JPH07112982B2 - 犬パルボウイルスワクチン - Google Patents

犬パルボウイルスワクチン

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JPH07112982B2
JPH07112982B2 JP61019162A JP1916286A JPH07112982B2 JP H07112982 B2 JPH07112982 B2 JP H07112982B2 JP 61019162 A JP61019162 A JP 61019162A JP 1916286 A JP1916286 A JP 1916286A JP H07112982 B2 JPH07112982 B2 JP H07112982B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な犬パルボウイルスワクチン、その製造方
法、新規な犬パルボウイルス株、および犬パルボウイル
ス伝染に対する犬の防御法に関するものである。
犬パルボウイルス（canine parvovirus;CPV）による
犬、特に子犬の伝染は、しばしば急性下痢、発熱および
白血球減少症（相対的なリンパ球減少症）を特徴とする
腸疾患をもたらす。
CPVによる犬の伝染を防止するためワクチンが開発され
てきている。しかしながら、これらのワクチンはしばし
ば、母体に由来する抗体（maternally derived antibod
y:MDA）の存在下で投与すると有効でない。或る種の子
犬の場合、この受動免疫は予防接種を阻げるのに充分な
量で相当期間（４ケ月以上）にわたつて持続する。その
後、MDAレベルが減少するにつれて、子犬は伝染および
病気に対する防御が不充分になり、しかも予防接種に対
しては依然抵抗性がある。したがつて、これらの子犬は
その若い世代に相当期間にわたつて防御されない状態と
なる。特に、母体に由来する免疫が消失した後、同腹子
（litters）の伝染の危険により重大な結果がもたらさ
れる。
この理由で、若い世代の早期に子犬を免疫し得るCPVワ
クチンが要望されている。
本発明の目的は、この種のワクチンを提供するにある。
本発明によるワクチンは、国内名称154のCPV株に由来す
るウイルスからなることを特徴とする。このウイルス株
の試料は、フランス国、パリー在、パスツール研究所の
コレクシヨン・ナシヨナレ・デ・カルチユーレ・デ・ミ
クロオルガニスム（Collection Nationale de Cultures
de Microorganismes）にNo.I−404として寄託されてい
る。
好ましくは、本発明によるワクチンは弱毒生型のCPV株
を含有している。
弱毒化は、犬または猫に由来する細胞の培養物でウイル
スを約37℃の温度で何回か継代培養することにより達成
される。各工程につき、事前の培養工程から回収したウ
イルスを新しい細胞培養物を含有する培地へ接種する。
細胞を培養するには、当業界で知られた方法を使用す
る。
ワクチンを製造するには、このように弱毒化された種ウ
イルス（Seed virus）を、たとえば猫胚繊維芽（feline
embryo fibroblast:FEF）培養物のような細胞培養物に
て増殖させることができる。好ましくは、これは犬の正
常温度で行なわれる。このように増殖させたウイルス
は、組織細胞培養液および／または細胞を集めて回収す
ることができる。必要に応じ、回収に際し増殖基質から
の感染粒子の放出を促進させる技術（たとえば音波処
理）によつてウイルスの収率を高めることができる。ワ
クチンは懸濁物として作成することができ、或いは凍結
乾燥することもできる。凍結乾燥したCPVワクチンの場
合、１種もしくはそれ以上の安定化剤を添加するのが好
ましい。適する安定化剤はたとえばSPGA〔ボバルニツク
（Bovarnick）によりジヤーナル・バクテリオロジー、
第59巻、第509頁（1950）に記載されている〕、炭水化
物（たとえばソルビトール、マニトール、澱粉、蔗糖、
デキストラン、グルコースなど）、蛋白質（たとえばア
ルブミンまたはカゼイン）或いはその分解生成物、蛋白
質含有剤（たとえば牛血清またはスキムミルク）、およ
び緩衝剤（たとえばアルカリ金属燐酸塩）である。必要
に応じ、アジユバント活性を有する１種もしくはそれ以
上の化合物も添加することができる。適するアジユバン
トはたとえばアルミニウムの水酸化物、燐酸塩または酸
化物、鉱油〔たとえばバイオールＦ（Bayol F;登録商
標）、マルコール52（Marcol52;登録商標）〕およびサ
ポニンである。
或いは又、本発明によるワクチンは不活性型としてCPV
株を含有することもできる。
本発明による不活性型CPVワクチンは、複製と毒性との
両者が消失したウイルスから作成される。一般に、これ
は化学的手段または物理的手段により達成することがで
きる。化学的不活性化は、ウイルスをたとえば酵素、ホ
ルムアルデヒド、β−プロピオラクトンもしくはエチレ
ンイミンまたはその誘導体、有機溶剤（たとえばハロゲ
ン化炭化水素）および／または洗剤〔たとえばトウイー
ン（Tween;登録商標）、トライトンＸ（TritonX:登録商
標）〕、デオキシコール酸ナトリウム、スルホベタイン
またはセチルトリメチルアンモニウム塩）で処理して行
なうことができる。有利には、ウイルスを高エネルギ放
射線、たとえばUV光、γ線またはＸ線にかけて物理的不
活性化を行なうことができる。必要に応じ、不活性化剤
を中和する。たとえば、ホルムアルデヒドで不活性化し
た製剤はチオ硫酸塩で中和することができる。必要に応
じ、その後にpHを約７の値まで復帰させる。一般に、ア
ジユバントをも不活性化ウイルスに添加し、さらに必要
に応じて１種もしくはそれ以上の乳化剤、たとえばトウ
イーン（登録商標）およびスパン（Span;登録商標）を
も添加する。
ウイルス株154は次の特性により犬パルボウイルスとし
て同定された： （ｉ） 猫および犬の細胞において増殖しうる能力。
（ii） 分裂しなかつた猫および犬の両細胞において増
殖しない性質。
（iii） pH7.2で豚赤血球を凝集するが、ヒトまたはゲ
ツシ動物の赤血球を凝集しないような赤血球凝集素（ha
emagglutinins）の細胞培養物中に於ける生成。
（iv） 細胞培養物内の典型的な核封入物（nuclear in
clusions）の生成。
（ｖ） 猫の汎白血球減少症ウイルスおよび公知の犬パ
ルボウイルスに対し調製された猫および兎の抗血清によ
る中和。
（vi） 猫の汎白血球減少症ウイルスおよび公知の犬パ
ルボウイルスに対し調製された抗血清による赤血球凝集
反応の阻止。
さらに、新規なCPV株は、次の一連の性質により従来公
知のCPV株から区別される： a.猫および犬の両者に由来する繊維芽型の細胞において
37℃の温度にて良好に増殖して、特徴的な細胞変性効果
（cytopathic effect）を示す能力。公知のCPV株と比較
して、本発明によるウイルス株は下記第Ｉ表に要約する
ような増殖特性を示す： （ｂ） 上記細胞系における寒天下の大きい明確なプラ
ークの生成。
これらのデータから、CPV株154は新規なウイルス株であ
ると結論することができる。
ウイルス株154は、CPV伝染の徴候を示す子犬の糞から得
られた。しかしながら、これはこのウイルスに伝染した
子犬または犬からの腸管試料、胸腺もしくはその他のリ
ンパ腺組織、骨髄、血液または肝臓から分離することも
できる。試料材料を精製しかつ緩衝生理的食塩水もしく
は細胞培養培地で希釈した後、犬もしくは猫由来の活発
に分裂している細胞へ接種することができる。
公知のウイルス株からなるワクチンとは異なり、本発明
によるワクチンは６週令における殆んどの子犬および９
〜12週令におけるほぼ100％の子犬に有効である。この
ことは、その時点まで持続していた母体に由来する抗体
を新規なCPVウイルスが打破し得る。（break through）
が、予防接種した子犬にCPV伝染の徴候を引き起こさな
いことを意味する。
12週令における母体による抗体の力価は一般に1:32以下
に低下しており、かつ1:32を越えるレベルは12週令にお
いて極めて稀れである。1:32の力価を有する動物の100
％近くが本発明のワクチンによる予防接種に反応し、1:
64のレベルでさえ殆んど子犬が反応する。
CPVに対し母体の抗体を有することが知られまたは疑が
わしい子犬に適した予防接種系は、たとえば12週令にお
ける１回の予防接種或いは６週令から開始する反復予防
接種（たとえば６週令、９週令および12週令）或いは４
週令から開始する毎週の予防接種のいずれかである。
母体による抗体の存在に関する情報が得られない場合
は、一般に12週令で予防接種することが推奨される。
弱毒生ワクチンの推奨される投与量は103TCID50以上で
あるが、MDAを有する子犬の場合には少なくとも子犬１
匹当り106TCID50であることが好ましい。
これらワクチンの投与は非経口的（たとえば注射）また
は経腸的（たとえば経口投与による）に行なうことがで
きる。
さらに、本発明はまたその一部として、混合ワクチンで
あり、これらワクチンは上記CPVワクチンウイルスの他
に少なくとも１種の次の犬ワクチンウイルスを含む：犬
ジステンバー、伝染性犬肝炎（CAV−１およびCAV−
２）、狂犬病、パラインフルエンザ、犬コロナウイルス
（canine coronavirus）、麻疹および／または伝染性細
菌レプトスピラ病およびボルデテラ病。
伝播（transmission）する間の病原性、免疫原性および
毒性増大を試験するため、CPVを７匹の犬に順次に伝播
させた。この試験において18匹の子犬を使用し、これら
は全て接種の時点で抗体を含まなかつた。全ての子犬は
観察期間中ずつと良好な状態を維持し、抗体反応を示し
た。白血球数は正常の範囲内に留まつた。
本発明のワクチンの接種による防御効果は、６週令の予
防接種に対し抗体反応を示した４匹の子犬、並びに２匹
の予防接種しない比較の子犬を毒性のCPV株に感染させ
て示された。予防接種されていない犬はCPV伝染に特徴
的な臨床的徴候を示したのに対し、予防接種した子犬は
その徴候を示さなかつた。
実施例 １ ウイルスの分離および継代 犬小屋にて８週令のビーグル種の子犬で生じたパルボウ
イルス伝染の臨床例から採取した直腸スワブ（swab）か
らウイルスを単離した。
このウイルスをFEFの培養物に接種し、これら細胞で再
度継代させた後、犬のA72細胞系の培養物へ移した。
〔ビン（Binn），マルチビツキ（Marchwicki）およびス
テフエンソン（Stephenson）A.M.J.V.R.第41巻、第855
−860頁（1981）〕。細胞培養物におけるウイルスの全
継代は37℃で行なつた。
次いで、ウイルスをこの細胞系で41回継代させて弱毒化
し、その過程で４回のクローン化工程を４回目、７回
目、10回目および40回目の継代時点で行なつた。それぞ
れの場合、大きい明瞭な分離プラークを取り出した。
次いで、A72細胞における41回目の継代ウイルス（プー
ル182）をFEF培養物に再び接種し、プール182後のFEFに
おける第２回継代の回収物を「マスターシード（MASTER
SEED）」ロツトとして保存しかつこれをプール190と名
付けた。
実施例 ２ 生ワクチンの製造 A.実施例１にしたがつて得られたマスターシードロツト
から、１次および２次の処理用シードロツトを作成し
た。これらは、A72細胞系から移した後に４回および５
回FEA細胞培養物で継代させたものである。FEF細胞培養
物に、処理用シードウイルスを播種し感染させた。次い
で、培養物をウイルスの細胞変性効果が適当な段階に達
するまで培養した。この時点で、細胞培養培地を回収し
かつ−70℃にて保存した。
B.回収物の試料をウイルス力価について分析しかつ不稔
（sterility）につき試験した。ウイルス力価が既知で
ある場合には、ウイルスに安定化剤を配合して最終配合
物中で5.5％のソルビトールと5.5％のNZアミン（カゼイ
ンの膵臓消化物）にさせた。次いで、この配合物を中性
ガラス壜中へ1.0mlの容量で満たし、次いで凍結乾燥さ
せかつ減圧下で密封した。
実施例 ３ 各母体由来の抗体を考慮した子犬の予防接種 107.4TCID50のCPV量を含有するワクチンを、赤血球凝集
阻止により確認された種々のレベルの、母体に由来する
抗体（MDA）力価を含有する135匹の子犬に投与した。こ
れら子犬の124匹には６週令にて予防接種し、残りの11
匹には９週令にて予防接種した。第６週にて少数の子犬
は予防接種に対し血清学的に反応しなかつたが、これら
には８〜９週令にて再び予防接種し、全ての場合にこれ
らは急速な血清変化を伴つて反応した。
これら結果の要約を下記第２表および第３表に示す： 実施例 ４ 検出可能な母体に由来する抗体の存在下における本ワク
チンと他種ワクチンとの効果の比較 ３種の異なるワクチンの効果を、２つの別々の試験で比
較した。
第１の試験においてビーグル犬コロニーで生まれた子犬
に、弱毒化したスミス−クラインの生CPVワクチン（SK
−CPV）またはインテルベツト（Intervet）猫パルボウ
イルスワクチン（FPV）のいずれかを予防接種した。
第２の試験においてビーグル犬コロニーで生まれた子犬
に、本発明による生CPVワクチン（Int−CPV）またはイ
ンテルベツト猫パルボウイルスワクチン（FPV）のいず
れかを予防接種した。
これら子犬には４〜８週令から毎週予防接種した。全て
の子犬は母親から母体の抗体を受けていた。
結果を第４表に示す。
本発明のワクチンによる子犬の免疫は、致命的なCPV疾
患に対し公知のワクチンにより得られる防御よりもずつ
と優れた防御をもたらすという結論が引き出される。
実施例 ５ 不活性化ワクチンの作成 実施例２にしたがつて得られた細胞培養培地（1ml当り1
08TCID50の力価を有する）を、37℃で２時間培養する際
に0.1％濃度のβ−プロピオラクトンにて処理した。
1N NaOHの滴加により、所定時間間隔で液体を中和し
た。フエノールレツド（培地中に存在）が、pH調整を必
要とする時点を示す。
最後に、燐酸アルミニウムを、アジユバントとして混合
物に0.3％の最終濃度まで配合した。
実施例 ６ 12週令における予防接種に対する母体由来免疫子犬の反
応 母体由来の抗体の相当な力価を示す２群の子犬を、実施
例２にしたがつて作成した生ワクチンまたは異型の猫パ
ルボウイルス系ワクチンのいずれかで免疫した。
母体由来の抗体は、赤血球凝集阻止滴定により決定し
た。
各群には３種の異なる投与量を施こし、各群を９匹の子
犬で構成した。
結果を第５表に示す。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】犬パルボウィルス株154のウィルスを含む
    犬パルボウィルス伝染に対する免疫ワクチンであって、
    前記犬パルボウィルス株154はフランス、パリのパスツ
    ール研究所のコレクション・ナショナレ・デ・カルチュ
    ーレ・デ・ミクロオルガニズムにNo.I−404として寄託
    されており且つ６週における母体に由来する抗体（MD
    A）の力価が160以下の子犬に６週および８週目に２回予
    防接種することにより子犬を防御する特性を少なくとも
    持っていることを特徴とする前記ワクチン。
  2. 【請求項２】前記ウィルスが弱毒生型であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項に記載のワクチン。
  3. 【請求項３】犬パルボウィルス株154を、１回投与当た
    り少なくとも103TCID50を含むことを特徴とする特許請
    求の範囲第２項に記載のワクチン。
  4. 【請求項４】犬パルボウィルス株154を、１回投与当た
    り少なくとも106TCID50を含むことを特徴とする特許請
    求の範囲第３項に記載のワクチン。
  5. 【請求項５】犬パルボウィルス株154のワクチンウィル
    スを含み、さらに少なくとも犬ジステンパーウィルス、
    伝染性犬肝炎ウィルス（CAV−１およびCAV−２）、狂犬
    病、パラインフルエンザ、犬コロナ、麻疹および／また
    は伝染性細菌：レプトスピラ病およびボルデテラ病のう
    ちの一種のワクチンウィルスを含有する混合ワクチンで
    あって、前記犬パルボウィルス株154はフランス、パリ
    のパスツール研究所のコレクション・ナショナレ・デ・
    カルチューレ・デ・ミクロオルガニズムにNo.I−404と
    して寄託されており且つ６週における母体に由来する抗
    体（MDA）の力価が160以下の子犬に６週および８週目に
    ２回予防接種することにより子犬を防御する特性を少な
    くとも持っていることを特徴とする前記混合ワクチン。
  6. 【請求項６】犬パルボウィルス株154のウィルスの細胞
    組織培養物から回収した物質を、犬パルボウィルス伝染
    に対しワクチン活性を有する医薬製剤に形成することか
    らなる犬パルボウィルスワクチンの製造方法であって、
    前記犬パルボウィルス株154はフランス、パリのパスツ
    ール研究所のコレクション・ナショナレ・デ・カルチュ
    ーレ・デ・ミクロオルガニズムにNo.I−404として寄託
    されており且つ６週における母体に由来する抗体（MD
    A）の力価が160以下の子犬に６週および８週目に２回予
    防接種することにより子犬を防御する特性を少なくとも
    持っていることを特徴とする前記方法。
  7. 【請求項７】犬パルボウィルス株154のウィルスを含む
    犬パルボウィルス伝染に対する免疫ワクチンを子犬に投
    与することからなる犬パルボウィルス伝染に対する犬の
    防御法であって、前記犬パルボウィルス株154はフラン
    ス、パリのパスツール研究所のコレクション・ナショナ
    レ・デ・カルチューレ・デ・ミクロオルガニズムにNo.I
    −404として寄託されており且つ６週における母体に由
    来する抗体（MDA）の力価が160以下の子犬に６週および
    ８週目に２回予防接種することにより子犬を防御する特
    性を少なくとも持っていることを特徴とする前記防御
    法。
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