JPH07111429B2

JPH07111429B2 - レ−ザ−磁気免疫測定法

Info

Publication number: JPH07111429B2
Application number: JP22456786A
Authority: JP
Inventors: 幸一藤原; 壽一野田; 裕迪水谷; 弘子水谷
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: NTT Inc
Priority date: 1986-09-22
Filing date: 1986-09-22
Publication date: 1995-11-29
Anticipated expiration: 2010-11-29
Also published as: JPS6379070A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は抗原抗体反応を利用した免疫測定法のうち、超
高感度の測定法に属するものであり、微量の検体から特
定の抗体又は抗原を検出可能な免疫測定法に関するもの
である。

〔従来の技術〕

エイズ、成人Ｔ細胞白血病等の新型ウイルス性疾病、並
びに、各種ガンの早期検査法として、抗原抗体反応を利
用した免疫測定法の開発が、現在、世界的規模で進めら
れている。これは、抗原であるビールス等が生体に侵入
した場合に形成される抗体が、前記抗原と特異的に反応
する性質（抗原抗体反応）を利用して、抗体又は、抗原
そのものを検出しようとするものである。このための、
微量免疫測定法として、従来からラジオイムノアッセイ
（RIA）、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等
が実用化されてきた。これらは、アイソトープ、酵素、
蛍光体で標識された抗原又は抗体を用い、これと特異的
に反応する抗体又は、抗原の有無を検出するものであ
る。このうちRIAは、抗原抗体反応に寄与した検体量
を、標識化されたアイソトープの放射線量を測定するこ
とにより定量するものであり、現在のところ、ピコグラ
ム程度の超微量測定が唯一可能な方法である。しかし、
RIAは放射性物質を取り扱わなければならないため、特
殊設備が必要であり、半減期や廃棄物処理等の点から、
使用時期、場所等の制約があった。又、酵素、蛍光体を
用いる方法では、発色や、発光を用いて抗原抗体反応の
有無を確認するものであるため、測定が半定量的であ
り、検出限界もナノグラム程度であった。従って、RIA
と同程度の検出感度を有し使用上の制限のない免疫測定
法が求められていた。

又、抗原抗体反応の有無の検出にレーザー光を用いる方
法としては、肝臓癌の検出を目的として、プラスチック
の微粒子にAFP（アルファ・フェト・プロテイン）に対
する抗体をつけ、抗原抗体反応に基づく該プラスチック
同士の凝集により生じた質量変化を、レーザー光の散乱
又は透過状態の変化から調べる方法が発表されている。
この方法では、検出感度は10^-10gであり、従来のレーザ
ー光を用いた方法の百倍以上とされているが、RIAの感
度の百分の一以下である。この方法は、水溶液中での抗
原抗体のブラウン運動の変化を利用しているため、測定
に際しては、検体を含む水溶液の温度制御を精密に行う
必要があり、気温や振動等の外界の影響を受け易い欠点
があった。

〔発明の目的及び解決しようとする問題点〕

本発明は、半減期や廃棄物処理等の種々の制約を解決
し、RIAと同程度のピコグラムの検出感度を有する新し
い免疫測定法を実現しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、磁性超微粒子を標識として用い、特定の、又
は未知の抗原又は抗体にこの標識を付けて磁性体標識体
とする。次に、検体としての抗体又は抗原を既知の固相
化された抗原又は抗体と抗原抗体反応させ、又は検体と
しての抗体又は抗原を直接固相化し、前記磁性体標識体
と抗原抗体反応を起こさせる。その後未反応の前記磁性
体標識体を除去した後に、検体を液相中に分散させる。
この場合に前記検体が、前記磁性体標識体と特定の抗原
抗体反応を起こす抗原又は抗体である場合には、検体を
含む液相中に磁性体標識体が残存し、それら以外の場合
には、液相中には磁性体標識体は存在しない。よって、
液相中の磁性体標識体の有無及び存在量を知ることによ
り検体の特定及び定量が可能となる。磁性体標識体の有
無及び存在量は、液相中に分散した検体によるレーザー
光の散乱、透過光の強度変化を測定することにより知る
ことができる。

〔作用〕

本発明は磁性超微粒子を抗原抗体反応の標識として用い
るために、未反応の磁性体標識体を磁場により検体から
分離除去することができる。また、液相化した後は、磁
気的方法により磁性体標識体を濃縮し、検出感度を向上
させることができる。また、この磁性体標識体を交流磁
場内で駆動しつつ該交流磁場と同期した散乱光または透
過光の変化を選択的に測定することにより、外界の影
響、バックグランドの散乱の除去等を有効に行うことが
できる。本発明では、磁性超微粒子を標識として用いて
いるので使用時期や場所の制限はない。

本発明で、検体と磁性体標識体を反応させる前処理に
は、固相化された既知の抗原又は抗体と検体としての抗
体又は抗原を反応させる間接法と、検体としての抗体又
は抗原を直接固相化する直接法がある。また、磁性体標
識体を反応させる方法としては、検体と磁性体標識体を
積極的に反応させる方法と、反応を阻害する方法（競合
阻害反応検出法）とがある。以下に実施例を示す。

〔実施例〕

実施例１第１図は本発明の第１の実施例（間接法）を説明する図
であって、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程を、（ｅ）
〜（ｆ）は比較対照試料の調整工程を示している。１は
寒天より成る支持体、２はウイルス抗体、３はウイルス
抗原、４は磁性体標識ウイルス抗体、５は希土類磁石、
６はガラスセルである。（ａ）は既知のウイルス抗体２
を支持体１に固相化する工程、（ｂ）は固相化した抗体
２に患者の血液中の未知のウイルス抗原３を注入し、抗
原抗体反応をさせる工程、（ｃ）はウイルス抗原３に磁
性体標識ウイルス抗体４を反応させる工程、（ｄ）は支
持体１を溶解、除去後、検体をガラスセル６に入れ、水
溶液中に分散させる液相化工程である。（ｅ）（ｆ）は
比較対照試料の調整工程を示し（ｅ）は、ウイルス抗原
３が存在しなかったために検体と抗原抗体反応をしなか
った磁性体標識ウイルス抗体４を希土類磁石５により、
該固相化抗体から分離・除去する工程、（ｆ）は比較対
照試料の液相化工程である。（ｅ）と同様の工程を
（ｃ）にほどこすことにより未反応の過剰の磁性体標識
ウイルス４を検体から除去することができる。本実施例
において、ウイルス抗体を寒天に固定した理由は、
（ｃ）の工程で、過剰の標識体を希土類磁石で分離、除
去する操作を容易にするためである。（ｅ）の除去工程
は、磁性体標識体の特性を利用して磁石を用いて行った
が、洗浄によっても除去は可能である。磁石と洗浄の併
用も有効である。磁性体標識ウイルス抗体４として、本
実施例ではウイルス抗原３と特異的に結合する抗体をマ
グネタイト超微粒子の表面に被覆したものを使用した。
磁性超微粒子としてマグネタイトを選んだ理由はマグネ
タイトがウイルスや特異抗体との親和性が良くウイルス
等を標識するのに適しているためである。また、外部磁
場による分離、除去、並びに後述する散乱光、透過光の
測定を効率的かつ効果的に行うためには、該マグネタイ
トは単磁区粒子構造が好ましく、粒子径は50nm程度が適
当であった。なお、磁性超微粒子はマグネタイトに限ら
れるものではなく、γフェライト等の化合物磁性体、
鉄、コバルト等の金属磁性体でも勿論よい。

第２図は本発明の実施例の内、前記で説明した、調整済
みの検体並びに比較対照試料をレーザー光散乱・透過法
で測定する方法を説明する図であって、８は出力5mWのH
eNeレーザー、９は入射光線、10は散乱光束、11は透過
光線、12はSiフォトダイオード、13はロックインアン
プ、14は電磁石、15は電磁石14を駆動するための0.5Hz
の低周波電源、16は散乱光を集光するレンズ、17は偏光
板である。検体あるいは比較対照試料の入ったガラスセ
ル６は電磁石14の中に装着され、レーザー入射光線９の
周りに磁性体標識体は誘導・濃縮され、レーザー８によ
る検体を含む液体からの散乱光束10又は透過光線11はフ
ォトダイオード12で検出される。液相中で磁性体標識ウ
イルス抗体４の運動は、電磁石14により制御されるた
め、散乱光束10及び透過光線11の強度は、低周波電源15
の周波数に同調することになる。したがって、ロックイ
ンアンプ13で低周波電源15の周波数に同調した散乱光束
10あるいは、透過光線11のみを増幅すれば、温度変動等
の外乱の影響を全く受けないで、検体を含む液体からの
散乱光あるいは透過光の強度を測定することが出来る。
本実施例の場合、検体を含む液体からの散乱光強度は交
流磁場の周期に同期して測定されたが、比較対照試料中
には磁性体標識体が存在しないために交流磁場に同期す
る成分は存在せず散乱光強度は直流的でありロックイン
アンプ13を通して測定することによりバックグランドレ
ベルを知ることができる。既知の量の磁性体標識体を含
む標準溶液を希釈しながら測定した結果、RIAとほぼ同
程度のピコグラムの検出限界を有することが明らかにな
った。

なお、通常の測定は散乱光で行えばよいが、検体の種
類、濃度によっては透過光を使用する方が高S/Nの測定
が出来る場合がある。偏光板17は検体からの偏光成分を
分離して測定するために使用するものである。即ち入射
レーザー光として、直線偏光に近いものを用い液相中に
磁性体標識体が存在しないときに消光するようにクロス
ニコルの設定しておき、光路中に磁性体標識体が誘導さ
れたときに偏光状態が変化して出射光が得られるように
しておく。本実施例においては、磁性体標識体を0.5Hz
の低周波に同調させて該検体を含む液体からの散乱光を
測定したが、該低周波電源は0.5Hzに限られるものでは
なく、検体を含む水溶液の粘度及び磁界強度等に応じた
最適な周波数を決めることが好ましい。

本実施例で磁界による濃縮、交流磁場の印加をしない場
合でも、磁性体標識体を含む検体と、比較対照試料との
散乱強度の差から、マイクログラム程度の検出は可能で
あった。

実施例２第３図は本発明の第２の実施例（間接法）を説明する図
であって、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程を、（ｅ）
〜（ｆ）は比較対照試料の調整工程を示している。１は
ゼラチンより成る支持体、２はウイルス抗体、３はウイ
ルス抗原、４′はマグネタイトの超微粒子により標識さ
れた、磁性体標識抗免疫グロブリンである。ここで抗免
疫グロブリンとは、ウイルス抗体を他の生体にいれるこ
とにより形成される特異抗体であり、ウイルス抗体と特
異的に抗原抗体反応する特性を有する。５は希土類磁
石、６はガラスセルである。（ａ）は既知のウイルス抗
原３を支持体１に固相化する工程、（ｂ）は検体である
患者の血液中のウイルス抗体２とウイルス抗原３を反応
させる工程、（ｃ）は磁性体標識抗免疫グロブリン４′
とウイルス抗体２を抗原抗体反応させる工程、（ｄ）は
支持体１を溶解、除去後、検体をガラスセル６に入れ、
水溶液中に分散させる液相化工程である。（ｅ）は未反
応の磁性体標識抗免疫グロブリン４′を希土類磁石５に
より、該固相化抗原から分離・除去する工程、（ｆ）は
比較対照試料の液相化工程である。

検体をこれらの工程を通して調整した後、前記実施例１
のレーザー光散乱法により検体の定量を行ったところ、
実施例１と同程度のピコグラムのウイルス抗体の検出が
できた。

実施例３第４図は本発明の第３の実施例（直接法）を説明する図
であって、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程を示してい
る。１はゼラチンより成る支持体、４は鉄超微粒子によ
り標識された磁性体標識ウイルス抗体、３′はインフル
エンザウイルス、51は電磁石、６はガラスセルである。
（ａ）は検体である患者の血液中の未知のウイルス３′
を支持体１に固相化する工程、（ｂ）は既知の磁性体標
識ウイルス抗体４とウイルス３′を反応させる工程、
（ｃ）は過剰な磁性体標識ウイルス抗体４を電磁石51に
より分離・除去する工程、（ｄ）は支持体１を溶解、除
去後、該検体をガラスセル６に入れ、水溶液中に分散さ
せる液相化工程である。

種々の型の既知のインフルエンザウイルス抗体に標識し
た磁性体標識ウイルス抗体４を用意し、これと患者から
採取した未知のインフルエンザウイルス３′とを抗原抗
体反応させ、検体をこれらの工程を通して調整した後、
前記実施例１のレーザー光散乱法により検体検査を行う
ことにより、インフルエンザウイルスの特定が可能とな
る。本方法による測定法は、検出感度が高いために従来
の酵素や蛍光体を用いる方法に比較して、ウイルス感染
初期の段階でインフルエンザウイルスの特定を行うこと
が出来た。

実施例４第５図は本発明の第４の実施例である、競合阻害反応検
出法の一例を説明する図であって、１はゼラチンより成
る支持体、２はウイルス抗体、３はウイルス抗原、21は
磁性体標識ウイルス抗原、５は希土類磁石、である。本
実施例では、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程を、
（ｅ）〜（ｆ）は比較対照試料の調整工程を示してい
る。（ａ）は既知のウイルス抗体２を固相化する工程、
（ｂ）は固相化された抗体２と患者のウイルス抗原３と
を抗原抗体反応させる工程、（ｃ）は別工程で磁性体に
より標識した磁性体標識ウイルス抗原21を前記（ｂ）の
抗原抗体反応後の検体と反応させる工程、（ｄ）は前記
工程（ｃ）で未反応の磁性体標識ウイルス抗原21を磁石
５により捕集する工程、（ｅ）は比較対照試料に磁性体
標識ウイルス抗原21を反応させる工程、（ｆ）は未反応
の磁性体標識ウイルス抗原21を磁石５により捕集する工
程である。

検体及び比較対照試料をこれらの工程により調整した
後、前記実施例１のレーザー光散乱法により測定したと
ころ、本実施例の場合は、磁性体標識ウイルス抗原21は
検体を含む液相中ではウイルス抗原３によりウイルス抗
体２との反応を阻害されるため未反応のまま磁石により
除去される。しかし比較対照試料を含む液相中にはウイ
ルス抗原３は存在しないため磁性体標識ウイルス抗原21
はウイルス抗体２と反応し検出されることになる。その
結果検体を含む液相中からは磁性体標識体は検出され
ず、比較対照試料を含む液相中のみに磁性体標識体が検
出された。但し、ウイルス感染初期の患者からの検体で
はウイルス抗原３の数が極めて少ないため、工程（ｂ）
では一部の固相化抗体のみがウイルス抗原３と反応する
ため、検体を含む液相中からも磁性体標識体は検出され
るがウイルス抗原３の増加につれ検出量は減少する。こ
の減少量により、ウイルス抗原３の量を定量することが
できる。

実施例５第６図は本発明の第５の実施例である。競合阻害反応検
出法の他の一例を説明する図であつて、１はゼラチンよ
り成る支持体、３はウイルス抗原、２はウイルス抗体、
４は磁性体標識ウイルス抗体、５は希土類磁石、であ
る。本実施例では、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程
を、（ｅ）〜（ｆ）は比較対照試料の調整工程を示して
いる。（ａ）は既知のウイルス抗原３を固相化する工
程、（ｂ）は固相化された抗原３と患者のウイルス抗体
２と抗原抗体反応させる工程、（ｃ）は磁性体標識ウイ
ルス抗体４をウイルス抗体２に反応させる工程、（ｄ）
は前記工程で未反応の磁性体標識ウイルス抗体４を磁石
５により捕集する工程、（ｅ）は比較対照試料に磁性体
標識ウイルス抗体４を反応させる工程、（ｆ）は未反応
の磁性体標識ウイルス抗体４を磁石５により捕集する工
程である。

本実施例においても、実施例４と同じ結果が得られた。

上記実施例に於て、支持体として寒天またはゼラチンを
用いているが、これらの間には本質的な差異はなく、固
相化される抗原、または抗体との組合せから経験的に選
択される。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明は磁性超微粒子を抗原抗体
反応の標識として用い、未反応の磁性超微粒子を磁場中
で分離除去後、磁場中で検体を含む液体にレーザー光を
照射し、標識体からの散乱光又は透過光を測定するもの
でありRIA法と比較して、使用時期、場所等の制限がな
い。又電磁石等により外部から、磁性体標識体をレーザ
ー照射部へ誘導濃縮することにより、検出感度の向上を
図ることができる。又同様の手段により外部から磁性体
標識体の運動を制御することにより外界の影響を排除す
ることが可能である。

本測定法は特に抗原抗体反応の検査の自動化に適した方
法であるから、集団検診で必要とされる、各種のウイル
ス、ガン等のスクリーニング検査に用いれば特に効果が
発揮される。また、抗原抗体反応の他に、従来RIA法が
適用されているペプチドホルモン等の種々のホルモンあ
るいは種々の酵素、ビタミン、薬剤などの測定にも応用
することが可能である。このように、本発明の方法は患
者の早期診断、治療に役立てることが出来、医療界につ
くすところ大である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第１の実施例、第２図は本発明の実施
例のうち、レーザー光の散乱・透過を計測する方法を説
明した図、第３図は本発明の第２の実施例、第４図は本
発明の第３の実施例、第５図は本発明の第４の実施例、
第６図は本発明の第５の実施例を示す図である。１……支持体、２……ウイルス抗体、３……ウイルス抗
原、３′……インフルエンザウイルス、４……磁性体標
識ウイルス抗体、４′……磁性体標識抗免疫グロブリ
ン、５……希土類磁石、６……ガラスセル、８……レー
ザー、９……入射光線、10……散乱光束、11……透過光
線、12……フォトダイオード、13……ロックインアン
プ、14……電磁石、15……低周波電源、16……レンズ、
17……偏光板、21……磁性体標識ウイルス抗原、51……
電磁石

フロントページの続き (72)発明者水谷弘子東京都渋谷区宇田川町６番11号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原または抗体に磁性体超微粒子を標識し
て磁性体標識体とし、該磁性体標識体と検体を抗原抗体
反応させる工程と、該工程後の前記検体から、未反応の
前記磁性体標識体を分離除去する工程と、該工程の後の
前記検体を液体中に分散させてレーザー光を照射する工
程と、該工程による前記検体からの散乱光または透過光
を測定する工程からなることを特徴とするレーザー磁気
免疫測定法。
【請求項２】磁性体標識体と抗原抗体反応させる検体
が、該検体と、該検体の特異抗体又は抗原との、抗原抗
体反応後のものであることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載のレーザー磁気免疫測定法。
【請求項３】磁性体超微粒子により標識される抗体が抗
免疫グロブリンであることを特徴とする特許請求の範囲
第１項または第２項記載のレーザー磁気免疫測定法。
【請求項４】未反応の磁性体標識体を分離除去する工程
が、磁石による分離除去であることを特徴とする特許請
求の範囲第１、２又は第３項記載のレーザー磁気免疫測
定法。
【請求項５】液体中に分散された検体が磁場中に置か
れ、該磁場によりレーザー光照射部分に誘導、濃縮され
ていることを特徴とする特許請求の範囲第１、２、３又
は４項記載のレーザー磁気免疫測定法。
【請求項６】レーザー光が照射される検体が周期的に変
化する磁場中におかれ、該磁場の周期に同期した散乱光
または透過光を検出することを特徴とする特許請求の範
囲第１、２、３、４、又は５項記載のレーザー磁気免疫
測定法。