JPH0710774A - スプレプトコッカス・スイス感染に対するワクチン - Google Patents
スプレプトコッカス・スイス感染に対するワクチンInfo
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- JPH0710774A JPH0710774A JP6103080A JP10308094A JPH0710774A JP H0710774 A JPH0710774 A JP H0710774A JP 6103080 A JP6103080 A JP 6103080A JP 10308094 A JP10308094 A JP 10308094A JP H0710774 A JPH0710774 A JP H0710774A
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- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血清型から独立し且つ血清学的に交差反応性
の防御抗原を主成分とするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｕｉｓ感染に対するワクチンを提供する。 【構成】 細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ
に対する中和抗体を誘発することが可能な分子量約５４
ｋＤのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓのポリペ
プチド、該ポリペプチドを含有するワクチン及びその製
造方法。
の防御抗原を主成分とするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｕｉｓ感染に対するワクチンを提供する。 【構成】 細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ
に対する中和抗体を誘発することが可能な分子量約５４
ｋＤのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓのポリペ
プチド、該ポリペプチドを含有するワクチン及びその製
造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｓｕｉｓのポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｓｕｉｓに起因する疾患からブタを防御するた
めのワクチン、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ
ポリペプチドに対して反応性の抗体及びこのようなワク
チンの製造方法に係る。
ｕｓ ｓｕｉｓのポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｓｕｉｓに起因する疾患からブタを防御するた
めのワクチン、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ
ポリペプチドに対して反応性の抗体及びこのようなワク
チンの製造方法に係る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓは関節炎、敗血症、髄
膜炎、心外膜炎、心内膜炎、多漿膜炎及び／又は肺炎に
より特徴付けられるブタの感染性疾患の主要な原因物質
として同定された（Ｃｌｉｆｔｏｎ−Ｈａｄｌｅｙ，
Ｆ．Ａ．；Ｂｒ．Ｖｅｔ．Ｊｏｕｒｎ．１３９：１−５
（１９８３）， Ｖｅｃｈｔら；Ｖｅｔ．Ｑｕａｒｔｅ
ｒｌｙ ７： ３１５−３２１ （１９８５）， Ｗｉ
ｎｄｓｏｒ，Ｒ．Ｓ．； Ｖｅｔ ｒｅｃ．１０１：
３７８−３７９ （１９７７）， Ｈｉｇｇｉｎｓ
ら； Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５４： １７０−
１７３ （１９９０）， Ｄｅｖｒｉｅｓｅら； Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｃ．１２７： ６８（１９９０））。
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓは関節炎、敗血症、髄
膜炎、心外膜炎、心内膜炎、多漿膜炎及び／又は肺炎に
より特徴付けられるブタの感染性疾患の主要な原因物質
として同定された（Ｃｌｉｆｔｏｎ−Ｈａｄｌｅｙ，
Ｆ．Ａ．；Ｂｒ．Ｖｅｔ．Ｊｏｕｒｎ．１３９：１−５
（１９８３）， Ｖｅｃｈｔら；Ｖｅｔ．Ｑｕａｒｔｅ
ｒｌｙ ７： ３１５−３２１ （１９８５）， Ｗｉ
ｎｄｓｏｒ，Ｒ．Ｓ．； Ｖｅｔ ｒｅｃ．１０１：
３７８−３７９ （１９７７）， Ｈｉｇｇｉｎｓ
ら； Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５４： １７０−
１７３ （１９９０）， Ｄｅｖｒｉｅｓｅら； Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｃ．１２７： ６８（１９９０））。
【０００３】罹患率が特に高いのは３〜１２週齢の子ブ
タである（Ｗｉｎｄｓｏｒ，Ｒ．Ｓ．及びＥｌｌｉｏ
ｔ，Ｓ．Ｄ．； Ｊ．Ｈｙｇ．Ｃａｍｂ．， ７５：
６９−７８ （１９７５）， Ｇｕｉｓｅら； Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｃ．１１７： ４３−４４（１９８５）， Ｈ
ｏｆｆｍａｎ，Ｌ．Ｊ．及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ；
Ｌ．Ｍ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｅｔ．Ｌａｂ．Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｉａｎｓ ２８ｔｈ Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．
２０１−２１０ （１９８５））。全年齢のブタがこの
細菌物質に対して感受性であるが、１４週齢以上のブタ
の致死率は低い（Ｇｕｉｓｅら； Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１
１７： ４３−４４ （１９８５）， Ｈｏｆｆｍａ
ｎ，Ｌ．Ｊ．及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ； Ｌ．Ｍ．Ａ
ｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｅｔ．Ｌａｂ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｉａｎｓ ２８ｔｈ Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．： ２０１
−２１０ （１９８５））。
タである（Ｗｉｎｄｓｏｒ，Ｒ．Ｓ．及びＥｌｌｉｏ
ｔ，Ｓ．Ｄ．； Ｊ．Ｈｙｇ．Ｃａｍｂ．， ７５：
６９−７８ （１９７５）， Ｇｕｉｓｅら； Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｃ．１１７： ４３−４４（１９８５）， Ｈ
ｏｆｆｍａｎ，Ｌ．Ｊ．及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ；
Ｌ．Ｍ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｅｔ．Ｌａｂ．Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｉａｎｓ ２８ｔｈ Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．
２０１−２１０ （１９８５））。全年齢のブタがこの
細菌物質に対して感受性であるが、１４週齢以上のブタ
の致死率は低い（Ｇｕｉｓｅら； Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１
１７： ４３−４４ （１９８５）， Ｈｏｆｆｍａ
ｎ，Ｌ．Ｊ．及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ； Ｌ．Ｍ．Ａ
ｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｅｔ．Ｌａｂ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｉａｎｓ ２８ｔｈ Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．： ２０１
−２１０ （１９８５））。
【０００４】この生物は他の動物種及びヒトにおける疾
患に関連する場合もある（Ｄｅｖｒｉｅｓｅら； Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｃ．１２７： ６８（１９９０）， Ｈｏｍｍ
ｅｚら； Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１２３： ６２６−６２７
（１９８８）， Ａｒｅｎｄｓら； Ｒｅｖ．Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｄｉｓ １０： １３１−１３７ （１９８
８）， Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら； Ｊ．Ｃｌｉｎｉ
ｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７： ２６３３−２６３６
（１９８９）， Ａｒｅｎｄｓ，Ｊ．Ｐ．及びＺａｎ
ｅｎ．Ｈ．Ｃ．； Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ １
０： １３１−１３７ （１９８８））。これらの症例
の感染は通常は皮膚外傷を介して生じる。
患に関連する場合もある（Ｄｅｖｒｉｅｓｅら； Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｃ．１２７： ６８（１９９０）， Ｈｏｍｍ
ｅｚら； Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１２３： ６２６−６２７
（１９８８）， Ａｒｅｎｄｓら； Ｒｅｖ．Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｄｉｓ １０： １３１−１３７ （１９８
８）， Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら； Ｊ．Ｃｌｉｎｉ
ｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７： ２６３３−２６３６
（１９８９）， Ａｒｅｎｄｓ，Ｊ．Ｐ．及びＺａｎ
ｅｎ．Ｈ．Ｃ．； Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ １
０： １３１−１３７ （１９８８））。これらの症例
の感染は通常は皮膚外傷を介して生じる。
【０００５】Ｓ．ｓｕｉｓ疾患はＤｅＭｏｏｒ（ＤｅＭ
ｏｏｒ，Ｃ．Ｅ．； Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅ
ｕｗｅｎｈｏｅｋ ２９： ２７２−２８０ （１９６
３））によりオランダ国から最初に報告された。それ以
来、他のヨーロッパ諸国や、カナダ、米国及びオースト
ラリアから他の研究者が相次いで報告している（Ｓａｎ
ｆｏｒｄ，Ｅ．及びＴｉｌｋｅｒ，Ｍ．Ｅ．； Ｊ．Ａ
ｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２３： ５−９７
（１９８２）， Ｐｅｒｃｈら； Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．１７： ９９３−９９６ （１９８
３）， Ｌａｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．及びＫｏｔｔ，Ｂ．；
Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｅｔ．Ｌａｂ．Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｉａｎｓ ２８ｔｈ Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．： １
２１−１３０ （１９８５）， Ｇｕｉｓｅら； Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｃ．１１７： ４３−４４（１９８５）， Ｃ
ｌｉｆｔｏｎ−Ｈａｄｌｅｙ，Ｆ．Ａ．； Ｂｒ．Ｖｅ
ｔ．Ｊｏｕｒｎ．１３９： １−５ （１９８３））。
ｏｏｒ，Ｃ．Ｅ．； Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅ
ｕｗｅｎｈｏｅｋ ２９： ２７２−２８０ （１９６
３））によりオランダ国から最初に報告された。それ以
来、他のヨーロッパ諸国や、カナダ、米国及びオースト
ラリアから他の研究者が相次いで報告している（Ｓａｎ
ｆｏｒｄ，Ｅ．及びＴｉｌｋｅｒ，Ｍ．Ｅ．； Ｊ．Ａ
ｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２３： ５−９７
（１９８２）， Ｐｅｒｃｈら； Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．１７： ９９３−９９６ （１９８
３）， Ｌａｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．及びＫｏｔｔ，Ｂ．；
Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｅｔ．Ｌａｂ．Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｉａｎｓ ２８ｔｈ Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．： １
２１−１３０ （１９８５）， Ｇｕｉｓｅら； Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｃ．１１７： ４３−４４（１９８５）， Ｃ
ｌｉｆｔｏｎ−Ｈａｄｌｅｙ，Ｆ．Ａ．； Ｂｒ．Ｖｅ
ｔ．Ｊｏｕｒｎ．１３９： １−５ （１９８３））。
【０００６】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ株
は多数の異なる血清型に亜分類された。
は多数の異なる血清型に亜分類された。
【０００７】血清型決定は莢膜多糖抗原に基づく（Ｋｏ
ｅｈｎｅら； Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４０： １
６４０−１６４１ （１９７９）， Ｐｅｒｃｈら；
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７： ９９３−
９９６ （１９８３））。
ｅｈｎｅら； Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４０： １
６４０−１６４１ （１９７９）， Ｐｅｒｃｈら；
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７： ９９３−
９９６ （１９８３））。
【０００８】これまでに全世界で２９種の異なる血清型
が検出されている。
が検出されている。
【０００９】しかしながら、数種の血清型は特定の国に
片寄って発生している。スカンジナビア諸国では血清型
７が最も多発し、オーストリアでは血清型９が最も多
い。全世界中で見いだされる最も一般的な血清型は血清
型２である（Ｇｏｇｏｌｅｗｓｋｉら； Ａｕｓｔ．Ｖ
ｅｔ．Ｊ．６７： ２０２−２０４ （１９８７），Ｂ
ｏｅｔｎｅｒら； Ａｃｔａ Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ｂ
９５： ２３３−２３９（１９８７））。
片寄って発生している。スカンジナビア諸国では血清型
７が最も多発し、オーストリアでは血清型９が最も多
い。全世界中で見いだされる最も一般的な血清型は血清
型２である（Ｇｏｇｏｌｅｗｓｋｉら； Ａｕｓｔ．Ｖ
ｅｔ．Ｊ．６７： ２０２−２０４ （１９８７），Ｂ
ｏｅｔｎｅｒら； Ａｃｔａ Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ｂ
９５： ２３３−２３９（１９８７））。
【００１０】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓの
病因、ビルレンス因子又は防御抗原についてはほとんど
不明である。
病因、ビルレンス因子又は防御抗原についてはほとんど
不明である。
【００１１】従って、病原体に対する有効なワクチン接
種に必要な因子も解明されていない。
種に必要な因子も解明されていない。
【００１２】細菌疾患に対するワクチンを製造するため
に一般に使用されている手段の１つは全細胞ワクチン調
製物の製造及び試験である。
に一般に使用されている手段の１つは全細胞ワクチン調
製物の製造及び試験である。
【００１３】これはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕ
ｉｓについても実施されており、全細胞ワクチンはブタ
において同種抗原投与に対して顕著な防御を生じること
が判明した（Ｈｏｌｔら； Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．
４８： ２３−２７ （１９９０））。
ｉｓについても実施されており、全細胞ワクチンはブタ
において同種抗原投与に対して顕著な防御を生じること
が判明した（Ｈｏｌｔら； Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．
４８： ２３−２７ （１９９０））。
【００１４】しかしながら、全細胞調製物により得られ
る防御は血清型特異的であると思われる（Ｋｅｂｅｄｅ
ら； Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２： ２４９−
２５７ （１９９０））。全細胞ワクチンの他の一般的
な周知の欠点は、ａ）注入部位及びその周囲に望ましく
ない反応が生じ、ｂ）実際に防御の誘発に関与する物質
の量に比較して大量の非特異的タンパク質を投与しなけ
ればならないという点である。
る防御は血清型特異的であると思われる（Ｋｅｂｅｄｅ
ら； Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２： ２４９−
２５７ （１９９０））。全細胞ワクチンの他の一般的
な周知の欠点は、ａ）注入部位及びその周囲に望ましく
ない反応が生じ、ｂ）実際に防御の誘発に関与する物質
の量に比較して大量の非特異的タンパク質を投与しなけ
ればならないという点である。
【００１５】多糖莢膜に基づき現時点で既に２９種の異
なるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ血清型が公知
であるという事実に鑑みると、全細胞をベースとするワ
クチンは広い防御を得るために多数の血清型を含むべき
である。
なるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ血清型が公知
であるという事実に鑑みると、全細胞をベースとするワ
クチンは広い防御を得るために多数の血清型を含むべき
である。
【００１６】肺炎レンサ球菌に起因する肺炎からヒトを
防御するために実際にこのようなワクチンが製造されて
いる（Ｂｏｕｌｎｏｉｓ，Ｇ．Ｊ．； Ｊｏｕｒｎ．Ｇ
ｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３８： ２４９−２５
９ （１９９２））。
防御するために実際にこのようなワクチンが製造されて
いる（Ｂｏｕｌｎｏｉｓ，Ｇ．Ｊ．； Ｊｏｕｒｎ．Ｇ
ｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３８： ２４９−２５
９ （１９９２））。
【００１７】このワクチンは最高頻度の血清型からの２
３種の多糖を含む。このワクチンは複雑であること以外
に、莢膜多糖の低免疫原性による重大な欠点がある。
３種の多糖を含む。このワクチンは複雑であること以外
に、莢膜多糖の低免疫原性による重大な欠点がある。
【００１８】従って、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｕｉｓの病因に関与すると思われる特定の因子を決定す
るために多数の試みがなされている。
ｕｉｓの病因に関与すると思われる特定の因子を決定す
るために多数の試みがなされている。
【００１９】潜在的ビルレンス因子として赤血球凝集素
及びフィブリエが報告されているが、病因におけるそれ
らの厳密な役割又は機能は未知であり、夫々の分子又は
タンパク質は同定されていない（Ｊａｃｑｕｅｓら；
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２： ２８３３−２８３
８ （１９９０）， Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら；Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８： ２１５６−２
１５８ （１９９０））。
及びフィブリエが報告されているが、病因におけるそれ
らの厳密な役割又は機能は未知であり、夫々の分子又は
タンパク質は同定されていない（Ｊａｃｑｕｅｓら；
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２： ２８３３−２８３
８ （１９９０）， Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら；Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８： ２１５６−２
１５８ （１９９０））。
【００２０】これまでに次の４種のタンパク質が潜在的
ビルレンス因子として提案されている。
ビルレンス因子として提案されている。
【００２１】ａ）４４ｋＤタンパク質（Ｇｏｔｔｓｃｈ
ａｌｋら； Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂ．３０： ５９−７
１ （１９９２））、 ｂ）９４ｋＤタンパク質（Ｈｏｌｔら； Ｊ．Ｃｏｍ
ｐ．Ｐａｔｈ． １００３： ８５−９４ （１９９
０））、 ｃ）１１０ｋＤタンパク質（ＥＦ：細胞外因子）（Ｖｅ
ｃｈｔら； Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ５９： ３
１５６−３１６２ （１９９１）， Ｖｅｃｈｔら；
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ６０： ５５０−５５６
（１９９２），Ｓｍｉｔｈ及びＶｅｃｈｔ； ＰＣＴ
出願ＷＯ９２／１６６３０）、 ｄ）１３６ｋＤタンパク質（ＭＲＰ：ムラミニダーゼ放
出タンパク質）（Ｖｅｃｈｔら； Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ．５９： ３１５６−３１６２ （１９９１），
Ｖｅｃｈｔら； Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：
５５０−５５６（１９９２）， Ｓｍｉｔｈ及びＶｅ
ｃｈｔ； ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１６６３０）。
ａｌｋら； Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂ．３０： ５９−７
１ （１９９２））、 ｂ）９４ｋＤタンパク質（Ｈｏｌｔら； Ｊ．Ｃｏｍ
ｐ．Ｐａｔｈ． １００３： ８５−９４ （１９９
０））、 ｃ）１１０ｋＤタンパク質（ＥＦ：細胞外因子）（Ｖｅ
ｃｈｔら； Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ５９： ３
１５６−３１６２ （１９９１）， Ｖｅｃｈｔら；
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ６０： ５５０−５５６
（１９９２），Ｓｍｉｔｈ及びＶｅｃｈｔ； ＰＣＴ
出願ＷＯ９２／１６６３０）、 ｄ）１３６ｋＤタンパク質（ＭＲＰ：ムラミニダーゼ放
出タンパク質）（Ｖｅｃｈｔら； Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ．５９： ３１５６−３１６２ （１９９１），
Ｖｅｃｈｔら； Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：
５５０−５５６（１９９２）， Ｓｍｉｔｈ及びＶｅ
ｃｈｔ； ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１６６３０）。
【００２２】４４ｋＤタンパク質はＳ．ｓｕｉｓ血清型
２の病原株から検出され、非病原性突然変異株には存在
しないように思われた。４４ｋＤタンパク質を欠失する
突然変異株に対する抗血清は、親株に対する十分な防御
を得るためには不十分であった。従って、このタンパク
質はビルレンスに関与すると仮定される。
２の病原株から検出され、非病原性突然変異株には存在
しないように思われた。４４ｋＤタンパク質を欠失する
突然変異株に対する抗血清は、親株に対する十分な防御
を得るためには不十分であった。従って、このタンパク
質はビルレンスに関与すると仮定される。
【００２３】Ｓ．ｓｕｉｓ血清型２の９４ｋＤタンパク
に対するウサギ抗血清は、マウスにおいて同種抗原投与
に対する防御を誘発することが判明した。
に対するウサギ抗血清は、マウスにおいて同種抗原投与
に対する防御を誘発することが判明した。
【００２４】１１０ｋＤ及び１３６ｋＤタンパク質は病
原性の高い株には存在するが、非病原性株には存在しな
いようであり、１１０ｋＤタンパク質は病原性の低い株
には存在しないようである。
原性の高い株には存在するが、非病原性株には存在しな
いようであり、１１０ｋＤタンパク質は病原性の低い株
には存在しないようである。
【００２５】従って、１１０ｋＤ及び１３６ｋＤタンパ
ク質は病因に関与すると予想される。他方、これらのタ
ンパク質の単離物に基づく防御実験は未だに公表されて
いない。
ク質は病因に関与すると予想される。他方、これらのタ
ンパク質の単離物に基づく防御実験は未だに公表されて
いない。
【００２６】要約すると、これまでに同定された全潜在
的ビルレンス因子のうちで血清型２に対する防御に関与
することが示されているのは４４ｋＤ及び９４ｋＤタン
パク質のみである。この防御はマウスの同種抗原投与で
しか実証されていない。
的ビルレンス因子のうちで血清型２に対する防御に関与
することが示されているのは４４ｋＤ及び９４ｋＤタン
パク質のみである。この防御はマウスの同種抗原投与で
しか実証されていない。
【００２７】更に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕ
ｉｓ血清型２株ではこれまでに上記４種のタンパク質の
存在しか示されていない。
ｉｓ血清型２株ではこれまでに上記４種のタンパク質の
存在しか示されていない。
【００２８】上述のように、多数の異なる血清型が存在
するので、血清型から独立し且つ血清学的に交差反応性
の防御抗原がワクチンの主成分として明らかに好適であ
る。このような抗原はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｕｉｓでは報告されていない。
するので、血清型から独立し且つ血清学的に交差反応性
の防御抗原がワクチンの主成分として明らかに好適であ
る。このような抗原はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｕｉｓでは報告されていない。
【００２９】
【課題を解決するための手段】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｓｕｉｓの株には、チオールにより活性化され
得、コレステロールにより阻害され得且つ溶血活性を示
す分子量約５４ｋＤのポリペプチドを分泌するものがあ
ることが意外にも知見された。
ｕｓ ｓｕｉｓの株には、チオールにより活性化され
得、コレステロールにより阻害され得且つ溶血活性を示
す分子量約５４ｋＤのポリペプチドを分泌するものがあ
ることが意外にも知見された。
【００３０】全ての溶血毒素は膜完全性及び／又は機能
を破壊することにより哺乳動物細胞を損傷させる現象を
生じさせる。この破壊は細胞膜に一旦取り込まれた毒素
のオリゴマー形態による孔構造形成によると予想され
る。
を破壊することにより哺乳動物細胞を損傷させる現象を
生じさせる。この破壊は細胞膜に一旦取り込まれた毒素
のオリゴマー形態による孔構造形成によると予想され
る。
【００３１】本発明の溶血ポリペプチドはチオール活性
化毒素であることが判明した。チオール活性化毒素は還
元状態のみで活性であり、酸化後に可逆的に活性を失う
（Ｓｍｙｔｈ，Ｃ．Ｊ．及びＤｕｎｃａｎ，Ｊ．Ｌ．；
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｊｅｌｊａｓｚｅｗｉｃｚ，
Ｊ．及びＷａｄｓｔｒｏｍ，Ｔ（編） Ｌｏｎｄｏ
ｎ， ＡｃｅｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ： １２９−１８３
（１９７８））。
化毒素であることが判明した。チオール活性化毒素は還
元状態のみで活性であり、酸化後に可逆的に活性を失う
（Ｓｍｙｔｈ，Ｃ．Ｊ．及びＤｕｎｃａｎ，Ｊ．Ｌ．；
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｊｅｌｊａｓｚｅｗｉｃｚ，
Ｊ．及びＷａｄｓｔｒｏｍ，Ｔ（編） Ｌｏｎｄｏ
ｎ， ＡｃｅｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ： １２９−１８３
（１９７８））。
【００３２】チオール基の役割は解明されていないが、
膜を傷つけるために必須の配列モチーフの重要な部分で
あると推定される。
膜を傷つけるために必須の配列モチーフの重要な部分で
あると推定される。
【００３３】ある種の溶血素の細胞溶解作用の背後の機
序から判断すると、溶血ポリペプチドは哺乳動物細胞膜
内でコレステロールに結合すると仮定される。タンパク
質は細胞に一旦結合すると、脂質二重膜に侵入する。こ
うしてオリゴマー溶血素複合体が形成され、トランスメ
ンブラン孔を形成すると仮定される。
序から判断すると、溶血ポリペプチドは哺乳動物細胞膜
内でコレステロールに結合すると仮定される。タンパク
質は細胞に一旦結合すると、脂質二重膜に侵入する。こ
うしてオリゴマー溶血素複合体が形成され、トランスメ
ンブラン孔を形成すると仮定される。
【００３４】本発明のポリペプチドの溶血活性はコレス
テロールにより阻害され得る溶血素群に属することが立
証された。コレステロールは溶血素がそれに感受性の細
胞と結合する際に重要な役割を果たすと思われる。コレ
ステロールが細胞との結合における毒素の主要結合部位
であるような数種のモデルが提案されている。遊離コレ
ステロールは細胞溶解活性の強力な阻害剤であり、この
ことは毒素上のステロール結合部位が（遊離）コレステ
ロールにより占められるならばもはや（膜結合）コレス
テロールに結合し得ないという事実により説明すること
ができる（Ｂｏｕｌｎｏｉｓら； Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．５： ２６１１−２６１６（１９９１））。
テロールにより阻害され得る溶血素群に属することが立
証された。コレステロールは溶血素がそれに感受性の細
胞と結合する際に重要な役割を果たすと思われる。コレ
ステロールが細胞との結合における毒素の主要結合部位
であるような数種のモデルが提案されている。遊離コレ
ステロールは細胞溶解活性の強力な阻害剤であり、この
ことは毒素上のステロール結合部位が（遊離）コレステ
ロールにより占められるならばもはや（膜結合）コレス
テロールに結合し得ないという事実により説明すること
ができる（Ｂｏｕｌｎｏｉｓら； Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．５： ２６１１−２６１６（１９９１））。
【００３５】本発明の溶血ポリペプチドは約５４ｋＤの
推定分子量を有する。この分子量は実施例２に記載する
ようなポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する標準
化方法に従って決定した。図１のレーンＣはマーカー分
子（レーンＡ及びＤ）の間で精製ポリペプチドを示す。
推定分子量を有する。この分子量は実施例２に記載する
ようなポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する標準
化方法に従って決定した。図１のレーンＣはマーカー分
子（レーンＡ及びＤ）の間で精製ポリペプチドを示す。
【００３６】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓの
株の１種であるＰ１／７株の溶血ポリペプチドは更に、
そのＮ末端アミノ酸配列の決定により特徴付けられた。
配列番号１はポリペプチドのＮ末端配列を示す。溶血ポ
リペプチドは数種のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕ
ｉｓ株から単離することができるが、全株から単離でき
るわけではない。夫々の溶血ペプチドを産生するＳ．ｓ
ｕｉｓ株における溶血ポリペプチドをコードする遺伝子
の核酸配列には僅かな改変が存在してもよい。これらの
改変により形成される新しいトリプレットが同一アミノ
酸をコードするのであればポリペプチドのアミノ酸配列
に何ら影響し得ない。例えばロイシンをコードするトリ
プレットＣＴＧ中のＧが同様にロイシンをコードするＣ
により置換された場合がこれに相当する。一方、ＴがＣ
により置換されるならば、新たに形成されるトリプレッ
トはロイシンでなくプロリンをコードする。この結果、
溶血ポリペプチドのアミノ酸配列に変異が生じる。
株の１種であるＰ１／７株の溶血ポリペプチドは更に、
そのＮ末端アミノ酸配列の決定により特徴付けられた。
配列番号１はポリペプチドのＮ末端配列を示す。溶血ポ
リペプチドは数種のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕ
ｉｓ株から単離することができるが、全株から単離でき
るわけではない。夫々の溶血ペプチドを産生するＳ．ｓ
ｕｉｓ株における溶血ポリペプチドをコードする遺伝子
の核酸配列には僅かな改変が存在してもよい。これらの
改変により形成される新しいトリプレットが同一アミノ
酸をコードするのであればポリペプチドのアミノ酸配列
に何ら影響し得ない。例えばロイシンをコードするトリ
プレットＣＴＧ中のＧが同様にロイシンをコードするＣ
により置換された場合がこれに相当する。一方、ＴがＣ
により置換されるならば、新たに形成されるトリプレッ
トはロイシンでなくプロリンをコードする。この結果、
溶血ポリペプチドのアミノ酸配列に変異が生じる。
【００３７】アミノ酸配列中の変異は１種以上のアミノ
酸が機能的等価物により置換された結果であり得、ある
いはより低頻度であるが終止コドンの導入の結果であっ
たり、核酸配列中の欠失／挿入の場合には１種以上のア
ミノ酸の挿入又は欠失の結果であったりする。多くの場
合は機能的等価物による置換である。Ｎｅｕｒａｔｈら
（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ， ＮｅｗＹＯｒｋ （１９７９）， １４
頁、図６）により記載されている例は、アミノ酸アラニ
ンからセリンへの置換Ａｌａ／Ｓｅｒ、又はＶａｌ／Ｉ
ｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ等である。上記機能的に等価なア
ミノ酸による置換をもたらす変異以外に、１種のアミノ
酸を機能的等価物ではない別のアミノ酸により置換した
変異もあり得る。この種の変異は、その空間的折り畳み
に僅かな改変を有するタンパク質を生成し得るという点
のみが、機能的等価物による置換とする。
酸が機能的等価物により置換された結果であり得、ある
いはより低頻度であるが終止コドンの導入の結果であっ
たり、核酸配列中の欠失／挿入の場合には１種以上のア
ミノ酸の挿入又は欠失の結果であったりする。多くの場
合は機能的等価物による置換である。Ｎｅｕｒａｔｈら
（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ， ＮｅｗＹＯｒｋ （１９７９）， １４
頁、図６）により記載されている例は、アミノ酸アラニ
ンからセリンへの置換Ａｌａ／Ｓｅｒ、又はＶａｌ／Ｉ
ｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ等である。上記機能的に等価なア
ミノ酸による置換をもたらす変異以外に、１種のアミノ
酸を機能的等価物ではない別のアミノ酸により置換した
変異もあり得る。この種の変異は、その空間的折り畳み
に僅かな改変を有するタンパク質を生成し得るという点
のみが、機能的等価物による置換とする。
【００３８】言うまでもなく、ポリペプチドの免疫原活
性が維持されるように溶血ポリペプチドのアミノ酸配列
に変異をもたらすように溶血ポリペプチドをコードする
核酸配列が変異している場合も本発明の範囲に含まれ
る。
性が維持されるように溶血ポリペプチドのアミノ酸配列
に変異をもたらすように溶血ポリペプチドをコードする
核酸配列が変異している場合も本発明の範囲に含まれ
る。
【００３９】本発明は更に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｓｕｉｓ感染からブタを防御することが可能であ
り、上記溶血ポリペプチド又はＳ．ｓｕｉｓの溶血ポリ
ペプチドに対して免疫応答を誘発することが可能なその
一部を含むワクチンに係る。このようなワクチンは例え
ば本発明のポリペプチド又はＳ．ｓｕｉｓの溶血ポリペ
プチドに対する免疫応答を誘発することが可能なその一
部に似せた合成ポリペプチドを使用することにより製造
することができる。
ｓ ｓｕｉｓ感染からブタを防御することが可能であ
り、上記溶血ポリペプチド又はＳ．ｓｕｉｓの溶血ポリ
ペプチドに対して免疫応答を誘発することが可能なその
一部を含むワクチンに係る。このようなワクチンは例え
ば本発明のポリペプチド又はＳ．ｓｕｉｓの溶血ポリペ
プチドに対する免疫応答を誘発することが可能なその一
部に似せた合成ポリペプチドを使用することにより製造
することができる。
【００４０】このようなワクチンの別の製造方法は細菌
培養物からの溶血ポリペプチドの生化学的精製である。
この方法は、例えば細菌の遠心分離と、溶血ポリペプチ
ドを他の成分から分離するためのゲル濾過カラムの使用
により実施することができる。例えば選択的硫安沈殿に
より精製した後、遠心分離し、ペレットを適切な緩衝液
に溶解させてもよい。
培養物からの溶血ポリペプチドの生化学的精製である。
この方法は、例えば細菌の遠心分離と、溶血ポリペプチ
ドを他の成分から分離するためのゲル濾過カラムの使用
により実施することができる。例えば選択的硫安沈殿に
より精製した後、遠心分離し、ペレットを適切な緩衝液
に溶解させてもよい。
【００４１】このようなワクチンは例えば分子クローニ
ング法により製造することもできる。この方法では、本
発明のポリペプチド又はＳ．ｓｕｉｓの溶血ポリペプチ
ドに対する免疫応答を誘発することが可能なその一部を
コードする核酸配列を発現ベクターにクローニングし、
その後、適切な発現系で発現させる。その後、発現産物
をワクチン中で使用することができる。使用可能な発現
系としては、細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物細胞
発現系を挙げることができる。
ング法により製造することもできる。この方法では、本
発明のポリペプチド又はＳ．ｓｕｉｓの溶血ポリペプチ
ドに対する免疫応答を誘発することが可能なその一部を
コードする核酸配列を発現ベクターにクローニングし、
その後、適切な発現系で発現させる。その後、発現産物
をワクチン中で使用することができる。使用可能な発現
系としては、細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物細胞
発現系を挙げることができる。
【００４２】ポリペプチドの別の製造方法は、ポリペプ
チドの遺伝情報を適切なウイルスベクターにクローニン
グし、ウイルスの宿主細胞を使用してタンパク質を発現
させる方法である。このような系は例えばワクチニアウ
イルスベクターと感受性哺乳動物細胞の組み合わせ、又
はバキュロウイルスベクターとＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の組み合わせである。その後、
発現されたポリペプチドを含む細胞溶解物をそのまま又
は精製してワクチンベースとして使用することができ
る。
チドの遺伝情報を適切なウイルスベクターにクローニン
グし、ウイルスの宿主細胞を使用してタンパク質を発現
させる方法である。このような系は例えばワクチニアウ
イルスベクターと感受性哺乳動物細胞の組み合わせ、又
はバキュロウイルスベクターとＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の組み合わせである。その後、
発現されたポリペプチドを含む細胞溶解物をそのまま又
は精製してワクチンベースとして使用することができ
る。
【００４３】更に別のアプローチは、ブタを宿主動物と
するウイルスを所謂組換えキャリヤー生ウイルス（ＬＲ
Ｃ：Ｌｉｖｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃａｒｒｉｅ
ｒ）として使用する方法である。このＬＲＣは付加的遺
伝情報をクローニングしたウイルスである。この組換え
ウイルスに感染した動物はベクターウイルスの免疫原に
対してのみならず、その遺伝コードが組換えウイルスに
付加的にクローニングされるポリペプチドの免疫原部分
に対しても免疫原応答を生じる。
するウイルスを所謂組換えキャリヤー生ウイルス（ＬＲ
Ｃ：Ｌｉｖｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃａｒｒｉｅ
ｒ）として使用する方法である。このＬＲＣは付加的遺
伝情報をクローニングしたウイルスである。この組換え
ウイルスに感染した動物はベクターウイルスの免疫原に
対してのみならず、その遺伝コードが組換えウイルスに
付加的にクローニングされるポリペプチドの免疫原部分
に対しても免疫原応答を生じる。
【００４４】外来ブタ病原性生物からの遺伝情報を運搬
するための組換えキャリヤー生ウイルスとして特に有用
なウイルスは偽狂犬病ウイルスである。このウイルスは
例えば偽狂犬病／豚コレラウイルス混合ワクチン接種の
ためのＬＲＣとして既に使用され、成功している。
するための組換えキャリヤー生ウイルスとして特に有用
なウイルスは偽狂犬病ウイルスである。このウイルスは
例えば偽狂犬病／豚コレラウイルス混合ワクチン接種の
ためのＬＲＣとして既に使用され、成功している。
【００４５】好適形態によると、本発明のワクチンは更
に他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ免疫原を含
む。
に他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ免疫原を含
む。
【００４６】Ｓ．ｓｕｉｓ血清型２溶血ポリペプチドに
対する抗血清はその血清型に関係なく他の全溶血産生
Ｓ．ｓｕｉｓ株の溶血素に対して反応性であることが判
明した。
対する抗血清はその血清型に関係なく他の全溶血産生
Ｓ．ｓｕｉｓ株の溶血素に対して反応性であることが判
明した。
【００４７】これは上記４４ｋＤ、９４ｋＤ、１１０及
び１３６ｋＤＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓポ
リペプチドでは立証されていない。
び１３６ｋＤＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓポ
リペプチドでは立証されていない。
【００４８】しかしながら、これらのうちの１種又は他
の任意のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ免疫原
を付加的に含有する本発明のワクチンは、更に優れた効
果を有する。この高い効果は例えば相乗効果の結果であ
ると思われる。従って、抗原負荷が更に低く、より有効
なワクチンを製造することができる。
の任意のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ免疫原
を付加的に含有する本発明のワクチンは、更に優れた効
果を有する。この高い効果は例えば相乗効果の結果であ
ると思われる。従って、抗原負荷が更に低く、より有効
なワクチンを製造することができる。
【００４９】より好適な形態によると、本発明のワクチ
ンは更に本発明のポリペプチドに結合した担体を含む。
担体としては、アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ
血清アルブミンのような他の分子のみならず、複合糖分
子も使用できる。
ンは更に本発明のポリペプチドに結合した担体を含む。
担体としては、アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ
血清アルブミンのような他の分子のみならず、複合糖分
子も使用できる。
【００５０】更に好適な形態によると、本発明のワクチ
ンは本発明のポリペプチドに結合した莢膜多糖を含む。
ンは本発明のポリペプチドに結合した莢膜多糖を含む。
【００５１】ポリペプチドと炭水化物との共有結合方法
は例えばＤｉｃｋ，Ｗ．Ｅ．及びＢｅｕｒｔ，Ｍ．；
Ｃｏｎｔｒｉｂ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１０： ４８−１１４ （１９８９）により記載さ
れている。
は例えばＤｉｃｋ，Ｗ．Ｅ．及びＢｅｕｒｔ，Ｍ．；
Ｃｏｎｔｒｉｂ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１０： ４８−１１４ （１９８９）により記載さ
れている。
【００５２】当然のことながら、他の種類の担体又はポ
リペプチドと炭水化物の他の結合方法も本発明の範囲に
含まれる。
リペプチドと炭水化物の他の結合方法も本発明の範囲に
含まれる。
【００５３】別の態様によると、本発明のワクチンは更
に他のブタ病原生物及びウイルスからの抗原を含む。こ
のような生物及びウイルスは例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、偽
狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパ
ーボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、
大腸菌、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏ
ｐａｔｈｉａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏ
ｃｉｄａ及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓ
ｅｐｔｉｃａである。
に他のブタ病原生物及びウイルスからの抗原を含む。こ
のような生物及びウイルスは例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、偽
狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパ
ーボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、
大腸菌、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏ
ｐａｔｈｉａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏ
ｃｉｄａ及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓ
ｅｐｔｉｃａである。
【００５４】本発明のワクチンは好適形態によると更に
アジュバントを含有し得る。アジュバントは一般に宿主
の免疫応答を非特異的に追加免疫する物質からなる。種
々多数のアジュバントが当業者に公知である。アジュバ
ントの例はフロイント完全アジュバント、フロイント不
完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポ
リマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ Ａ（登録商
標）、鉱物油（例えばＢａｙｏｌ（登録商標）又はＭａ
ｒｋｏｌ（登録商標））、植物油及びＣａｒｂｏｐｏｌ
（登録商標）（ホモポリマー）、又はＤｉｌｕｖａｃ
（登録商標）Ｆｏｒｔｅである。
アジュバントを含有し得る。アジュバントは一般に宿主
の免疫応答を非特異的に追加免疫する物質からなる。種
々多数のアジュバントが当業者に公知である。アジュバ
ントの例はフロイント完全アジュバント、フロイント不
完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポ
リマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ Ａ（登録商
標）、鉱物油（例えばＢａｙｏｌ（登録商標）又はＭａ
ｒｋｏｌ（登録商標））、植物油及びＣａｒｂｏｐｏｌ
（登録商標）（ホモポリマー）、又はＤｉｌｕｖａｃ
（登録商標）Ｆｏｒｔｅである。
【００５５】ワクチンは更に所謂「ベヒクル（Ｖｅｈｉ
ｃｌｅ）」を含有し得る。ベヒクルはポリペプチドが共
有結合せずに付着する化合物である。しばしば使用され
るベヒクル化合物は例えば水酸化アルミニウム、リン酸
アルミニウム、酸化アルミニウム、シリカ、カオリン及
びベントナイトである。
ｃｌｅ）」を含有し得る。ベヒクルはポリペプチドが共
有結合せずに付着する化合物である。しばしば使用され
るベヒクル化合物は例えば水酸化アルミニウム、リン酸
アルミニウム、酸化アルミニウム、シリカ、カオリン及
びベントナイトである。
【００５６】抗原が部分的にベヒクルに埋包されるこの
ようなベヒクルの特殊形態は所謂ＩＳＣＯＭ（ＥＰ１０
９．９４２， ＥＰ１８０．５６４， ＥＰ２４２．３
８０）である。
ようなベヒクルの特殊形態は所謂ＩＳＣＯＭ（ＥＰ１０
９．９４２， ＥＰ１８０．５６４， ＥＰ２４２．３
８０）である。
【００５７】更に、ワクチンは１種以上の適切な表面活
性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎを
含有し得る。
性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎを
含有し得る。
【００５８】多くの場合、ワクチンを安定剤と混合し、
例えば分解し易いポリペプチドが分解しないようにした
り、ワクチンの寿命を強化したり、凍結乾燥効率を改善
する。有用な安定剤は例えばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉ
ｋら； Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５９： ５０
９ （１９５０））、炭水化物（例えばソルビトール、
マンニトール、トレハロース、澱粉、スクロース、デキ
ストラン又はグルコース）、タンパク質（例えばアルブ
ミン又はカゼイン）又はその分解産物、及び緩衝剤（例
えばアルカリ金属リン酸塩）である。更に、ワクチンを
生理学的に許容可能な希釈剤に懸濁してもよい。
例えば分解し易いポリペプチドが分解しないようにした
り、ワクチンの寿命を強化したり、凍結乾燥効率を改善
する。有用な安定剤は例えばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉ
ｋら； Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５９： ５０
９ （１９５０））、炭水化物（例えばソルビトール、
マンニトール、トレハロース、澱粉、スクロース、デキ
ストラン又はグルコース）、タンパク質（例えばアルブ
ミン又はカゼイン）又はその分解産物、及び緩衝剤（例
えばアルカリ金属リン酸塩）である。更に、ワクチンを
生理学的に許容可能な希釈剤に懸濁してもよい。
【００５９】言うまでもなく、アジュバントを添加し、
ベヒクル化合物又は希釈剤を添加し、ポリペプチドを乳
化又は安定化する他の方法も本発明に含まれる。
ベヒクル化合物又は希釈剤を添加し、ポリペプチドを乳
化又は安定化する他の方法も本発明に含まれる。
【００６０】別の態様によると、本発明のポリペプチド
又はその抗原部分に対して単一特異的に反応性の抗体を
使用し、受動的免疫を付与する。
又はその抗原部分に対して単一特異的に反応性の抗体を
使用し、受動的免疫を付与する。
【００６１】単一特異的抗体は、本発明の５４ｋＤポリ
ペプチド又はその一部と反応することが特異的に可能で
あり、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ抗原
に対しては特異的に反応しない抗体である。
ペプチド又はその一部と反応することが特異的に可能で
あり、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ抗原
に対しては特異的に反応しない抗体である。
【００６２】病原体に対する抗体を受動的免疫感作で首
尾よく使用することができる。この種の療法の利点は、
感染時投与に抗体を利用できるという点にある。従っ
て、宿主の免疫系が活性化され、十分に高い防御レベル
を生じるまで待つ必要がなく、時間の損失がない。特に
感染が既に発生している場合や疾患が進行中の場合に抗
体を投与すると、病原体及び病原体により生成される毒
素から動物を即座に回復させることができる。従って、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ感染後にＳ．ｓ
ｕｉｓ溶血ポリペプチドに対する抗体を利用してブタを
疾患から防御することが可能なワクチンも本発明の範囲
に含まれる。
尾よく使用することができる。この種の療法の利点は、
感染時投与に抗体を利用できるという点にある。従っ
て、宿主の免疫系が活性化され、十分に高い防御レベル
を生じるまで待つ必要がなく、時間の損失がない。特に
感染が既に発生している場合や疾患が進行中の場合に抗
体を投与すると、病原体及び病原体により生成される毒
素から動物を即座に回復させることができる。従って、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ感染後にＳ．ｓ
ｕｉｓ溶血ポリペプチドに対する抗体を利用してブタを
疾患から防御することが可能なワクチンも本発明の範囲
に含まれる。
【００６３】本発明は更に、本発明のポリペプチドを医
薬的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤と混合
することからなる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕ
ｉｓによる感染に対して哺乳動物を防御することが可能
なワクチンの製造方法も提供する。
薬的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤と混合
することからなる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕ
ｉｓによる感染に対して哺乳動物を防御することが可能
なワクチンの製造方法も提供する。
【００６４】
【実施例】実施例１ 細菌株 Ｓ．ｓｕｉｓ タイプ２株Ｐ１／７及び６８８／９は英
国、ケンブリッジ大学のＴ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ博士に
より提供された。タイプ２株４００５、Ｄ２８２、３９
２１、３９７７、３８８９及びＴ１５はオランダ国、Ｌ
ｅｙｓｔａｄ，ＣＤＩ−ＤＬＯのＵ．Ｖｅｃｈｔ博士か
ら入手した。タイプ７株１０６８１、１０７２７及び１
４３９１はデンマーク、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｉｎｔ
ｅｒｖｅｔＳｃａｎｄｉｎａｖｉａのＢ．Ｎｉｅｌｓｅ
ｎ博士により提供された。参照株１〜２２はデンマー
ク、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕ
ｍＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＪ．Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ博士
から入手した。
国、ケンブリッジ大学のＴ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ博士に
より提供された。タイプ２株４００５、Ｄ２８２、３９
２１、３９７７、３８８９及びＴ１５はオランダ国、Ｌ
ｅｙｓｔａｄ，ＣＤＩ−ＤＬＯのＵ．Ｖｅｃｈｔ博士か
ら入手した。タイプ７株１０６８１、１０７２７及び１
４３９１はデンマーク、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｉｎｔ
ｅｒｖｅｔＳｃａｎｄｉｎａｖｉａのＢ．Ｎｉｅｌｓｅ
ｎ博士により提供された。参照株１〜２２はデンマー
ク、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕ
ｍＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＪ．Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ博士
から入手した。
【００６５】株Ｂ１０、血清型１はオランダ国、Ｄｅｖ
ｅｎｔｅｒの“Ｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄｓｄｉｅｎｔ ｖ
ｏｏｒ ｄｉｅｒｅｎ， Ｏｏｓｔ−Ｎｅｄｅｒｌａｎ
ｄ”から入手した最新のフィールド単離株である。
ｅｎｔｅｒの“Ｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄｓｄｉｅｎｔ ｖ
ｏｏｒ ｄｉｅｒｅｎ， Ｏｏｓｔ−Ｎｅｄｅｒｌａｎ
ｄ”から入手した最新のフィールド単離株である。
【００６６】株ＮＶ９２１０９血清型８、２２０８９Ｋ
Ｍ血清型９及び２２０８９１ＧＶ血清型１４は疾患ブタ
からの最新フィールド単離株である。
Ｍ血清型９及び２２０８９１ＧＶ血清型１４は疾患ブタ
からの最新フィールド単離株である。
【００６７】細菌培養物 細菌株をヒツジ血液寒天上で画線し、２４時間３７℃で
培養した。バッチ培養物中の溶血素産生を定量するため
に、数個のコロニーを１００ｍｌ トッド−ヒューイッ
トブロス（Ｄｉｆｃｏ）に接種し、指数増殖期の終わり
まで（通常５〜６時間）３７℃で培養した。次に１０，
０００×ｇで１０分間遠心分離により細胞を除去し、上
清を使用時まで−２０℃で保存した。
培養した。バッチ培養物中の溶血素産生を定量するため
に、数個のコロニーを１００ｍｌ トッド−ヒューイッ
トブロス（Ｄｉｆｃｏ）に接種し、指数増殖期の終わり
まで（通常５〜６時間）３７℃で培養した。次に１０，
０００×ｇで１０分間遠心分離により細胞を除去し、上
清を使用時まで−２０℃で保存した。
【００６８】溶血素阻害試験 血清の溶血素阻害力価を決定するために、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ７．４）を希釈剤として使用し、
深いウェルを有するタイタープレート中で試験血清の連
鎖２倍希釈液（２μｌ）を調製した。次に、２5溶血単
位を含有する溶血素溶液７５μｌを各ウェルに加えた。
２０℃で１０分間インキュベーション後、２％（洗浄）
ウマ赤血球懸濁液１５０μｌを各ウェルに加え、溶血活
性の滴定に関して上述したように試験を行った。溶血の
５０％阻害を最小限度で生じる最高希釈度として力価を
決定した。１：１２８に予備希釈した７５μｌの血清Ｐ
３９９及び種々の株の未希釈培養物上清７５μｌを使用
して、（Ｓ．ｓｕｉｓタイプ２から誘導される）精製溶
血素に対する特異的ブタ血清Ｐ３９９が種々の（血清
型）株により生じる溶血活性を阻害する能力を単一ウェ
ル中で試験した。その後、上記のように試験を完了し
た。同様に１：１２８に予備希釈した予備免疫血清を対
照（最大溶血）として使用した。血清Ｐ３９９が予備免
疫血清に比較して溶血を＞５０％阻害した場合には交差
中和が明白であった。最大溶血（予備免疫血清）がバッ
クグラウンド（血清Ｐ３９９）の２倍に達しないので、
溶血素力価＜２4のサンプルはこの試験では結果を与え
ない。
ｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ７．４）を希釈剤として使用し、
深いウェルを有するタイタープレート中で試験血清の連
鎖２倍希釈液（２μｌ）を調製した。次に、２5溶血単
位を含有する溶血素溶液７５μｌを各ウェルに加えた。
２０℃で１０分間インキュベーション後、２％（洗浄）
ウマ赤血球懸濁液１５０μｌを各ウェルに加え、溶血活
性の滴定に関して上述したように試験を行った。溶血の
５０％阻害を最小限度で生じる最高希釈度として力価を
決定した。１：１２８に予備希釈した７５μｌの血清Ｐ
３９９及び種々の株の未希釈培養物上清７５μｌを使用
して、（Ｓ．ｓｕｉｓタイプ２から誘導される）精製溶
血素に対する特異的ブタ血清Ｐ３９９が種々の（血清
型）株により生じる溶血活性を阻害する能力を単一ウェ
ル中で試験した。その後、上記のように試験を完了し
た。同様に１：１２８に予備希釈した予備免疫血清を対
照（最大溶血）として使用した。血清Ｐ３９９が予備免
疫血清に比較して溶血を＞５０％阻害した場合には交差
中和が明白であった。最大溶血（予備免疫血清）がバッ
クグラウンド（血清Ｐ３９９）の２倍に達しないので、
溶血素力価＜２4のサンプルはこの試験では結果を与え
ない。
【００６９】実施例２ 溶血素の精製 株Ｐ１／７の一晩培養物２５０ｍｌを３７℃のトッド−
ヒューイットブロス１２リットル中で嫌気性条件下で６
時間成長させた後、細胞を連続フロー遠心分離により除
去した。培養物上清を４℃に冷却し、０．８μｍフィル
ターに通した後、ＰＴＣＧ１０，０００ＮＭＷＬフィル
ターで１５０ｍｌに濃縮した。０．２μｍフィルターを
通した後、１．０ｍｌずつをＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２ゲ
ル濾過カラム（ＦＰＬＣ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加
え、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する４０ｍＭリン酸緩衝
溶液（ｐＨ７．２）で溶離した。０．５ｍｌフラクショ
ンを集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング及
び溶血素試験で分析した。溶血ピーク活性はフラクショ
ン３５〜４５で溶出した（図２）。
ヒューイットブロス１２リットル中で嫌気性条件下で６
時間成長させた後、細胞を連続フロー遠心分離により除
去した。培養物上清を４℃に冷却し、０．８μｍフィル
ターに通した後、ＰＴＣＧ１０，０００ＮＭＷＬフィル
ターで１５０ｍｌに濃縮した。０．２μｍフィルターを
通した後、１．０ｍｌずつをＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２ゲ
ル濾過カラム（ＦＰＬＣ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加
え、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する４０ｍＭリン酸緩衝
溶液（ｐＨ７．２）で溶離した。０．５ｍｌフラクショ
ンを集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング及
び溶血素試験で分析した。溶血ピーク活性はフラクショ
ン３５〜４５で溶出した（図２）。
【００７０】種々のカラムフラクションをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ及びイムノブロッティングで分析した結果、溶血活
性は約５４ｋＤの単一抗原と同時に移動することが判明
した（図３）。溶血フラクション３５〜４５をプール
し、５０％（ＮＨ4）2ＳＯ4で４℃で３時間選択的に沈
殿させることにより微量の汚染物質を除去した。遠心分
離後、ペレットを４０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．
２）２０ｍｌに再懸濁した。この最終調製物はクーマシ
ーブリリアントブルーで染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で
約５４ｋＤの単一ポリペプチド種として出現し（図
１）、β−メルカプトエタノールで還元後に約０．７×
１０6溶血単位／ｍｇの比活性を有していた。
ＧＥ及びイムノブロッティングで分析した結果、溶血活
性は約５４ｋＤの単一抗原と同時に移動することが判明
した（図３）。溶血フラクション３５〜４５をプール
し、５０％（ＮＨ4）2ＳＯ4で４℃で３時間選択的に沈
殿させることにより微量の汚染物質を除去した。遠心分
離後、ペレットを４０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．
２）２０ｍｌに再懸濁した。この最終調製物はクーマシ
ーブリリアントブルーで染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で
約５４ｋＤの単一ポリペプチド種として出現し（図
１）、β−メルカプトエタノールで還元後に約０．７×
１０6溶血単位／ｍｇの比活性を有していた。
【００７１】タンパク質定量 ウシ血清アルブミンを標準として使用してＬｏｗｒｙら
（Ｌｏｗｒｙら； ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２
６５−２７５ （１９５１））の方法によりタンパク質
濃度を測定した。
（Ｌｏｗｒｙら； ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２
６５−２７５ （１９５１））の方法によりタンパク質
濃度を測定した。
【００７２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッテ
ィング Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ．； Ｎａ
ｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５ （１９７０））に
記載の方法に概ね従って９％スラブゲル及びサンプル調
製物中でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ポリ
ペプチドをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染
色するか又はＩｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＶＤＦ膜にエレク
トロブロットした。ブロットをポリクローナルウサギ血
清Ｒ２０８９又はポリクローナルマウス血清Ｍ１８９で
プローブした（抗血清の項参照）。洗浄後、セイヨウワ
サビペルオキシダーゼ−ヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウス
結合体及び基質としてジアミノベンジジンを使用して結
合抗体を可視化した。
ィング Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ．； Ｎａ
ｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５ （１９７０））に
記載の方法に概ね従って９％スラブゲル及びサンプル調
製物中でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ポリ
ペプチドをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染
色するか又はＩｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＶＤＦ膜にエレク
トロブロットした。ブロットをポリクローナルウサギ血
清Ｒ２０８９又はポリクローナルマウス血清Ｍ１８９で
プローブした（抗血清の項参照）。洗浄後、セイヨウワ
サビペルオキシダーゼ−ヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウス
結合体及び基質としてジアミノベンジジンを使用して結
合抗体を可視化した。
【００７３】種々の処理後の溶血活性 全処理とも力価２7を有する４０ｍＭリン酸緩衝塩水溶
液（ｐＨ７．２）中の精製溶血素０．５ｍｌずつを使用
した。
液（ｐＨ７．２）中の精製溶血素０．５ｍｌずつを使用
した。
【００７４】−２０℃、４℃、２０℃、３７℃及び１０
０℃の各温度で溶血素をインキュベーション後に溶血ア
ッセイで温度差の効果を測定した。プロテイナーゼ−Ｋ
効果処理を試験するために、濃縮酵素溶液（２ｍｇ／ｍ
ｌ）５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加え、１０分間２
０℃でインキュベートした。その後、溶血素アッセイで
残留溶血活性を測定した。
０℃の各温度で溶血素をインキュベーション後に溶血ア
ッセイで温度差の効果を測定した。プロテイナーゼ−Ｋ
効果処理を試験するために、濃縮酵素溶液（２ｍｇ／ｍ
ｌ）５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加え、１０分間２
０℃でインキュベートした。その後、溶血素アッセイで
残留溶血活性を測定した。
【００７５】β−メルカプトエタノールによる還元効果
を試験するために、１０％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエ
タノール溶液５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加え、１
０分間２０℃でインキュベートした後、溶血素アッセイ
で活性を試験した。
を試験するために、１０％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエ
タノール溶液５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加え、１
０分間２０℃でインキュベートした後、溶血素アッセイ
で活性を試験した。
【００７６】Ｈ 2Ｏ 2による酸化効果を試験するために、
１０％Ｈ2Ｏ2溶液５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加え
た後、２０℃で１０分間インキュベートした。その後、
溶血素アッセイで残留活性を測定した。
１０％Ｈ2Ｏ2溶液５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加え
た後、２０℃で１０分間インキュベートした。その後、
溶血素アッセイで残留活性を測定した。
【００７７】１０％（ｗ／ｖ）ＴＬＣＫ溶液５μｌを溶
血素溶液０．５ｍｌに加えた後、２０℃で１０分間イン
キュベートすることにより、ＴＬＣＫ（Ｎ−Ａ−ｐ−ト
シル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン、Ｓｉｇｍａ）に
よるチオール基のアルキル化効果を決定した。その後、
溶血素アッセイで残留活性を測定した。
血素溶液０．５ｍｌに加えた後、２０℃で１０分間イン
キュベートすることにより、ＴＬＣＫ（Ｎ−Ａ−ｐ−ト
シル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン、Ｓｉｇｍａ）に
よるチオール基のアルキル化効果を決定した。その後、
溶血素アッセイで残留活性を測定した。
【００７８】（１０％エタノール中）５％コレステロー
ル１０μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加えた後、２０℃
で１０分間インキュベートし、その後、溶血素アッセイ
で残留活性を測定することによりコレステロールの効果
を試験した。
ル１０μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加えた後、２０℃
で１０分間インキュベートし、その後、溶血素アッセイ
で残留活性を測定することによりコレステロールの効果
を試験した。
【００７９】過剰のβ−メルカプトエタノール（２％最
終濃度）を反応混合物の一部に加えた後、２０℃で１０
分間インキュベートし、溶血活性を滴定することによ
り、所定の処理の還元による可逆性を試験した。
終濃度）を反応混合物の一部に加えた後、２０℃で１０
分間インキュベートし、溶血活性を滴定することによ
り、所定の処理の還元による可逆性を試験した。
【００８０】種々の処理が溶血活性に及ぼす効果を表１
に示す。結果から明らかなように、溶血素は熱不安定性
であり、プロテイナーゼ−Ｋ消化、Ｈ2Ｏ2による酸化及
びＴＬＣＫによるアルキル化に対して感受性である。更
に、溶血活性はコレステロールにより阻害される。β−
メルカプトエタノールと共にインキュベーション後、活
性の増加が検出され、Ｈ2Ｏ2で酸化した調製物に過剰の
β−メルカプトエタノールを加えると、溶血活性は回復
した。ＴＬＣＫで処理した調製物に過剰のβ−メルカプ
トエタノールを加えると、溶血活性は部分的に回復し
た。この部分的な回復はＴＬＣＫと反応しなかった酸化
チオール基の存在により説明することができる。温度及
びコレステロールの効果はβ−メルカプトエタノールの
添加により逆転しなかった。
に示す。結果から明らかなように、溶血素は熱不安定性
であり、プロテイナーゼ−Ｋ消化、Ｈ2Ｏ2による酸化及
びＴＬＣＫによるアルキル化に対して感受性である。更
に、溶血活性はコレステロールにより阻害される。β−
メルカプトエタノールと共にインキュベーション後、活
性の増加が検出され、Ｈ2Ｏ2で酸化した調製物に過剰の
β−メルカプトエタノールを加えると、溶血活性は回復
した。ＴＬＣＫで処理した調製物に過剰のβ−メルカプ
トエタノールを加えると、溶血活性は部分的に回復し
た。この部分的な回復はＴＬＣＫと反応しなかった酸化
チオール基の存在により説明することができる。温度及
びコレステロールの効果はβ−メルカプトエタノールの
添加により逆転しなかった。
【００８１】夫々の試薬又は溶血素を省略した二重の試
験サンプルは夫々の方法が溶血活性に及ぼす効果又は試
薬が赤血球に及ぼす効果を夫々示さなかった。
験サンプルは夫々の方法が溶血活性に及ぼす効果又は試
薬が赤血球に及ぼす効果を夫々示さなかった。
【００８２】溶血素に対する種々の赤血球種の感受性 力価２8を有する精製溶血素の還元（０．１％β−メル
カプトエタノール）調製物を使用して種々の赤血球種
（即ちヒト、ウシ、シチメンチョウ、ハト、マウス、ニ
ワトリ、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ及びブタ）の
感受性を試験した。「溶血活性の滴定」とほぼ同様に試
験を行った。全赤血球は溶血素に対してほぼ同等に感受
性であるように思われた。力価は２7（マウス、ネコ及
びシチメンチョウ）〜２10（ヒト）であった。
カプトエタノール）調製物を使用して種々の赤血球種
（即ちヒト、ウシ、シチメンチョウ、ハト、マウス、ニ
ワトリ、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ及びブタ）の
感受性を試験した。「溶血活性の滴定」とほぼ同様に試
験を行った。全赤血球は溶血素に対してほぼ同等に感受
性であるように思われた。力価は２7（マウス、ネコ及
びシチメンチョウ）〜２10（ヒト）であった。
【００８３】Ｎ末端アミノ酸配列 株Ｐ１／７から得た精製溶血素の最初の１６アミノ酸残
基を自動エドマン分解により配列番号１に示すように決
定した。
基を自動エドマン分解により配列番号１に示すように決
定した。
【００８４】種々のＳ．ｓｕｉｓ株中の溶血素分子の分
布 血清型株１〜２２を含む入手可能な全株をトッド−ヒュ
ーイットブロス中で指数増殖期の終わりまで（５〜６時
間）培養し、その後、細胞を遠心分離により除去した。
培養物上清中の溶血素分子の存在を溶血素アッセイ及び
イムノブロッティングで決定した。全部ではないが多く
の株は培養物上清中で種々の量の溶血活性を生じるよう
に思われた（表２）。
布 血清型株１〜２２を含む入手可能な全株をトッド−ヒュ
ーイットブロス中で指数増殖期の終わりまで（５〜６時
間）培養し、その後、細胞を遠心分離により除去した。
培養物上清中の溶血素分子の存在を溶血素アッセイ及び
イムノブロッティングで決定した。全部ではないが多く
の株は培養物上清中で種々の量の溶血活性を生じるよう
に思われた（表２）。
【００８５】低活性のサンプルを含む全溶血サンプルは
コレステロール及びＨ2Ｏ2により阻害されるように思わ
れた。更に、Ｈ2Ｏ2で酸化した調製物に過剰のβ−メル
カプトエタノールを加えると、溶血活性は完全に回復し
た。
コレステロール及びＨ2Ｏ2により阻害されるように思わ
れた。更に、Ｈ2Ｏ2で酸化した調製物に過剰のβ−メル
カプトエタノールを加えると、溶血活性は完全に回復し
た。
【００８６】要約すると、大部分の株は免疫学的及び生
化学的に溶血素に関連する培養物上清中で溶血活性を生
じるように思われ、他の非関連溶血素では何の徴候も検
出されなかった。
化学的に溶血素に関連する培養物上清中で溶血活性を生
じるように思われ、他の非関連溶血素では何の徴候も検
出されなかった。
【００８７】実施例３ ワクチン 精製溶血素、濃縮培養物上清又はプールしたＳｕｐｅｒ
ｏｓｅ−１２カラムフラクション１９〜３１をベースと
する４種のワクチン及びプラシーボワクチンを株Ｐ１／
７から調製した。
ｏｓｅ−１２カラムフラクション１９〜３１をベースと
する４種のワクチン及びプラシーボワクチンを株Ｐ１／
７から調製した。
【００８８】比較のために、精製ＥＦをベースとするワ
クチンを調製した。
クチンを調製した。
【００８９】株Ｂ１０から濃縮培養物上清をベースとす
るワクチンを調製した。
るワクチンを調製した。
【００９０】ワクチンは次のように調製した。
【００９１】均質なマイクロエマルジョンが得られるま
で精製溶血素（４０μｇタンパク質／ｍｌ）をＤｉｌｕ
ｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバントと１：１
で混合した。このワクチンをＶＡＣ−ＳＬＹと命名し
た。
で精製溶血素（４０μｇタンパク質／ｍｌ）をＤｉｌｕ
ｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバントと１：１
で混合した。このワクチンをＶＡＣ−ＳＬＹと命名し
た。
【００９２】濃縮培養物上清を含有するワクチンは、Ｐ
ＴＣＧ濃縮物の一部（１．９ｍｇタンパク質／ｍｌ）を
均質懸濁液が得られるまでＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ
（登録商標）アジュバントと１：１で混合した。このワ
クチンをＶＡＣ−ＣＣＳと命名した。
ＴＣＧ濃縮物の一部（１．９ｍｇタンパク質／ｍｌ）を
均質懸濁液が得られるまでＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ
（登録商標）アジュバントと１：１で混合した。このワ
クチンをＶＡＣ−ＣＣＳと命名した。
【００９３】第３のワクチンは、プール及び濃縮したＳ
ｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムフラクション１９〜３１
（２ｍｇタンパク質／ｍｌを含有）を均質懸濁液が得ら
れるまでＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジ
ュバントと混合（１：１）することにより調製した。カ
ラムフラクション１９〜３１はＳ．ｓｕｉｓ株Ｐ１／７
の細胞外で産生されたタンパク質の大部分を含んでいた
が、本質的に溶血素を含有していなかった。このワクチ
ンをＶＡＣ−ＳＣＦと命名した。
ｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムフラクション１９〜３１
（２ｍｇタンパク質／ｍｌを含有）を均質懸濁液が得ら
れるまでＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジ
ュバントと混合（１：１）することにより調製した。カ
ラムフラクション１９〜３１はＳ．ｓｕｉｓ株Ｐ１／７
の細胞外で産生されたタンパク質の大部分を含んでいた
が、本質的に溶血素を含有していなかった。このワクチ
ンをＶＡＣ−ＳＣＦと命名した。
【００９４】第４のワクチンは、細胞上清を０．２μｍ
フィルターで濾過した後、６０％飽和（ＮＨ4）2ＳＯ4
で０℃で１６時間沈殿させることにより調製した。遠心
分離後、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、培養物上清の約
１００倍の濃度の調製物を得た。
フィルターで濾過した後、６０％飽和（ＮＨ4）2ＳＯ4
で０℃で１６時間沈殿させることにより調製した。遠心
分離後、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、培養物上清の約
１００倍の濃度の調製物を得た。
【００９５】プラシーボワクチンは抗原溶液の代わりに
４０ｍＭリン酸緩衝塩水溶液（ｐＨ７．２）を使用した
以外は上記と同様に調製した。
４０ｍＭリン酸緩衝塩水溶液（ｐＨ７．２）を使用した
以外は上記と同様に調製した。
【００９６】株Ｂ１０を使用し、上述のように６０％飽
和（ＮＨ4）2ＳＯ4で０℃で１６時間沈殿させることに
よりワクチンを調製した。
和（ＮＨ4）2ＳＯ4で０℃で１６時間沈殿させることに
よりワクチンを調製した。
【００９７】（ＮＨ4）2ＳＯ4の漸減勾配を使用して株
Ｐ１／７培養物上清の疎水的相互作用クロマトグラフィ
ー（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフローカラム、
高置換）後にＥＦワクチンを得た。（透析及び希釈後
の）最終精製ＥＦ調製物は約１５０μｇ／ｍｌのＥＦを
含有していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色に
よると、調製物は純度＞９５％であった。
Ｐ１／７培養物上清の疎水的相互作用クロマトグラフィ
ー（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフローカラム、
高置換）後にＥＦワクチンを得た。（透析及び希釈後
の）最終精製ＥＦ調製物は約１５０μｇ／ｍｌのＥＦを
含有していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色に
よると、調製物は純度＞９５％であった。
【００９８】抗血清 次のように精製溶血素に対する特異的ポリクローナルブ
タ血清（Ｐ３９９）を得た。４週齢のブタをワクチンＶ
ＡＣ−ＳＬＹ ２ｍｌで筋肉内経路（頸部）により免疫
感作した。感作から２週間後、同一（量）のワクチン及
びワクチン接種経路を使用してブタに追加免疫した。追
加免疫から２週間後、ブタから採血し、血清を使用時ま
で−２０℃で保存した。
タ血清（Ｐ３９９）を得た。４週齢のブタをワクチンＶ
ＡＣ−ＳＬＹ ２ｍｌで筋肉内経路（頸部）により免疫
感作した。感作から２週間後、同一（量）のワクチン及
びワクチン接種経路を使用してブタに追加免疫した。追
加免疫から２週間後、ブタから採血し、血清を使用時ま
で−２０℃で保存した。
【００９９】マウス防御試験 ４週齢Ｂａｌｂ−Ｃマウスを４群に分け、ＶＡＣ−ＣＣ
Ｓ、ＶＡＣ−ＳＣＦ、ＶＡＣ−ＳＬＹ又はプラシーボワ
クチン０．５ｍｌを皮下経路によりワクチン接種した。
感作から２週間後、同一ワクチン及びワクチン接種経路
を使用してマウスに追加免疫した。追加免疫から２週間
後、４×１０9ＣＦＵ／ｍｌを含有するトッド−ヒュー
イットブロス中の株Ｐ１／７の６時間培養物を使用して
マウスに腹腔内経路で抗原投与（０．５ｍｌ）した。抗
原投与後、致死率を７日間記録した。
Ｓ、ＶＡＣ−ＳＣＦ、ＶＡＣ−ＳＬＹ又はプラシーボワ
クチン０．５ｍｌを皮下経路によりワクチン接種した。
感作から２週間後、同一ワクチン及びワクチン接種経路
を使用してマウスに追加免疫した。追加免疫から２週間
後、４×１０9ＣＦＵ／ｍｌを含有するトッド−ヒュー
イットブロス中の株Ｐ１／７の６時間培養物を使用して
マウスに腹腔内経路で抗原投与（０．５ｍｌ）した。抗
原投与後、致死率を７日間記録した。
【０１００】結果 抗原投与後、プラシーボをワクチン接種したマウスは３
日以内に死亡し、ＶＡＣ−ＣＣＳ及びＶＡＣ−ＳＬＹを
ワクチン接種したマウスは完全に防御されたようであっ
た（表３）。ＶＡＣ−ＳＣＦは部分的な防御しか誘発し
なかった。このワクチンは株Ｐ１／７の細胞外で産生さ
れた抗原の大部分を含有していたが、本質的に溶血素を
含有していなかった。
日以内に死亡し、ＶＡＣ−ＣＣＳ及びＶＡＣ−ＳＬＹを
ワクチン接種したマウスは完全に防御されたようであっ
た（表３）。ＶＡＣ−ＳＣＦは部分的な防御しか誘発し
なかった。このワクチンは株Ｐ１／７の細胞外で産生さ
れた抗原の大部分を含有していたが、本質的に溶血素を
含有していなかった。
【０１０１】結論 以上から結論すると、本発明の精製溶血素を含有するワ
クチンはマウスにおいて防御性である。従って、溶血素
はビルレンス因子であり、Ｓ．ｓｕｉｓタイプ２感染の
有害な効果からマウスを防御するにはこの単一ビルレン
ス因子を中和すれば十分である。
クチンはマウスにおいて防御性である。従って、溶血素
はビルレンス因子であり、Ｓ．ｓｕｉｓタイプ２感染の
有害な効果からマウスを防御するにはこの単一ビルレン
ス因子を中和すれば十分である。
【０１０２】マウス異種防御実験 実験動物 Ｉｆｆａ Ｃｒｅｄｏから入手したＢＡＬＢ／ｃマウス
（４週齢）を使用した。
（４週齢）を使用した。
【０１０３】実験手順 ３０匹（２×１５）１群のマウス群に表６に示すように
夫々のワクチン０．４ｍｌを１回皮下経路で接種する
か、又はワクチン接種せずにおいた（３０匹１群）。ワ
クチン接種から４週間後に１群につき半数のマウスには
株Ｂ１０（タイプ１）、残りの半数には株Ｐ１／７（タ
イプ２）の６時間培養物０．５ｍｌを腹腔内経路で免疫
投与した。
夫々のワクチン０．４ｍｌを１回皮下経路で接種する
か、又はワクチン接種せずにおいた（３０匹１群）。ワ
クチン接種から４週間後に１群につき半数のマウスには
株Ｂ１０（タイプ１）、残りの半数には株Ｐ１／７（タ
イプ２）の６時間培養物０．５ｍｌを腹腔内経路で免疫
投与した。
【０１０４】致死率を７日間記録した。株Ｂ１０は株Ｐ
１／７（致死率１００％）に比較してマウスに対して低
病原性であった（致死率約２０％）。そこで、Ｂ１０抗
原投与群の疾患マウスの数も記録した。抗原投与直前に
血液サンプルを採取し、プールした群血清をイムノブロ
ットで試験した。
１／７（致死率１００％）に比較してマウスに対して低
病原性であった（致死率約２０％）。そこで、Ｂ１０抗
原投与群の疾患マウスの数も記録した。抗原投与直前に
血液サンプルを採取し、プールした群血清をイムノブロ
ットで試験した。
【０１０５】結果 溶血素試験によると、株Ｂ１０（血清型１）の培養物上
清は溶血活性が２９・５であり、株Ｐ１／７（血清型
２）の培養物上清は活性が２７であった。即ち、株Ｂ１
０は株Ｐ１／７の５倍の溶血活性を生じた。
清は溶血活性が２９・５であり、株Ｐ１／７（血清型
２）の培養物上清は活性が２７であった。即ち、株Ｂ１
０は株Ｐ１／７の５倍の溶血活性を生じた。
【０１０６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によ
ると、株Ｂ１０及びＰ１／７の両方の濃縮培養物上清は
５４ｋＤタンパク質（ＳＬＹ）を含有しており、株Ｂ１
０の濃縮培養物上清は活性が高いことから、５４ｋＤタ
ンパク質の含有量が高いと思われた。
ると、株Ｂ１０及びＰ１／７の両方の濃縮培養物上清は
５４ｋＤタンパク質（ＳＬＹ）を含有しており、株Ｂ１
０の濃縮培養物上清は活性が高いことから、５４ｋＤタ
ンパク質の含有量が高いと思われた。
【０１０７】精製ＥＦは５４ｋＤタンパク質を含有して
いなかった。
いなかった。
【０１０８】抗原投与後、どちらの培養物上清含有ワク
チンもマウスに同種及び異種防御を誘発することが判明
した（表６参照）。株Ｐ１／７又はＢ１０の培養物上清
を抗原として使用してプール群血清をイムノブロットで
試験した処、どちらの培養物上清ワクチンも抗ＳＬＹ抗
体を誘発することが判明した（表６）。抗Ｂ１０培養物
上清では、抗Ｐ１／７培養物上清に比較して強い反応が
検出された。イムノブロットで異種試験（Ｐ１／７培養
物上清に対する抗Ｂ１０培養物上清及びＢ１０培養物上
清に対する抗Ｐ１／７培養物上清）を行った処、５４ｋ
Ｄ抗原は主要又は唯一の反応性抗原であった。
チンもマウスに同種及び異種防御を誘発することが判明
した（表６参照）。株Ｐ１／７又はＢ１０の培養物上清
を抗原として使用してプール群血清をイムノブロットで
試験した処、どちらの培養物上清ワクチンも抗ＳＬＹ抗
体を誘発することが判明した（表６）。抗Ｂ１０培養物
上清では、抗Ｐ１／７培養物上清に比較して強い反応が
検出された。イムノブロットで異種試験（Ｐ１／７培養
物上清に対する抗Ｂ１０培養物上清及びＢ１０培養物上
清に対する抗Ｐ１／７培養物上清）を行った処、５４ｋ
Ｄ抗原は主要又は唯一の反応性抗原であった。
【０１０９】精製ＥＦをワクチン接種したマウスでは抗
体は誘発されたが、高投与量であるにも拘わらず同種又
は異種抗原投与から防御されなかった（表６）。
体は誘発されたが、高投与量であるにも拘わらず同種又
は異種抗原投与から防御されなかった（表６）。
【０１１０】結論 どちらの培養物上清ワクチンもマウスに同種及び異種防
御を誘発した。異種試験時に５４ｋＤ抗原がイムノブロ
ットにおける唯一又は主要な反応性抗原であるという事
実は、ＳＬＹがマウスにおける交差防御因子であること
を明示している。
御を誘発した。異種試験時に５４ｋＤ抗原がイムノブロ
ットにおける唯一又は主要な反応性抗原であるという事
実は、ＳＬＹがマウスにおける交差防御因子であること
を明示している。
【０１１１】ブタ防御実験 ＶＡＣ−ＳＬＹ、ＶＡＣ−ＳＣＦ及びプラシーボを上述
のように調製した。
のように調製した。
【０１１２】ＶＡＣ−ＳＬＹはＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒ
ｔｅ（登録商標）アジュバント中２０μｇ／ｍｌの精製
溶血素を含有していた。ＶＡＣ−ＳＣＦ（２ｍｇタンパ
ク質／ｍｌ）はＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商
標）アジュバント中にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｕｉｓの細胞外で産生されたタンパク質の大部分を含有
していたが、本質的に溶血素を含有していなかった。
ｔｅ（登録商標）アジュバント中２０μｇ／ｍｌの精製
溶血素を含有していた。ＶＡＣ−ＳＣＦ（２ｍｇタンパ
ク質／ｍｌ）はＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商
標）アジュバント中にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｕｉｓの細胞外で産生されたタンパク質の大部分を含有
していたが、本質的に溶血素を含有していなかった。
【０１１３】４週齢のブタ９匹を各々３匹からなる３群
に分け、ＶＡＣ−ＳＬＹ、ＶＡＣ−ＳＣＦ及びプラシー
ボ２ｍｌを（筋肉内、頸部）ワクチン接種した。最初の
感作から２週間後、同一ワクチン及びワクチン接種経路
を使用してブタを追加免疫した。ブースターから２週間
後、４×１０9ＣＦＵ／ｍｌ（４）を含有するトッド−
ヒューイットブロス中の株Ｐ１／７の６時間培養物を使
用して静脈内経路（０．５ｍｌ）抗原投与した。感作の
直前に血液サンプルを採取し、血清を使用時まで−２０
℃で保存した。
に分け、ＶＡＣ−ＳＬＹ、ＶＡＣ−ＳＣＦ及びプラシー
ボ２ｍｌを（筋肉内、頸部）ワクチン接種した。最初の
感作から２週間後、同一ワクチン及びワクチン接種経路
を使用してブタを追加免疫した。ブースターから２週間
後、４×１０9ＣＦＵ／ｍｌ（４）を含有するトッド−
ヒューイットブロス中の株Ｐ１／７の６時間培養物を使
用して静脈内経路（０．５ｍｌ）抗原投与した。感作の
直前に血液サンプルを採取し、血清を使用時まで−２０
℃で保存した。
【０１１４】細菌再単離 剖検時に大脳、肺及び足根から、可能な場合には大部分
の患部からスワブを採取した。成長した寸法に基づいて
細菌成長を０、１、２、３又は４と採点した。
の患部からスワブを採取した。成長した寸法に基づいて
細菌成長を０、１、２、３又は４と採点した。
【０１１５】結果 抗原投与後、プラシーボでワクチン接種したブタは、数
個の関節損傷による跛行、外観の意気消沈及び高体温に
より特徴付けられる重度の臨床徴候を生じた。プラシー
ボでワクチン接種した３匹のブタのうち２匹は神経学的
徴候を生じ、非常に重症であったため、安楽死させる必
要があった。ＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種したブタは
対照と同一の臨床徴候を示したが、その程度は低かっ
た。この群のうちの１匹は神経学的徴候を生じ、安楽死
させる必要があった。ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種し
たブタは最も軽症であった。この群のブタは軽度の徴候
しか示さず、他の２群に比較して短期間に回復した。臨
床結果を表４に要約する。解剖すると、プラシーボでワ
クチン接種したブタは重度の多発性関節炎に罹患してお
り、ほとんどの関節が冒されていた（表５）。ＶＡＣ−
ＳＣＦでワクチン接種したブタも同様に多発性関節炎に
罹患していたが、その程度は低く、ＶＡＣ−ＳＬＹでワ
クチン接種したブタのほとんどの関節は正常であった
（表５）。
個の関節損傷による跛行、外観の意気消沈及び高体温に
より特徴付けられる重度の臨床徴候を生じた。プラシー
ボでワクチン接種した３匹のブタのうち２匹は神経学的
徴候を生じ、非常に重症であったため、安楽死させる必
要があった。ＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種したブタは
対照と同一の臨床徴候を示したが、その程度は低かっ
た。この群のうちの１匹は神経学的徴候を生じ、安楽死
させる必要があった。ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種し
たブタは最も軽症であった。この群のブタは軽度の徴候
しか示さず、他の２群に比較して短期間に回復した。臨
床結果を表４に要約する。解剖すると、プラシーボでワ
クチン接種したブタは重度の多発性関節炎に罹患してお
り、ほとんどの関節が冒されていた（表５）。ＶＡＣ−
ＳＣＦでワクチン接種したブタも同様に多発性関節炎に
罹患していたが、その程度は低く、ＶＡＣ−ＳＬＹでワ
クチン接種したブタのほとんどの関節は正常であった
（表５）。
【０１１６】プラシーボでワクチン接種した３匹のブタ
のうちの２匹及びＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種した３
匹のブタの全部の種々の組織から種々の量のＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓが再単離されたが、ＶＡＣ
−ＳＬＹでワクチン接種したブタからは再単離されなか
った（「再単離合計得点」の項目の下に示した数は各群
における合計動物から再単離された細菌の相対量を示
す）（表５）。
のうちの２匹及びＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種した３
匹のブタの全部の種々の組織から種々の量のＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓが再単離されたが、ＶＡＣ
−ＳＬＹでワクチン接種したブタからは再単離されなか
った（「再単離合計得点」の項目の下に示した数は各群
における合計動物から再単離された細菌の相対量を示
す）（表５）。
【０１１７】脳サンプルの組織学的試験（表５）の結
果、ＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種した２匹のブタ及び
プラシーボでワクチン接種した２匹のブタに髄膜炎が検
出された。
果、ＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種した２匹のブタ及び
プラシーボでワクチン接種した２匹のブタに髄膜炎が検
出された。
【０１１８】結論 ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタは数日間で臨床
徴候を示したが、これらの徴候はＶＡＣ−ＳＣＦ又はプ
ラシーボでワクチン接種したブタに比較すると著しく軽
度であり且つ短期間であった。解剖すると、ＶＡＣ−Ｓ
ＬＹでワクチン接種したブタはＶＡＣ−ＳＣＦ又はプラ
シーボでワクチン接種したブタに比較して繊維性関節炎
が軽度であり、頻度も低かった。更に、ＳＣＦでワクチ
ン接種した２匹のブタ及びプラシーボでワクチン接種し
た２匹のブタは髄膜炎に罹患していたが、ＶＡＣ−ＳＬ
Ｙでワクチン接種したブタのうちで髄膜炎に罹患してい
るものは皆無であった。更に、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチ
ン接種したブタの肺、関節及び脳は無菌であったが、他
の２群のこれらの器官の大部分からはＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓタイプ２が再単離された。イムノ
ブロットでは、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタ
の血清（抗原投与日に採取）は全培養物上清中の５４ｋ
Ｄの単一抗原バンドと反応し、溶血素が免疫原性である
こと及び溶血素調製物が高純度であることが確認され
た。
徴候を示したが、これらの徴候はＶＡＣ−ＳＣＦ又はプ
ラシーボでワクチン接種したブタに比較すると著しく軽
度であり且つ短期間であった。解剖すると、ＶＡＣ−Ｓ
ＬＹでワクチン接種したブタはＶＡＣ−ＳＣＦ又はプラ
シーボでワクチン接種したブタに比較して繊維性関節炎
が軽度であり、頻度も低かった。更に、ＳＣＦでワクチ
ン接種した２匹のブタ及びプラシーボでワクチン接種し
た２匹のブタは髄膜炎に罹患していたが、ＶＡＣ−ＳＬ
Ｙでワクチン接種したブタのうちで髄膜炎に罹患してい
るものは皆無であった。更に、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチ
ン接種したブタの肺、関節及び脳は無菌であったが、他
の２群のこれらの器官の大部分からはＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓタイプ２が再単離された。イムノ
ブロットでは、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタ
の血清（抗原投与日に採取）は全培養物上清中の５４ｋ
Ｄの単一抗原バンドと反応し、溶血素が免疫原性である
こと及び溶血素調製物が高純度であることが確認され
た。
【０１１９】以上の結果から明らかなように、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ溶血素は重要な因子であ
り、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ感染の有害
な作用からブタを高度に防御し、種々の器官／組織から
細菌を除去するためにはこの単一因子を中和すれば十分
である。
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ溶血素は重要な因子であ
り、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ感染の有害
な作用からブタを高度に防御し、種々の器官／組織から
細菌を除去するためにはこの単一因子を中和すれば十分
である。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
【表４】
【０１２４】
【表５】
【０１２５】
【表６】
【０１２６】
配列番号：１ 配列の長さ：１６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル配列：ＮＯ フラグメント型：Ｎ末端 起源 生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ 株名：Ｐ１／７ 配列 Asp Ser Lys Gln Asp Ile Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Leu Thr Tyr Glu 1 5 10 15
【図１】低分子量マーカー（レーンＡ）、濃縮培養物上
清（レーンＢ）、精製Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｕｉｓ溶血素（レーンＣ）及び高分子量マーカーのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）。ゲ
ルはクーマシーブリリアントブルーで染色した。左右の
数字はマーカータンパク質の分子量を示す。
清（レーンＢ）、精製Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｕｉｓ溶血素（レーンＣ）及び高分子量マーカーのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）。ゲ
ルはクーマシーブリリアントブルーで染色した。左右の
数字はマーカータンパク質の分子量を示す。
【図２】Ｓ．ｓｕｉｓタイプ２株Ｐ１／７の濃縮培養物
上清のＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２クロマトグラフィーのエ
マルジョン曲線。実線：２８０ｎｍの吸光度、破線：溶
血素力価。
上清のＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２クロマトグラフィーのエ
マルジョン曲線。実線：２８０ｎｍの吸光度、破線：溶
血素力価。
【図３】マーカータンパク質（レーンＡ）、株Ｐ１／７
の濃縮培養物上清（レーンＢ）及びＳｕｐｅｒｏｓｅ−
１２カラムフラクション（レーンＣ〜Ｎ）のウェスタン
ブロット。レーンＣ：フラクション１５、レーンＤ：フ
ラクション１８、レーンＥ：フラクション２０、レーン
Ｆ：フラクション２３、レーンＧ：フラクション２６、
レーンＨ：フラクション２８、レーンＩ：フラクション
３０、レーンＪ：フラクション３２、レーンＫ：フラク
ション３４、レーンＬ：フラクション３６、レーンＭ：
フラクション３８、レーンＮ：フラクション４０。マー
カータンパク質（レーンＡ）はクーマシーブリリアント
ブルーで染色した。Ｓ．ｓｕｉｓ抗原（レーンＢ〜Ｎ）
はウサギ血清でプローブした後、ヤギ抗ウサギ結合体及
びジアミノベンジジンを基質として使用することにより
染色した。マーカータンパク質の分子量を左側に示す。
の濃縮培養物上清（レーンＢ）及びＳｕｐｅｒｏｓｅ−
１２カラムフラクション（レーンＣ〜Ｎ）のウェスタン
ブロット。レーンＣ：フラクション１５、レーンＤ：フ
ラクション１８、レーンＥ：フラクション２０、レーン
Ｆ：フラクション２３、レーンＧ：フラクション２６、
レーンＨ：フラクション２８、レーンＩ：フラクション
３０、レーンＪ：フラクション３２、レーンＫ：フラク
ション３４、レーンＬ：フラクション３６、レーンＭ：
フラクション３８、レーンＮ：フラクション４０。マー
カータンパク質（レーンＡ）はクーマシーブリリアント
ブルーで染色した。Ｓ．ｓｕｉｓ抗原（レーンＢ〜Ｎ）
はウサギ血清でプローブした後、ヤギ抗ウサギ結合体及
びジアミノベンジジンを基質として使用することにより
染色した。マーカータンパク質の分子量を左側に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 17/10 8318−4Ｈ
Claims (11)
- 【請求項１】 約５４ｋＤの分子量を有しており、チオ
ールにより活性化され得、コレステロールにより阻害さ
れ得、天然形態にあるときに溶血活性を有するＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓのポリペプチド、又は該
ポリペプチドに対する免疫応答を誘発することが可能な
該ポリペプチドの一部。 - 【請求項２】 前記ポリペプチドがＮ末端アミノ酸配列
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕを有することを特徴とする
請求項１に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドの一
部。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のポリペプチドを
含むことを特徴とするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｕｉｓ感染からブタを防御することが可能なワクチン。 - 【請求項４】 別のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕ
ｉｓ免疫原を更に含むことを特徴とする請求項３に記載
のワクチン。 - 【請求項５】 ポリペプチドが担体に結合していること
を特徴とする請求項３又は４に記載のワクチン。 - 【請求項６】 担体が莢膜多糖であることを特徴とする
請求項５に記載のワクチン。 - 【請求項７】 アジュバントを含むことを特徴とする請
求項３から６のいずれか一項に記載のワクチン。 - 【請求項８】 ブタ病原性ウイルス又は微生物に由来す
る付加的免疫原を含むことを特徴とする請求項３から７
のいずれか一項に記載のワクチン。 - 【請求項９】 免疫原がＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、偽狂犬病ウイル
ス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパーボウイル
ス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、Ｅ
ｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉ
ａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及
びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃ
ａから構成される群から選択されることを特徴とする請
求項８に記載のワクチン。 - 【請求項１０】 請求項１又は２に記載のポリペプチド
に対して単一特異的に反応性の抗体。 - 【請求項１１】 請求項１又は２に記載のポリペプチド
を医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤と
混合することからなる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｕｉｓによる感染から哺乳類を防御することが可能な
ワクチンの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93201401 | 1993-05-17 | ||
| NL93201401.2 | 1993-05-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0710774A true JPH0710774A (ja) | 1995-01-13 |
| JP3578799B2 JP3578799B2 (ja) | 2004-10-20 |
Family
ID=8213828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10308094A Expired - Fee Related JP3578799B2 (ja) | 1993-05-17 | 1994-05-17 | ストレプトコッカス・スイス感染に対するワクチン |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5612042A (ja) |
| EP (1) | EP0626452B1 (ja) |
| JP (1) | JP3578799B2 (ja) |
| AT (1) | ATE183241T1 (ja) |
| CZ (1) | CZ289302B6 (ja) |
| DE (1) | DE69419966T2 (ja) |
| DK (1) | DK0626452T3 (ja) |
| ES (1) | ES2137310T3 (ja) |
| GR (1) | GR3031698T3 (ja) |
| HU (1) | HU218154B (ja) |
| PL (1) | PL177219B1 (ja) |
| SK (1) | SK281324B6 (ja) |
| TW (1) | TW494103B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2009263266A (ja) * | 2008-04-24 | 2009-11-12 | Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | ストレプトコッカス・スイス感染症予防用ワクチン |
| JP2012521391A (ja) * | 2009-03-26 | 2012-09-13 | インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー | 各種血清型のブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ）細菌から防御するためのワクチン |
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|---|---|---|---|---|
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| US5919466A (en) * | 1993-10-01 | 1999-07-06 | Gerbu Biotechnik Gmbh | Method for improving the yield of immunoantibodies in the vaccination of animals and humans |
| US5863543A (en) * | 1996-06-05 | 1999-01-26 | University Of Saskatchewan | Camp factor of streptococcus uberis |
| WO1996041879A1 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | University Of Saskatchewan | Camp factor of streptococcus uberis |
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| AU769539B2 (en) | 1999-01-29 | 2004-01-29 | Zoetis Services Llc | Adjuvants for use in vaccines |
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