JPH07110332A

JPH07110332A - 結核菌の検査試薬及び検出方法

Info

Publication number: JPH07110332A
Application number: JP25399193A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Tomiyama; 哲雄富山; Takashi Yamaguchi; 隆司山口; Kazuhiro Matsuo; 和浩松尾; Akihiro Yamazaki; 晤弘山崎
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1993-10-12
Filing date: 1993-10-12
Publication date: 1995-04-25

Abstract

(57)【要約】【構成】抗ＭＰＢ６４抗体からなる、結核菌を免疫学
的に検出するための結核菌検査試薬及び検出方法。【効果】従来の結核菌を培養して検出する方法に比
べ、短時間に確実に結核菌を検出することができるの
で、結核患者の早期確定診断および早期治療が可能とな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＭＰＴ６４を免疫学的
に検出することによって結核菌を特異的に検出する試薬
に関する。更に詳しくは、液体培地で検体中の結核菌を
培養し、この培養液中に産生されたＭＰＴ６４を免疫学
的に同一のＭＰＢ６４に対する抗ＭＰＢ６４抗体によっ
て免疫学的に検出する結核菌検査試薬及び検出方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの結核は、結核菌(Mycobacterium t
uberculosis)の感染によって惹起される呼吸器などの感
染症であることは周知の通りである。結核の大多数を占
める肺結核は、肺癌、肺真菌症、肺吸虫症などと臨床的
に鑑別するのは困難なことが多く、確定診断はもっぱら
検体の培養により結核菌を検出する方法にたよってい
る。しかし、結核菌の培養は、通常小川培地を用いて４
〜８週間を必要とし、更に検出菌の同定が必須である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、従来の
方法で結核菌を検出するには長期間を必要とするため、
結核の確定診断および早期の治療に大きな障害となって
いるばかりではなく、排菌による周囲の人への感染など
公衆衛生上も問題が大きい。また、結核菌を免疫学的に
検出する方法は従来全く知られていない。本発明は、結
核菌を免疫学的に特異的にかつ迅速に検出することがで
きる検査試薬及び検出方法を提供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】前記の問題を解決するた
め、本発明者等は、結核菌のみが産生する蛋白、ＭＰＢ
６４に着目し、喀痰などの検体を液体培地で培養し、培
養液中に分泌されたＭＰＢ６４を免疫学的に検出するこ
とによって、迅速、確実に結核菌を検出する試薬の開発
に成功し、本発明を完成するに至った。更に、この特異
的検出法は、培養された未知分離菌の同定、迅速な薬剤
感受性試験にも応用することができる。

【０００５】本発明は、抗ＭＰＢ６４抗体からなる、結
核菌を免疫学的に検出するための結核菌検査試薬及びそ
れを用いて免疫検定法により結核菌を検出する方法であ
る。ＭＰＢ６４は、1986年M. Harboe 等によりＢＣＧ菌
が産生する蛋白の中から分離精製され、そのＮ末端付近
のアミノ酸配列が報告されている(Infection and Immun
ity vol.52, 293-302, 1986)。結核菌は数百種類の蛋白
を培養液中に分泌するが、ＭＰＴ６４は結核菌におい
て、ＭＰＢ６４はＢＣＧ菌においてのみ産生される種特
異蛋白であり、両者は、免疫学的に同一である。

【０００６】このＭＰＢ６４を結核菌培養液中の数百種
類の蛋白から純粋に分離するためには多大の労力と時間
を要し、しかもその収量は非常に少なく、検査試薬の原
料に供するのは極めて困難であったが、本発明者等は、
特開平１−２４７０９４号においてＭＰＢ６４遺伝子を
クローニングし、全塩基配列を決定し、大腸菌でＭＰＢ
６４を純粋に直接発現することに成功した。更に改良を
加えて、より大量に発現できる技術を開発した。すなわ
ち、融合蛋白発現ベクターｐＭＡＬ６４ｃを含む大腸菌
株（ＦＥＲＭＰ−１３７６２）を培養し、この培養菌体
を超音波で破砕し、遠心によって破砕液上清を分取し、
この上清画分よりＭＰＢ６４を純粋に調製することがで
きる。また、スメグマ菌のような結核菌の類縁菌を宿主
として用い、上記ＭＰＢ６４遺伝子を導入して、菌体外
に直接分泌発現させ、培養上清から大量のＭＰＢ６４を
純粋に調製することも可能である。

【０００７】このＭＰＢ６４を免疫学的に検出するため
の抗血清は、ＭＰＢ６４を抗体産生能のある動物、例え
ばモルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギに通常の方法で免
疫することによって容易に得られる。この抗ＭＰＢ６４
抗血清を用いて、結核菌を検出するには、検体中の結核
菌を液体培地で培養し、例えば１週間後に、培養液中に
分泌されたＭＰＢ６４を免疫学的に検出すればよい。免
疫学的検出法として、逆受身血球凝集反応（ＲＰＨ
Ａ）、逆受身ラテックス凝集反応（ＲＰＬＡ）、酵素免
疫抗体法（ＥＩＡ）等をはじめとして、多くの免疫学的
検定法が適用できる。これらの方法により高感度でＭＰ
Ｂ６４を検出することができるが、結核菌のバイオハザ
ード対策として、安全キャビネットの中で検査できるこ
とが望ましいので、ＲＰＨＡおよびＲＰＬＡが特に望ま
しい。ＲＰＨＡ法を行うためには、タンニン酸処理固定
ヒトＯ型赤血球またはヒツジ赤血球に抗ＭＰＢ６４抗体
を感作し、これを試験管またはマイクロプレート中で検
体の結核菌培養液またはその希釈液に加えてから静置
し、１〜３時間後に管底凝集像として判定できる。赤血
球の代りにポリスチレンなどのラテックスを担体とした
ＲＰＬＡも同様に有用な方法である。いづれの方法にお
いても、管底凝集がおこればＭＰＢ６４の存在が確認で
き、結核菌が培養されたことが証明される。また、この
反応は、極めて容易に、しかも安全キャビネットの中で
も実施できるので、臨床検査に特に適している。

【０００８】

【発明の効果】以上のように、従来結核菌の培養に、４
〜８週間を要していたのが、抗ＭＰＢ６４抗体を用いて
免疫学的に検出すれば１週間の培養で足り、しかも同時
に、結核菌であることの確認が確実にできるので、結核
患者の早期確定診断および早期治療が可能となる。

【０００９】

【実施例】実施例１．ＭＰＢ６４の生産融合蛋白発現ベクターｐＭＡＬ６４ｃを含むE. coli JM
109 株（ＦＥＲＭＰ−１３７６２）を、一晩培養した培
養液４０mlをＬ−ブロス培地４リットル（アンピシリン
１００mg/l含有）に加えた。３７℃で４時間培養した
後、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド
（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．３mMになるように加え、さ
らに３時間培養した。この培養液を氷冷し、遠心（８，
０００rpm で１０分間）して集菌した後、２００mlのカ
ラムバッファー(10mM Tris-Cl(pH7.4)、200mM NaCl、1mM
EDTA、1mMアジ化ナトリウム、1mM ジチオトレイトール）
に懸濁し、−２０℃で一晩凍結した。融解後、超音波細
胞破砕装置（東湘電気製ＵＣＤ−２００Ｔ型）により菌
体を破砕した。再度遠心して破砕液の上清を集めた。上
清をアミロース樹脂カラム（マルトースバインディング
プロテインを吸着できる、米国、ＮＥＢ社製）２０mlに
通し、８倍量のカラムバッファーで洗浄した。次に、１
０mMマルトースを含むカラムバッファーにより吸着した
融合蛋白を溶出させ、２８０nmの吸光度を指標に蛋白含
有画分（１５０mg相当量）を集めた。

【００１０】実施例２．ＭＰＢ６４の精製実施例１で得た蛋白含有画分にプロテアーゼFactor Xa
（米国、ＮＥＢ社製）２５０μg を加え、２５℃で７２
時間おいた。切断溶液をそのままヒドロキシアパタイト
カラム（米国、バイオラッド社製）１ｇにかけた。８０
mlのカラムバッファーを流すことによりマルトースを除
去し、次に０．５M リン酸ナトリウム溶液（pH７．０）
を流して蛋白を溶出させた。蛋白含有画分をそのままア
ミロースカラムにかけて切断されたマルトースバインデ
ィング蛋白を吸着させ、目的のリコンビナントＭＰＢ６
４蛋白を素通りさせた。ＭＰＢ６４蛋白を含む画分を集
め、濃縮後、２０mM Tris-Cl(pH8.0) 含有２５mMＮａＣ
ｌ溶液に対して透析した。これをＦＰＬＣ（スウェーデ
ン、ファルマシア社製）（条件：Mono Ｑイオン交換カ
ラムを用い、移動相として２０mM Tris-Clバッファー(p
H8.0) 中、ＮａＣｌからなる濃度勾配液を用いる）で精
製し、３．０mgの精製標品を得た。

【００１１】実施例３．抗ＭＰＢ６４ヤギ血清の作製実施例２で調製したＭＰＢ６４を生理食塩水で１mg/ml
溶液とし、この溶液２mlにフロイント完全アジュバント
２mlを混合してからエマルジョンとし、ヤギの背面皮下
および大腿部筋肉内にそれぞれ注射して免疫した。４週
間後、６週間後および８週間後にＭＰＢ６４、１mg/ml
水溶液を０．５mlづつ静脈注射し、最後の追加免疫の７
日後に全採血し、血清を分離して抗ＭＰＢ６４ヤギ血清
８００mlを得た。

【００１２】実施例４．精製抗ＭＰＢ６４抗体の調製実施例３で調製した抗ＭＰＢ６４ヤギ血清（以下抗血清
と称する）２容に飽和硫酸アンモニウム水溶液１容を加
え、室温で１時間処理した後、３，０００rpmで３０分
遠心して硫酸アンモニウム沈殿画分をとり、生理食塩水
に対して透析して抗体の１／３飽和画分を得た。次にＢ
ｒＣＮ−セファロース４Ｂ（スエーデン、ファルマシア
社製）充填カラムにＭＰＢ６４を通して吸着させ、洗浄
後、上記抗体の１／３飽和画分を通して吸着させた後、
酢酸バッファー(pH2.5) を流して抗体を解離させて分取
し、pHを７．２に補正して精製抗ＭＰＢ６４抗体を得
た。

【００１３】実施例５．抗体感作血球の作製グルタールアルデヒド固定ヒツジ赤血球の０．５％ＰＢ
Ｓ懸濁液１容に、１：１００，０００タンニン（米国、
ＮＢＣ社製）を１容加え、室温で１５分間処理した後、
ＰＢＳで３回洗浄し、１容のＰＢＳに懸濁して０．５％
タンニン血球を得た。このタンニン血球１容に実施例４
で得た精製抗ＭＰＢ６４抗体（４μg/ml）１容を加え、
３７℃で３０分間処理し、ＰＢＳで３回洗浄後、希釈液
（０．１％ウシ血清アルブミン＋ＰＢＳ）１容に懸濁し
て抗体感作血球を得た。この抗体感作血球を用いて、逆
受身血球凝集反応を行ったところ、ＭＰＢ６４の４ng/m
l 以上で管底凝集を示した。

【００１４】結核菌検出例結核菌検査検体として喀痰を用い、常法によりデュボス
液体培地を用いて培養し、１週間後にＭＰＢ６４の有無
を次のようにして検査した。マイクロプレートに希釈液
２５μl を滴下しておき、この中に液体培養液５μl を
加え、その上に、実施例５で調製した抗体感作血球２５
μl を滴下し、３時間後に管底凝集の有無を肉眼で判定
した。対照として、小川培地を用いて常法により８週間
培養した。この結果を表に示す。

【００１５】

【表１】

【００１６】表にみられるように、１週間培養した液中
のＭＰＢ６４の検出結果と、小川培地で８週間培養によ
る結核菌の検出結果はよく一致し、本発明のＭＰＢ６４
検出法が小川培地培養法に完全におきかえられることを
示した。このように、ＭＰＢ６４検出法は、結核菌検出
法として迅速、確実な結果を得ることができ、臨床検査
法として適切な方法であることを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者松尾和浩神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者山崎晤弘神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗ＭＰＢ６４抗体からなる、結核菌を免
疫学的に検出するための結核菌検査試薬。
【請求項２】抗ＭＰＢ６４抗体を用いて免疫学的検定
法により結核菌を検出する方法。