いて加水分解する
ことができる。ジスルフィドは、ジチオスレイトール、
グルタチオン、β−メルカプトエチルアミン又は他の常
用の試薬を用いて開裂せしめることができる。ジスルフ
ィドの開裂はポリペプチドへの接合の前又は後で行うこ
とができる。
【００３８】特定の金属に依存して、金属キレートを製
造するために種々の条件及び技法を用いることができ
る。テクニチウムキレートを製造するため、カルボキシ
レート又は活性化エステルのごときキレート化化合物
を、還元剤、例えば第一錫又はジチオニトの存在下、常
用の条件下でペルテクネテート（pertechnetate)溶液と
一緒にし、こうしてテクネチウムキレートを安定な塩と
して形成せしめる。レニウムキレートは、クエン酸塩及
びＮ2 Ｓ2 リガンドの存在下で第一錫イオンによりペル
レネート（perrhenate) を還元することにより形成する
ことができる。収率は、５０℃にて１時間後５０％以上
である。
【００３９】キレート化された酸はすでにエステル化さ
れており、又は常法に従ってエステル化される。すでに
エステル化されている場合、不安定な錯体、例えばＴｃ
−９９mmグルコネートが調製され、これはＮ2 Ｓ2 活性
化エステルリガンドへの交換を許容し、蛋白質接合のた
めに適当な錯体を形成するであろう。
【００４０】他の方法として、水性媒体中、少なくとも
理論量、好ましくは過剰量のヒドロキシ化合物の存在下
で水溶性カルボジイミド、例えばＥＤＣＩを用いること
によりカルボン酸を活性化することができる。適切に緩
衝化された水性媒体を用いることができる。過剰のカル
ボジイミドは酢酸塩を加えることにより尿素に転換する
ことができる。次に、この水性媒体を、さらに精製する
ことなくポリペプチドとの接合のために直接使用するこ
とができる。
【００４１】好ましくは、ポリペプチドをエステル含有
水性媒体に、便利な濃度、穏和なアルカリ性pHにて、一
般に約７．５以上、約９以下にて添加し、そして活性エ
ステルのすべてがポリペプチドと反応するか又は実質上
完全に加水分解されるのに十分な時間反応を行う。通
常、時間は約６時間より短かくそして３０分間以上であ
り、温度は約０℃〜５０℃の範囲であり、通常約４０℃
を超えない。特定の条件は、特定の活性化されたエステ
ル、pH、ポリペプチドの活性等に従って選択する。
【００４２】金属イオンの非存在下でキレート化剤（Ｎ
2 Ｓ2)をポリペプチドに接合させることも可能であるが
好ましくはない。カルボン酸基をポリペプチドに連結し
て安定な共有結合、例えばアミド結合を形成し、次に還
元されキレート化された交換可能な形の金属を添加す
る。
【００４３】キレートとしてα−又はβ−ジオキソ化合
物が有用である。便利には、金属イオンを、弱くキレー
ト化されたイオンとして、又は弱くキレート化する基、
例えばウロネート、例えばグルコネートの存在下で加え
ることができる。
【００４４】この発明のキレートは、哺乳動物宿主に、
一般に注射により、放射性核種が望まれる特定の部位に
依存して静脈内に、動脈内に、腹腔に、腫瘍内に、又は
これらに類似する方法により投与される。一般に、宿主
のサイズに依存して、約０．００１〜５０μCi／kg宿主
となるように約０．１〜２mlが投与される。
【００４５】ヒトのためには、投与量は一般に、約１０
〜５０ mCi／７０kg宿主、さらに一般には約２５〜３５
mCi／７０kg宿主である。下等哺乳動物、例えばマウス
については、生体分布研究のためには１μCiであり、他
方イメージング研究のためには５００μCiより多量であ
る。その目的に応じて放射性核種を投与した後、検出又
は治療のための種々の方法により宿主を処理することが
できる。
【００４６】次に、例によりこの発明をさらに具体的に
説明する。但し、これによりこの発明の範囲を限定する
ものではない。
【００４７】例1. Ｎ，Ｎ′−ビス（ベンゾイルメルカ
プトアセチル）−３，４−ジアミノブチレートの合成 窒素のもと暗フラスコ中に１．５４ｇ（０．０１０mmol
e)の３，４−ジアミノ酪酸塩酸塩及び２５０mlの純エタ
ノールを入れる。次に、この溶液中に乾燥ＨＣｌガスを
泡立てる。この混合物を１〜２日間、エチルエステルの
形成が完了するまで還流する。
【００４８】次に生成物を乾燥固体に濃縮し、そして塩
酸塩エステルを、氷浴温度にて急速攪拌することより、
５０mlのトルエンと５０mlの飽和炭酸水素ナトリウムと
の混合物中に溶解する。この溶液に、１０mlのトルエン
中５．０ｇ（０．０４４mole）のクロロアセチルクロリ
ドを滴加する。添加が完了した後、混合物を室温まで放
置し、そしてさらに３０分間攪拌する。
【００４９】層を分離し、そして水相を酢酸エチルで２
回抽出する。有機相を一緒にし、水及び塩水で洗浄し、
そして乾燥する（硫酸マグネシウム）。溶剤を除去する
ことにより生成物を白色固体として残す。この生成物を
さらに精製することなく使用することができる。
【００５０】１．４１ｇ（約４．４５mmole)のビス−ク
ロロアセタミドの溶液を、窒素のもとで１０mlの乾燥エ
タノール中に調製する。これに、乾燥エタノール中チオ
安息香酸ナトリウムの溶液〔ナトリウムメトキシド
（０．２０４ｇ（８．８７mmole)のナトリウム、及びエ
タノール）を１．２３ｇ（８．９０mmole)のチオ安息香
酸と反応せしめて調製する〕を加える。
【００５１】室温にて数分間置いた後、沈澱が生ずる。
反応混合物を３０分間還流加熱する。次に放冷し、酢酸
エチルで稀釈し、水及び塩水で洗浄し、そして乾燥する
（硫酸マグネシウム）。溶剤を除去してクリーム色の固
体を残す。これはトルエンから結晶化する。
【００５２】例2. Ｔｃ−９９ｍによる放射性ラベル化 1. 例１において調製した生成物（０．１mg）を０．３
mlのエタノールに加熱溶解し、次に３０μｌの５Ｎ水酸
化ナトリウム及び０．３mlの水を次々に加える。９５℃
にて１５分間加熱した後、この間にエタノールが蒸発し
て、加水分解されたリガンドの実質的に水性の溶液が残
る。
【００５３】次に、この混合物に塩溶液（０．５ml以
下）中ゼネレーター・ペルテクネテート（約３０mCi 以
下のＴｃ−９９ｍ及び０．５mgの新しく溶解したナトリ
ウムジチオニトを含む）を加え、あるいは、（２）混合
物を室温にて短時間放置した後、混合物をさらに１５分
間９５℃に加熱し、そしてpHを約８に調整する。
【００５４】2. 例１の保護されたチオール及び遊離カ
ルボン酸を有するリガンド０．１０mgを、２０mgのグル
コン酸ナトリウム及び０．０１０mgのＳｎＣｌ2 ・２Ｈ
2 Ｏに加え、pHを５に調整する。ペルテクネテートとし
てのＴｃ−９９ｍを混合物に加え、そして混合物を９５
℃にて５分間加熱する。
【００５５】生成物を調製用ＨＰＬＣにより精製するこ
とができ、この場合２５cmオクタデシルシランカラム(A
ltex Model 312クロマトグラフ；４．６×２５０mmＯＤ
Ｓウルトラスペア、５μ）を使用し、そして９５％の
０．０１Ｍリン酸ナトリウム及び５％のエタノールで
１．０ml／分の流速で溶出する。調製物をシリカゲル薄
層ストリップ上で、還元され加水分解されたテクニチウ
ムについて分析した。
【００５６】例3. 活性化されたエステルの形成 活性化されたエステルの形成の条件は次の通りである。
反応フラスコに、カルボン酸リガンド又は痕跡レベルの
金属錯体カルボキシレート及び等モル量のヒドロキシ化
合物及び小過剰量、約２５％過剰量の１−エチル−３−
ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＣＤ
Ｉ）及び４００μｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
を加える。反応が完了した後、酢酸ナトリウムを加えて
未反応のＥＣＤＩを分解し、そして溶液を接合のために
そのまま使用する。
【００５７】接合すべき蛋白質を０．２Ｍ硼酸緩衝液
（pH８．５〜９．０）中に約２〜５mg／mlの蛋白質濃度
に溶解する。すべての蛋白質が溶解するまで混合物を４
℃に保持する。pHを８．５〜９に調整した水性蛋白質溶
液にエステル溶液を加え、そして必要であればpHを再調
整する。次に、生成した接合体を、ＨＰＬＣゲル濾過カ
ラム上で、溶離剤として０．０５Ｍリン酸塩（pH７．
４）を用いて製造的にクロマトグラフ処理する。
【００５８】次の研究において種々の条件を用い、この
場合、時間、温度、濃度及びpHの種々の条件下で、免疫
グロブリンとの反応のために上記のようにして調製され
たテクニチウムキレートの活性化エステルを使用した。
次の第１表に結果を示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】例4. ４，５−ジアミノペンタノエートの
合成 ２００mlの水中５０．５ｇの炭酸水素ナトリウムの溶液
に８５．０ｇのグルタミン酸γ−エチルエステルを加
え、そしてこの混合物を氷−塩浴中で冷却した。温度を
０℃〜５℃に維持しながら、４０ｇのカルボベンゾキシ
クロリドを加え、そして混合物を５時間攪拌し、次に室
温に加温し、そしてさらに２時間攪拌した。
【００６３】２×２００mlのエーテルで抽出した後、混
合物を６Ｎ ＨＣｌによりコンゴレッドpH３に酸性化し
た。分離した油状物を３×１００mlの塩化メチレンで抽
出し、一緒にした有機層を塩水及び水で洗浄し、そして
次に無水硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発、及び２００
mlの四塩化炭素からの結晶化により４６．３ｇ（７７
％）の収量が得られた。融点８６℃〜８８℃。
【００６４】４５mlのＴＨＦ中４６ｇの上記生成物の溶
液に、３５℃〜４０℃にてＢＨ4 −ＴＨＦ（１７８ml中
０．１８mmole)に急速に加えた。３時間後、ＴＬＣ（酢
酸エチル−ヘキサン４：１）上のアリコートは、アルコ
ールへの実質的に完全な転換を示した。
【００６５】反応混合物に５０mlのエタノールを加え、
そして蒸発乾燥した。１００mlのエタノールと共にこの
方法を２回繰り返した後、残渣を水に懸濁し、酢酸エチ
ルで抽出し、そして２×１００mlの２％炭酸水素塩の水
溶液及び水で次々に有機層を洗浄し、次に無水硫酸ナト
リウムで洗浄した。次に有機層を蒸発せしめ、残渣をヘ
キサン中に溶解し、そして冷却した後、３０．８ｇ（７
１％）の低融点固体が得られた。融点８６〜８８℃；Ｔ
ＬＣ（Ｒｆ＝０．１９、酢酸エチル／ヘキサン）。
【００６６】上記のようにして調製したアルコール（２
９．５ｇ）を９０mlのピリジン（０℃〜５℃）に溶解
し、そして１９．５ｇのトシルクロリドを１度に加え
た。１時間後、ピリジニウム塩酸塩の沈澱が観察され、
そして混合物をさらに２時間攪拌し、次に４℃にて一夜
貯蔵した。この溶液を攪拌しながら１ｌの氷水に注入
し、そして生じた固体を濾過により分離し、水で洗浄
し、そしてデシケーター中で一夜乾燥して３５ｇ（８０
％）のトシルエステルを得た。融点７３℃〜７６℃。
【００６７】１５０mlのＤＭＦ中トシルエステル（２
２．４５ｇ）に、３．９ｇのナトリウムアジドを加え、
そして混合物を５０℃〜５５℃にて３時間加熱した。こ
の時間の終りに、５〜１０torrの真空中でＤＭＦを除去
し、冷水を加え、そして濾過した。生成したアジドをデ
シケーター中で一夜乾燥して１４．５６ｇ（９１％）の
目的生成物を得た。融点６０℃〜６３℃。
【００６８】２２７mlの１Ｎ ＨＣｌ−エタノール（無
水）に１４ｇの上記のアジドを溶解し、この溶液を注意
深く、水素化ビン中の酸化白金１．４ｇに加えた。この
混合物を、５０℃〜５５℃にて４８時間水素化し、そし
てＴＬＣにより還元の経過を追跡した。反応が完了した
とき触媒を濾去し、濾液を蒸発乾燥し、そして残渣を３
２５mlの６Ｎ ＨＣｌに溶解し、そして混合物を３６時
間還流した。
【００６９】濾過し、そして蒸発乾燥した後、残渣を１
００mlの水に溶解し、水を蒸発せしめ、そしてこの方法
を２回反復した。残渣をエタノールと共にすりつぶして
８．３ｇ（９１％）のジアミノ酸生成物を得た。融点＞
２５０℃。
【００７０】例5. ｏ−ニトロフェニルジスルフィド保
護リガンドを用いる抗体Ｎ2 Ｓ2 接合体の合成 ５０mlのＤＭＦに溶解した２．０５ｇの前記のジアミノ
酸にトリエチルアミン（３ml）及びサクシンイミジルＳ
−ベンゾイルチオグリコレート（５．８６ｇ）を加え、
そしてこの混合物を１５分間攪拌した。ジエチルホルム
アミドを真空除去し、そして１００mlの冷水を加えた。
沈澱した油状物を放置して固化せしめた。この固体を濾
取し、乾燥し、そして酢酸エチルから結晶化した。融点
１２６℃〜１２７℃。
【００７１】３０mlのエタノール中ナトリウムエトキシ
ド（ナトリウム１４０mg）に、０．９６６ｇの上記生成
物を加え、そして混合物を室温にて一夜攪拌した。溶剤
を真空蒸発せしめた後、残渣を氷酢酸中に溶解し、溶剤
を蒸発せしめ、そしてこの工程を２回反復した。残渣を
３０mlの氷酢酸に再溶解し、そして０．７７ｇのｏ−ニ
トロフェニルスルフェニルクロリドを加え、そして混合
物を室温にて２４時間攪拌した。
【００７２】反応をＴＬＣ（アセトニトリル／水９５：
５）によりモニターし、そして反応が完了したとき、酢
酸を真空除去し、そして冷水を加えた。固体沈澱物を濾
取し、冷エタノール（１０〜１５ml）で洗浄し、そして
Ｐ0 Ｏ5 上で１２時間真空乾燥した。収量は１．０３ｇ
（８８％）であった。融点＞２００℃、ＴＬＣ：アセト
ニトリル／水９５：５；Ｒｆ＝０．３９。
【００７３】５０mlのＴＨＦ（無水）に懸濁したビス−
（ジ−ｏ−ニトロフェニルジスルフィド（０．２９３
ｇ）に、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（６３mg）を加
え、次にジシクロヘキシルカルボジイミド（１１３mg）
を加え、そして混合物を室温にて４８時間攪拌した。
【００７４】この溶液を約１５〜２０mlに濃縮し、そし
て冷却し、沈澱を濾去し、そして濾液を約１０mlに濃縮
し、そして約１０℃〜１５℃に冷却した。濾過した後、
濾液を約４℃にて２〜３時間保持した。冷溶液に無水エ
ーテルを添加することにより黄色沈澱（約９５mg）が生
じ、次に約９０mgの不純な生成物が生じた。
【００７５】抗体接合反応混合物を４０mlの最終容積中
に含めた：１．８mg（１．７２×１０-5mole）のビス−
（ジ−ｏ−ニトロフェニルジスルフィド）Ｎ2 Ｓ2 リガ
ンド、１７８mgのマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ、
１．２×１０-6mole) 、４．０mlの再蒸留ＤＭＦ、０．
０５Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液（pH８．５）。室温にて９
０分間攪拌した後、４．４mlの５Ｎ塩化ナトリウム及び
１．９mlの１００mMジチオスレイトールを加えた。
【００７６】さらに３０分間の後、反応混合物を遠心し
て沈澱を除去し、そして上清をゲル濾過カラムクロマト
グラフィーにより分画した。カラムからの溶出液を２８
０mmにてモニターし、そしてモノマー抗体接合体を含有
する画分をプールし、そしてアミコン攪拌セル（３０，
０００分子量カットオフ）中で濃縮した。最終収量は１
４１mg（８２％）であった。
【００７７】例6. Ｔｃ−酒石酸塩による抗体−リガン
ド接合体のテクニチウム−９９ｍラベル化 酒石酸第一錫キットを、窒素雰囲気下脱気されたバイア
ル中で、０．５mlの酒石酸二ナトリウム（１５０mg／m
l）及び０．１ml塩化第一錫（エタノール中１．０mg／m
l）の脱気した溶液から調製した。酒石酸第一錫キット
に、ナトリウムペルペクネテート０．５ml（〜１５mCi)
を加え、そして５０℃にて１０〜１５分間加熱した。
【００７８】室温に冷却した後、Ｔｃ−９９ｍ酒石酸塩
及び不溶性Ｔｃ−９９ｍについての品質管理を、それぞ
れメチルエチルケトン及び０．０１Ｍ酒石酸ナトリウム
（pH７．０）溶離液を用いて Gelman ITLC上で行った。
Ｔｃ−９９ｍ酒石酸塩の形成は典型的には９８〜９９％
であり、不溶性Ｔｃ−９９ｍの値は０．１〜０．２％で
あった。脱気されたバイアルに、１００μｌの塩溶液、
２００μｌのリン酸ナトリウム（０．２Ｍ、pH８．
０）、及び２００μｌの抗体−リガンド接合体（１．９
mg／ml）を次々に加えた。接合体を添加した直後に２５
０μｌのＴｃ−酒石酸塩（約３〜５mCi)を加え、そして
５０℃にて１時間加熱した。
【００７９】蛋白質に結合したテクネチウムの％及びペ
ルテクネテートの形成を、それぞれ５０％ＭｅＯＨ：１
０％酢酸アンモニウム（１：１）、及び１−ブタノール
を用いてＩＴＬＣにより決定した。テクネチウムの導入
は、リガンドと抗体の比率が１．５〜３．０であるリガ
ンド−Ａｂ接合体に対して、典型的には７０〜８８％で
あった。
【００８０】
【表４】
【００８１】例7. あらかじめ形成されたＴｃ−９９ｍ
ペンタノイルＮ2 Ｓ2 キレートによる抗体のラベル化 Ｔｃ−９９ｍキレート化誘導体を次のようにして抗体と
接合せしめた。Ｎ，Ｎ′−ビスメルカプトアセチル４，
５−ジアミノペンタン酸によりキレート化されたＴｃ−
９９ｍを塩基性pHにて２５μｇのＮ2 Ｓ2 リガンドと共
にＴｃ−９９ｍペルテクネテートをジチオニトで還元す
ることにより調製した。
【００８２】０．５mlの水中上記錯体を、pH７におい
て、３．０mgの２，３，５，６−テトラフルオロフェノ
ールを含有する水：アセトニトリル（１：９）１００μ
ｌに加え、そして７．５mgの１−シクロヘキシル−３−
（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（モルホＣＤ
Ｉ）を含有する水：アセトニトリル（１：９）１００μ
ｌを加えることにより酸を活性化した。室温にて１８時
間貯蔵した後、Baker-10SPE 逆相Ｃ18カラムを用いて混
合物を精製した。
【００８３】カラムを２mlのエタノールで条件調節し、
次にＨＩＬＣグレードの水で洗浄した。次に、反応混合
物をカラムに加え、カラムを０．０１Ｍリン酸ナトリウ
ム（pH７．０）中１０％エタノール２mlずつにより４回
洗浄し、そしてエステル錯体を２．５mlずつのアセトニ
トリルで溶出した。最初の溶出液は８．５mCi を含有
し、そして第２の溶出液は０．１８mCi を含有してい
た。自然崩壊により、収率は８６％であった。
【００８４】２mlのバイアルに、窒素流中に蒸留された
溶剤であるアセトニトリル中活性化されたエステル錯体
４．５mCi を加え、そして０．４０mlの硼酸ナトリウム
（０．５Ｍ、pH９．０）を加えた。攪拌しながら、３０
μｌ（９．１４mg／ml）の抗黒色腫抗体（９．２．２
７）を加えた。最終蛋白質濃度は０．５２mg／mlであっ
た。
【００８５】反応を、Gelman ITLC SGストリップを用い
そして５０％水性メタノール：１０％酢酸アンモニウム
（１：１）で溶出することによりＴＬＣで追跡し、室温
にて１５分間で４７％の蛋白質がＴｃ−９９ｍを結合
し、３０分間で５９％であることが示された。Ｔｃ−９
９ｍでラベルされた蛋白質をセントリコン−１０ｋフィ
ルター遠心により精製した。９２．４％の蛋白質がＴｃ
−９９ｍと結合したサンプルは、ＦＥＭＸ黒色腫細胞へ
の８４．０％の結合を示した。
【００８６】例8. Ｒｅ−１８６／４，５−ジメルカプ
トアセタミドペンタノイル−抗体（抗黒色腫抗体９．
２．２７）の調製 脱気したバイアル中で、１００μｌのＨ2 Ｏ、１００μ
ｌのアセトニトリル、１００μｌのクエン酸塩溶液（２
８．８mg、１．５×１０-4mole) 、５０μｌのリガンド
〔テトラフルオロフェニル４，５−ジ−（テトラヒドロ
ピラニルメルカプトアセタミド）ペンタン酸（０．４０
mg、６．５×１０-7mole) 、５０μｌの塩化第一錫
（０．５mg、２．６×１０-6mole) 、及びアセトニトリ
ル中Ｒｅ−１８６ペルレネート（４．２４μｇ、２．３
×１０-8mole) を一緒にする。混合物を５０℃にて１時
間加熱し、そして次に０．３mlの１Ｎ ＮａＯＨを加え
る。
【００８７】Ｒｅ−１８６Ｎ2 Ｓ2 錯体のテトラフルオ
ロフェニルエステル生成物をＣ18 Baker-10 ＳＰＥカラ
ム上で精製する。カラムへの適用の後、２×３mlのＨ2
Ｏ及び４×３mlの１０％ＣＨ3 ＯＨ／０．０１Ｍリン酸
塩（pH７）で不純物を洗浄除去する。生成物を２mlのア
セトニトリルで溶出し、そして次に溶液を窒素流のもと
で乾燥するまで減少させる。生成物の収量は約６０％で
ある。
【００８８】Ｒｅ−１８６Ｎ2 Ｓ2 錯体の接合は、３４
０μｌの硼酸緩衝液（０．５Ｍ、pH９）中抗体（１６０
μｌ、５mg／ml）〔Morgan等、 Hybridoma (1981）１：
27〕の添加によって行う。室温にて３０分間置いた後、
５８％の放射能が蛋白質に結合した。ＦＥＭＸ黒色腫細
胞への放射能の結合により決定された免疫反応性は、非
蛋白質結合物質について補正した後８０％であった。
【００８９】例9. イミデート形のＮ2 Ｓ2 リガンドの
合成、抗体への接合及びＴｃ−９９ｍによる放射性ラベ
ル化 ２，３−（ビス−カルボベンジルオキシ）ジアミノプロ
パン−１−オール〔２〕 ５００mlの水素化ビンに５５ｇ
（０．２５mole) の２，３−ジブロモプロパノール（ア
ルドリッヒ）及び３００mlの２８〜３０％水性ＮＨ4 Ｏ
Ｈ溶液を仕込んだ。この混合物を内部温度計と共に密封
し、Ｐａｒｒ振とう機で振とうしながら２３時間７５℃
〜８５℃に加熱した。
【００９０】冷却したとき、振とうを停止し、そして混
合物を注意深く開放した。油浴上で加熱しながらＮ2 ガ
スを通すことにより、混合物を５０mlに蒸発せしめた。
熱い内に５０mlのＥｔＯＨを加え、そして混合物を放冷
した。２，３−ジアミノプロパン−１−オールの臭化水
素塩を濾過により集め、そして乾燥して白色固体の硬い
塊を５０ｇ得、これをさらに精製することなく使用し
た。
【００９１】１１０mlの４Ｎ ＮａＯＨ中２５ｇの粗製
塩の溶液を０℃に冷却（氷浴）し、そしてこの溶液に１
００mlのＣＨ2 Ｃｌ2 中３１．４ml（０．２２mole、３
７．５ｇ）のベンジルクロロホルメートの溶液を加え
た。この混合物は０℃にて３０分間、そして室温にて１
６時間、急速攪拌した。
【００９２】ＣＨ2 Ｃｌ2 相を集め、７５mlの塩水で洗
浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4)、濾過し、そして濃縮した。
生じた固体を１００mlのＥｔ2 Ｏで洗浄し、濾過により
集め、そして真空乾燥して１０．７ｇ（２４％）の
〔２〕を白色固体として得た。これをＣＨＣｌ3 ／ヘキ
サンから再結晶化し小さい針状体を得ることができた。
融点１１９℃〜１２０℃。
【００９３】２，３−（ビス−カルボベンジルオキシ）
ジアミノプロピル−１−メタンスルホネート〔３〕 Ｎ2 雰囲気下で０℃に冷却された１５０mlのＣＨ2 Ｃｌ
2 中１０．６８ｇ（３０mmole)の〔２〕及び６．２７ml
（４．５５ｇ、４５mmole)のＥｔ2 Ｎの懸濁液に、２．
２５ml（３．７８ｇ、３３mmole)のメタンスルホニルク
ロリドを加え、そしてこの混合物を０℃にて３０分間攪
拌した。
【００９４】生じた透明な溶液を７５mlの５％ＨＣｌ、
７５mlのＨ2 Ｏ、７５mlの５％ＮａＨＣＯ3 、及び７５
mlのＮａＣｌ飽和水溶液（すべて氷中で冷却）で次々に
洗浄した。ＣＨ2 Ｃｌ2 相を乾燥し（ＭｇＳＯ4)、濾過
し、濃縮し、そしてＣＨＣｌ 3 ／ヘキサンから結晶化し
て１２．３３ｇ（９４％）の白色結晶を得た。融点９２
℃〜９３℃。
【００９５】３，４−（ビス−カルボベンジルオキシ）
ジアミノブチロニトリル〔４〕 ６．５６ｇ（１５mmole)の〔３〕、１．０８ｇ（１６．
５mmole)のＫＣＮ、０．４０（１．５mmole)の１８−ク
ラウン−６、及び７５mlの無水アセトニトリル（３Åの
分子篩上で貯蔵したもの）の混合物を窒素雰囲気中で１
９時間還流した。
【００９６】冷却したとき、混合物を１００mlの１０％
ＮａＨＣＯ3 溶液と２００mlのＣＨ 2 Ｃｌ2 の間で分配
した。ＣＨ2 Ｃｌ2 相を１００mlずつの５％ＨＣｌ、
水、及び塩水で洗浄した。ＣＨ2 Ｃｌ2 相を乾燥し（Ｍ
ｇＳＯ4)、濾過し、そして濃縮して５．４７ｇの褐色油
状物を得た。ＣＨＣｌ3 ／ヘキサンからの２回の再結晶
化により２．６８ｇの〔４〕を白色固体として得た。融
点１１１℃〜１１２℃。
【００９７】３，４−ジアミノブチロニトリルジハイド
ロゼンイオジド塩〔５〕 １００mlのフラスコ中の３．３８ｇ（１３．３mmole)の
Ｉ2 に、Ｎ2 雰囲気下で、５．４２ml（３．８７ｇ、２
６．５mmole)のヘキサメチルジシランを加えた。固体Ｉ
1 が溶解するまで（３０分間）、混合物を４５℃〜５０
℃の油浴中に浸漬した。
【００９８】温度を１００℃に上げ、そして色が消失す
るまで５分間保持した。この溶液を氷浴により０℃に冷
却し、そして１３．３mlのＣＨ2 Ｃｌ2 で稀釈した。０
℃の溶液に、１３．３mlのＣＨ2 Ｃｌ2 中１．９６
（５．３mmole)の〔４〕の溶液を５分間にわたり滴加し
た。冷却浴を除去し、そして混合物を室温にて３時間暗
中で攪拌した。
【００９９】この混合物に２．１５ml（１．７０ｇ、５
３mmole)のＭｅＯＨを加え、そして攪拌を一夜（１６時
間）続けた。混合物を０℃に冷却し、そして固体を濾過
により集め、そして真空乾燥して１．７５ｇ（１００
％）の黄褐色固体の〔５〕を得、これはそのジベンゾイ
ル誘導体として特徴付けられた。
【０１００】３，４−ジベンゾイルメルカプトアセタミ
ドブチロニトリル〔６〕 ３．２７ｇ（１０mmole)の〔５〕、７．３３ｇ（２５mm
ole)のＮ−サクシンイミジルＳ−ベンゾイルメルカプト
酢酸、及び１０mlのＤＭＦの混合物に、０℃Ｎ 2 雰囲気
下で３．４８ml（２．５２ｇ、２５mmole)のトリエチル
アミンを加えた。冷却浴を取りさり、そして混合物を１
時間攪拌した。
【０１０１】混合物を、５０mlの５％ＨＣｌ溶液で稀釈
し、そして２×５０mlのＣＨ2 Ｃｌ 2 で抽出した。一緒
にしたＣＨ2 Ｃｌ2 相を１００mlの５％ＮａＨＣＯ3 溶
液で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4)、濾過し、そして真空
乾燥して６．７５ｇの紫色を帯びた固体を得た。
【０１０２】クロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯ
Ａｃ）により精製を行い、そして精製された画分の結晶
化（ＣＨＣｌ3 ／ヘキサン）により３．２０ｇ（７０
％）の白色固体を得た。融点１２５℃〜１２７℃。
【０１０３】３，４−ビス−メチルジチオアセタミドブ
チロニトリル〔７〕 ６mlのＥｔＯＨ中４５５mg（１．０mmole)の〔６〕の懸
濁液に、室温にてＮ2雰囲気下で２．２mlの１Ｎ水性Ｎ
ａＯＨを加えた。混合物を室温にて１．６時間攪拌し、
そして生じた透明な溶液に２２６μｌのメタンチオスル
ホン酸メチルを加えた。この混合物を３時間攪拌し、そ
して２０mlのpH７の緩衝液と２×２０mlのＣＨ2 Ｃｌ2
との間で分配した。
【０１０４】一緒にした水層を乾燥し（ＭｇＳＯ4)、濾
過し、そして濃縮して５９１mgのピンク色の残渣を得
た。シリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡc)による
精製及びＣＨＣｌ3 ／ヘキサンからの結晶化により合計
２１７mg（６４％）の白色非晶質固体〔７〕を得た。融
点１２１℃〜１２３℃。
【０１０５】メチル３，４−ビス−メチルジチオアセタ
ミドブチルイミデート塩酸塩〔１〕 １．６６mlのＭｅＯＨ及び４．１５mlのＥｔ2 Ｏ中１４
１mg（０．４１mmole）の〔７〕の懸濁液を−２０℃に
冷却し（ＣＯ2 ／ＣＣｌ4)、そしてほとんどの固体が溶
解しそして溶液がＨＣｌにより飽和されるまで、セプタ
ム入口を通して５分間にわたりＨＣｌガスを混合物に通
した。
【０１０６】この混合物をフリーザー中のデシケーター
に６６時間入れ、そして次に真空中で濃縮して白色泡状
固形物を生成せしめた。固形物を破砕し、無水Ｅｔ2 Ｏ
で３回洗浄し、真空乾燥して灰色味のある白色の固体と
して１１１mg（６６％）の〔１〕を得た。この物質は加
熱により分解し、そしてまたフリーザー中で数日間の後
分解した。
【０１０７】抗体／メチル３，４−ビス−メチルジチオ
アセタミドブチルイミデート接合体の製造 Ｎ2 Ｓ2 リガンドの２mg／mlストック溶液を乾燥アセト
ニトリル中に調製した。２−ニトロ−５−チオスルホベ
ンゾエートを用いてジスルフィド含量を決定することに
より溶液を標定し〔Thannhauser 等、 Anal.Biochem.
(1984) 138 ：181 〕、そしてリガンド濃度が５．３０m
Mであることを見出した。
【０１０８】マウスモノクローナル抗体への接合のた
め、０．１６mlのＮ2 Ｓ2 リガンド−アセトニトリル溶
液を反応バイアルに加え、そして乾燥窒素流により溶剤
を除去した。抗体（０．６２mlの８．１mg／ml溶液）と
１．０mlの０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH９．
５）とを混合し、そして次に乾燥したリガンドを収容す
る反応容器に加えた。
【０１０９】室温にて３０分間攪拌した後、全溶液を、
同じ量の乾燥リガンドを収容する新たなバイアルに加
え、そして溶液をさらに３０分間攪拌した。接合した抗
体を、５０mMリン酸ナトリウム（pH７．５）、０．５Ｍ
塩化ナトリウム中でセファデックスＧ−２５クロマトグ
ラフィーにより精製した。
【０１１０】蛋白質含有画分をプールし、そしてアミコ
ン攪拌セル中で約２mg／mlの濃度に濃縮した。溶液をグ
ルタチオンが５０mMとなるようにし、２５分間攪拌し、
そしてセファデックスＧ−２５ゲル濾過により精製し、
そして前記のようにして濃縮した。最終溶液（１．７mg
／ml）を、使用まで４℃にて貯蔵した。
【０１１１】抗体／メチル３，４−ビス−メチルジチオ
アセタミドブチルイミデート接合体の放射性ラベル化 Ｔｃ−９９ｍ酒石酸塩を、１００μｇのＳｎＣｌ2 、９
Ｖ／Ｖ％のエタノール、７５mgの酒石酸二ナトリウム、
及び３．２mCi のナトリウム（Ｔｃ−９９ｍ）ペルテク
ネテートを用いて、全体積１．１mlの脱気した水中に調
製した。この溶液を５０℃にて１５分間加熱した。
【０１１２】約１００μｌのＴｃ−９９ｍ酒石酸塩溶
液、１００μｌの０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム（pH１
０）、及び１００μｇの抗体接合体を別のバイアルに加
えた。次に、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを用いて合計体
積を０．５mlに調整し、そして溶液を５５℃にて６０分
間インキュベートした。ＨＰＬＣ〔ＴＳＫカラム、０．
２Ｍリン酸ナトリウム（pH７．４）、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム〕による分析は、９５％のＴｃ−９９ｍが抗体
接合体と会合したことを示した。
【０１１３】例１0. Ｓ−テレフタロイル置換Ｎ2 Ｓ2
リガンドの調製 テレフタル酸のモノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル〔１〕
を、Buckle及びSmith,J.Chem.Soc. (1971) 54：2821の
方法により調製した。サクシンイミジルエステル〔２〕
を、〔１〕と１．２モル当量のＮ−ヒドロキシサクシン
イミド及び１．３モル当量の１．３−ジシクロヘキシル
カルボジイミドとを乾燥ＴＨＦ中で室温にて１４〜１６
時間攪拌することにより調製した。
【０１１４】薄層クロマトグラフィー分析は、反応が完
了したことを示した。次に、ジシクロヘキシル尿素を濾
去し、そして得られた液を真空濃縮して〔２〕を白色固
体として得た。〔２〕の最終精製を、フラッシュクロマ
トグラフィーにより達成した。
【０１１５】１．０モル当量のメルカプト酢酸及び２．
０モル当量の４−ジメチルアミノピリジンを乾燥ＴＨＦ
中に溶解することによりチオエステル〔３〕を調製し
た。サクシンイミジルエステル〔２〕を攪拌中の上記溶
液に加えた。５時間攪拌した後、反応が完了したことが
薄層クロマトグラフ分析により示された。
【０１１６】ＴＨＦを真空除去し、そして残渣をＣＨ2
Ｃｌ2 中に溶解した。次に、溶液をＨＣｌ希釈溶液で洗
浄し、そして無水ＭｇＳＯ4 で乾燥した。濾過及び溶剤
の蒸発により〔３〕が無色油状物として得られ、このも
のは放置の後固化した。サクシンイミジルエステル
〔４〕を Subramanianの方法〔 R.F.Schneider等、J.Nu
cl.Med. (1984)25： 223−229 〕により調製した。
【０１１７】３．０モル当量のトリエチルアミンを含有
するＨ2 Ｏ／ＣＨ3 ＣＮ（１：４）中に４，５−ジアミ
ノペンタン酸二塩酸塩を溶解し、そして次に２．０モル
当量のサクシンイミジルエステル〔４〕を加えることに
よりカルボン酸〔５〕を調製した。
【０１１８】室温にて１４〜１８時間攪拌した後、ＴＬ
Ｃ分析は反応が完了したことを示した。溶剤を真空除去
した。残渣を酢酸エチルに溶解し、そしてＨＣｌ希水溶
液、水、及び塩水で洗浄した。次に、酢酸エチル層を無
水Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥した。濾過、及び溶剤の除去後、
ワックス状固体が得られ、これを酢酸エチルとヘキサン
との混合物から再結晶化して〔５〕を白色固体として得
た。
【０１１９】〔５〕を１．２モル当量の２，３，５，６
−テトラフルオロフェノールと共に乾燥ＴＨＦに溶解す
ることによりテトラフルオロフェノールエステル６Ａを
調製した。この混合物に１，３−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド（１．２モル当量）を加え、そしてこの混合
物を１２〜１５時間攪拌した。
【０１２０】薄層クロマトグラフィーによる分析は反応
が完了したことを示した。ジシクロヘキシル尿素を濾去
し、そして溶剤を真空蒸発せしめた。残渣をフラッシュ
クロマトグラフィーにより精製してエステル〔６Ａ〕を
白色固体として得た。
【０１２１】〔５〕を１．２モル当量のＮ−ヒドロキシ
サクシンイミドと共に乾燥ＴＨＦに溶解することにより
サクシンイミジルエステル（６Ｂ）を調製した。この混
合物に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．
２モル当量）を加え、そしてこの混合物を室温にて１４
〜１６時間攪拌した。
【０１２２】薄層クロマトグラフ分析は、反応が完了し
たことを示した。ジシクロヘキシル尿素を濾去し、そし
て溶剤を真空除去した。残渣を酢酸エチル中に溶解し、
そして水で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水Ｎａ2 ＳＯ
4 で乾燥した。乾燥剤を濾去し、そして溶剤を真空除去
した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーに
より精製してサクシンイミジルエステル〔６Ｂ〕を白色
固体として得た。
【０１２３】テトラフルオロフェニルエステル〔６Ａ〕
をＣＨ2 Ｃｌ2 中に溶解し、そしてこの溶液を最初に０
℃にて過剰のトリフルオロ酢酸で処理し、次に室温にて
３時間攪拌することにより、ｔｅｒｔ−ブチル保護基を
除去した。薄層クロマトグラフィー分析は反応が完結し
たことを示した。次に、溶剤及び過剰のトリフルオロ酢
酸を真空除去して白色ないし無色の固体を得、これをＣ
Ｈ3 ＣＮ／Ｈ2 Ｏから再結晶化して〔７Ａ〕を白色粉末
として得た。
【０１２４】サクシンイミジルエステル〔６Ｂ〕の場
合、化合物〔６Ａ〕について記載したのと同様にしてｔ
ｅｒｔ−ブチル保護基を除去した。しかしながら、フラ
ッシュクロマトグラフィーにより生成物〔７Ｂ〕を精製
することが必要であった。これらの反応過程をまた、イ
ソフタル酸のモノｔｅｒｔ−ブチルエステルから出発し
て行い、上記の生成物の類似のメタ異性体を得た。
【０１２５】例１1. Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル
４，５−ジテレフタロイルメルカプトアセタミドペンタ
ノエートのＩｇＧ抗体への接合 ４８０μｇ（７．１×１０-7mole) のＮ2 Ｓ2 リガンド
活性エステル〔６Ｂ〕、０．２mlの再蒸留ＤＭＦ（１０
％）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍ硼酸ナト
リウム（pH８．５）、及び１０．０mgのマウスモノクロ
ーナル抗体（６．７×１０-8mole) を含有する２．０ml
の合計容積中で接合を行った。
【０１２６】室温にて９０分間攪拌した後、反応混合物
を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（pH７．５）中、セファデックスＧ−
２８でのゲル濾過により画分した。接合した抗体を含有
する排除容積を集めた。残留非蛋白質物質を除去するた
め、接合体を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含め０．０
５Ｍリン酸ナトリウム（pH７．５）に対して１８時間透
析した。蛋白質の最終収量は１００％であった。
【０１２７】例１2. ４，５−ジテレフタリルメルカプ
トアセタミドペンタノイル／ＩｇＧ抗体接合体のＴｃ−
９９ｍラベル化 １２０μｌの塩水、２００μｌの０．２Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH８）、及び８０μｌのテレフタロイル硫
黄保護Ｎ2 Ｓ2 接合体（４．６６mg／ml）に、前記のよ
うにして調製したＴｃ−９９ｍ酒石酸（約４mCi)を加え
た。反応混合物５０℃にて１時間加熱し、これにより９
０％のＴｃ−取り込みがもたらされた。
【０１２８】上記の方法に従って、イソフタロイル類似
体を製造することもできる。得られる生成物が放射性核
種接合体の最大形成をもたらことが重要である。さら
に、放射性同位元素は時間と共に崩壊するから、時間に
関心がもたれる。そして、この発明の化合物を用いて、
蛋白質を急速に接合せしめ、イン−ビボで使用するため
の放射性核種置換試薬を得ることができる。
【０１２９】この試薬は、純粋な形で、良収量で得るこ
とができ、そして放射性核種金属はイン−ビボで使用す
るための蛋白質とのキレートとして保持される。従っ
て、放射性核種を安全に目的部位に向けることができ、
低レベルの放射能のみが非特異的に向けられそして結合
する。以上、この発明を詳細に説明したが、この発明の
範囲内において多くの変化、変法を行うことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 51/00 Ｃ０７Ｃ 323/25 7419−4Ｈ Ｃ０７Ｆ 1/08 7457−4Ｈ 13/00 Ｚ 9155−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/60 Ｚ Ｇ２１Ｈ 5/02 Ｃ Ｇ２１Ｋ 5/02

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の式： 【化１】 （式中、Ｍはテクネチウム、レニウムもしくは銅又はこ
    れらの金属の酸化物であり；ｎは１〜６の整数であり；
    Ｗは＝ＮＨ又は＝Ｏであり；そしてＹは癌細胞に結合す
    る免疫グロブリン又はその特異的結合断片である） により表わされるラベルされたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 次の式： 【化２】 （式中、Ｍはテクネチウム、レニウムもしくは銅又はこ
    れらの金属の酸化物であり；ｎは１〜６の整数であり；
    Ｗは＝ＮＨ又は＝Ｏであり；そしてＹは癌細胞に結合す
    る免疫グロブリン又はその特異的結合断片である） により表わされるラベルされたポリペプチドの製造方法
    において、次の式： 【化３】 （式中、Ｙ′はポリペプチドと共にアミド結合又はアミ
    ジノ結合を形成することができる活性化基であり、そし
    てＭ，ｎ及びＷは前記の意味を有する） により表わされるキレート化合物を、癌細胞と結合する
    ことができる免疫グロブリン又はその特異的結合断片と
    結合せしめることを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】 次の式： 【化４】 （式中、Ｍはテクネチウム、レニウムもしくは銅又はこ
    れらの金属の酸化物であり；ｎは１〜６の整数であり；
    Ｗは＝ＮＨ又は＝Ｏであり；そしてＹは癌細胞に結合す
    る免疫グロブリン又はその特異的結合断片である） により表わされるラベルされたポリペプチドの製造方法
    において、次の式： 【化５】 （式中、Ｔは金属又はその酸化物のキレート化に際して
    除去される硫黄保護基であり；そしてｎ，Ｗ及びＹは前
    記の意味を有する） で表わされるペプチド誘導体とテクネチウム、レニウム
    もしくは銅又はこれらの金属の酸化物と反応せしめるこ
    とを特徴とする方法。
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